Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kemoterapia ja anti-hormonaalisia hoidot ovat yleisimpiä hoitoja ei-elimeen rajoittunut eturauhassyöpä (PCA) . Kuitenkin tehokkuutta näiden hoitojen on rajoitettu, mikä vaatii kehittää vaihtoehtoisia lähestymistapoja. Tässä tutkimuksessa keskityttiin analysoimaan roolista pterostilbene (PTER) -isothiocyanate (ITC) konjugaatti – uusi luokka hybridiyhdiste syntetisoitiin liittämällä ITC diiniosan PTER selkäranka – säätelyssä toimintojen androgeenireseptorin (AR), mikä aiheuttaa apoptoosin Eturauhassyövän soluja. Konjugaattimolekyyli aiheutti 50% kasvun esto (IC

50) 40 ± 1,12 ja 45 ± 1,50 uM AR positiivinen (LNCaP) ja negatiivisen (PC-3-solut), vastaavasti. Alennettu leviämisen PC-3 ja LNCaP-soluissa konjugaatti korreloi kertyminen solujen G2 /M-vaiheen ja induktio kaspaasi riippuvaista apoptoosia. Sekä PI3K /Akt ja MAPK /ERK reitit oli tärkeä ja ero rooli konjugaatin indusoiman apoptoosin näistä PCa soluja. Vaikka inhibiittori Akt (A6730) tai Akt-spesifinen, pieniä häiritseviä RNA (siRNA) suuresti valoherkkä PC-3-solujen konjugoida: n indusoiman apoptoosin, päinvastoin, apoptoosin kiihdytti estämällä ERK (by PD98059 tai ERK siRNA) siinä tapauksessa, LNCaP-solut, sekä lopulta huipentui ilmentymisen pilkottiin kaspaasi-3-proteiinin. Lisäksi antiandrogeeninen aktiivisuus konjugaattia välittämä vähentynyt ilmentyminen AR ja sen co-aktivaattorien (SRC-1, GRIP-1), siten puuttumatta niiden vuorovaikutus AR. Kaikki nämä tiedot viittaavat siihen, että konjugaatti inhiboivan solujen lisääntymisen ja apoptoosin induktion osittain välittyy alaspäin säätely AR, Akt, ja ERK signalointi. Nämä havainnot antavat perusteet suunnitella uusia terapeuttisia lähestymistapoja hoitoon PCa käyttämällä konjugaattia yksin tai yhdessä muiden terapeuttisten.

Citation: Nikhil K, Sharan S, Chakraborty A, Roy P (2014) pterostilbene-isotiosyanaatti Conjugate estää kasvu eturauhassyöpäsolujen Riippumatta androgeenireseptorin tila. PLoS ONE 9 (4): e93335. doi: 10,1371 /journal.pone.0093335

Editor: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

vastaanotettu: 30 syyskuu 2013; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2014; Julkaistu: 03 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Nikhil et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimuksen avustuksia neuvoston tieteellisen ja teollisen tutkimuksen ja Ministry of Human Resources ja kehittäminen (MHRD), Intian hallitus tutkimus- apurahoja kN ja projektin assistentin PR, vastaavasti. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Edelleen PR haluaa myös säiliön muihin rahoittajille, Department of Biotechnology (BT /PR14836 /AAQ /01/455/2010) ja Department of Science and Technology (SR /SO /HS-39/2009) heidän taloudellista tukea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta huomattavista ponnisteluista ablaatio syöpiä, eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin diagnosoitu syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuoleman miehillä Yhdysvalloissa, arviolta 217730 uutta tapausta ja 32050 kuolemaa vuonna 2010 [1]. Vaikka etiologia PCa edelleen tuntematon, kohonneet steroidihormonien, kuten androgeenit ja estrogeenit, sekä kasvutekijät, kuten insuliinin kaltainen kasvutekijä 1, pidetään tärkeänä riskitekijöitä [2] – [4]. Androgeeniablaatio hoito on ensimmäinen vastaus, mutta useimmilla potilailla, joilla on edennyt PCa lopulta kehittää vastustuskykyä tämän hoidon ja etenee hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä (HRPC), joille ei ole olemassa parantavaa hoitoa [5]. Puute tehokkaita hoitovaihtoehtoja hallintaan HRPC vahvistavat tarvetta kehittää uusia yhdisteitä, jotka toimivat yksin tai yhdistelminä.

Androgeenien ja AR toiminnot on keskeinen rooli syövän synnyssä ja etenemisessä PCA sekä normaalissa eturauhasen kehitys [6], [7]. Toimet androgeenit kuten testosteroni ja dihydrotestosteroni (DHT), välittävät AR, joka on jäsen tumareseptorin Super perheen ligandin-riippuvaisen transkription tekijöitä, [8]. Lisäksi androgeenin, AR aktiivisuus, voidaan myös modifioida molekyylien muiden solujen signaalinvälitysreittien. Säätelyn kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja myöhemmät lisäykset ekstrasellulaarisen säädelty kinaasi (ERK) ja Akt signalointi ovat sekaantuneet PCa etenemistä [9]. Akt säätelee AR signalointireitin fosforylaatio ja /tai transkription säätelyyn AR. Akt fosforyloi AR seriinissä 210/213 ja 790/791 ja lopulta transaktivoi sen toimintaa. Aiemmassa tutkimuksessa osoitti, että inhibitio Akt-reitin kumoaa HER-2 /neu-indusoidun AR-signaloinnin toimintaa [10]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Akt on aktivaattori AR tarvitaan androgeenistä riippumaton selviytymisen ja kasvun Eturauhassyövän soluja. Tutkimus on osoittanut, että inhibitio toinen tai molemmat näistä reiteistä on syvempi vaikutus kasvaimen solujen kehitystä ja kuoleman, mikä tekee niistä houkuttelevia monimuotoiset tavoitteet PCa terapiassa. Siksi AR, Akt, ja ERK voisivat olla potentiaalisia hoidossa PCa.

Bioaktiivinen elintarvikkeiden ainesosien, erityisesti yhä arvioidaan potentiaalisina PCa kemopreventiivisiä aineita, koska niiden oletetaan turvallisuus [11]. Yksi tällainen yhdiste on pterostilbene (PTER), joka on luonnossa esiintyvä dimetyylieetteriä analoginen resveratrolin (RESV), joka on suurempi oraalinen biosaatavuus ja lisääntyneen tehon verrattuna RESV [12]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että PTER voi estää kasvun eri hormonin reagoivan syöpien, kuten rinta- [13] – [15] ja PCa [14], [16] – [18] sekä

in vitro

ja

in vivo

. Vaikka anti-metastaattinen, anti-kasvain ja anti-leukemiasolujen ominaisuuksia PTER on vakiintunut rintasyöpä, on rajallisesti raportteja toiminnan PTER lisääntymisessä Eturauhassyövän indusoiman steroidihormonien [16]. Vastaavasti, isotiosyanaatit (ITC), ovat luonnossa esiintyviä, alhaisen molekyylipainon orgaanisia yhdisteitä, joiden yleinen kaava on R-NCS [19]. Nämä chemoprotective aineita löytyy monenlaisia ​​cruciferous vihannekset, kuten parsakaali, kukkakaali, kaali, ruusukaali, ja lehtikaali [20]. Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että lisääntynyt kulutus cruciferous vihannekset voivat olla suojaava PCa riski [21] – [24]. Kuitenkin huolimatta pakottavia epidemiologisten korrelaatio, aktiivisuus ITC vastaan ​​PCa soluja on vielä järjestelmällisesti arvioitu. Koska yksittäiset roolit PTER ja ITC on jo liitetty PCA meidän tarkoituksena on kehittää konjugaattia PTER-ITC etsimään voimakas anti-syöpä molekyylejä. Konjugaatti valmistettiin liittämällä ITC sisältävät tiosemikarbatsidin farmakoforin kanssa PTER selkäranka kuten aiemmin on kuvattu [25]. Yllättäen konjugaattimolekyyli testattaessa in vitro, osoittivat tehokasta sytotoksisuutta monenlaisia ​​syövän solulinjoja verrattain pienempi annos verrattuna sen lähtöaineen eli PTER [25]. Lisäksi tutkimuksemme osoitti, että antiproliferatiivista aktiivisuutta konjugaatin ihmisen rintasyövän solulinjoissa johtui sen kyvystä pidättää solut G2 /M vaiheessa ja kaspaasi, ja myös korreloi saarron Akt ja ERK signalointireitteihin [ ,,,0],25].

esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme yksityiskohtaisempia teho- ja molekyylitason toimintamekanismit PTER-ITC konjugaattia käyttäen androgeeniriippuvaisissa (LNCaP) ja androgeenista riippumaton (PC-3) PCa soluja. Lisäksi olemme myös verrattu PTER-ITC konjugaatti emoyhdisteen PTER so RESV. Tutkimuksemme Näin tunnistetut äskettäin kehitetty konjugaatin olevan voimakas AR-estäjän että vaimentaa voimakkaasti kasvua PCa solujen in vitro muuntamalla AR ilmaisu sekä säätelevät solusyklin etenemisen ja apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Kaikki soluviljelmässä reagenssit saatiin GIBCO (Invitrogen, CA, USA), ellei toisin mainita. Penisilliini, streptomysiini, MTT: tä (3- (4, 5-dimetyyli-2-tiatsolyyli) 2,5diphenyl-2H-tetrazoliumbromide), soluviljelylaatua dimetyylisulfoksidi (DMSO), agaroosin ja kaikki analyysilaatua kemikaalit olivat HiMedia (Mumbai, Intia ). Käänteinen transcription- polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) sarjat olivat genei (Bangalore, Intia). RESV, PTER, DHT, Akt1 /2 estäjät, PD98059 (ERK estäjä), Z-VAD-FMK (pan kaspaasiestäjä), Z-LEHD-FMK (kaspaasi-9 erityisiä estäjä), Z-IETD-FMK (caspase- 8 erityisiä estäjä) ja BCA proteiini arviointi sarjat olivat Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Polyfect transfektioreagenssia hankittiin QIAGEN (Valencia, CA, USA). Pifithrin-α (p53-estäjä), vasta-aineita kaspaasi-3, Bax, Akt, p-Akt, ERK, p-ERK, SRC-1, GRIP-1, N-CoR: n, β-aktiini ja pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) vastaan ​​Akt (sc-43609), ERK (sc-35335) ja ohjaus (sc-37007; negatiivinen kontrolli kokeita käyttämällä kohdistettuja siRNA transfektio; kukin koostuu salattu sekvenssi, joka ei johda erityiseen hajoamisen kaikista tunnetuista solun mRNA) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). PTER-ITC konjugaatti syntetisoitiin asymmetrinen synteesi laboratoriossa kemian, Indian Institute of Technology Roorkee, Intia, menetellen kuvattu aiemmin [25] ja tästä lähtien nimetty konjugaatin käsikirjoituksen (Fig. 1A).

(A) rakenne resveratrolin, pterostilbene ja pterostilbene-isotiosyanaattia konjugaattia. (B) vaikutus konjugaatin apoptoosin PC-3 ja LNCaP-soluissa, mikä ilmenee edustavan FACS-analyysillä käyttämällä anneksiini V merkki. (C) Histogrammi, joka esittää tietoja FACS-analyysi, jossa tulokset ovat keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. # Ja * edustaa tilastollisesti merkitsevää eroa niiden erityistarkastuksia (ajoneuvo käsitelty) soluille alussa ja lopussa apoptoosin vastaavasti

p

0,05.

Solulinjat ja kulttuuri

eturauhaskarsinoomasolulinjaa linjat (AR-positiiviset LNCaP ja AR-negatiivinen PC-3) ja noncancer solulinjoissa (CHO ja COS-1) saatiin National Center for Cell Science (NCC), Pune, Intia. PC-3, CHO ja COS-1-soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen media (DMEM), kun taas LNCaP-soluja ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (lämmöllä inaktivoitu) alle 5% CO

2 37 ° C: ssa. Kaikki kokeet suoritettiin käyttäen LNCaP, PC-3, CHO ja COS-1-solut kanavasta alle 29, 34, 20 ja 30 vastaavasti. Solut pestiin kunnolla ennen materiaalin vaihtoa steroidi-free täydellistä väliainetta ennen jokaista hoitoa yhdisteillä, ellei toisin mainita.

sytotoksisuusmääritykset

MTT-määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],25]. Lyhyesti, 5 x 103 solua 200 ul: ssa väliainetta ympättiin 96-kuoppalevyille (Griener, Saksa

).

24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0,1, 1, 10, 100 ja 1000 uM) RESV, PTER ja konjugaatti. Ohjaus-soluja käsiteltiin 0,1% DMSO: ta (vehikkelikontrolli). Viljellyt solut testattiin 24 tunnin kuluttua lisäämällä 20 ui 5 mg /ml MTT jälkeen inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. MTT sisältävässä väliaineessa imettiin sitten ja 200 ui DMSO: ta (Himedia, Mumbai, Intia) lisättiin liuottamiseksi formazone kiteitä. Optinen tiheys (OD) mitattiin 570 nm: ssä ELISA-levyn lukijaa (Fluostar optimia, BMG Labtech, Saksa). Inhibitioprosentti laskettiin:

Annosvastekuvaaja ja IC

50-arvot saatiin epälineaarisella regressioanalyysillä [epälineaarinen regressio (sigmoidinen annosvaste vaihtelevalla rinne)] käyttäen Graph Pad Prism, versio 5,02 ohjelmisto (Graph Pad Software Inc., CA, USA).

Cell Cycle jakelu ja apoptoosimäärityksessä virtaussytometrialla

Solusykli jakelu ja anneksiini V /propidiumjodidilla (PI) positiiviset solut olivat analysoitiin virtaussytometrialla. Lyhyesti, ensimmäinen solut ympättiin ja käsiteltiin 0, 10, 20 ja 40 uM konjugaatti täydellisessä elatusaineessa 24 h ajan. Tätä seurasi trypsinoimalla ja vahvistamisesta 70% etanolia, ja lopulta pesu PBS: llä. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin RNaasi A: lla (50 ug /ml), värjättiin PI (50 ug /ml) ja inkuboitiin pimeässä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja analysoitiin virtaussytometrialla solusyklin jakeluun. Apoptoosin, konjugaatin käsitellyt solut värjättiin Alexa-Fluor 488-konjugoidulla anneksiini-V käyttäen Vybrant-Apoptosis Assay Kit Invitrogen (USA) kohti valmistajan protokollaa. Värjätyt solut analysoitiin sitten fluoresenssi solulajittelulla (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ja tiedot oli standardoitu käyttäen Cell Quest 3.3 ohjelmisto.

Caspase Pitoisuus

kaspaasi-aktiivisuus määritettiin käyttämällä ApoTarget kaspaasi kolorimetristä proteaasimäärityksessä näytteenottolaitteen kit (KHZ1001; Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, molemmat PCa soluja käsiteltiin kasvavia annoksia konjugaatin ja RESV 24 tuntia. Sitten solut kerättiin, pestiin PBS: ssä, ja hajotettiin 50 ul: ssa lyysipuskuria jäissä 10 min. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti, joka sisälsi 150 ug proteiineja inkuboitiin 200 uM kaspaasi-3 (Ac-DEVD-pNA), kaspaasi-8 (Ac-IETD-pNA) ja kaspaasi-9 (Ac-LEHD-pNA) substraatit vastaavasti reaktiopuskuria 37 ° C: ssa 1 h 96 ja tasainen pohjalevy. Tasot julkaissut pNA mitattiin sitten 405 nm aallonpituudella ELISA-levyn lukijaa (Fluostar optimia, BMG Labtech, Saksa). Taitettavan kasvu kaspaasi-3, -8, ja -9 toiminta määritettiin suoran vertailun tasolle un aiheuttama ohjaus. Sillä kaspaasiestäjä määrityksessä solut esikäsiteltiin synteettisellä pan-kaspaasi-inhibiittori (Z-VAD-FMK), kaspaasi-8-estäjä (Z-IETD-FMK) ja kaspaasi-9-inhibiittori (Z-LEHD-FMK) 1 h ennen kuin lisättiin konjugaatin ja solukuoleman analysoitiin MTT-määrityksellä kuten edellä.

RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin käsitellyistä soluista käyttäen RNA: n eristämistä kit saatu genei ( Bangalore, Intia). Uutettu RNA Sitten näytteet määrällisesti ja sama määrä yksittäisten hoitojen litteroitiin avulla RT – PCR -kittiä genei (Bangalore, Intia) mukaan valmistajan ohjeiden. PCR suoritettiin denaturoivalla 94 ° C: ssa 60 s, pariutuminen eri lämpötiloissa (riippuen alukeparien käytetään) 45 s ja pidennys 72 ° C: ssa 2 min, mitä seurasi, että syklien määrä vahvistusta varten. Alukkeet Bcl-2, Bcl-x L, Bax, AR ja β-Actin suunniteltiin avulla Primer 3 ohjelmistojen ja standardoitu laboratoriossa. PCR-tuotteet eroteltiin sitten 2% agaroosigeelillä ja visualisoitiin geelissä dokumentaatiojärjestelmän (Bio Rad, USA). Voimakkuus bändejä agaroosigeeleillä analysoitiin ImageJ 1,43 ohjelmistoa (NIH, USA) ja normalisoitu p-aktiini PCR-tuotteet. Kukin RT-PCR suoritettiin kolme kertaa. Taulukko S1 esittää alukkeen sekvenssi, tuotteen koko, hehkutus lämpötilassa, ja jaksojen määrä käyttää kaikkien alukkeiden.

Immunofluoresenssivärjäys

Immunofluoresenssivärjäystä, LNCaP-solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 3 % paraformaldehydillä, tehdään läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 ja lopuksi salvattiin 1% BSA 30 min huoneenlämmössä. Sitten soluja inkuboitiin AR kanin polyklonaalista vasta-ainetta laimennettuna 1:200 blokkauspuskurissa 1 tunnin ajan RT: ssä. Lopuksi solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin FITC-leimatun anti-kani sekundääristä vasta-ainetta laimennettuna 1:1000 estopuskurissa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss, Axiovert 25, Saksa).

Co immunosaostus ja Western blot -analyysi

LNCaP-solut maljattiin 100 mm: n viljelymaljoilla ja käsiteltiin konjugaattia tai DHT 24 tuntia. Koko-solu-lysaatit valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [26] ja immunosaostuksella (IP), joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, ja 1% Triton X-100. Proteiini alikvootit 500 ug inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: ssa käyttäen 2 ug vasta-ainetta vastaan ​​suunnattu AR. Proteiini-A-Cl -agaroosihelmiä Sitten lisättiin ja inkuboitiin vielä 6 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Immunosaosteet pestiin neljä kertaa IP-puskurissa ja immunokompleksien otettiin talteen keittämällä SDS-näytepuskurissa. Lopuksi Western blot suoritettiin käyttäen anti-AR, anti-SRC-1 ja anti-GRIP-1-vasta-aineita (Santa Cruz, CA, USA). Western blot -analyysiä varten, solulysaateista valmistettiin korjuun jälkeen niistä lyysipuskurissa. Noin 40 ug kokonais-proteiinia ajettiin elektroforeesilla 12% SDS-PAGE, ja Western blotting suoritettiin käyttäen protokollaa. Lyhyesti, analysoidut proteiinit siirrettiin nailonkalvoille. Blotit blokattiin TBST-puskurissa (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM natriumkloridia, 0,05% Tween-20), joka sisälsi 5% rasvatonta maitojauhetta. Ne pestiin sitten TBST-puskurissa ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa samaa puskuria, joka sisältää sopivia määriä primaaristen vasta-aineiden: kaspaasi-3, Bax, Bcl-2, Akt, p-Akt, ERK, p-ERK, AR, SRC -1, GRIP-1 (1:500) ja β-aktiini (1:1000). Jälkeen blotit pestiin ja inkuboitiin anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (1:20,000) konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (HRP). Värin kehitys suoritettiin pimeässä käyttämällä ECL (Amersham, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Kehittyneissä blotit tehtiin densitometrinen analyysi ImageJ 1,43 ohjelmisto (NIH, USA) käyttäen β-aktiini sisäisenä kontrollina.

Transfektio

LNCaP-soluja kasvatettiin ja transfektoitiin väliaikaisesti pMMTV-neomysiiniä -luciferase plasmidi (300 ng /105 solua) RPMI-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää käyttäen polyfect transfektioreagenssia (Qiagen, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten, 24 h transfektion jälkeen, solujen viljelyalustassa muuttaa väliaineessa, joka sisälsi 5% hiilellä erotettua FBS: ää vähentää kontaminoivien steroideja seerumista ja inkuboitiin vielä päivä ennen aloittamista hoitoja. Siinä tapauksessa, että PC-3-soluja, ne samalla transfektoitiin, mutta lisäksi pMMTV-neomysiini-lusiferaasi-konstrukti, ne transfektoitiin myös pSG5-Har-puro-plasmidin (täyspitkä har in pSG5-ekspressiovektoriin) välinen suhde on 5: 1, kuten edellä on esitetty. Kokeita varten, joihin liittyy yhteistyötä sääntelyviranomaisten, 50 ng koaktivaattoria plasmidit (25 ng kutakin GRIP-1 ja SRC-1) yhdessä pMMTV-neo-luc (250 ng) transfektoitiin LNCaP. Arvioida transfektiotehokkuus, 500 ng /105 solua SV40-promoottori-Renilla lusiferaasi (PRL-SV40) vektoriin (Promega Madison, USA) kotransfektoitiin sisäisenä kontrollina. Sitten soluja käsiteltiin joko vehikkelillä tai eri pitoisuuksina (1-40 uM) konjugaatin ja /tai 10 nM DHT 24 tuntia, ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin ohjeiden mukaisesti annetaan Kit (Promega, Madison, USA ). Kukin koepiste tehtiin kolmena kappaleena ja vaihteli alle 10%. Arvot lusiferaasi kunkin lysaatit normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus.

Sijainti tutkimuksia, pEGFP-AR plasmidi transfektoitiin LNCaP-ja PC-3-soluja (300 ng /105 solua). Sitten soluja inkuboitiin 10 nM DHT /ilman 10 ja 20 uM konjugaattia ja seurataan säännöllisesti till 12 h alle fluoresenssi (Zeiss, Axiovert 25, Saksa).

siRNA Transfektio

siRNA ihmisen Akt ja ERK ja ohjaus siRNA ostettiin kaupallisesti Santa Cruz Biotechnology (USA). LNCaP-ja PC-3-PCa-solut transfektoitiin siRNA: illa (lopullisessa pitoisuudessa 100 nM) käyttäen polyfect transfektioreagenssia (Qiagen, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 24 tunnin transfektion jälkeen solut pestiin hyvin ja korvattiin tuoreella kasvualustalla. Solut käsiteltiin sitten 20 uM konjugaatin 24 tuntia, ja lopulta proteiinin lysaatit valmistettiin päätyttyä hoidon. Tasot p-Akt, p-ERK ja pilkottiin kaspaasi-3 ilmaisuja havaittiin Western blot -analyysillä.

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM ja arvioitiin tilastollisesti käyttämällä yhden tapa ANOVA seurasi Bonferroni

post hoc

testi käyttäen Graph Pad Prism 5,04 ohjelmisto (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA).

p

-arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

soluproliferaation inhibointi konjugaattiadditiolla

LNCaP (AR positiivinen ) ja PC-3 (AR negatiivinen) soluja viljeltiin eri pitoisuuksilla RESV, PTER ja konjugaatti 24 tuntia täydellisessä RPMI ja DMEM, vastaavasti. Meidän tiedot osoittivat, että hoito LNCaP-ja PC-3 PCa solujen RESV, PTER ja konjugaattia aiheutti annoksesta riippuvaisen soluproliferaation inhibointi. Kuten taulukosta 1, tapauksessa LNCaP, konjugaatin johti lähes 50%: n vähennys määrän eläviä soluja 40 ± 1,12 uM, kun se oli noin 66,4 ± 1,39 ja 82,2 ± 2,19 uM tapauksessa PTER ja RESV käsitellylle soluissa 24 tunnin kuluttua hoidon. Samoin, jos PC-3-solujen IC

50-arvo konjugaatin, PTER ja RESV havaittiin olevan 45 ± 1,50, 75 ± 2,55 ja 95,0 ± 1,13 uM 24 tunnin kuluttua hoidon (taulukko 1). Lisäksi, kun testattiin noncancer solulinjoissa, kuten CHO- ja COS-1, kaikki yhdisteet havaittiin olevan IC

50 arvot yli 100 uM. Siten molemmat syöpäsolun linjat todettiin olevan herkempiä konjugaatin kohtelun kuin PTER ja RESV kuvailema alemman IC

50-arvot niissä kaikissa. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että PTER-ITC konjugaatti on voimakas sytotoksinen lääkeaine sekä AR positiivinen ja AR negatiivisia solulinjoja joskin hieman korkeampi taso entisessä verrattuna jälkimmäisen.

Differential herkkyys PC-3 ja LNCaP-solujen Conjugate aiheuttaman apoptoosin

miljöö MTT määrityksen tulokset, laajensimme testi, jossa selvitetään PCa solujen apoptoosia jälkeen konjugaatin hoidon käyttämällä anneksiini-V /PI kaksinkertainen värjäys määritys ja virtaus cytometry analyysi. Jälkeen PCa soluja inkuboitiin eri konsentraatioita konjugaattia, solut värjättiin Alexa Fluor 488-konjugoidulla anneksiini-V: n ja PI, joka voidaan arvioida varhain ja myöhään apoptoottiset solupopulaatioiden. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, konjugaatti tuotti annoksesta riippuvan kasvun apoptoottisten solupopulaation sekä PCa tutkituissa soluissa. Hoito PC-3-solujen kasvavia annoksia konjugaatin 24 h lisännyt alussa apoptoottisten solujen noin 44%: sta 68% ja myöhään apoptoottisia soluja 12%: sta 16%: iin 20 ja 40 uM pitoisuuksina, verrattuna ajoneuvon käsiteltyjen ryhmien vastaavasti (Fig. 1 B yläpaneeli). Koska PC-3-solujen puuttuu funktionaalinen p53-proteiini, oli kiinnostavaa määrittää, onko läsnä villityypin p53 vaikuttaa solujen herkkyyttä solun aiheuttama kuolema konjugaatti, koska p53 tunnetaan säädellä apoptoosia eri ärsykkeille. Me käsitellyt tätä kysymystä määrittämällä herkkyyttä LNCaP (villityypin p53) kohti konjugaatti aiheuttama apoptoosin FACS-analyysillä. Hoito LNCaP 24 tuntia kasvavia annoksia konjugaatin johti asteittaisen lisääntymisen varhaisen apoptoottisten solujen (anneksiini V positiivinen vain) 52%: sta 72%: iin 20 ja 40 uM, tässä järjestyksessä (Kuva. 1 B, alempi paneeli). Myöhään apoptoottiset solut (anneksiini V ja PI positiivinen) lisääntyi huomattavasti 8%: sta 18,5%: iin (Fig. 1 B, alempi paneeli) verrattuna vain 0,23% varhaisten apoptoottisten solujen ja lähes mitätön määrä myöhään apoptoottisten solujen negatiivisen kontrollin hoidetussa ryhmässä 0,1% DMSO. Histogrammi oikeassa paneelissa (Fig. 1 C) ilmaisee tilastollisen analyysin kolme samanlaista itsenäisen kokeen sekä solulinjoissa. Mielenkiintoista, kokonaismäärä apoptoottisten solujen ei ollut tilastollisesti merkitsevä (

p

0,05) välillä LNCaP ja PC-3-solujen testattaessa eri pitoisuuksilla konjugaatin, mikä viittaa siihen, että p53-proteiini ei ollut mukana asetuksessa konjugaatin aiheuttaman apoptoosin eturauhassyövän soluja.

Conjugate aiheuttama Stage erityisiä pidätys eturauhassyöpäsolujen

kasvu- ja DNA-synteesin estävän vasteita konjugaatin PCA soluissa, tutkimme seuraavaksi sen vaikutus solusyklin etenemisen. Kuten on esitetty kuviossa. 2A ja 2B, hoito PC-3 ja LNCaP-solut kasvavat annokset konjugaatin 24 tuntia aiheutti annoksesta riippuva nousu kertyminen solujen G2 /M-vaiheessa samanaikaisesti väheneminen G1 vaiheessa soluissa. Siinä tapauksessa, että PC-3-soluja, vaikutus havaittiin 40 uM konjugaatti oli suurimmillaan noin 50% soluista on pidätetty G2 /M-vaiheen, verrattuna vain 22% kontrolliryhmän (Fig. 2A). Samanlainen suuntaus G2 /M vaiheessa pidätyksen osoitettiin myös LNCaP (35% käsitellyissä soluissa oli 11% kontrollisoluissa), vaikka koko väestöstä soluja ei päässyt korkean 50% kuten havaittiin PC-3 solut. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, konjugaatin hoito johti kertymistä 16-35% soluista G2 /M-vaiheen kasvavia annoksia konjugaatin. Näin ollen konjugaatti-välitteistä kasvun estäminen sekä PC-3 ja LNCaP-solut korreloivat G2 /M-vaiheen solusyklin pysähtymisen.

Cell cycle jakelu (A) PC-3 ja (B) LNCaP-solut käsittelemällä vaihtelevia annoksia konjugaatin. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Edustaa tilastollisesti merkitsevää eroa vehikkelillä käsiteltyihin PC-3 ja LNCaP-soluissa vastaten kutakin vaiheessa solukierrossa

p

0,05. (C) vaikutukset vaihtelevia annoksia konjugaatin (vasen paneeli) ja resveratrolin (oikea paneeli) on kaspaasi-8, -9 ja -3 toimintaa PC-3 ja (D) LNCaP-soluja. Tulokset ovat keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Edustaa tilastollisesti merkitsevää eroa valvoa soluja vastaavia caspases testataan

p

0,05. (E) vaikutus kaspaasi-inhibiittorit on konjugaatti-indusoituvaa solukuolemaa PC-3 ja (F) LNCaP-soluja. Solut esikäsitellään 20 uM vastaavien kaspaasi-inhibiittorit: Z-LEHDFMK (kaspaasi-9-inhibiittori); Z-IETDFMK (kaspaasi-8-estäjä); ja Z-VAD-FMK (yleinen kaspaasiestäjä) 1 h, ennen kuin lisättiin 20 uM konjugaatin. Solukuolema mitattiin 24 tunnin kuluttua konjugaatin hoitoon käytetään MTT-määritystä. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Ja # edustaa tilastollisesti merkitsevää eroa kontrolliin (ajoneuvo) ja konjugaatti käsiteltyjä soluja vastaavasti kullekin solulinjoissa

p

0,05. ns, ei-merkitsevä.

Konjugaatti Aktivoi kaspaasi-3 kautta kaspaasi-9

aktivointi sekä ulkoisten ja sisäisten kaspaasi reittejä on jo tiedetään olevan merkittävä mekanismeja apoptoottisten solujen kuolema useimmissa solukkojärjestelmissä. Jotta ymmärtää paremmin taustalla solureiteillä Konjugaattirokotteiden aiheuttama kuolema Eturauhassyövän soluja, mahdollista roolia kaspaasi tässä prosessissa tutkittiin mittaamalla toimintojen kaspaasin 8, -9, ja -3 näissä kasvainsoluissa. Kun taas kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 ovat välttämättömiä proteaaseja ulkoisten ja sisäisten apoptoottisten reittien vastaavasti, kaspaasi-3 toimii alavirtaan efektoreina näiden molempien reittien. Hoito PC-3-solujen kanssa kasvavina annoksina (10, 20 ja 40 uM) konjugaatin ja RESV 24 tuntia aiheutti annoksesta riippuvaisen augmentation kaspaasi-9 ja kaspaasi-3-entsyymin toimintaa. Tämä lisäys oli suhteellisesti korkeampi, jos konjugaattia käsiteltyjä soluja verrattuna soluihin, käsiteltiin samalla annoksella RESV (Fig. 2C). Kaspaasi-8, vaikka oli marginaalinen kasvu aktiivisuutensa suuren annoksen RESV hoitoa, ei tällaista induktio havaittiin tapauksessa konjugaatin hoidon (Fig. 2C). Päinvastoin, saatujen tulosten osalta LNCaP kasvoi merkittävästi kaikilla kolmella kaspaasi eli kaspaasin 8, -9 ja -3 on konjugaatti hoito osoittaa osallistumista sekä sisäsyntyinen (kautta kaspaasi-9) ja ulkoisen (kautta kaspaasi-8) reittejä apoptoottisen prosessin konjugoidulla tässä solulinjassa (Fig. 2D, vasen paneeli). Lisäksi tuloksemme osoittivat, että kaspaasi-9 tapahtuu ennen kuin kaspaasi-8 (pienempinä annoksina), mikä viittaa siihen, että mitokondrion reitti saattaa olla välttämätöntä konjugaatti: n indusoiman apoptoosin. Toisaalta, RESV hoito osoitti myös merkittävä kasvu kaspaasi -9 ja -3 toimintaa, mutta vähemmässä määrin verrattuna konjugaatin (Fig. 2D, oikea paneeli) (

p

0,05). Näin ollen edellä esitettyjen tietojen selvästi, että konjugaatti indusoi apoptoosia PC-3-solujen välittämää sisäisellä reitillä, kun taas sekä ulkoisen ja sisäisen väyliä edistää apoptoosia LNCaP-soluissa. Lisäksi konjugaatin havaittiin olevan tehokkaampi kuin RESV apoptoosin sekä PCa testatuissa solulinjoissa.

Lisäksi valaista polku, joka oli vallitseva konjugaatti: n indusoiman apoptoosin, farmakologiset inhibiittorit erityisiä kaspaasien käytettiin koetin jos he voisivat suojata soluja apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. 2E ja 2F, Z-VAD-FMK, yleisen kaspaasi-inhibiittori, osoitti merkittävää inhibitiota solukuoleman sekä PC-3 ja LNCaP-soluissa viittaa siihen, että apoptoosi on hallitseva muoto indusoimaa solukuolemaa konjugaatin. Siinä tapauksessa, että PC-3-solut, Z-LEHD-FMK, spesifinen inhibiittori kaspaasi-9 inhiboi myös konjugaatti indusoi solukuoleman 73%, kun taas Z-IETD-FMK, spesifinen inhibiittori kaspaasi-8, oli täysin tehoton estämään konjugaatti solukuolema (

p

0,05) (kuvio. 2E). Lisäksi, siinä tapauksessa, että LNCaP-soluja, estäjä kaspaasi-9 esti lähes täysin konjugaatti indusoiman apoptoosin, kun taas estäjä kaspaasin 8 vain osittain inhiboitu (Kuva. 2F). Konjugaatti solukuolema oli kaikkein näkyvästi estetty, kun soluja esikäsiteltiin sekä kaspaasi-8 ja kaspaasi-9-inhibiittorit. Yhdessä nämä tiedot edelleen vahvistaa havainto, että konjugaatti indusoi apoptoosin liittyy kaspaasi -9 /-8 /-3 ja kaspaasi-9 /-3 reittejä LNCaP ja PC-3-soluissa.

Bcl-2: n ja Bax ovat mukana Apoptoosi Conjugate

Bcl-2 muodostaa heterodimeerisen kompleksin apoptoottisen Bax-proteiinin, jolloin neutraloivat sen apoptoottinen vaikutus. Siksi suhde Bax /Bcl2 pidetään usein ratkaiseva tekijä solukuoleman tai selviytymistä.