Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska pitkäaikainen altistuminen estrogeenin ja lisääntynyt telomeraasiaktiivisuuteen liittyvät kohdun limakalvon syövän synty, tavoitteenamme oli arvioida vuorovaikutusta MAPK-reitin ja estrogeenin induktio telomeraasiaktiivisuuden kohdun limakalvon syövän soluissa. Estradioli (E2) indusoi telomeraasiaktiivisuuden ja hTERT-mRNA: n ilmentymistä estrogeenireseptori (ER) -α positiivinen, Ishikawa kohdun limakalvon syöpä-solulinjasta. UO126, erittäin selektiivinen MEK1 /MEK2, inhiboitu telomeraasiaktiivisuutta ja hTERT mRNA ilmaisun aiheuttama E2. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös transfektion jälkeen ERK 1/2-erityisiä siRNA. Hoito E2 johti nopeaan fosforylaatioon p44 /42 MAPK ja lisääntynyt MAPK toimintaa, joka poisti UO126. HTERT promoottori sisältää kaksi estrogeenivasteen elementit (eres), ja Lusiferaasimäärityksiä osoittavat, että nämä eres jotka aktivoituvat E2. Altistuminen UO126 tai ERK 1/2-erityisiä siRNA yhdistettynä E2 torjua stimuloivan vaikutuksen E2 lusiferaasiaktiivisuuteen näistä eres. Nämä havainnot viittaavat siihen, että E2-induktio telomeraasiaktiivisuuden välittyy kautta MAPK-reitin ihmisen kohdun limakalvon syövän solut.

Citation: Zhou C, Steplowski TA, Dickens HK, Malloy KM, Gehrigin PA, Boggess JF, et al . (2013) Estrogeeni induktio telomeraasiaktiivisuuden kautta asetus mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) Dependent Pathway in Human Endometrial syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (2): e55730. doi: 10,1371 /journal.pone.0055730

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu 6 marraskuuta, 2012 Hyväksytty: 29 joulukuu 2012; Julkaistu: 07 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuki häntä anteliaasti V Foundation for Cancer Research ja Steelman Fund (Bae-hyppy VL ja Gehrig PA). Hanke kuvattu tukivat myös (1) Valittu numero KL2RR025746 (UNC Clinical Translational tiedepalkinto-K12 Scholars Program) National Center for Research Resources (Bae-hyppy VL) ja (2) Award Number 1K23CA143154-01A1 (NIH /NCI K23 ohjasivat potilaslähtöisiä Research Career Development Grant). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpä on kaikkein yleisin maligniteetti naisilla Yhdysvalloissa [1]. Endogeeniset ja eksogeeniset estrogeenin altistumisen ovat merkittäviä riskitekijöitä kehittämistä tyypin I endometriumin syövät; kuitenkin molekyylitason yhteydestä estrogeenin ja kohdun limakalvon syövän syntymistä edelleen huonosti. Meidän edellinen työ osoitti, että estrogeeni sääntely telomeraasin saattavat olla rooli pahanlaatuinen muutos kohdun limakalvon [2].

Telomeres ovat erikoistuneita rakenteita distaalipäähän kromosomien ja toiminta kromosomissa suoja, paikannus, ja replikointi. Ikääntymisen, ihmisen telomeerit väistämättä tehdään asteittainen lyhentäminen normaaleissa somaattisten solujen läpi replikaation riippuvainen sekvenssin vahingon päistä DNA. Progressiivinen lyheneminen telomeres lopulta johtaa kromosomi epävakaus, joka johtaa solujen vanhenemista. Telomerase on ribonukleoproteiini- käänteistranskriptaasi että syntetisoi telomeerisesti DNA kromosomaaliseen päihin. Tämä entsyymi tunnistaa G-rikas lohkon olemassa olevan telomeerien toistosekvenssistä ja syntetisoi uusi kopio jakson uusinta puuttuessa komplementaarinen DNA-säie, jossa on segmentti sen sisäisen RNA komponentti toimii mallina [3], [4 ]. Näin ollen, telomeraasin koostuu RNA-templaatista (ihmisen telomeraasin RNA, hTR) ja katalyyttinen proteiini hTERT (human telomeraasin käänteistranskriptaasin, hTERT), joka on käänteistranskriptaasin aktiivisuutta [5] – [7]. Ilmaisu hTERT havaitaan korkeilla tasoilla telomeraasia-positiivisten syöpäsolujen mutta ei telomeraasia negatiivisissa soluissa, ja sitä pidetään nopeutta rajoittava tekijä telomeraasiaktiivisuuden [7], [8].

Yli 85% ihmisen kohdun limakalvon karsinoomien ilmaista telomeraasiaktiivisuutta [9] – [12], ja taso telomeraasiaktiivisuuden on korreloinut edenneet pitkälle sairaus ja lantion imusolmuke etäpesäke [12]. Ihmisen kohdun limakalvo on ainutlaatuisen dynaaminen kudoksen, joka koostuu epiteelin rauhaset ja sidekudos, joka läpikäy mutkikkaita leviämisen, eritystä, ja erittely koko lisääntymisikäisiin. Kuukautiskierron aikana, kohdun limakalvon epiteelisoluihin säätelevät sukupuolihormonit estrogeenin ja progesteronin, ja kohdun limakalvon carcionogenesis arvellaan liittyvän pitkäaikainen altistuminen estrogeeni, yksimielisesti mukaan progesteroni. Normaalissa endometriumin ilmentyminen telomeraasi korreloi solujen lisääntymisen, on tyypillisesti lokalisoitu epiteelisolujen rauhas soluissa, ja säädellään hormonaalisesti-odotuksiin, kuukautiskierron vaihe riippuvaisella tavalla [13], [14]. Lisääntynyt telomeraasiaktiivisuutta havaitaan proliferatiivinen vaiheessa kun estrogeenitaso on maksimaalinen seuraa lähellä poissa tasoilla eritysvaiheessa kun progesteronin tasot ovat korkeat [13]. Tällainen näyttö viittaa siihen, suhde sukuhormonipitoisuudet, modulaatio telomeraasiaktiivisuuden ja kehityksen endometriumin syöpä.

promoottorialueen hTERT on kloonattu ja karakterisoitu, ja se sisältää kahden mahdollisen estrogeenin vaste-elementit (eres), mikä suora sidos estrogeenin ja telomeraasin asetuksen [2], [15] – [18]. Olemme aikaisemmin havainneet, että telomeraasiaktiivisuus ja hTERT mRNA lisättiin vastauksena estrogeenin estrogeenireseptorin-α (ERa) riippuvainen muodin endometriumsyöpään solulinjoissa [2]. Lisäksi olemme osoittaneet, sitoutuminen kompleksoidun estrogeenin kanssa ERa on eres löytyy hTERT-promootterin, joka ilmaisee mahdollisen oleva mekanismi välillä telomerase induktion ja pahanlaatuisiin hormoniriippuvaisten kohdun limakalvon solut [2].

Mitogen- aktivoitu proteiini kinaasit (MAPK) ovat tärkeä perheen proteiinikinaasien mukana signaalien lähettämiseksi solukalvon tumaan. On hyvin tunnettua, että p44 /42 MAPK-signalointireitin aktivoidaan mitogeenisten ärsykkeiden välillä kasvutekijöiden ja sukupuolisteroidihormonit, kuten estrogeeni, progesteroni, ja epidermaalista kasvutekijää (EGF), ihmisen rinta-, munasarja- ja endometriumin syövän solut, muun muassa [ ,,,0],19] – [21]. Jotta saadaan käsitys molekyylitason mekanismeja, jotka ohjaavat sääntelyn telomeraasiaktiivisuuden estrogeenin, tutkimme suhdetta MAPK-reitin ja estrogeenin aiheuttama telomeraasiaktiivisuutta ihmisen kohdun limakalvon syövän solut.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

sääntely telomeraasi ilmentymisen tutkittiin ER-positiivisia (Ishikawa) ja ER-negatiivinen (HEC-1B) ihmisen kohdun limakalvon syöpä solulinjoja [22], [23]. Nämä solulinjat saatiin lahjana tri Bruce Lessey (Center for naisten Medicine, Greenville, SC). Kuten edellä on kuvattu, estrogeenin aiheuttama ERE kloramfenikoliasetyylitransferaasi (CAT) aktiivisuus määritettiin kussakin näistä solulinjoista vahvistaa toiminnallinen ER asema [24]. Ishikawa ja HEC-1B-soluja kasvatettiin MEM, jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, että läsnä 5% CO

2 37 ° C: ssa. Endometriumin syöpä solulinjoja viljeltiin fenolipunattomassa väliaineessa, jossa oli 0,5% hiili-dekstraani-FBS: ää ja 1 päivä ennen käsittelyä estrogeenin tai U0126.

Kemikaalit ja plasmidi

Kaikki hTERT toimittaja promoottori lusiferaasi plasmidit saatiin tohtori I. Horikawa (National Institute of Health, Bethesda, MD). 17-β estradioli (E2) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). UO126 hankittiin Calbiochem (La Jolla, CA). Anti-fosforyloitu p42 /44 ja anti-fosforyloimattomia p42 /44-vasta-aineita olivat Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-β-aktiini vasta-aine oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Tehostetun kemiluminesenssin Western blotting tunnistus reagenssit olivat yhtiöstä Amersham (Arlington Heights, IL). Kaikki muut kemikaalit olivat yhtiöltä Sigma (St. Louis, MO).

E2 ja U0126 hoito

Solut ympättiin 4 x 10

5 solua T25-viljelypulloon tai 1,5 x 10

5 solua per kuoppa 12-kuoppaisella levyllä, joka sisälsi joko 5 ml: n tai 1,2 ml: n säännöllisin väliaineen, vastaavasti. Median vaihdettiin sitten fenoli-punaista väliaineessa, jossa oli 0,5% FBS: aa, ja inkubointi 37 ° C: ssa yön yli. Välittömästi ennen käsittelyä, väliaine viljelymaljoilta imettiin, kolmasti pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja korvattiin tuoreella kasvualustalla. E2 liuotettiin etyylialkoholia tai U0126 liuotettuna DMSO: hon lisättiin tämän jälkeen kuhunkin kuoppaan. Samanaikaisesti sama määrä etyylialkoholia tai DMSO: ta, lisättiin kontrollikuoppiin.

telomeraasiaktiivisuuden määritys

Telomeraasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä PCR-pohjainen telomeerisesti toista vahvistusta protokolla (TRAP) (TRAP -eze telomeraasi detektioreagenssipakkaus, Oncor, Gaithersburg, MA). Lyhyesti, solupelletit hajotettiin, homogenisoitiin 105 ul: lla jääkylmää 1 × CHAPS, jäissä 30 min ajan, ja sentrifugoitiin 13000 g 21 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Saatu supernatantti siirrettiin sitten uuteen putkeen ja säilytetään -80 ° C: ssa. Näyte uute otettiin sitten ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-pakkausta (Bio-Rad, Hercules, CA). 0,25 ja 05 ug proteiinia, asetettiin 50-ul reaktioseosta, käytettiin TRAP määrityksessä. 30 min inkuboinnin jälkeen 30 ° C: ssa, 27 sykliä PCR-monistusta suoritettiin (30 min 94 ° C: ssa seurasi 30 min 59 ° C: ssa). PCR-tuotteet analysoitiin sitten elektroforeesilla 10% polyakryyli- ei-denaturoivissa geeleissä. Geelit analysoitiin ja mittaamaan PhosphorImaging järjestelmää Imagequant ohjelmisto (Molecular Dynamics sis., Sunnyvale, CA). Kukin koe suoritettiin kahdesti.

Reaaliaikainen RT-PCR hTERT: ille

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen RNAqueous kittiä (Ambion, Austin, TX) ja puhdistettiin edelleen käyttämällä DNA-sarjaa (Ambion, Austin, TX). Käänteinen transkriptio ja PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen TaqMan Gold yksivaiheinen RT-PCR kit ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Käänteistranskriptio suoritettiin 48 ° C: ssa 30 minuutin ajan. PCR-olosuhteet koostuivat 10 min vaiheessa 95 ° C: ssa ja 40 sykliä välillä 95 ° C 15 s ja 65 ° C 1 min. Taloudenhoito ohjaus geenin, hapan ribosomaalinen fosfoproteiini P0 (RPLP0, joka tunnetaan myös nimellä 36B4), käytettiin sisäisenä kontrollina korjaamaan eroja RNA: n määrä kussakin näytteessä [25]. Alukkeet ja fluorogeeniset koettimet hTERT: ille ja RPLP0 on kuvattu aikaisemmin [25]. Standardikäyrä hTERT synnytettiin käyttäen laimennoksia tunnetun määrän cRNA syntetisoitiin

in vitro

transkription kloonattu fragmentti. Normalisoitu taso hTERT kussakin näytteessä arvioitiin suhteessa hTERT tasolta RPLP0 tasolla, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena ja toistettiin kahdesti johdonmukaisuuden.

Western blot -analyysi

Ishikawa-soluja maljattiin tiheydellä 3 x 10

5 solua /kuoppa kuusikuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua elatusaine aspiroitiin ja korvattiin seerumia. 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin E2, UO126 tai molemmat yhdessä vähintään 15 minuuttia ja enintään 24 tunnin ajan. Levyt kaavittiin RIPA-puskuriin ja solujen lysaatit valmistettiin 2 x SDS-puskuriin. Solulysaatit erotettiin 12% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Membraani blokattiin 1 tunnin ajan TBS-T + 5% rasvatonta kuivamaitoa, ja inkuboitiin sitten phosphophorylated-p44 /42 MAPK: n monoklonaalinen vasta-aine (1:2000) tai pan-p44 /42 MAPK: n polyklonaalista vasta-ainetta (1:1000) yön yli 4 ° C: ssa (Cell Signaling, Beverly, MA). Membraani pestiin sitten TBS-T: n ja inkuboitiin toissijaisen peroksidaasiin konjugoitu vasta-aine 1 tunnin ajan. Vasta-aineen sitoutuminen havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiojärjestelmää (ECL). Band netto voimakkuudet kvantitoitiin käyttäen Millipore Digital Bioimaging System (Bedford, MA). Kukin koe suoritettiin kahdesti.

In vitro

-kinaasimääritys

aktiivisuus p44 /42-kinaasiaktiivisuutta mitattiin

in vitro

käyttämällä p44 /42 MAP kinaasianalyysiä kit (Cell Signaling, Danvers, MA). Lyhyesti, Ishikawa-soluja maljattiin tiheydellä 3 x 10

5 solua /kuoppa kuusikuoppaisille levyille. Seuraavat E2 ja UO126 hoito, levyt pestiin 4 kertaa jääkylmällä PBS: llä, ja 0,5 ml jääkylmää lyysipuskuria +1 mM PMSF lisättiin kuhunkin kuoppaan. Solut kaavittiin, sonikoitiin ja sentrifugoitiin 10000 g: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Saatu supernatantti inkuboitiin 15 ui suspendoitiin immobilisoidun fosfo-p44 /42 MAP-kinaasin (Thr202 /Tyr204) monoklonaalinen vasta-aine 12 tuntia 4 ° C: ssa. Immuuni kompleksi pestiin lyysipuskurilla 5 kertaa ja kerran kinaasipuskurilla ilman substraattia. Immunopresipitoidun MAPK inkuboitiin sitten 30 minuutin ajan 30 ° C: ssa kinaasipuskurissa, jossa on 2 ug Elk1 fuusioproteiinin ja 200 uM ATP: tä. Kinaasireaktio lopetettiin lisäämällä 25 ui 3 x SDS-puskurissa. ElK1 erotettiin SDS-PAGE-geeli, ja sen jälkeen inkuboitiin anti-fosfo-Elk1 (Ser 308) vasta-aine, 4 ° C: ssa yön yli. Elk1 havaittiin ECL, kuten on kuvattu Western blot -analyysiä. Kukin koe suoritettiin kahdesti.

lusiferaasianalyysissä

Ohimenevä transfektio lusiferaasireportteri plasmidien suoritettiin käyttäen TransFast Transfection Reagent (Promega, Madison, WI). Lyhyesti, 8 x 10

4 Ishikawa-soluja siirrostettiin 24-kuoppalevyille yön yli ja transfektoitiin promoottorilusiferaasivektorissa plasmideilla (0,5 ug /kuoppa). PRL-SV40: llä (2 ng /kuoppa), joka sisälsi Renilla reniformis lusiferaasin kotransfektoitiin kunkin transfektion sisäisenä kontrollina normalisoida transkriptionaalista aktiivisuutta hTERT-promootterin plasmidit. Lusiferaasimääritys suoritettiin sitten käyttäen Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) protokollien mukaisesti valmistajan toimittamien. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin plasmidi, ja kukin koe suoritettiin kahdesti.

ERK 1/2 siRNA määrityksessä

ERK 1/2 pieni häiritsevä RNA (siRNA) hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Mukaan valmistajan ohjeiden, Ishikawa-soluja maljattiin 6-kuoppaisille levyille tai 12-kuoppalevyille suositellaan solupitoisuuteen. 24 tunnin kuluttua, transfektiot suoritettiin noin 60%: n konfluenssiin käyttäen transfektioreagenssia (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Kunkin transfektion reaktio, 100 nM ERK 1/2 siRNA tai ohjata siRNA käytettiin valmistamiseksi siRNA-transfektiolla komplekseja huoneenlämpötilassa 15 minuutin ajan. Transfektiot suoritettiin 0,5 (12-kuoppaisella levyllä) tai 1,5 ml (6-kuoppaisella levyllä) seerumia 8 tuntia. Inkubaation jälkeen, transfektion kompleksit poistettiin ja korvattiin niitä vastaavat media. Jokaisessa kokeessa on käsittelemättömiä kontrolleja, jotka saavat transfektioreagenssin olivat mukana. Transfektiotehokkuuden (80% -90%), määritettiin fluoresenssin mikroskoopilla fluoreseiinileimattua epäspesifinen siRNA transfektoitujen solujen ja Western blotting -analyysi. Soluja käytetään Western blotting-analyysi, TRAP määritys, lucifersae toimintaa ja reaaliaikainen PCR klo 36-48 tuntia transfektion jälkeen.

Tulokset

Vaikutus E2 hTERT mRNA ja telomeraasiaktiivisuuteen Ishikawa solut

Ishikawa solulinja, E2 havaittiin lisäävän telomeraasiaktiivisuus annoksesta riippuvalla tavalla, kuten määritettiin TRAP määrityksellä (kuvio 1A). Lisääntynyt aktiivisuus oli riippuvainen sekä E2 pitoisuus ja valotusaika. Kun 0,1-10 uM E2 lisättiin, telomeraasiaktiivisuus ajan säännelty 12 h, mikä jatkui kunnes vähintään 72 tunnin hoidon jälkeen. Hoitoon soluja 1-10 uM E2 yli 48 tunnin aiheuttama maksimaalinen telomeraasiaktiivisuutta. Mitään vaikutusta E2 telomeraasiaktiivisuus havaittu ERa negatiivinen kohdun limakalvon syövän solulinja (HEC-1B), samoissa käsittelyolosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty).

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla E2 (0,1 -10 uM) 48 tunnin ajan tai käsiteltiin 1 uM E2 aikaa kurssin muoti (A). Telomeraasiaktiivisuus määritettiin TRAP määrityksessä. hTERT RNA ilmentyminen arvioitiin reaaliaikaisen RT-PCR (B). Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD kaksinkertaisten näytteiden ainakin kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. (ITAS = sisäinen telomeraasi määritys vakio, C = kontrolli).

Ymmärtääksemme oleva mekanismi induktion telomeraasiaktiivisuuden, me määrällisesti reaaliaikaisella RT-PCR-määrityksen taso hTERT mRNA ilmentymistä samoissa olosuhteissa. HTERT-geeni koodaa katalyyttistä alayksikköä telomeraasi ja on tavallisesti nopeutta rajoittava tekijä telomeraasin entsymaattinen aktiivisuus. E2 lisääntynyt hTERT mRNA: n ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla (1-10 uM). Tämä säätely ylöspäin aktiivisuuden havaittiin alle 6 tunnin kuluttua E2 hoidon, ja maksimaalinen induktio hTERT mRNA ilmaisun havaittiin 48 tuntia. E2 aiheuttama hTERT mRNA ilmaisun pysyivät koholla yli 72 h (kuvio 1 B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että asetus telomeraasiaktiivisuuden E2 voi esiintyä transkription tasolla endometriumin syöpäsoluja.

Vaikutus UO126 on telomeraasiaktiivisuuden ja hTERT mRNA ilmaisun Ishikawa soluissa

osoitteen rooli MAPK-reitin E2-indusoidun telomeraasiaktiivisuuden Ishikawa-soluissa, olemme alun perin arvioitiin kyky UO126, tietyn MEK1 ja MEK2 estäjä, suoraan inhiboivat telomeraasiaktiivisuuden. Vuonna Ishikawa-soluja, UO126 esti telomeraasiaktiivisuuden annoksesta riippuvalla tavalla (0,1-10 uM) kuten on osoitettu TRAP-määrityksellä (kuvio 2A ja 2B). Samanaikaisesti, UO126 vähentynyt hTERT mRNA: n ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla, kuten määritettiin kvantitatiivisesti reaaliaikaisen RT-PCR: llä (kuvio 2C). Nämä tulokset osoittavat, että UO126 on riittävä estämään telomeraasiaktiivisuus ja hTERT-mRNA: n transkription kohdun limakalvon syövän soluissa.

Ishikawa-soluja käsiteltiin UO126 vaihtelevilla pitoisuuksilla (0,1-10 uM) 24 tunnin ajan. Telomeraasiaktiivisuus arvioitiin TRAP määritystä (A ja B), hTERT-ekspressio arvioitiin reaaliaikaisen RT-PCR: llä (C). (C = kontrolli).

Vaikutus UO126 E2 aiheuttama telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT mRNA ilmaisun Ishikawa soluissa

tutkimiseksi vaikutuksen UO126 E2 aiheuttama telomeraasiaktiivisuutta ja hTERT mRNA: n ekspressio, soluja käsiteltiin 10 uM UO126, 1 uM E2, tai molempien yhdistelmänä (10 uM UO126 + 1 uM E2) 24 tunnin ajan, ja telomeraasiaktiivisuus ja hTERT-ilmentyminen määritettiin myöhemmin. Kuten kuviossa 3 on esitetty, E2 indusoi lisääntynyt telomeraasiaktiivisuus ja hTERT-mRNA: n ilmentyminen on noin 2-3 kertainen verrattuna valvontaa, ja nämä stimuloivia vaikutuksia lähes poistettiin läsnä UO126 (10 uM). Nämä tiedot viittaavat siihen, että funktio MEK inhibiittorin, UO126, ei tapahdu ainoastaan ​​tasolla telomeraasin itse entsyymin, vaan myös transkription tasolla hTERT-geenin.

Soluja käsiteltiin 10 uM UO126 ( U), 1 uM E2 tai molemmat yhdessä 24 tunnin ajan. (A) Telomeraasiaktiivisuus määritettiin TRAP määrityksessä. (B) Telomeraasiaktiivisuus edustettuna graafisen käyttämästä TPG (yhteensä tuotetusta tuotteesta), joka vastaa suhteellista telomeraasiaktiivisuutta. TPG lasketaan suhde TRAP tuotteen kaistan sisäisen telomerase määritys standardin bändi. (C) hTERT mRNA ilmentyminen määritettiin reaaliaikainen RT-PCR. (C = kontrolli).

Vaikutus UO126 E2 aiheuttama aktivointi p44 /42

Jotta vuorovaikutuksen arvioimiseksi E2 ja MAPK-reitin, käytimme fosforyloitua-erityinen p44 /42 MAPK-vasta tunnistaa E2 aiheuttama tyrosiinifosforylaatioon näiden kinaasien Ishikawa solulinjassa. Under seerumin puutteessa olosuhteissa, havaitsimme alhaisen perustason taso tyrosiinifosforyloitunut muotojen P44 /42. Hoidon jälkeen 1 uM E2, fosforylaatio p44 /42 oli nopeasti aiheuttama ja saavutti maksimaalisen induktio 30 minuutin käsittelyn jälkeen. Tason fosforylaation p44 /42 säilyivät koholla noin 60 min (kuvio 4A). Yhteenlaskettu P44 /42 MAPK proteiinin taso pysyi muuttumattomana koko näissä kokeissa, määritettynä käyttämällä ei-fosforyloidun vasta p44 /42 saman solukalvojen. Inkuboimalla 10 uM UO126 täysin tukossa E2 indusoiman fosforylaation p44 /42 (kuvio 4B ja 4C).

Soluja käsiteltiin 1 uM E2, 10 uM UO126 (U) tai molempia yhdistelmänä vähintään 15 min ja enintään 24 tunnin ajan. Fosforylaatio P42 /44 määritettiin Western blotting-analyysi. MAPK aktiivisuus määritettiin immunosaostuksella määrityksen Elk1. E2 indusoi fosforylaatio p42 /44 (A) ja MAPK aktiivisuuden aikaan mukaisesti (D). UO126 inhiboi fosforylaatiota p42 /44 ja MAPK indusoimaa E2 (B, C ja E). (C = kontrolli).

Sen varmistamiseksi, että lisääntynyt fosforylaatiota p44 /42 edustaa entsymaattinen aktiivisuus proteiinia, mittasimme p44 /42 kinaasiaktiivisuuden kautta immuunikompleksin -kinaasimäärityksessä jossa Elk1 tarjoillaan substraattina. Elk1 transkriptiotekijä on tunnettu alavirtaan tavoite p44 /42 ja pidetään merkkiaine MAPK toimintaa. Havaitsimme lisää mitattavasti aktiivisuus p44 /42 jälkeen E2 stimulaation, joiden maksimaalinen huippu 30 min. P44 /42 kinaasiaktiivisuutta oli verrannollinen fosforylaation P44 /42. UO126 myös pienensi p44 /42 kinaasiaktiivisuutta aiheuttama E2 (kuvio 4D ja 4E). Nämä tiedot vahvistavat suhdetta E2 signalointi ja MAPK väylän Ishikawa solulinjassa.

vaikutus E2 ja UO126 on hTERT-promootterin aktiivisuus

Koska meillä aikaisemmin tehty työ kohdun limakalvon syövän solulinjoissa [2], transkriptionaalisen aktiivisuuden hTERT-promootterin saattaa välittää ERa sitoutumalla eres sijaitsee tällä promoottori. Sääntely promoottorin sekvenssi hTERT-geenin sisältää kaksi otaksuttua eres 5 ’reunustavan sekvenssin: distaalinen yksi -2777 /-2755 ja proksimaalinen yksi -979 /-956 on päällekkäinen SP1 sitoutumiskohta [16], [ ,,,0],17]. Sen määrittämiseksi, onko UO126 on mukana säätelyssä hTERT-promootterin aktiivisuutta indusoi E2, suoritimme sarjan lyhytaikaisten transfektioiden lusiferaasireportteri- plasmidit, jotka sisältävät eripituisia 5’-promoottorialueen hTERT-geenin. Lyhyesti, Ishikawa solut transfektoitiin kaksi ERE-reagoiva toimittajat, joista yksi sisälsi sekä ERE sivustoja, ja toinen, joka sisälsi vain proksimaalinen ERE /SP1 päällä (kuvio 5A). Kuten kuviossa 5B on esitetty, E2 lisääntynyt lusiferaasiaktiivisuutta sekä Toimittajat noin 2,5-3 kertainen verrattuna kontrolliin. UO126 esti tehokkaasti lusiferaasiaktiivisuus näistä toimittajille E2: n läsnäollessa (kuvio 5B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että MAPK-reitin osallistuu E2 /ERa-aktivointi eres että hTERT promoottori; ja näin ollen, tämä reitti voi olla kriittinen välittämisessä hTERT transkriptionaalisen aktiivisuuden aiheuttama E2.

Kaavakuva hTERT-promootterin lusiferaasi plasmideja, jotka esittävät kahta ERE sitovaa kohtaa ja ytimen promoottori (A). Ishikawa-soluja transfektoitiin hTERT-promootterin lusiferaasi plasmidit ja lusiferaasin aktiivisuus määritettiin altistuksen jälkeen 1 uM E2 tai 10 uM UO126 (U) 36 tuntia. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD kaksinkertaisten näytteiden ainakin kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. (C = kontrolli).

vaikutukset ERK1 /2-erityisiä siRNA yhdistettynä E2 telomeraasiaktiivisuutta, hTERT ilme ja hTERT-promootterin aktiivisuus Ishikawa soluissa

Jotta tarkastaa osallistuminen MAPK väylän E2 induktion telomeraasiaktiivisuuden, tarkastelimme seurauksia transfektio ERK 1/2-erityisiä siRNA yhdistettynä E2 telomeraasiaktiivisuutta, hTERT ilme ja hTERT-promootterin aktiivisuus Ishikawa solulinjassa. ERK1 /2-spesifisiä siRNA vähentää fosforylaation p42 /44 indusoi estrogeeni 48 tuntia, määritettynä Western blotting -analyysi (kuvio 6A). Densitometrisellä määrän normalisoitu ohjaamaan proteiinin EIF4E, E2 fosforylaatio lisääntyy p42 /44 29%, ja E2: n läsnä ollessa ERK1 /2-spesifistä siRNA vähentynyt fosforylaatio p42 /44 79%. Telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT ilmaisun analysoitiin TRAP määrityksen ja reaaliaikainen RT-PCR klo 48 h (kuvio 6B ja 6C). Samanlainen hoito U0126, E2 aiheuttama lisääntynyt telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT mRNA ilmaisun noin 2-3 kertainen verrattuna valvonta, ja nämä stimuloivia vaikutuksia lähes lakkautettiin läsnä ERK 1/2-erityisiä siRNA. Lucifersae aktiivisuus määritettiin sen jälkeen, kun solut transfektoitiin ERK1 /2 siRNA 24 tunnin ajan, minkä jälkeen transfektointi hTERT-promootterin lusiferaasi-plasmidia (P3915), ja sitten käsittelemällä 1 uM estrogeenin 36 tuntia (kuvio 6D). Kuten löytynyt UO126, transfektio ERK 1/2-spesifisiä siRNA esti tehokkaasti lusiferaasin aktiivisuutta P3915 promoottorin E2: n läsnäollessa. Nämä tulokset tarjoavat lisänäyttöä välisen suhde MAPK-reitin ja E2-välitteisen induktion hTERT transkriptionaalisen aktiivisuuden.

Solut joko transfektoitu ERK1 /2 siRNA tai negatiivinen kontrolli (Neg) 8 tuntia ja sitten käsiteltiin 1 uM estrogeenin 36-48 tuntia. Vaikutus transfektion ERK 1/2-pyrkien siRNA fosforylaatiota varten p42 /p44 indusoi estrogeeni arvioitiin Western-blottauksella 48 h (kuvio 6A). Telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT ilmaisun analysoitiin TRAP määrityksen ja reaaliaikainen RT-PCR klo 48 h (kuvio 6B ja 6C). Lucifersae aktiivisuus määritettiin sen jälkeen, kun solut transfektoitiin ERK1 /2 siRNA 24 tunnin ajan, minkä jälkeen transfektointi hTERT-promootterin lusiferaasi-plasmidia (P3915), ja sitten käsittelemällä 1 uM estrogeenin 36 tuntia (kuvio 6D). (ITAS = sisäinen telomeraasi määritys vakio, C = kontrolli).

Keskustelu

Olemme aiemmin osoittaneet, että E2 indusoi telomeraasiaktiivisuus ja hTERT mRNA: n ilmentymisen ER-positiivisessa endometriumsyöpään solulinjoissa , mahdollisesti kautta sitoutumisen kompleksoidun estrogeenin kanssa ERa kohteeseen eres tavataan hTERT promoottori. Tässä tutkimuksessa halusimme saada taustalla molekyylitason mekanismi mukana säätelyssä telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT mRNA ilmaisun aiheuttama E2 ERa-positiivisten Ishikawa solulinjan. Koska vakiintunut suhde ERa ja MAPK-reitin, se tuntui loogiselta, että tämä reitti voi olla mukana induktio telomerase E2.

Hoito UO126, erittäin selektiivinen estäjä sekä MEK1 ja MEK2, esti telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT mRNA ilmaisun Ishikawa soluissa. Lisäksi U0126 täysin tukossa E2 stimuloiman telomeraasiaktiivisuudelle ja hTERT mRNA: n ilmentymisen. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös transfektion jälkeen ERK 1/2 erityisiä siRNA. Hoito E2 johti nopeaan fosforylaatioon p44 /42 MAPK ja lisääntynyt MAPK funktionaalisen aktiivisuuden, ja tämä vaikutus voitaisiin poistaa lisäämällä UO126. Lusiferaasimäärityksiä osoittavat, että altistuminen UO126 tai ERK 1/2 erityisiä siRNA torjua stimuloivan vaikutuksen E2 hoidon eres sijaitsee hTERT promoottori. Niinpä todisteita siitä, että E2 indusoi telomeraasiaktiivisuus ja hTERT mRNA ilmaisun ERa-positiivisten kohdun limakalvon syövän solut, jotka on riippuvainen signalointi kautta MAPK-reitin. Tietääksemme vain yksi tutkimus on sekaantunut osuuskunta rooli MAPK säätelyssä hTERT kanssa ER, ja tämä oli nimenomaan ER ihmisen haiman solulinjoissa [26].

Erilaisia ​​tutkimuksia on osoittaneet, että vastaus kohdegeenien estrogeenin riippuu useista tärkeistä tekijöistä, mukaan lukien luonteeltaan estrogeenireseptorin ligandi ja solun yhteydessä, kohdegeenin promoottorin ja tiettyjä transkriptiotekijöitä, sekä aineita, jotka vaikuttavat proteiinikinaasi aktivointi ja proteiinin fosforylaatio [2] , [16], [27] – [29]. Ihmisen hTERT promoottori sisältää epätäydellisen estrogeenivasteen elementin (ERE) ja ERE /SP1 puoli päällä. Me ja muut ovat havainneet, että estrogeenin aiheuttama hTERT-geenin ilmentyminen ja telomeraasiaktiivisuus voi johtua sitoutuvan suoraan ERa kaksi ERE toimipaikkoja promoottorialueen hTERT-geenin [2], [15] – [17]. Lisäksi eres, tämä alueella on konsensus-sekvenssit sitoutumisen transkriptiotekijöiden, kuten SP1, Ap2, AP4, c-Myc, NF-1 ja E-box [8], [29] – [31]. On osoitettu, että E2 aktivointi ytimen hTERT-promootterin voidaan kokonaan poistaa, kun c-Myc sivustoja kumonnut mutaatiot [16]. E2 on myös todettu merkittävästi aktivoi c-Myc-promoottorin Lusiferaasimäärityksiä käyttäen c-Myc-promoottori-reportteri plasmidit [16]. Tämän perusteella huipentui näyttöä, voidaan väittää, että estrogeeni voi välittää hTERT transkriptionaalisen aktiivisuuden kautta ERa suoraan sitovien eres että hTERT-promootterin tai vaihtoehtoisesti E2-transkriptiotekijöiden, jotka ovat vuorovaikutuksessa tämän promoottorin tai todennäköisesti kautta molempia mekanismeja.

MAPK signalointiryöpyn säätelee erilaisia ​​solujen toimintaa, kuten solun kasvussa, erilaistumiseen, selviytyminen ja solukuolemaan. Tämä polku on ajateltu olevan välttämätöntä säätelyssä ERa transkription, kuten uudella mekanismilla, jonka ERa ja ERK2 kolokalisoituvat at chromatin sitoutumiskohtiin ja yhteistyötä sääntelyä hormoni proliferaation [32], [33]. Estrogeenireseptorin signalointi ja aktivoitumisen MAPK-reitin myös sekaantuneet kehittymistä ja etenemistä Hormonaalisesti ajettu syöpien, kuten rinta- ja kohdun limakalvon syöpä. Progesteroni on todettu estävän estrogeenin indusoiman aktivaation telomeraasiaktiivisuuden rintasyövän ja kohdun limakalvon syövän solulinjat [34], ja MAPK-reitin on osoitettu olevan osittain vastuussa tästä antagonistinen vaikutus. Tamoksifeeni, yhteinen adjuvanttihoito rintasyövän, on estrogeenin kaltaisia ​​ominaisuuksia kohtukudoksessa ja liittyy lisääntynyt riski kohdun limakalvon syöpä. Hoito kohdun limakalvon syövän solujen tamoksifeenin on osoitettu johtavan induktion telomeraasiaktiivisuuden, joita voidaan tehokkaasti estetty MEK estäjä. Sp1 sitoutumiskohdat ja ETS perheenjäsen motiivien on löydetty hTERT promoottori 5′-sivuavan sekvenssin [30], [35] – [37], ja nämä ovat mahdollisia transkriptiotekijöitä, jotka on kohdistettu MAPK-reitin ja voidaan indusoida kautta estrogeenin ja progesteronin signalointia.