Krooninen sairaus

tiivistelmä

UDP-(UGT) perheen entsyymien on tärkeä rooli vieroitus syöpää sekä puhdistuma syöpälääkkeet. Ihmisillä, 19 UGT perheenjäsenet on tunnistettu ja ne ilmaistaan ​​kudosspesifisellä tavalla koko kehon. Kuitenkin UGT ei ole aikaisemmin tunnettu siitä, melanosyyttien tai melanooma. Esillä olevassa tutkimuksessa, UGT2B7, UGT2B10, ja UGT2B15 tunnistettiin olevan tavanomaisesti ilmaistaan ​​ihmisen melanosyyttien. Samat kolme UGT perheenjäseniä myös ilmaistu ensisijaisen melanoomasolulinja WM115. Ei UGT ekspressiota havaittiin toisen primäärisen melanooman solulinja, WM3211, tai missä tahansa metastaattinen melanooma solulinja tutkittiin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että UGT ilmentyminen häviää aikana melanooman etenemisen. Hoito WM3211 tai metastaattisen melanooman solulinjaa syöpälääkkeet (mukaan lukien vemurafenib) indusoima UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 osoittaa, että melanoomasolujen säilyy kyky uudelleen ilmaista nämä samat kolme UGT. Vastaava lisäys glukuronoitumalla aktiivisuuden melanoomasolujen seuraavissa anti-syövän hoitoon havaittiin myös. Lisäksi knockdovvn UGT2B7 vuonna WM115 soluissa herkistyneet näiden solujen käsittely adriamysiinin ja epirubisiinia osoittaa, että UGT2B7 osallistuu resistenssin näille lääkkeille. Kuitenkin knockdovvn UGT2B7 ollut vaikutusta temotsolomidia myrkyllisyyttä. Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi rooli UGT melanooman verestä. Koska UGT ovat lääkeainemetaboliaa, ehdotamme, että uudelleen ilmentymistä UGT muodostaa odottamattomat mekanismi kasvaimensisäistä lääkeresistenssin melanoomaan.

Citation: Dellinger RW, Matundan HH, Ahmed AS, Duong PH, Meyskens FL Jr (2012) Anti-Cancer Drugs Elicit uudelleen ilmentäminen UDP-glukuronosyylitransferaasin melanoomasoluissa. PLoS ONE 7 (10): e47696. doi: 10,1371 /journal.pone.0047696

Editor: Keiran Smalley, The Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 17 syyskuu 2012; Julkaistu: 22 lokakuu 2012

Copyright: © Dellinger et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat antelias tuella Oxnard ja Waltmar Foundations sekä avustuksia National Institutes of Health National Cancer Institute [P30CA62330] ja FLM ja syövän biologian koulutus avustus [T32CA009054] säädetty palkka tukea RWD tälle työlle. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

UGT entsyymien perhe katalysoi glukuronisaatiota monenlaisia ​​xenobiotic ja endogeenisten yhdisteiden. UGT konjugoimiseksi glukuronihapon osa niiden substraattien, muuttamalla biologiset ominaisuudet substraatin ja parantaa sen erittymistä virtsaan tai sappeen [1], [2]. Yleensä glukuronidaation muuntaa alustojen vähemmän bioaktiivisia, enemmän vesiliukoisia tuotteita helpottamaan niiden poistamista kehosta. Tällä tavalla UGT ovat kiinteästi mukana vieroitus monien syöpää puhdistuma huumeiden ja aineenvaihduntaa erilaisten endogeenisten substraattien, kuten bilirubiinin, steroidihormonien ja bioaktiivisten lipidien [1], [2]. On 19 ihmisen funktionaalisen UGT luokitellaan kolmeen alaperheeseen perustuen rakenteellisiin ja aminohapposekvenssihomologian, UGT1A, UGT2A ja UGT2B [2].

UGT ovat kalvoon sitoutuneiden entsyymien pitkälti lokalisoitu solulimakalvostoon [1], [3]. Substraattispesifisyys vaihtelee suuresti perheenjäsenten, joilla on laaja päällekkäin, ja niiden substraattispesifisyys voidaan muuttaa posttranslational muutoksia kuten fosforylaatioon [4]. Vaikka UGT ilmentyvät ensisijaisesti maksassa, ne myös elintärkeä tehtävä muissa kehon kudoksissa. Esimerkiksi UGT2B15 ja UGT2B17 ilmaistaan ​​eturauhasen jossa ne säätelevät paikallista androgeenitason läpi glukuronidaation [5] ja UGT1A10 ja UGT2B7 ilmaistaan ​​rinnasta, jossa ne säätelevät estrogeenit [6]. Lisäksi on saatu runsaasti todisteita siitä, että UGT tärkeä rooli siinä aerodigestive, ruoansulatuskanavassa, keuhko-, paksusuoli-, virtsarakko-, munuaisissa ja aivoissa [7], [8], [9], [10], [11]. Kuitenkin rooli UGT ihon, suurin elin elimistössä on vielä tutkimatta.

Melanooma on yksi nopeimmin kasvavista kasvaintyypeissä Yhdysvalloissa ja tapausten määrä maailmassa on kaksinkertaistunut viimeisten 30 vuoden aikana [12]. Melanooma, joka syntyy melanosyyttejä, on erittäin aggressiivinen kasvain, joka tunkeutuu verisuonten ja imusuonten järjestelmien muodostaa kasvaimia muualla kehossa [12], [13], [14]. Melanooma on erityisen joustava syöpä, osuus vain 4% kaikista ihosyöpiä mutta vastaa 80% ihon syöpäkuolemista [15]. Edelleen, vain 14%: lla potilaista, joilla oli metastaattinen melanooma hengissä 5 vuotta [15].

Systeeminen terapia lähestymistapoja ovat saavuttaneet vähän menestystä vastaan ​​metastaattinen melanooma tuloksena vain muutama FDA-hyväksyttyjä hoitoja [16]. Interferoni-α2b, interleukiini-2 ja temotsolomidi ovat kaikki osoittaneet rajoitettu tehoa kanssa hoitovaste yleensä alle 15% lyhyellä aikavälillä ilman selkeää vaikutusta melanooman liittyvää kuolleisuutta [16]. Kuitenkin viimeaikaisen menestyksen erityisen BRAF mutantti estäjä vemurafenib Faasi 1 kliinisen Reitti on erittäin lupaava [17]. Arviolta ilman taudin etenemistä 7 kk ilmoitettiin kaikkien potilaiden kätkeminen BRAF V600E mutaatio [17], joka on läsnä noin 50% kaikista ihosyövän [18]. Kuitenkin jännitystä vemurafenib monoterapiana hieman lievennetty sillä hankittu resistenssi on jo havaittavissa [17]. Siten mekanismin ymmärtämisessä (t) resistenssi kemoterapiaa että melanoomasolujen työllistävät on ensiarvoisen tärkeää torjua tätä tappavaa tautia.

Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli luonnehtia ilmentymistä ja toimintaa UGT melanosyyttien ja melanooman ja tutkimaan mahdollista roolia UGT huumeiden vastarintaa. Todisteet esitetään tässä paljastaa kolme UGT perheenjäseniä, UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15, olevan normaalisti ilmaistaan ​​ihmisen melanosyyttien eristetty vastasyntyneen esinahka. Samat kolme UGT havaittiin ilmentyvän ensisijaisesti melanoomasolulinja WM115. Mielenkiintoista on, että ei ole UGT ekspressiota havaittiin toisen primäärisen melanooman solulinja, WM3211, tai missä tahansa kolmesta metastaattisen melanooman solulinjoissa tutkittiin, mikä viittaa siihen, että UGT ilmentyminen on menetetty melanooman etenemisen. Kuitenkin hoito melanoomasolujen kanssa syöpälääkkeiden johtaa uudelleen ilmentyminen näiden samojen kolmen UGT. Tämä uusi uudelleen ilmentäminen UGT melanooman tutkitaan tarkemmin tässä.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja Cell Culture

temotsolomidi, adriamysiini, epirubisiini ja alamethicin saatiin Sigma . Vemurafenib ostettiin Selleck (Houston, TX). Normaalit ihmisen melanosyyttien eristettiin irrotettava tunnistettu vastasyntyneen esinahka ympärileikkauksilta leikkauksen mukaisesti protokollan hyväksymän UC Irvine sisäisen Review Board. Tämän mukaisesti hyväksytty protokolla ei ole rekrytointi aiheista, vain poistetut ympärileikatuilla kudos kerätään. Ei tunnistamiseksi kerätään tästä kudosta, joka muuten olisi hävitettävä. Melanosyyttien eristettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19], [20] ja viljeltiin MCDB153-alusta täydennettynä 2% naudan sikiön seerumia, 10 ng /ml 12-O-tetradecanoylphobol-13-asetaattia ja 0,15% naudan aivolisäkeuutetta. Melanooman solulinjat WM115, WM3211, Lu1205, SKmel28 ja A375 viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [21], [22], [23]. Vain WM3211 on WT B-Raf, kaikki muut satama V600E mutaatioita. Kaikki solulinjat olivat kielteisiä mykoplasmaa.

Yhteensä RNA: n eristäminen, käänteistranskriptio ja PCR

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä Arum kokonais-RNA Mini Kit (BioRad) yhtiöiden mukaan tarjotaan protokollaa. RNA kvantitoitiin käyttämällä NanoDrop 1000 (Thermo /Fisher) cDNA tehtiin sitten 1,0 ug RNA: sta käyttäen iScript käänteistranskriptaasia Kit (BioRad) standardimenetelmien mukaisesti. Sen jälkeen suoritettiin PCR käyttäen Quick kuormitus Taq (2X) master mix (New England Biolabs) ja ajettiin Applied Biosystems GeneAmp System 2700 lämpösyklerissä käyttäen seuraavaa protokollaa: Vaihe 1 = 94 ° C: ssa 5 min; Vaihe 2 (40 sykliä) = 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia, 68 ° C 1 min; Vaihe 3 = 68 ° C: ssa 10 min. Taulukko S1 täydentävät tiedot luetellaan monistamiseen käytetyt alukkeet yksittäisille UGT perheenjäseniä.

Real-Time PCR

analysoimiseksi UGT mRNA ekspressiotasot melanoomasolujen reaaliaikaisen PCR suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [3], [24]. Lyhyesti, ennalta suunniteltu TaqMan Gene Expression Assays [Applied Biosystems (ID: n Hs02383831_s1 varten UGT2B4-, Hs00426592_m1 varten UGT2B7, Hs02556282_s1 varten UGT2B10, Hs03008769_g1 varten UGT2B15 ja Hs99999905_m1 GAPDH)] käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti protokollaa. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen yhteensä 20 ui, joka sisälsi 50 ng cDNA: ta käyttämällä GAPDH kuin normalisoi ”housekeeping” geeni. Reaaliaikainen PCR suoritettiin CFX96 Real-Time PCR kone (BioRad). Raportoitu mRNA: n ilmentymisen arvot ovat keskimäärin vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen keskiarvoa ja keskihajontaa.

shRNA

Ready-kloonattiin shRNA kohdistettu UGT2B7 ja valvoa tyhjä ekspressiovektoreita hankittiin Origene. Kukin shRNA transfektoitiin WM115 soluihin käyttäen Biot transfektion ainetta (Bioland Scientific) valmistajan protokollien ja stabiilin ekspression valittiin lisäämällä puromysiiniä (Invivogen).

MTT-määritys

määritetään lääkkeiden vaikutuksia soluproliferaatioon teimme 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) määritykset (Sigma Aldrich). Lyhyesti, solut maljattiin yön yli 2000-4000 solua /sekä (riippuen solun kaksinkertaistaa kertaa) 96-kuoppalevyille, ja käsiteltiin joko adriamysiini, epirubisiini, tai temotsolomidi on sarjalaimennoksia lääkkeen. Kun kolmantena päivänä käsittelyn jälkeen MTT laimennettiin väriaine-free-väliainetta lisätään kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 3 tunnin ajan. Kun MTT metaboloituu aktiivisesti lisääntyvien solujen veteen liukenemattomia formazen sitten, dimetyylisulfoksidi (Sigma Aldrich) lisätään ja kolorimetriset muutokset analysoidaan ja kvantifioitiin spektrofotometrillä 590 nm: ssä. tulokset MTT analysoitiin käyttäen Graphpad Prism jossa lääkeannosta verrattuna sen vaikutus proliferaatioon piirretään; ei-lineaarista regressiokäyrän käyttämällä sigmoidaalista annos-vaste-yhtälöä sovitetaan kuvaaja ja puoli-maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) on saavutettu. Raportoitu IC

50-arvot ovat keskimäärin vähintään 3 riippumatonta kokeilut keskihajonta.

UGT Activity Assay

UGT aktiivisuutta tutkittiin käyttäen UGT-Glo määritystä (Promega) mukaan valmistaja protokollia. Soluhomogenaattien valmistettiin uudelleen suspendoimalla pelletoitiin solut Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (25 mM Tris-emäs, 138 mM NaCl: a ja 2,7 mM KCI, pH 7,4) ja saattamalla ne kolme kierrosta jäädytys-sulatus ennen homogenisoinnin käyttäen lasista dounce-homogenisaattoria . Soluhomogenaattien (5-20 mg proteiinia /ml) säilytettiin -70 ° C: ssa 100 ul: n eriä. Yhteensä soluhomogenaatti-proteiinin konsentraatiot määritettiin käyttäen BCA-määritystä yhtiöltä Pierce Biotechnology (Rockford, IL), kun proteiini uuttamalla käyttämällä standardimenetelmiä. Ihmisen maksan mikrosomeja (Xenotech, Lenexa, KS), käytettiin positiivisena kontrollina. Homogenaatit inkuboitiin alamethicin 10 minuuttia jäillä. Kukin reaktio käsitti 50 ug homogenaattia, UGT-Glo puskuri, 50 uM UGT monientsyymikompleksin Alustan ja vettä yhteensä 30 ui. Sitten joko 10 ul: aan vettä tai 10 ui 16 mM UDPGA (lopullinen pitoisuus 4 mM) lisättiin. Kukin näistä reaktioista tehtiin kolmena kappaleena (yhteensä 6 reaktiot kullekin homogenaattia). Reaktioita inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 90 min. Vain reaktioiden kanssa yhteistyössä alustan UDPGA lisätään voi glukuronidaatti alustaan. 90 minuutin kuluttua 40 ui lusiferiini Detection Reagent plus D-kysteiini lisätään kaikkiin kuoppiin, ja luminoivan signaali annetaan stabiloitua huoneenlämpötilassa 20 min. Sitten levy luettiin luminometrillä (Turner Biosystems modulin mikrolevyn). Negatiivisena kontrollina yksi kuuden reaktiot suoritettiin ilman UGT läsnä. UGT monientsyymikompleksin Alustana tuottaa luminenssi, mutta glukuronidimetaboliittien UGT monientsyymikompleksin alustaan ​​ei. Siten keskiarvo kolmena kappaleena reaktioiden kanssa yhteistyössä alustan UDPGA vähennetään keskiarvoa kolmena reaktioissa UDPGA määrittämiseksi UGT aktiivisuuden. Kuvaajat ovat komposiitti useita toisistaan ​​riippumattomia kokeita keskihajonta.

Tulokset

UGT Expression in Human Melanosyyteissä ja Melanooma

Vaikka UGT ilme on aiemmin raportoitu ihossa [25 ], UGT ilmaisu melanosyyttien ei ollut erityisesti osoitettu. Esillä olevassa tutkimuksessa ihmisen melanosyyttien eristetty de identifioitu vastasyntyneen esinahan analysoitiin UGT ilmentymisen RT-PCR: llä. Alukesarjat tarkoitettu yksittäisille UGT2B perheenjäsenten käytettiin sekä yksi yhteinen alukesetin havaitsemiseksi UGT1A perheenjäsen. UGT2As ei mitattu, koska ne ovat suurelta osin löytyy hajuaistijärjestelmän [26]. Kuten kuviossa 1A on esitetty, UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 todettiin ilmentyvän ihmisen melanosyyttien. PCR-tuotteet osoitetaan mustat nuolet (kuvio 1A) yritti ennustetussa kokoa, leikattiin irti ja yksittäisten UGT sekvenssit varmistettiin. Bändi on UGT2B4- kaistaa (kuvio 1A, kaista 1) oli myös leikattiin ja määritetään olevan UGT2B7 sekvensoimalla. Tämä ei ole kovin yllättävää, koska UGT2B perheen jäsenet jakavat suuren homologian. Itse asiassa, UGT2B4- ja UGT2B7 jakaa yli 90% identtisyys DNA-tasolla ja strategioita spesifisiä alukkeita on vaikeaa. Kontrollina RT-PCR suoritettiin käyttäen maksan RNA: ta osoittamaan, että UGT alukkeet sarjaa olivat toimivia ja osoittavat ennustetun kokoisia jokaiselle UGT amplikoni (kuvio 1 B). Expression näistä samat kolme UGT perheenjäseniä on havaittu myös ihmisen melanosyyttien toisesta de-tunnistetut vastasyntyneen esinahka (taulukko 1; HUOM että numerot 322 ja 423 ainoastaan ​​viittaavat päivämäärät esinahka saatiin valkoihoinen vauvoilla). Seuraavaksi UGT ekspressiota tutkittiin useissa primaarinen ja metastaattinen melanooma solulinjat RT-PCR: llä. Yhdenmukainen UGT ekspressiokuviota havaittu melanosyyttejä ensisijainen melanoomasolulinjalla WM115 esillä ainoastaan ​​UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 ilmaisu (kuvio 1 C). Koska suuri homologia perheenjäsenten, ja samanlainen kuin kuvio 1A ”UGT2B4-” bändi kuviossa 1C määritettiin olevan UGT2B7 DNA-sekvensoinnin jälkeen. Myös ylempi bändi UGT1A kaista leikattiin ja sekvensoitiin (vaikka se oli odotettua pienempi koko) ja määritettiin ei olla mitään UGT perheenjäsen. Ei UGT ilmentymistä ei havaittu toisessa primäärisen melanooman solulinja, WM3211 (kuvio 1 D), tai missä tahansa kolmesta metastaattisen melanooman solulinjoissa tutkittiin (yhteenveto taulukossa 1, kuviossa S1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että UGT ilmentyminen on menetetty melanooman etenemisen.

(A) RT-PCR-analyysi Kokonais-RNA ihmisen melanosyyttien ja UGT perheenjäseniä. Alukesarjat varten UGT2Bs suunniteltiin erityisesti kutakin isoformin vaikka sama alukesarja suunnattu yhteistä aluetta kaikkien UGT1As havaitsemiseen käytettiin UGT1A ilme. Kokonais-RNA ihmisen maksan käytettiin ohjaus UGT2B7 alukkeita. Nuolet osoittavat DNA bändejä odotetun kokoinen jonka sekvenssi varmistettiin. (B) Ohjaus RT-PCR-analyysi RNA: n maksasta käyttäen osoitti alukkeita sarjaa. (C) RT-PCR-analyysi RNA: n ihmisen melanoomasolulinja WM115 käyttäen osoitti alukkeita sarjaa. Nuolet osoittavat bändejä, jotka leikattiin irti ja sekvensoitiin. Band UGT2B4- kaistalla havaittiin UGT2B7 sekvensoimalla kun UGT2B10 ja UGT2B15 bändejä vahvistettiin odotettavissa UGT. (D) RT-PCR-analyysi RNA: n ihmisen melanoomasolulinja WM3211. GAPDH: ta käytettiin positiivisena kontrollina tässä varmistamiseksi cDNA laadun. (E) Reaaliaikainen PCR käyttäen TaqMan määrityksiä vastaan ​​osoitti UGT. ND = ei havaittu.

Jotta parantaa herkkyyttä ja spesifisyyttä UGT mRNA havaitseminen, TaqMan geeniekspression määrityksiä käytettiin raportin muut. Näissä määrityksissä on optimoitu olevan Yksittäisten UGT käyttäen koetinta sekä alukesarjaa. Voit valaista asiaa, ja vahvistavat uudelleen, että UGT2B7 on läsnä melanosyyttien vastakohtana UGT2B4-, reaaliaikainen PCR hyödyntäen TagMan määritykset suoritettiin melanosyyttien cDNA. Kuvio 1E osoittaa selvästi, että UGT2B7 on ilmaistu todellakin ihmisen melanosyyttien ja UGT2B4- ei havaittu.

Re-ilmentymä UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 in Melanooma Vastauksena syöpälääkkeet

Koska UGT ovat vaiheen II aineenvaihduntaa entsyymejä ja yksi niiden tärkeimmät tehtävät järjestelmällisesti on poistaa huumeiden, tutkimme jos UGT saattaa olla merkitystä luontainen vastustuskyky melanoomasolujen kemoterapeuttisia aineita. Siten melanoomasolulinjalla WM3211 käsiteltiin eri syöpälääkkeiden ja UGT ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. WM3211 valittiin näissä kokeissa, koska se ei ole havaittavaa UGT ekspressiota määritettynä RT-PCR: llä (kuvio 1 D).

Ensin käsitellään WM3211 solujen temotsolomidi, joka on tällä hetkellä tarkoitettu metastaattisen melanooman. Annos 100 uM valittiin tähän kokeeseen, koska julkaistut raportit temotsolomidi hoitoon soluviljelmässä yleisesti käyttävät vähintään 100 uM [27], [28]. Kuten kuviossa 2a on esitetty, UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 valittiin uudelleen ilmaistaan ​​WM3211 soluissa vasteena temotsolomidi. Mielenkiintoista on, että ei ole muita UGT indusoitiin (tuloksia ei ole esitetty), vain kolme UGT perheen jäseniä, jotka tavallisesti ilmaistaan ​​melanosyyttien (taulukko 1). Induktiota UGT ilmaisun vastauksena temotsolomidille käyttäytyi ajasta riippuva tavalla maksimaalinen ilme korkeimmillaan 8 h käsittelyn jälkeen (kuvio 2A). Kaikkien kolmen UGT niiden ilmentyminen vähenee jälkeen 8 h, mutta niiden ilmentyminen on edelleen koholla 24 h käsittelyn jälkeen (kuvio 2A).

predesigned Taqman geeniekspression määrityksiä käytettiin visualisoimaan yksittäisten UGT ilmentyminen reaaliaikaisella PCR seuraavista hoito WM3211 soluja (A) 100 uM temotsolomidi, (B) 1,0 uM adriamysiini tai (C) 0,1 uM epirubisiini. Kaikissa tapauksissa, UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 ilmentymistä tutkittiin osoitettu syövän vastaisen aineen 0, 8, 16 ja 24 tuntia hoidon jälkeen. * Tarkoittaa eri asteikko y-akselilla.

Valaistaan ​​jos uudelleen ilmentymistä näiden kolmen UGT perheenjäseniä oli spesifinen temotsolomidi tai jos tämä havaitaan vaste voi olla yleinen mekanismi melanooman puolustautua vastaan ​​kemoterapeuttiset, syövän aineiden adriamysiinin ja epirubisiinin tutkittiin. Nämä kaksi yhdistettä on valittu, koska ne liittyvät läheisesti antrasykliinejä, joita yleisesti käytetään erilaisten kiinteiden kasvainten, vaikka melanooma on osoittautunut olevan vastustuskykyisiä [29], [30]. Lisäksi epirubisiini tiedetään metaboloituu pääasiallisesti UGT2B7 [31], kun taas aineenvaihdunta adriamysiinin on paljon monimutkaisempi ja edellyttää useita erilaisia ​​vaihe II entsyymien (mukaan lukien UGT) ja ABC kuljettajat [30]. WM3211 melanoomasoluja olivat joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 0,1, 1,0 tai 10 uM adriamysiinin (kuvio S2A) tai epirubisiini (kuvio S2B) ja UGT ilmentymistä tutkittiin reaaliaikainen PCR jälkeen 8 tuntia. Molemmissa tapauksissa UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 havaittiin uudelleen ilmaistaan. Samanlaisia ​​temotsolomidille, ei muita UGT perheenjäsen aiheutettiin (tietoja ei ole esitetty). Aika kurssien tutkii UGT ilmentymisen käsittelyn jälkeen WM3211 soluja 1,0 uM adriamysiinin (kuvio 2B) tai 0,1 uM epirubisiini (kuvio 2C) suoritettiin sitten. Molemmissa tapauksissa UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 indusoituvat aikaa riippuvaisella tavalla, jolla on korkein ilmaus havaittu 24 tuntia.

Re-ilmentymä UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 etäispesäkemelanoomassa solut vastaus Epirubisiinia ja Vemurafenib

sen varmistamiseksi, että havaittu induktio UGT ei rajoitu WM3211 soluihin, kaksi metastaattinen melanooma solulinjoja (SKmel28 ja A375) tutkittiin induktion UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 vastauksena epirubisiinin. Aika kurssit tutkii UGT ilmaus käsittelyn jälkeen SKmel28 (kuvio 3A) tai A375 (kuvio S3), jossa on 0,1 uM epirubisiinilla suoritettiin sitten. Jälleen kerran, induktio kaikki 3 UGT havaittiin molemmissa metastaattisen melanooman solulinjaa maksimaalinen ekspressio 24 tuntia. Lisäksi koska vastus on havaittu kliinisissä tutkimuksissa lupaavan uuden lääkkeen vemurafenib, tutkimme mikäli UGT voitiin indusoida seuraavat vemurafenib hoitoa. SKmel28 soluja, jotka satama BRAF V600E mutaatio, hoidettiin 1 uM vemurafenib, kerätään 0, 8, 16 ja 24 h hoidon jälkeen ja niistä määritettiin UGT ekspressiotasoja. Kuten kuviossa 3B on esitetty, UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 olivat kaikki indusoitiin vasteena vemurafenib.

valmiista Taqman geeniekspression määrityksiä käytettiin visualisoida yksittäisten UGT ilmentyminen reaaliaikaisella PCR: llä käsittelyn jälkeen SKmel28 soluja (A ) epirubisiinia tai (B) vemurafenib. Ajankulku UGT2B ilmaisun jälkeen, epirubisiini (100 nM) tai vemurafenib (1 uM) hoito tutkittiin 0, 8, 16 ja 24 tuntia. * Tarkoittaa eri asteikko y-akselilla. ND = ei havaittu.

Lisääntynyt Glukuronidaatio melanoomasoluissa hoidon jälkeen Anti-cancer Agent

Sen jälkeen osoitetaan, että UGT voidaan uudelleen ilmaistaan ​​melanoomasolujen hoidon jälkeen anti syöpä aineita, ilmeinen kysymys oli siitä UGT aktiivisuus palautettiin samoin. Siksi glukuronidaatio tutkittiin käyttäen UGT-Glo määritys in Melanoomasolulinjojen että puuttuu UGT ilmaisun ja verrattuna samaan solulinjoja jälkeen epirubisiinihoidon. Tämä määritys työllistää UGT monientsyymikompleksin Alustan joka reagoi lusiferiini detektointireagenssia antaa valoa, joka voidaan kvantitoida luminometrillä. Kuitenkin, jos alusta on glukuronidoitua se ei enää reagoi lusiferiini detektioreagenssia antaa valoa. Siten kaksi reaktiota perustetaan per näyte, jolla on yhteistyössä alustan UDPGA ja toinen ilman. Vain reaktio UDPGA tuottaa glukuronidimetaboliittien substraattiin UGT ovat läsnä ja aktiivisia. Tällä tavalla koko UGT toimintaa näytteen voidaan mitata ero lähetetyn valon kahden reaktioita.

Ensinnäkin ensisijainen melanooma WM3211 soluja tutkittiin UGT toimintaan. Solut joko jätettiin käsittelemättä (n) tai käsitelty epirubisiinia osoitettuina pitoisuuksina. Solut kerättiin 24 tuntia myöhemmin ja analysoitiin UGT aktiivisuus. Kuten on esitetty kuviossa 4A, UGT aktiivisuus kasvoi vasteena epirubisiinin hoitoon verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kiinnostavaa, oli jonkin verran perustason glukuronidaation toimintaa käsittelemättömän WM3211 solut osoittaa, että UGT ilmaistaan ​​tässä solulinjassa, mutta matalammalle tasolle havaitseminen meidän RT-PCR kokeessa (kuvio 1 D). Ihmisen maksan mikrosomeissa käytettiin positiivisena kontrollina, koska ne ovat erittäin korkeita pitoisuuksia UGT ja ei ollut naattia läsnä negatiivinen kontrolli ottaa huomioon mahdolliset tausta signaalia. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, kun tämä koe toistettiin kaksi metastaattinen melanooma solulinjojen, SKmel28 (kuvio 4B) ja A375 (kuvio 4C). Molemmissa solulinjoissa UGT aktiivisuus dramaattisesti jälkeen epirubisiinihoidon. Toisin kuin WM3211 soluihin, ei ole metastasoitunut solulinja esillä UGT aktiivisuutta ilman hoitoa. Jälleen kerran ihmisen maksan mikrosomeja käytettiin positiivisena kontrollina ja negatiivisen kontrollin puuttui soluhomogenaattia.

Glukuronidaatio aktiivisuus tutkittiin UGT-Glo-määritys käyttäen 50 ug homogenaattia kohti reaktiota kolmeen Melanoomasolulinjojen; (A) WM3211 (B) SKmel28 ja (C) A375 ilman hoitoa ja verrattuna epirubisiinihoidon (EPI) ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. (-) Osoittaa negatiivinen kontrolli, jossa ei homogenaattia oli läsnä. (+) Osoittaa käyttää ihmisen maksan mikrosomeja (tiedetään olevan korkeat pitoisuudet lähes kaikki UGT perheenjäsenet) positiivisena kontrollina.

UGT2B7 pudotus herkistää WM115 melanoomasolujen Anti-cancer Drugs

selville toiminnallinen osuus glukuronoituminen melanooman vastus, UGT2B7 pudotettiin vuonna WM115 soluissa. shRNA suunnattu UGT2B7 transfektoitiin stabiilisti WM115 soluihin. Tämä solulinja nimeltään WM115-2B7KD. Reaaliaikainen PCR suoritettiin sitten sen vahvistamiseksi, että UGT2B7 mRNA-tasot olivat vähentyneet. Kuvio 5A osoittaa selvästi, että UGT2B7 mRNA tasoilla WM115-2B7KD solulinjassa oli -60% pienempi kuin WM115 solut stabiilisti transfektoitu tyhjällä vektorilla (WM115-pRS). Seuraavaksi puoli maksimaalinen inhibitio pitoisuudet (IC

50) määritettynä MTT-määritysten, suoritettiin tutkia, jos knockdovvn UGT2B7 herkistynyt WM115 soluja syövän hoitoon. IC

50-arvot WM115-2B7KD määritettiin ja verrattiin WM115-pRS (vakaa solulinja tehdään tyhjällä vektorilla kontrollina) ja emosolulinjassa vastaan ​​temotsolomidia adriamysiini ja epirubisiinia. Yhdenmukainen rooli glukuronoitumalla melanooman vastus, WM115-2B7KD havaittiin merkitsevästi pienempi (p 0,01) IC

50 arvoa adriamysiini ja epirubisiinia kohtelun kuin sekä WM115 ja WM115-pRS (kuvio 5B), joka ilmaisee että todellakin knockdovvn UGT2B7 herkistää melanoomasolujen näihin syöpälääkkeet. Ei vaikutusta IC

50-arvot havaittiin temotsolomidi tai vemurafenib kohtelu WM115-2B7KD solulinjassa verrattuna kahteen ohjaus solulinjoista (kuvio 5B).

(A) Reaaliaikainen PCR UGT2B7 mRNA-tasot verrataan melanoomasolulinjojen ilmensivät stabiilisti shRNA vastaan ​​UGT2B7 (WM115-2B7KD) tai tyhjän vektorin (WM115-, pRS). (B) IC

50-arvot määritetään MTT määrityksiä arvioida osuutta UGT2B7 melanoomaan kestävyys käsittelyn jälkeen temotsolomidia, adriamysiini, epirubisiini tai vemurafeninb. (C) IC

50-arvot määritetään MTT määrityksiä arvioida herkkyys Melanoomasolulinjojen kanssa (WM115) ja ilman (WM3211) UGT ilmaisun syöpälääkkeiden tiedetään metaboloivan UGT. Kaikki tiedot kaaviot ovat keskimäärin vähintään kolmen itsenäisen kokeen analysoitiin GraphPad Prism. Virhe pylväät edustavat keskihajonta ja * tarkoittaa merkitys p 0,01 verrattuna joko valvontaa.

Jos kaatamalla yksi UGT mukaan -60% herkistyneet melanoomasolujen adriamysiiniksi ja epirubisiinia sitten on aivan selvää, että IC

50 WM3211 melanoomasolujen (joka puuttuu UGT ilmaus) olisi huomattavasti alhaisempi kuin WM115 vanhempien soluja (jotka ovat UGT ilme). Niinpä verrattuna IC

50- varten WM115 ja WM3211 suoraan näille lääkkeille. Ennustetusti WM3211 solut 7-kertaiseksi ja 9-kertainen herkempiä adriamysiini ja epirubisiinin, vastaavasti (kuvio 5C).

Keskustelu

rooli UGT melanooman etiologiaa ei ollut tutkittu aiemmin vaikka UGT on merkittävä välys mekanismi syöpälääkkeet. Esillä olevassa tutkimuksessa UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 tunnistettiin olevan tavanomaisesti ilmaistaan ​​ihmisen melanosyyttien. Samat kolme UGT havaittiin ilmentyvän ensisijaisesti melanoomasolulinja WM115. Ei kuitenkaan UGT ekspressiota havaittiin toisen primäärisen melanooman solulinja, WM3211, tai missä tahansa kolmesta metastaattisen melanooman solulinjoja tutkitut osoittaa, että UGT ilmentyminen on menetetty melanooman etenemisen. Mielenkiintoista me osoittavat, että UGT2B7, UGT2B10 ja UGT2B15 voidaan uudelleen ilmaistaan ​​melanoomasolujen vastauksena syöpälääkkeet. Vastaava lisäys UGT aktiivisuuden osoitettiin myös hoidon jälkeen. Siten uudelleen ilmentymä UGT oletettavasti suojella syöpäsolut vastaan ​​syöpälääkkeet tehostamalla aineenvaihduntaa ja myöhemmin puhdistumaan. Mikä tärkeintä, nämä havainnot olivat yhdenmukaisia ​​sekä B-Raf villityypin melanoomasoluja (WM3211) ja B-Raf-mutantti solulinjoja (A375 ja SKmel28).

Valitettavasti, ei ole kaupallisesti saatavilla vasta-aineen on osoitettu havaita endogeenisen UGT2B proteiini ja näin ollen meidän yrittää visualisoida endogeenisen UGT2B proteiinia epäonnistuivat. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että UGT ovat kalvoon sitoutunut, liukenemattomat proteiinit. Näin ollen ei täyspitkä ihmisen UGT on puhdistettu ja /tai kiteytetään. Itse asiassa vain kiderakenne on raportoitu ihmisen UGT on C-terminaalinen puoli on UGT2B7, koska N-terminaalinen puoli oli leikattava pois liuottamiseksi proteiini [32]. Valtaosa julkaistu UGT westernit ovat solulinjat (yleensä hyönteisten), jotka yli-ilmentävät rekombinantti UGT. Lisäksi tuoreessa raportissa osoittaa selvästi, että suuri osa näistä yliekspressoituina rekombinantti UGT eivät ole käytössä [33]. Voidaan helposti kuvitella, että yhdistelmä-DNA-UGT proteiineja, jotka näkyvät westernit eivät ole täysin kypsiä, aktiivisia entsyymejä. Toisaalta täysin kypsä, aktiivinen UGT ei ehkä näy westernit vaikka yliekspressoidaan. Siten yhdenmukainen useiden ennen julkaisua UGT kenttään, tässä tutkimuksessa keskityttiin mRNA ilmaus UGT2B perheenjäsenten yhdistettynä analyysi UGT toimintaa. Hyödynsimme RNA-interferenssi ja glukuronidaation määrityksiä tutkia roolia UGT2B7 melanooman solujen eloonjäämistä [1], [3], [24], [34], [35], [36], [37].

testaamiseksi roolin glukuronoitumalla melanooman lääkeresistenssin suoraan, UGT2B7 pudotettiin vuonna WM115 soluissa, ainoa melanoomasolulinjalla olemme tunnistaneet kanssa UGT ilme toistaiseksi. Knockdovvn UGT2B7 herkistynyt melanoomasolujen epirubisiinia ja adriamysiinikäsittelyä mutta ei vaikuttanut temotsolomidia tai vemurafenib hoitoon. Nämä tulokset osoittavat, että heillä periaate, että glukuronidaation osallistuu melanooman lääkeresistenssin

in vitro

. Kaikkein looginen oletus on, että UGT2B7 glucuronidates epirubisiini ja adriamysiini aineenvaihduntatuotteiden suoraan johtaa sen puhdistumaan ennen nämä lääkkeet voivat käyttää niiden myrkyllisyys. Tämä vastaa ennen raportteja, että epirubisiini metaboloituu pääasiassa UGT2B7 [31] ja että glukuronidaatio on mukana myös adriamysiinin puhdistuma [30]. Se havainto, että myrkyllisyys temotsolomidia ja vemurafenib pysyi muuttumattomana sen jälkeen, kun UGT2B7 pudotus ei ollut täysin odottamaton, koska UGT ei ole koskaan liitetty aineenvaihduntaan näiden lääkkeiden.

On tärkeää huomata, että nämä kokeet tehtiin käyttämällä UGT2B7 kaataa solulinjassa, mikä oli vielä jonkin verran UGT2B7 läsnä. Lisäksi UGT2B10 ja UGT2B15 ovat edelleen läsnä.