Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kun pyritään kiertämään vastustuskykyä rapamysiinin – mTOR-estäjä – etsimme uusille rapamysiini-alavirtaan-tavoitteita, jotka voivat olla keskeisiä toimijoita vaste syöpäsolujen hoitoa. Huomasimme, että rapamysiini, kello nM pitoisuuksina, lisääntynyt fosforylaatiota eukaryoottinen initiaatiofaktoria (EIR) 2α in rapamysiini-herkkä ja estrogeeniriippuvainen MCF-7-soluissa, mutta oli vain vähäinen vaikutus eIF2α fosforylaatiota rapamysiiniklusterissa erottelua triple-negatiivinen MDA -MB-231-soluja. Lisäämällä salubrinal – estäjä eIF2α defosforylaatiota – vähentynyt ilmentyminen pinnan merkkiainetta, joka liitetään kyky huolehtia itsestään uusimista, lisääntynyt vanhenemista ja indusoitiin klonogeenisten solujen kuolemaan, mikä viittaa siihen, että liiallinen fosforylaatio eIF2α on haitallista solujen selviytymistä. Käsittelemällä soluja salubrinal parannettu säteilyn indusoimaa eIF2α fosforylaation ja klonogeenisten kuoleman ja osoitti, että säteilytetyt solut ovat herkempiä eIF2α fosforylaatiota kuin ei-säteilytetty niistä. Samanlainen salubrinal – phosphomimetic eIF2α muunnos – S51D – lisääntynyt herkkyys säteilylle, ja molemmat kumotaan säteilyn aiheuttama kasvu rintasyövän tyypin 1 alttius-geenin, mikä syytetään parannettu fosforylaatiota eIF2α modulaatioon DNA: n korjaukseen. Todellakin, salubrinal esti ei-homologisen end liittymällä sekä homologista rekombinaatiota korjaamiseen kaksinkertainen säikeen katkoksia, jotka synnyttivät I-Scel vihreänä fluoresoivaa proteiinia toimittaja plasmideja. Sen lisäksi, että sen vaikutus säteilyn, salubrinal parannettu eIF2α fosforylaation ja klonogeenisten kuoleman vasteena histonideasetylaasi-inhibiittori – vorinostat. Lopuksi katalyyttinen kilpaileva estäjä mTOR – Ku-0063794 – lisääntynyt fosforylaatioon eIF2α osoittavat edelleen osallistumisesta mTOR aktiivisuuden moduloinnissa eIF2α fosforylaatioon. Nämä kokeet viittaavat siihen, että liiallinen fosforylaatio eIF2α vähentää selviytymisen syöpäsolujen; tehden eIF2α arvoinen tavoite lääkekehitykseen, joilla on potentiaalia parantaa sytotoksista vaikutusta vakiintuneiden antineoplastisten hoitojen ja kiertää vastustuskyvyn rapalogues ja mahdollisesti estävien lääkkeiden kanssa ylävirtaan komponentit mTOR kautta.

Citation: Tuval-Kochen L, Paglin S, Keshet G, Lerenthal Y, Nakar C, Golani T, et ai. (2013) Eukaryotic aloittaminen Factor 2α – alavirtavaikuttajainhibiittorit nisäkäsvirologian rapamysiinin kohde – Moduloi DNA korjaus ja Syöpä hoitovastetta. PLoS ONE 8 (10): e77260. doi: 10,1371 /journal.pone.0077260

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 30 elokuu 2013; Julkaistu: 25 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Tuval-Kochen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat antelias lahjoitus jäämistöstä Miss HARAN esterin siunattu muisti kautta Keren Izvonot, Israel, terveysministeriön (SP) ja Medical Research Infrastructure Development Fund – Sheba Medical Center (YL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

fosfatidyyli 3-kinaasi – proteiinikinaasi B – nisäkkään rapamysiinin kohde (PI3K-Akt-mTOR) reitin säätelee solujen kasvua ja lisääntymistä. Vapautuminen koulutusjakson taustalla onkogeeninen muunnokset ja sen modulaatiota antineoplastisia hoitoja vaikuttaa niiden tuloksiin. MTOR: n estäjiä – rapamysiini, ja sen johdannaiset – vähentää syöpäsolujen lisääntymistä ja on testattu syöpälääkkeet kliinisissä kokeissa [1-3]. Rapamysiinin on käytetty päällystykseen stenttien estää angiografian-restenoosia [4], ja on voittanut FDA immunosuppressanttina. Sen johdannaiset – temsirolimous ja everolimous on hyväksytty hoitoon erityyppisten syöpien [5,6].

Rapalogues sitoutuvat niiden solunsisäisen reseptorin FK506 sitovan proteiinin 12 (FKBP12), muodostamalla kompleksi, joka inhiboi mTOR-kompleksi 1 (mTORC1) sitomalla mTOR: n FKBP12 rapamysiini-sitova alue [7]. Lisäksi pitkittynyt inkubointi rapalogues voi estää muodostumista mTOR kompleksin 2 (mTORC2) [8]. Kuitenkin vaikutus rapalogues on mTORC1 ja mTORC2 on solutyyppispesifisiä ja voi riippua suhteellinen runsaus molekyylien osallistuvat meikki mTORC n makromolekyylikompleksien [8,9]. Näin ollen estävän tuloksen rapalogues kasvaimen kasvu ei ole universaali [7].

Siksi rapamysiini-herkkien syöpäsolujen, rajaamista rapamysiini loppupään efektoreja jotka säätelevät kasvaimen kasvua ja vastaus antineoplastisia hoito johtaa todennäköisesti ja löytäneet uusia yhdisteitä, jotka inhiboivat kasvaimen kasvua ja /tai parantaa sen herkkyyttä vakiintuneiden hoitojen. Tällaiset molekyylit odotetaan kiertää vastus syöpäsolujen lääkkeitä, jotka kohdistuvat ylävirtaan komponentit PI3K-Akt-mTOR-reitin, kun ottaa vain osittainen vaikutus maailmanlaajuisen toimintaa.

Tässä tutkimuksessa me raportoimme, että mTOR johtaa lisääntyneeseen fosforylaation eIF2α – alayksikköä eIF2. Tähän mennessä on erottuvan raportit on julkaistu ottamiseksi mukaan mTOR vuonna eIF2α fosforylaatioon [10-16]. Käsiteltävänä oleva tutkimus osoittaa, että estrogeeni-riippuvaisten rapamysiini herkkä rintasyövän MCF-7-soluissa sekä triple negatiivinen rapamysiini-herkkä MDA-MB-231-solujen, mTOR rapamysiinillä ja erityisillä katalyyttinen estäjä (Ku-0063794 ) vastaavasti, johtaa lisääntyneeseen fosforylaation eIF2α. Kun sidottu GTP, eIF2 lähtevillä Met · tRNA

MET ribosomin joka sitten skannaa rajattu mRNA. Sen jälkeen tunnustetaan aloituskodonin ja GTP hydrolyysin, inaktiivinen eIF2 · BKT vapautetaan ja kierrätetään aktiiviseen eIF2 · GTP monimutkainen kautta vuorovaikutus guaniininukleotidiä vaihto tekijä eIF2b [17]. Normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa, eIF2α helpottaa vuorovaikutusta eIF2 kanssa eIF2b [18]. Kuitenkin fosforylaatio eIF2α sen Pa

51 kääntyy eIF2 peräisin olevan alustan eIF2b osaksi kilpaileva estäjä, mikä vähentää tason eIF2 · GTP · Met · tRNA

MET monimutkainen ja vaimennus maailmanlaajuisen proteiinin käännös. Tärkeää on, koska solutasolla on eIF2 on yli eIF2b, hieman lisääntynyt eIF2α fosforylaation voi sitoa merkittävä osa eIF2b [17]. Nisäkässoluissa eIF2α fosforyloituu neljä eri kinaasien, jotka reagoivat eri tavalla erilaisiin stressin signaalit [17], ja sen defosforylaatio suoritetaan katalyyttinen alayksikkö fosfo-proteiinifosfataasi 1 (PP1c) monimutkaisissa erityisten säätelyalayksiköt esim konstitutiivinen repressori eIF2α fosforylaation (Crep) tai stressin aiheuttama kasvun pysähtymisen ja DNA-vaurioita indusoituvan proteiinin (GADD34) [19]. Salubrinal – estäjä eIF2α defosforylaatiosta – häiritsee yhdistys PP1c ja sen säätelyalayksiköt, mikä johtaa lisääntyneeseen eIF2α fosforylaatioon. Sen soveltaminen eri solujärjestelmissä in vitro on käytetty valaista fysiologinen merkitys kasvanut eIF2α fosforylaation solun eloonjäämisen [20,21].

molekyyli- tulokset ja fysiologinen merkitys kasvanut eIF2α fosforylaation on tutkittu laajasti aikana solulimakalvostoon (ER) ylikuormitus, jossa se on yleisesti ajatellaan aiheuttavan suojaava rooli. Vastauksena lisääntynyt ER kuorma PKR kaltainen ER-lokalisoitu eIF2α kinaasi (PERK) aktivoituu ja ohimenevää eIF2α fosforylaation ensues [22]. Tämä johtaa maailmanlaajuiseen vaimennus proteiini käännös, joka voi mennä käsi kädessä lisääntynyt käännöksen erityisten mRNA: iden, jotka omistavat joko sisäinen-ribosomin-entry-site elementin [23] tai lyhyt avointa lukukehystä heidän 5 ”johtaja [17]. Maailmanlaajuinen vaimennus proteiinin translaation heikkenee ER kuormaa, kun taas erityisiä proteiineja, joiden kääntäminen on lisääntynyt aktivoida geenien transkriptiota moduloivien soluvastetta stressiin. Lievittämiseen eIF2α fosforylaation tarvitaan jotta käännös uuden transcriptome [24]

Altistuminen hiiren alkion fibroblasteissa (MEF) ja syöpälääkkeet – kuten doksorubisiini tai histonideasetylaasi-inhibiittorit – myös johtanut lisääntyneeseen fosforylaatioon eIF2α, vaikkakin jatkuvia sijaan ohimenevä yksi [25,26]. Näissä tutkimuksissa muutettu MEF kuljettavat ei-fosforyloitavissa eIF2α A /A mutaatiot osoitti suurempi herkkyys huumeita kuin S /S villityypin kollegansa johtaa päätelmään, että lääkkeen aiheuttama lisäys eIF2α fosforylaation on suojaava solukuolemaa. Vaikka tiukasti säädeltyä fosforylaatiota eIF2α voi olla suojaava, liiallinen ja jatkuva eIF2α fosforylaation voi olla yhtä haitallista kuin sen koko kumoamista. Itse asiassa on havaittu, että vaikka tiukasti säänneltyä fosforylaatiota eIF2α tarvitaan asianmukaista alkion kehityksen puute fosforyloidun eIF2α signalointi, koska homotsygoottisiksi eIF2α A /A sekä liiallinen fosforylaation johtuvat poistogeenisyys Crep, mutaatio, joka johtaa inhibitioon eIF2α defosforylaation, liittyy sikiön anemia ja kasvun hidastuminen [22]. Myös mutaatio PERK ja eston eIF2α fosforylaation tulos beetasolujen kuolemaa ja Wolcott-Rallison oireyhtymä, ja samalla liiallinen eIF2α fosforylaation TSC mutatoitunut soluissa altistuminen ER stressitekijästä estää ilmentymistä stressin aiheuttama transcriptome johtaa solukuolemaan [24] .

-tutkimuksiin liittyy jatkuva ja liiallinen eIF2α fosforylaation esto DNA korjaukseen, kehittämiseen vanhenemista ja väheni ilmaus pintamerkkiaine liittyy kyky huolehtia itsestään uusimista, mikä tarjoaa perustelut yhdessä lisääntynyt herkkyys anti- neoplastiset hoitojen, kuten ionisoivan säteilyn ja histonideasetylaasi estäjät (HDACi). Tuloksemme viittaavat siihen, että kehitetään lääkkeitä, jotka lisäävät eIF2α fosforylaatiota voidaan tarjota lisää tapana edistää herkkyyttä perustettu antineoplastisia hoitoja ja /tai kiertämisen vastustuskyky lääkkeille, jotka kohdistuvat ylävirtaan osat PI3K-Akt-mTOR-reitin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

MCF-7 ja MDA-MB-231 rintasyövän solulinjat, American Type Culture Collection (Manassas, VA), maljattiin tiheydellä 4 · 10

3 per cm

2 ja ylläpidetään edellä kuvatulla [27]. Solut säteilytetty 48 tunnin kuluttua pinnoitus on Cs

137 säteilyttäjällä (Gammacell 1000 Elite /3000 Elan) annoksena nopeudella 475 cGy /minuutti tai röntgen- säteilyttäjällä (Polaris sc-500 series II) annoksena nopeudella 100 cGy /minuutti. Rapamysiini, Vorinostat (LC laboratoriot, Boston, MA), Ku-0063794 (Selleck, Houston, TX) ja salubrinal (Calbiochem-Merck4Biosciences, Saksa) lisättiin viljelmiin kantaliuoksesta dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Kontrolliviljelmille yhtä suuret määrät ajoneuvon. DMSO pitoisuus alustassa ei ylittänyt 0,08%. Lääkkeet lisättiin viljelmään heti säteilyä.

Colony -eloonjäämiskoe

Plating pesäkkeiden -eloonjäämiskoe, pesäkkeiden laskenta, ja laskeminen elossa jakeiden suoritettiin kolmena rinnakkaisena, kuten on kuvattu aiemmin [28]. Ellei toisin mainita, pesäkkeet värjäsimme ja laskettiin 8-10 päivää seuraavien pinnoitus, kun 90-95% pesäkkeistä hallita hallussaan yli 50 solua. Teoreettinen additiivisen vaikutuksen, yhdistettyjen antineoplastisten hoitojen, solujen-eloonjäämiseen laskettiin seuraavalla kaavalla: 100 x SFA x SFB (SFA = eloonjääntifraktio käsiteltyjen solujen aineen ”a”; SFB = eloonjääntifraktio käsiteltyjen solujen agentti ”b”). Kokeellisesti määritetty eloonjääntifraktio, joka on pienempi kuin laskettu yksi osoittaa, että nämä kaksi ainetta on parannettu pikemminkin kuin additiivinen inhiboiva vaikutus solujen eloonjäämistä. Oletuksena Tämän yhtälön on, että agentit toimivat toisistaan ​​riippumatta saman väestöstä. Solufraktiosta prosentteina joka ei selviydy hoitoa (IF)% on yhtä kuin: [1-eloonjääntifraktio] x100 ja teoreettinen additiivinen estävää vaikutusta aineiden a ja b koosta tappoi solujen murto prosentteina – (IFAB)% on yhtä suuri kuin [29]: 100 x [1- (1-Ia /100) x (1-Ib /100)] = 100 x (1-SFA x SFB).

Western blotting -analyysi

valmistaminen solulysaateista ja analyysi hoidon aiheuttamat muutokset proteiinin tason ja fosforylaatio suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27] pienin muutoksin. Proteiinipitoisuus määritettiin kanssa bikinkoniini- happoreagenssia (Bio-Rad, Hercules, CA), ja yhtä suuri lastaus varmennettiin mittaamalla absorbanssi 520 nm Ponceau S (Sigma, St-Louis, MO) uutetaan PBS yksittäisistä suikaleita twin aikavälillä. Blotteja altistettiin röntgen- elokuvien kemiluminesenssin hoidon jälkeen West Pico ECL reagenssi (Thermo Scientific Rockford, IL). Arvot integroitu valon tiheyden autoradiogrammeista saatiin Image J NIH ohjelmistojen ja käytettiin määritykseen hoidon aiheuttamiin muutoksiin proteiinin tasoilla ja suhde fosforyloidun eIF2α (p-eIF2α) kokonais- tasolle proteiinin. Kanit vasta-aineita, jotka tunnistavat joko p-eIF2α tai molemmat fosforyloidun ja ei-fosforyloitu eIF2α olivat Cell Signaling Technologies (Boston, MA), ja vasta-aineita BRCA1 (klooni D9) ja CD2 olivat Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX)

karakterisointi epiteelin antigeenin (ESA) ilmentyminen FACS-analyysillä

Ohjaus ja salubrinal käsiteltiin solut irrotettiin ei-entsymaattista soluhajotusprosessin ratkaisu (Sigma, Israel), inkuboitiin ihmisen seerumin ja FcR estoreagenssia ja sitten loisteputki isotiosyanaatin (FITC) -anti-ESA tai isotyyppikontrollilla (Miltenyi Biotec, Saksa). 7-aminoactinomycin D (7AAD, eBiosciences, San Diego, CA) toimivat elinkelpoisuus väriainetta. Detection solujen värjäytymisen suoritettiin FACSCalibur käyttämällä Quest ohjelmistoa (BD Biosciences, San Jose, CA) kuvaamalla tavalla Keshet et al. värjäykseen pinnan MDR1 [30].

Värjäys happamat β-Galacotosidase

Solun -värjäyspakkausta Cell Signaling Technologies käytettiin solujen värjäytymisen ja mikrovalokuvia värjätään solut saatiin Nikonin TS100 Eclipse käänteismikroskooppi ja Nikon DS kamera.

Analyysit DNA korjaukseen

Ei-homologiset end liittymällä (NHEJ) korjaus määritettiin HeLa-soluissa ja homologinen rekombinaatio korjaus (HRR) määritettiin vuonna U2OS pysyvästi transfektoitujen solujen pEJSSA ja PDR-GFP vastaavasti [31,32]. HeLa [33,34] soluja lahja Dr. Dahm-Daphi, University of Hamburg ja U2OS olivat lahja tri Scully, Harvard Medical School [32,34]. Määritys suoritettiin pohjimmiltaan, kuten on kuvattu Moyal et al. ja Seluanov et ai. [34,35], paitsi että solut käsiteltiin 4,5 uM salubrinal 6 tuntia ennen transfektiota kanssa ilmentävien plasmidien I-Scel (tai tyhjä vektori kontrolleissa). Mittaus NHEJ, solut ko-transfektoitiin I-Scel ilmentävällä vektorilla ja pDsRed2-N1 suhteessa 10: 1. Transfektio suoritettiin LT1 DNA-transfektio-reagenssia (Mirus Bio LLC.) Valmistajan ohjeiden mukaisesti. Rinnakkainen, villityypin GFP ja DsRed ilmentävien solujen sekä negatiivisina kontrolleina käytettiin FACS kalibrointiin (säätämällä jännitettä ja väri korvaus). NHEJ aktiivisuutta seurattiin ilmoitetun ajanjakson transfektion kanssa I-Scel seuraamalla GFP ekspression DsRed ilmentävissä soluissa. Detection suoritettiin FACSCalibur 50.000 tapahtumaa näytettä kohti. Määrittämiseksi HR toiminnan osa I-Scel riippuvainen GFP ekspressoivien solujen jaettiin transfektion tehokkuutta näissä soluissa, kuten on kuvattu Moyal et al. [34]. Kokeellisissa olosuhteissamme, vaikutus salubrinal keskimäärin fluoresenssin intensiteetti GFP ilmentävät solut oli aina vähemmän kuin 10%, mikä osoittaa, että huomattava vaikutus salubrinal DNA korjaukseen ei ole seurausta inhibition käännös. Lisäksi, kuten on esitetty taulukossa S1 File S1, salubrinal ei muuttanut solusyklin jakautumista U2OS solujen osoittaa, että inhiboiva vaikutus salubrinal on HRR toimintaa transfektion jälkeen I-Scel johtuu suorasta inhibition korjaus eikä vaikutusta osa solujen S-vaiheessa.

Solujen transfektio plasmideilla koodaavat eIF2α varianttien

heIF2α S51A ja heIF2α S51D in pcDNA3.CD2 [36,37] oli lahja Dr. Ron laboratoriossa New York, NY. Ohimenevä transfektio suoritettiin JetPei (Polyplus, New York, NY) valmistajan ohjeita. Kun transfektio suoritettiin 10 cm viljelyastioihin – 10 ug plasmidia inkuboitiin 6 ml: aan kasvualustaa ilman antibiootteja 24 tuntia ennen kuin lisättiin 4 ml väliainetta ja jatkamasta koesuunnitelmalla. Kun transfektio suoritettiin 6 hyvin ruokia, havaitut määrät plasmideja inkuboitiin 2 ml: aan kasvualustaa ilman antibiootteja 24 tuntia ennen kuin lisättiin 0,5 ml väliainetta ja jatkamasta koesuunnitelmalla. Expression of toimittaja proteiinia seurattiin Western blot anti-CD2.

Tilastollinen

Parittomia Student

t

testiä tai yksi näyte

t

testin jälkeen logaritminen muutos käytettiin tilastolliseen analyysiin.

p

0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

Aiemmin on osoitettu, että estrogeenin riippuvaisten MCF-7-rinta- syöpäsolut ovat erittäin herkkiä rapamysiini (IC

50 – ~ 10 nM) . Sen sijaan kolminkertainen negatiivinen MDA-MB-231 on herkkä lääkkeen (IC

50 -5900 nM) [38] johtuen suhteellisen korkeasta fosfatidiinihapon joka kilpailee rapalogues sitoutumisesta FRB domain [9] . Tuloksemme osoittavat myös, että kun MCF-7-soluissa rapamysiini indusoi klonogeeniset kuoleman IC

50 ~ 50 nM, että MDA-MB-231-solujen pitoisuuteen saakka 2 uM ei vaikuttanut solujen eloonjäämistä (taulukko S2 File S1).

eIF2α on alavirtaan rapamysiinin kohde ja säteilytyksen

nM rapamysiini lisäsi fosforylaation eIF2α joka oli paljon selvempi MCF-7 kuin MDA-MB-231 (kuvio 1 ab). Ionisoivan säteilyn, toisaalta, lisääntynyt eIF2α fosforylaatio sekä MCF-7 ja MDA-MB-231 (kuvio 2 a-c) soluja. MDA-MB-231-solujen määrä nousi tasolle p-eIF2α sekä lisääntynyt suhde p-eIF2α jotta eIF2α säilyi läpi 48 tunnin kuluttua säteilytyksen. Joissakin kokeissa lasku kokonaistaso eIF2α säteilytettyyn soluissa todettiin, mutta tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. MCF-7-solujen taso p-eIF2α samoin kuin koko tason eIF2α väheni suuresti 48 tuntia säteilytyksen jälkeen, mutta koholla suhde p-eIF2α jotta eIF2α saavutetaan 24 tunnin kuluttua säteilytyksen säilyi.

a. Soluja inkuboitiin 24 tuntia 50 nM rapamysiinin, talteen ja käsitellään määrittämiseksi muutosten eIF2α fosforylaatioon b. Keskiarvo ± SEM kertainen muutos verrattuna valvonta eIF2α (e), p-eIF2α (p) ja suhde p-eIF2α /eIF2α (p /e) rapamysiini käsitellyissä soluissa. Analyysi edustaa 6 erillistä määritystä MCF-7-soluissa ja 3 MDA-MB-231-soluja. * Tarkoittaa merkittävä muutos verrattuna ohjaus –

p

0.05.

a. MCF-7 ja b. MDA-MB-231-soluja säteilytetään merkitty säteilyannos ja käsiteltiin analyysiä eIF2α fosforylaation on huomattava ajan säteilytyksen jälkeen. c. Keskiarvo ± SEM kertainen muutos verrattuna valvonta eIF2alpha (e), p-eIF2α (p) ja suhde p-eIF2α /eIF2α (p /e) säteilytettyä MCF-7 ja MDA-MB-231-soluja. Analyysi MCF-7 24 tunnin kuluttua säteilytys 1,5 ja 9,5 Gy edustaa 2 ja 3 erillisen määrityksen vastaavasti ja 48 tuntia 3 erillisen määrityksen kunkin annoksen. Analyysi MDA-MB-231-solut 24 tuntia edustaa 3 määritystä varten kunkin annoksen ja 48 tuntia 5 määritys 1,5 Gy ja 6 9,5 Gy. * Tarkoittaa merkittävä muutos verrattuna ohjaus –

p

0,05.

Lisääntynyt fosforylaation eIF2α on haitallista solun eloonjääntiin

määrittämiseksi merkitys kasvanut eIF2α fosforylaation solujen selviytymiseen käsittelimme MDA-MB-231-solujen salubrinal – estäjän of eIF2α defosforylaatiota. Salubrinal johti annoksesta riippuva lisäys eIF2α fosforylaation, joka on liittynyt lisääntynyt klonogeenisten syöttämällä (kuvio 3 a, b, taulukko 1). Yhdistäminen hoito salubrinal – pitoisuutena, joka ei vaikuta solujen eloonjäämistä (4,5 uM) – ja säteily lisännyt fosforylaatioon eIF2α joka liittyi parannettu klonogeeniset kuolemaan (kuva 3 c, d, taulukko 2, Taulukko S3 File S1) . Mielenkiintoista on, että solut, jotka saivat yhdistettyä hoitoa 4,5 uM salubrinal ja 1,5 Gy, fosforylaatio eIF2α oli samanlainen kuin se, joka saatiin soluissa, joita käsiteltiin salubrinal yksin, mikä viittaa siihen, että säteilytetyt solut ovat alttiimpia kasvoi eIF2α fosforylaatiota kuin ei-säteilytetty soluissa. Parannettu herkkyys säteilylle havaittiin myös salubrinal käsitelty MCF-7-solut (taulukko S4 File S1).

a. Solut prosessoitiin analyysiä eIF2α fosforylaation 48 tunnin kuluttua lisäämällä salubrinal (Sal). b. Keskiarvo ± SEM kertainen muutos verrattuna valvonta eIF2α (e), p-eIF2α (p) ja suhde p-eIF2α /eIF2α (p /e) salubrinal (Sal) käsiteltyjen solujen. Koe toistettiin 3 kertaa 4,5 uM ja kahdesti 16 uM. * Tarkoittaa merkittävä muutos suhteessa kontrolliin – P 0,05.

c. Soluja säteilytettiin huomattava säteilyannos ennen kuin lisättiin 4,5 uM Salubrinal (Sal). d. Tarkoittaa kertainen muutos verrattuna valvonta eIF2α (e), p-eIF2α (p) ja suhde p eIF2α /eIF2α (p /e) kantavassa koe toistettiin kerran samanlaiset tulokset (arvot e, p, ja p /e molemmista kokeista on esitetty taulukossa S3 File S1).

Salubrinal (uM) B-IF (%)

00 ± 0.64.50 ± 5938 ± 216.5100Table 1. Salubrinal indusoi annoksesta riippuvaisen klonogeenisten kuoleman.

MDA-MB-231-soluja kullattu ja käsitellään klonogeeniset määritystä. Numerot ovat IF (%) ± SEM kolmesta näytteestä. Vaikutus salubrinal solukuolemaan klo 9 ja 16,5 uM oli merkittävä (

p

0,05). CSV Lataa CSV Gy

-Sal IF (%) B + Sal IF (%) B Laskelmassa Lisäaine

00 ± 10 ± 313 ± 0,38 ± 2.631.517 ± 0,630 ± 1.6172.548 ± 166 ± 2.648Table 2. Salubrinal parantaa klonogeenisten solukuoleman säteilytettyjä soluja.

MDA-MB-231-soluja maljattiin klonogeenisten -eloonjäämiskoe. Salubrinal (Sal) (4,5 uM) lisättiin soluille välittömästi säteilytyksen jälkeen. Numerot ovat välineet IF (%) ± SEM kolmesta näytteestä edustavasta kokeesta, joka toistettiin kahdesti samanlaisin tuloksin. Teoreettinen additiivinen vaikutus salubrinal ja säteilyn koosta tappoi solujen murto esitetään osiossa ”laskettu lisäaine”. Vaikutus salubrinal lisäämiseen klonogeeniset kuolemaan 1,5 Gy ja 2,5 Gy säteily ryhmissä oli merkitsevä (

p

0,05). CSV Lataa CSV

Samanlainen vaikutus salubrinal, lyhytaikaisella transfektiolla kanssa phosphomimetic eIF2α S51D variantin vähentynyt – plasmidiin-annoksesta riippuvalla tavalla – klonogeenisten selviytymisen suhteen on havaittu soluissa, jotka oli transfektoitu ei-fosforyloitavissa S51A variantti. Suurilla plasmidi pitoisuuksina (kuvio 4 a) selviytymisen ilmentävien solujen phosphomimetic variantti oli pienempi kuin solut, jotka ilmentävät ei-fosforyloitavissa variantti. Kuitenkin alemmissa plasmidi pitoisuus eIF2α S51D ei vaikuta selviytymisen suhteen eIF2α S51A (kuvio 4 b), mutta lisäsi klonogeenisten kuoleman säteilytettyjä soluja (kuvio 4 c, taulukko 3). Kokeellisissa olosuhteissamme säteilyn aiheuttamista fosforylaation lisääntymiseen endogeenisen eIF2α oli samanlainen eIF2α S51A ja eIF2α S51D ilmentävien solujen (kuvio S1), mikä osoittaa, että samanlainen salubrinal haitalliset aiheuttamaa ilmentymisen eIF2α S51D tulokset lisääntynyt solujen määrä esti eIF2α eli eIF2α S51D ja fosforyloidun endogeenisen proteiinin.

a. Solut transfektoidaan 2 ug /2 ml eIF2α S51A (SA) tai eIF2α S51D (SD) käsiteltiin analyysiä varten 17 päivää post-pinnoitus. Tässä pitoisuudessa SD laski klonogeeniset selviytymistä. b, c. Solut transfektoidaan 1.5μg /2 ml SA tai SD. Solut b ei ollut säteilytetty taas solujen c säteilytettiin 1,5 Gy 24 tuntia transfektion jälkeen. Solut b ja c käsiteltiin analyysiä varten 10 päivää säteilytyksen jälkeisiin. Tässä pitoisuudessa SD sinänsä ei vaikuttanut klonogeeniset selviytymisen mutta ei lisätä herkkyyttä säteilylle. Koe toistettiin kerran samanlaisin tuloksin.

SA IF (%) B SA + 1,5 Gy IF (%) B SD IF (%) B SD + 1,5 Gy IF (%) B 0 ± 348 ± 0,50 ± 462 ± 1.5Table 3. phosphomimetic eIF2α variantti kasvaa klonogeenisten kuoleman säteilytettyjä soluja.

solut transfektoitiin 1.5μg /2 ml eIF2α S51A tai eIF2α S51D. Säteilytys 1,5 Gy tapahtui 24 tuntia myöhemmin. Pesäkkeet käsitelty analysoitavaksi 10 päivää säteilytyksen jälkeisiin. Numerot ovat keskiarvoja IF (%) välillä triplikaattinäytteet ± SEM. Koe toistettiin kerran samanlaisin tuloksin. Erot ohjaus ja säteilytettyjen ryhmille sekä kahden ryhmän välillä säteilytettyjen variantteja olivat merkittäviä

p

0,05. SA – ei-fosforyloitavissa eIF2α, S51A, SD – phosphomimetic eIF2α S51D. CSV Lataa CSV

Salubrinal vaikuttaa ilmaus pinta ESA

On raportoitu, että tuumorigeenisia rintasyöpä kantasolut rikastettu väestöryhmästä ilmentävien solujen CD

44 + /CD

24 – /low /ESA

+ pinnallaan [39], ja että osa-populaatio ilmaisseen saman yhdistelmän solun pinnan markkereita on tunnistettu rintasyövän solulinjoissa (kuten MDA-MB-231), ja on osoitettu olevan suuri kapasiteetti itseuudistumiseen ja kasvaimen aloittamista [40]. Koska yli 90% MDA-MB-231-solut ovat CD

44 + /CD

24- /alhainen, lajittelu solun pinnalla ESA ilmentymistä näissä soluissa voidaan käyttää indikaattorina muutoksia koko solufraktion self uusiutumiskyky [40]. Kuten kuviosta 5, käsittelemällä soluja salubrinal vähentynyt ilmentyminen ESA solujen pinnalla, mikä viittaa siihen, että haitallisia vaikutuksia liiallisen eIF2α fosforylaation voivat vähentää niiden kyky huolehtia itsestään uusiminen.

Soluja inkuboitiin 24 uM salubrinal 96 tuntia ennen sadonkorjuuta, Cell värjäys FITC-anti-ESA tai isotyyppis- verrokit havaittiin FACSCalibur. Koe toistettiin kahdesti samanlaisin tuloksin. 7AAD – elinkelpoisuus väriaine, FITC – anti-ESA.

Salubrinal indusoi vanhenemista rintasyöpäsoluissa

Siirtomaat säteilytetyn ja salubrinal käsiteltyjä soluja sisältävät laajentunut ja senescent näköinen soluja. Laskimme näiden solujen muodostuneiden pesäkkeiden altistumisen jälkeen 1 Gy, 4,5 uM salubrinal yhdistelmän säteilyn ja salubrinal ja käsittelemättömiä kontrolleja. Mielenkiintoista, vaikka yhdistelmähoito 4,5 uM salubrinal ja 1 Gy ei johtanut tehostetun klonogeeniset kuoleman (taulukko 2) on johtanut joka parantaa ulkonäköä senescent etsii soluja (kuvio 6). Värjäys hapanta β-Galacotosidase osoitti, että nämä suuret solut ilmentävät entsyymin osoittaa, että todellakin salubrinal parantaa vanhenemista säteilytettyyn soluissa (kuvio 6).

Solut varten yhdyskunnan säilymiseen määrityksessä. Salubrinal (4,5 uM) tai ajoneuvon lisättiin välittömästi säteily 1 Gy. Hapan β-galaktosidaasin aktiivisuus näkyy sininen tahra. Numerot ovat keskimäärin senescent etsivät solua /pesäke ± SD kolmena kappaleena levyt ja erot yhdistetyn hoitojen ja jokainen yksin hoitoja sekä kunkin hoidon ja valvonta olivat tilastollisesti merkitseviä

p

0,05. Bar, 100 uM.

Lisääntynyt eIF2α fosforylaatio säätelee DNA: n korjaukseen

säteily johti tehostettuun BRCA1 on proteiini, joka osallistuu DNA: n korjaukseen seuraavissa säteilyvauriot [41]. Kasvu BRCA1 kumottiin salubrinal ja ohimenevä ilmentyminen phosphomimetic eIF2α S51D viittaa siihen, että liiallinen eIF2α fosforylaatio säätelee DNA-vaurion korjaamiseen (Kuvio 7). Itse asiassa kokeissa HeLa-solujen kanssa ja U2OS solut, jotka ilmentävät toimittaja plasmideja NHEJ ja HRR vastaavasti osoittivat, että salubrinal esti korjaus I-Scel-indusoidun DSB kautta molemmat mekanismit (kuvio 8).

Ylähavas: Ohjaus ja säteilytettyjä soluja (1,5 Gy) käsiteltiin 4,5 uM salubrinal tai ajoneuvoon. Solut kerättiin 48 tunnin kuluttua säteilytyksen ja käsiteltiin Western blot muutosten analysointi tason BRCA1.

Ala paneelit: solut transfektoitiin 10 ug /ml, S51A ja S51D eIF2α variantteja tai transfektioreagensseja yksinään (SHAM). Soluja säteilytettiin 9,5 Gy 24 tuntia transfektion ja käsitellään BRCA1 analyysiä 24 tuntia post säteilyä. CD2 ilmentyi transfektoiduissa soluissa osoittaa onnistuneen transfektion. Sal – 4,5 uM salubrinal.

a. Mittaus NHEJ aktiivisuuden suoritettiin 24 tuntia transfektion kanssa I-Scel. Koe toistettiin kerran samanlaisin tuloksin eli 4% korjaus toiminnan valvontaa ja 3% salubrinal käsiteltyihin soluihin. b. Mittaus HR aktiivisuuden suoritettiin 36 tuntia transfektion kanssa I-Scel. Koe toistettiin kerran samanlaisin tuloksin eli 2,35% toimintaa ohjaus ja 1,6% aktiivisuuden salubrinal käsiteltyjen solujen 24 tuntia transfektion kanssa I-Scel. Sal – 4,5 uM salubrinal.

Lisääntynyt ja jatkuva fosforylaatio vaikuttaa vasteen rintasyövän solujen Vorinostat

Samanlainen säteilyn HDACi – Vorinostat johtaa myös lisääntyneeseen eIF2α fosforylaatioon. Tämä kasvu on ajateltu keinona solujen suojausta [26]. Kuitenkin yhdistämällä pieninä pitoisuuksina salubrinal ja Vorinostat pitoisuuksina, jotka yksin tuskin vaikuttavat eIF2α fosforylaatiota, lisännyt fosforylaatioon eIF2α, joka jälleen kerran oli yhteydessä lisääntyneeseen klonogeeniset kuolema (Kuva 9, taulukko 4, taulukko S5 File S1).

a. Solut kerättiin 48 tuntia levityksen jälkeen ajoneuvon (D), 4,5 uM salubrinal (S), 0,75 uM Vorinostat (V) tai molemmat (V + S) ja käsiteltiin Western blot-analyysi eIF2α fosforylaation. b. Tarkoittaa kertainen muutos suhteessa kontrolliin on eIF2α (e), peIF2α (p) ja suhde peIF2α /eIF2α (p /e). b.