Krooninen sairaus

tiivistelmä

androgeenireseptorin (AR) on pääasiallinen terapeuttinen kohde eturauhassyövässä. Viimeisten 70 vuoden androgeenien puute hoitoa (ADT) on ollut merkittävä terapeuttinen fokus. Kuitenkin jotkut potilaat eivät saa, ja niiden kasvainten, jotka eivät aluksi vastaa ADT lopulta edetä. Yksi äskettäin kuvattu mekanismi tällainen vaikutus on kasvua ja eloonjäämistä edistävät vaikutukset AR, jotka kohdistetaan riippumatta AR-ligandien, testosteroni ja dihydrotestosteroni. Kuitenkin erityinen ligandista riippumatonta AR kohdegeenien joiden osuus tätä seikkaa ei hyvin tunnettu. Osoitamme tässä, että

c-Myc,

joka on keskeinen välittäjäaine ligandista riippumattoman eturauhassyövän kasvua, on keskeinen ligandista riippumatonta AR kohdegeenin. Käyttämällä mikrosiruanalyysi, huomasimme, että

c-Myc

ja AR ekspressiotasoja korreloivat voimakkaasti keskenään kasvainten sairastavien potilaiden kastraation kestävät eturauhassyöpä (CRPC) edistyy huolimatta ADT. Olemme vahvisti, että AR suoraan säätelee

c-Myc

transkription ligandista riippumattomalla tavalla, että

AR

ja

c-Myc

vaimennus vähentää ligandista riippumattoman eturauhassyövän solukasvun ja että ektooppinen ekspressio c-Myc vaimentaa anti-kasvun vaikutukset AR tukahduttaminen. Tärkeää on, hoidon bromodomain estäjän JQ1 tukahdutettu c-Myc-toiminto ja tukahdutti ligandista riippumatonta eturauhassyöpä solujen eloonjäämistä. Tuloksemme määrittelevät uuden yhteyden kaksi kriittistä proteiineja eturauhassyövän – AR ja c-Myc – ja osoittaa potentiaalin AR ja c-Myc-suunnattu hoitoja parantaa eturauhassyöpää valvontaa.

Citation: Gao L, Schwartzman J, Gibbs A, Lisac R, Kleinschmidt R, Wilmot B, et ai. (2013) androgeenireseptorin Edistää Ligandivälitteinen Independent Eturauhassyöpä etenemisensä c-Myc lisääntymisen merkkejä. PLoS ONE 8 (5): e63563. doi: 10,1371 /journal.pone.0063563

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 lokakuu 2012; Hyväksytty: 02 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 21, 2013

Copyright: © 2013 Gao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä julkaisu oli mahdollista tuella Oregon Clinical ja Translational tutkimuslaitos, myöntää useita KL2 RR024141 National Center for Research Resources ja National Center for edistäminen Translational laitos National Institutes of Health (jA). Tätä työtä tukee myös Pacific Northwest Eturauhassyöpä SPORE /National Cancer Institute (P50CA097186) (JA, PN, IC), Department of Defense (PC093509) (PSN), lentoemäntä Medical Research Institute Young Kliininen tutkijan palkinto (JA ), joka on Wayne D. Kuni Joan E. Kuni Foundation Kuni Scholar Award (JA), ja Eturauhassyöpä Foundation Young Investigator Award (JA). Erityistä ansiosta Platt Electric, Bruce Burns, ja Burns Family Fund of Oregon yhteisön Foundation heidän filantrooppinen tukea tätä työtä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä miehillä Yhdysvalloissa, jossa 241740 uusia tapauksia ennakoitu tänä vuonna [1]. Huolimatta seulonta ja varhainen hoito, eturauhassyöpä yleisesti vääjäämättä, ja 28170 miestä ennustetaan kuolla eturauhassyöpään tänä vuonna [1]. Lähes kaikki nämä eturauhassyövän kuolemista johtuu metastaattinen, kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC), joka on edennyt huolimatta androgeenien puute hoitoa (ADT) – yleisin hoito potilailla, joilla on uusiutuva tai edennyt eturauhassyöpä.

ADT toimii alentamalla tasot voimakas AR-ligandien testosteronin ja dihydrotestosteroni (DHT) tai häiritsemällä sitovan androgeenin ligandien androgeenireseptorin (AR) proteiini, pääasiallinen terapeuttinen kohde eturauhassyövässä [2]. Huolimatta ADT, mukaan lukien uudet ja tehokkaampia hoitoja, kaikki eturauhasen syövät lopulta edetä [3], [4]. Tällä etenemistä, AR ilmentyy kaikkialla [5], [6].

On olemassa useita mahdollisia selityksiä AR-riippuvainen mekanismeja etenemisen huolimatta tukahduttaminen tai haittaa androgeenien ligandien. Näitä ovat intratumoraalista androgeenin synteesin sukupolven konstitutiivisesti aktiivisen AR transkriptivariantissa, AR-geenin monistamisen, aktivoivat AR mutaatioita, tai aktivoitumista AR kasvutekijät [7] – [16]. On myös selvää, että AR-proteiini voi edistää aktivoitumista AR ligandista riippumatonta reittejä erillinen AR kanoninen ligandi-aktivoitujen reittejä CRPC [17]. Kuitenkin kriittinen alavirran AR kohdegeenien tämäntyyppisten osuus AR riippuvainen, ligandista riippumatonta eturauhassyöpä solujen eloonjäämistä ei ole täysin selvitetty. Tutkimuksessa Tällaisten AR kohdegeenien ja mekanismit, joilla AR säätelee niiden ilme parantaa ymmärrystämme kastraatio-resistenssin ja johtaa niiden tärkeimpien AR riippuvainen proteiineista, joiden toiminta voi ohjata kasvua ja selviytymistä CRPC soluja. Tällaiset tavoitteet ja keinot olisivat luonnollisesti tullut merkittäviä painopisteitä lääkekehityksen.

Ymmärtääksemme geenejä, jotka saattavat selittää em keskityimme

c-Myc

. Tämä johtuu siitä: 1)

c-Myc

yli-ilmentymisen edistää eturauhassyövän kehitykseen [18]; 2)

c-Myc

ylössäädellään androgeeni ligandista riippuvan eturauhassyövän ja edelleen yläreguloituja CRPC [19], [20]; ja 3) ennen raportit ovat osoittaneet, että c-Myc, kuten AR, edistää ligandista riippumatonta eturauhasen syöpäsolujen kasvua [21]. Meidän tarkastelu ennen tietojen lokalisoitu AR sitoutumiskohdat koko genomiin kromatiinin immunosaostuksella (chip) osoitti, että AR paikantuu vahvistajaelementti on

c-Myc

geeni [17]. Se oli kuitenkin epäselvää,

c-Myc

oli suora AR kohdegeenin ja onko androgeenireseptorin ligandit olivat välttämättömiä AR sääntelyä

c-Myc

ilme.

määritetty että

c-Myc

säätelyyn ylöspäin ihmisen CRPC kasvaimissa korreloi

AR

säätelyä, ja varmistimme, että

c-Myc

on suora AR kohdegeenin käyttäen kromatiinin immunosaostuksella (ChIP ) määritykset.

c-Myc

tukahduttaminen saavutetaan sama yleinen vaikutus kuin

AR

tukahduttaminen, ja

c-Myc

yliekspressio vaimentaa anti-kasvua vaikutukset

AR

tukahduttaminen. Vaikka AR edistää

c-Myc

ilme, hoito androgeenireseptorin ligandien eivät lisääntyneet

c-Myc

ilme. Siten AR edistää ilmentymistä

c-Myc

ligandista riippumattomalla tavalla, ja

c-Myc

on keskeinen AR kohdegeenin.

Lopuksi käsiteltiin syöpäsolujen BET bromodomain estäjä JQ1 joka tukahduttaa c-Myc ilmaisun [22], [23]. Hoito JQ1 saavuttaa sama kokonaisvaikutus kuin

c-Myc

RNAi ja pienentää eturauhasen syöpäsolun selviytymisen androgeeni ligandia köyhdytettyä olosuhteissa.

Tutkimustemme selventää, että

c-Myc

on keskeinen androgen ligandista riippumatonta AR kohdegeenin, joka edistää androgeenireseptorin ligandista riippumaton mutta AR riippuvan eturauhassyövän solujen eloonjäämistä. Tuloksemme osoittavat myös mahdollisuuksia AR-hoitojen, tai c-Myc-hoitojen, eturauhassyövässä lisänä ADT.

Tulokset

AR ja

c-Myc

ovat yhtäpitävästi ilmaistuna Metastaattinen CRPC

sekä AR ja c-Myc ovat kriittisiä eloonjäämisreittejä eturauhassyövässä, ja ekspressiotasot sekä

AR

ja

c-Myc

ovat yleisesti lisääntyi ihmisen CRPC kasvaimissa etenee huolimatta ADT [24], [25]. Kuitenkin se oli tiedetä yliekspressio

AR

ja

c-Myc

oli yhdistetty muihin ihmisen CRPC kasvaimissa. Niinpä määritettiin ilmentymistasojen

AR

ja

c-Myc

geenien ilmentymisen mikrosiruja 140 ihmisen CRPC kasvaimissa versus 15 terveessä eturauhasessa. Seuraavaksi tutkimme yhdistys

AR

säätelyä ja

c-Myc

säätelyyn ylöspäin ihmisen CRPC kasvaimia.

AR

mRNA tasot CRPC näytteet liittyy vahvasti

c-Myc

mRNA-tasot (Pearsonin korrelaatio = 0,3698, 95%: n luottamusväli: 0,2172-+0,5048, kaksisuuntainen p-arvo 0,0001 ) (kuvio 1A). Olemme myös laskea kertoimet suhde

c-Myc

ja

AR

säätelyyn ylöspäin näissä CRPC yksilöitä. Oli tilastollisesti merkittävää yhteyttä

AR

säätelyä ja

c-Myc

säätelyä (OR = 3,528, 95%: n luottamusväli: 1,347-9,240, p-arvo: 0,0108 Fisherin Exact Test) (kuvio 1 B).

A) Z-score (normaaliin eturauhasnäytteissä) on

AR

versus

c-Myc

mRNA ilmaisun yli 140 ihmisen CRPC etäpesäkkeitä. Pearsonin korrelaatiokerrointa, lineaarinen regressio, ja F testi merkitsevästi nollasta rinne tehtiin kunkin parin geenejä. B) Fisherin testiä ja riskisuhde on kontingenssitaulukkomenetelmillä analysoimalla yhteistyössä kasvaimia esiintyi kanssa

AR

tai

c-Myc

z-arvoja suurempi kuin 2.

AR Suppression Vähentää kasvu AR ligandista riippuvaa ja AR Ligandivälitteinen riippumaton kastraatio kestävä syöpäsolujen

tukahdutti ilmaus

AR

kanssa RNAi eturauhassyöpäsoluissa kasvatettu hiilellä erotettua, androgeenireseptorin ligandin köyhdytettyä seerumia.

AR

RNAi vähentää solujen kasvua sekä androgeenin ligandista riippuvan LNCaP-solujen ja niiden CRPC johdannaiset kutsutaan LNCaP-abl (kuvio 2A). Huomattavaa on, että molemmat näistä soluista vain ilmaista täyspitkän AR transkriptin.

AR

tukahduttaminen kanssa RNAi vuonna 22RV1 CRPC solulinjaa, joka ilmentää sekä täyspitkä AR ja AR transkripti variantti saavuttaa sama vaikutus (kuvio 2A). Kaikissa solulinjoissa, AR suppression vähentää solujen kasvua aiheuttamatta apoptoosia (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa virheeseen leviämisen. Näin ollen, vaikka androgeenireseptorin ligandin ehtyminen,

AR

poistaminen vähentää edelleen eturauhasen syöpäsolujen kasvua.

A) LNCaP, abl ja 22RV1 solut transfektoitiin 50 nM ei-kohdennettuja ohjaus (NTC) tai

AR

RNAi oligonukleotideja. Solut kytketään hiilellä erotettua seerumia päivänä transfektion. Solujen kasvu määritettiin 5 päivää myöhemmin LNCaP ja 6 päivää myöhemmin abl ja CRPC 22RV1 kanssa trypaanisinieksluusiolla menetelmällä. B) Immunoblot AR ilme. Alempi bändejä AR immunoblot vuonna 22RV1 soluissa heijastavat läsnäolo AR transkriptin variantti [7]. B) LNCaP, abl ja 22RV1 solut transfektoitiin 50 nM NTC tai

c-Myc

RNAi oligonukleotideja. Solut kytketään hiilellä erotettua seerumia päivänä transfektion. Solujen kasvu määritettiin 5 päivää myöhemmin LNCaP ja 6 päivää myöhemmin abl ja 22RV1 kanssa trypaanisinieksluusiolla menetelmällä. Immunoblot C-Myc-proteiinin ilmentymisen. C) LNCaP-solujen stabiileja yli-ilmentymisen tyhjän vektorin (EV) tai c-Myc luotiin. Nämä solut transfektoitiin 50 nM ei-kohdennettu ohjaus (NTC) tai AR siRNA oligonukleotideja. Solujen kasvu määritettiin 6 päivää myöhemmin kanssa trypaanisinieksluusiolla menetelmällä. Immunoblot AR ja c-Myc-proteiinin ilmentymisen. Korkeampi bändejä c-Myc immunoblottaus c-Myc-yli-ilmentävät solut edustavat ektooppisesti-ilmaistaan ​​c-Myc. * Osoittaa p 0,05 verrattuna NTC.

c-Myc Suppression yhteenveto siitä Effect of AR poisto, ja c-Myc-ilmentymän Vaimentaa antituumorivaikutuksen AR Suppression

onko c-Myc vaikuttaa myös eturauhasen syöpäsolun kasvua riippumaton androgeenireseptorin ligandien, me tukahdutti

c-Myc

käyttäen RNAi. Kuten

AR

downregulation,

c-Myc

alassäätö tukahdutetaan ligandista riippumatonta kasvua LNCaP, abi, ja 22RV1 soluja (kuvio 2B). Edelleen, me samanaikaisesti vaimentaa

AR

ja

c-Myc

kanssa RNAi. Kosuppressio molempien proteiinien ei vähentänyt solujen kasvua yli tukahduttaminen joko

AR

tai

c-Myc

itsestään (kuva S1).

osoitti myös, että

c-Myc

yli-ilmentymisen siirrettävä ligandista riippumatonta kasvua ligandista riippuvan LNCaP lisätyistä pitkäaikaisia ​​kastraatiotason olosuhteissa, mikä on yhtäpitävä aikaisemman raportin (kuva S2) [21]. Seuraavaksi tukahdutti

AR

kanssa RNAi LNCaP-soluissa yli-ilmentävät tyhjän vektorin tai

c-Myc

ja määrällisten solujen kasvua.

c-Myc

yliekspressio suojasi kasvua tukahduttava vaikutus

AR

RNAi (kuvio 2C). Tämä osoittaa, että

c-Myc

ainakin osittain myötävaikuttaa AR vaikutuksista edistämisestä ligandista riippumatonta eturauhassyöpä solujen eloonjäämistä.

AR mutta ei Androgeenit edistää c-Myc Expression

c-Myc

-onkogeeni yleisesti yliaktiivista eturauhassyöpä, ja

c-Myc

ilmentymisen lisääntyminen edistää ligandista riippumatonta eturauhassyöpä solujen eloonjäämistä [21]. Kuitenkin riippuvuus

c-Myc

ilme AR ei ollut osoitettu. Näin ollen meidän tutkitut aiemmin julkaistu ChIP microarray tiedot, lokalisoitu AR koko genomin androgeenin ligandista riippuvan LNCaP-solujen ja niiden Abl CRPC johdannaiset [17]. AR on raportoitu sitoutua tehostaja on

c-Myc

geenin molemmissa näistä solulinjoista. Siksi meidän vieressä käytetään sirun nämä tulokset vahvistava.

Ensinnäkin kasvoi soluja hiilellä erotettua, androgeenireseptorin ligandin köyhdytettyä seerumia ja määritettiin vaikutus hoidon androgeenireseptorin ligandin R1881 päälle AR käyttöasteen ja histoni asetylaatio, merkki aktiivisen transkription kello

c-Myc

hostajaelementti käyttäen siru. Olemme myös mitataan vaikutuksia R1881 hoitoa hyvin kuvattu, ligandiaktivoituja geeni

KLK3

. AR ja korkea histoni asetylaatio oli läsnä

c-Myc

tehostajansa vaikka soluja kasvatettiin ligandia köyhdytettyä seerumia (kuvio 3A). Edelleen lisäämällä R1881 kulttuuriin ei tehostanut AR käyttöaste tai histoni asetylaatio osoitteessa

c-Myc

(kuvio 3A). Tämä on ristiriidassa vaikutusta R1881 on

KLK3

geeni edistävää lisääntynyt rikastuminen AR ja histoni asetylaatio (kuvio 3A).

LNCaP, abi, ja 22RV1 soluja kasvatettiin hiilellä erotettua seerumia 72 tuntia ja käsiteltiin sitten 10 nM R1881: n (tai etanoli ajoneuvo) 4 tunnin ajan. A) Kromatiini immunosaostus suoritettiin määrittämään rikastumista AR ja histoni H3 asetylointi (AcH3) on

c-Myc

ja

KLK3

tehostajana elementtejä. B) QRT-PCR suoritettiin määrittämään mRNA tasot

KLK3

ja

c-Myc

suhteessa aktiini. C) Immunoblottaus suoritettiin määrittämään proteiinin tasot AR, c-Myc, ja aktiini. * Tarkoittaa p 0,05 verrattuna vehikkeliin.

vieressä määritti R1881 hoidon ilmentymisen

c-Myc

tai

KLK3

. R1881-hoito lisäsi

KLK3

ilmentymistä (kuvio 3B). Kuitenkin R1881 hoito ei lisännyt

c-Myc

ilme. Kuvio 3B, C).

Seuraavaksi käsitellään eturauhassyövän solut MDV3100, voimakas, uusi androgeeniantagonistin [26]. MDV3100 hoito tukahdutti ilmentymisen

KLK3

mutta ei vaikuttanut ekspressioon

c-Myc

. (Kuva S3). Nämä tulokset tukevat edelleen käsitystä, että androgeenireseptorin ligandit eivät edistä ilmaus

c-Myc

.

Voit selvittää AR kykeni säännellä

c-Myc

on ligandista riippumattomalla tavalla, käytimme RNAi tukahduttaa ilmaisun

AR

ja mitataan

c-Myc

ilme. RNAi-välitteinen tukahduttaminen

AR

vähensi c-Myc-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen (kuvio 4A, B). Suoritimme ChIP määrityksiä ja vahvisti, että

AR

RNAi pienentää AR ja histoni asetylaatio päässä

c-Myc

tehostajana (kuvio 4C). Tämä oli merkittävintä 22RV1 solulinjassa, vaikka vahva kehitys oli nähtävissä myös LNCaP ja Abl soluja. Siten

c-Myc

on suora AR kohdegeenin ja

AR

RNAi vaimentaa

c-Myc

ilmentymistä ainakin osittain läpi ehtymiseen AR ja histoni asetylaatio alkaen

c-Myc

tehostajana. Myös yli-ilmennetään AR M12 eturauhassyövän solulinjaa, joka ei normaalisti ilmaista AR. AR yli-ilmentyminen kasvoi c-Myc-mRNA ja proteiinin ilmentyminen (kuva S4). Tämä tukee edelleen käsitystä, että AR aktivoi

c-Myc

ilmentymisen ligandista riippumattomalla tavalla.

LNCaP, abi ja 22RV1 solut transfektoitiin 50 nM ei-kohdennettu ohjaus (NTC) tai AR RNAi oligonukleotideja. Sitten soluja kasvatettiin hiilellä erotettua seerumia 96 tunnin ajan. Lopussa hoidon, solut kerättiin poimia mRNA: ta ja proteiinia. A) QRT-PCR suoritettiin määrittämään tasot

c-Myc

suhteessa

aktiini

. B) Immunoblottaus suoritettiin määrittämään tasojen AR, c-Myc ja aktiini. C) Parallel käsittelyt tehtiin ja soluja ristisilloitettu ja käsitelty sirun määrittämiseksi AR ja histoni H3 asetylointi (AcH3) rikastumiseen

c-Myc

tehostajana. * Osoittaa p 0,05 verrattuna NTC.

AR Suppression yhteenveto siitä Effect c-Myc Suppression

Seuraava ratkaistava, onko RNAi-välitteinen tukahduttaminen

AR

kertasi vaikutus RNAi-välitteinen tukahduttaminen

c-Myc

ilmentymiseen hyvin kuvattu

c-Myc

kohdegeenien (kuvio 5) [27], [28]. Molemmat

c-Myc

RNAi ja

AR RNAi

vähensi ilmaus

c-Myc

aktivoitujen geeni

E2F1

; päinvastoin,

c-Myc

ja

AR

RNAi sekä lisääntyneen ekspression

c-Myc

-repressed geenin

CDKN1A

(kuvio 5). Viimeaikaiset raportit osoittavat, että mitoosi geenit, kuten

KIF11

,

AURKB

, ja

TPX2

, ovat keskeisiä c-Myc kohdegeenien [29] – [31].

AR

RNAi kertasi vaikutus c

Myc

RNAi ja vähensi myös näiden geenien ilmentymistä (kuvio 5). Tämä osoittaa, että AR tukahduttaminen häiritsee c-Myc toiminta ja ilmentyminen vakiintunut c-Myc kohdegeeneissä.

LNCaP ja abl-solut transfektoitiin 50 nM ei-kohdennettu ohjaus (NTC) ja joko A)

AR

tai B)

c-Myc

RNAi oligonukleotideja. Solut kytketään hiilellä erotettua seerumia päivänä transfektion ja kerättiin 96 tuntia myöhemmin. QRT-PCR suoritettiin sen määrittämiseksi, tasot ilmoitettu

c-Myc

kohdegeenien suhteessa

aktiini

. * Osoittaa p 0,05 verrattuna NTC.

BET Bromodomain Inhibitor JQ1 vaimentaa c-Myc toimintaa ja vähentää AR Ligandivälitteinen riippumaton Eturauhassyöpä Cell Survival

Tuloksemme osoittavat, että

c-Myc

on tärkeä AR kohdegeenin mutta

c-Myc

n ilmaisua ei aktivoi androgeeni ligandien. Tällä hetkellä hoidot tukahduttaa AR ilmaisua ei ole vielä saatavilla. Kuitenkin viime aikoina työ osoittaa, että BET bromodomain estäjä kutsutaan JQ1 estää c-Myc ilmaisun ja c-Myc-toiminto, koska

c-Myc

on bromodomain kohdegeenin [22], [23]. Siksi me käsitellään syöpäsolujen kanssa JQ1. JQ1 pienensi mRNA: ta ja proteiinia tasot c-Myc (kuvio 6A, B) ja tukahdutetaan c-Myc, joka voidaan mitata c-Myc kohdegeenin ilmentymistä (kuvio 6B). Lopuksi, kuten

c-Myc

RNAi, JQ1 hoito nanomolaarisina pitoisuuksina vähentää ligandista riippumatonta eturauhassyöpä solujen eloonjäänti (kuvio 6C).

LNCaP, abi, ja 22RV1 soluja kasvatettiin charcoal- riisuttu seerumia ja vehikkeliä, 50 nM, 250 nM tai 500 nM JQ1 24 tunnin välein 72 tunnin ajan. A) Immunoblottaus suoritettiin määrittämään proteiinin tasot c-Myc. B) QRT-PCR suoritettiin sen määrittämiseksi, mRNA: n taso

c-Myc

ja c-Myc kohdistuu geenien

KIF11, CDKN1A, TPX2

, ja

AURKB

suhteessa

aktiini

. * Osoittaa p 0,05 verrattuna ajoneuvoon. C) Solujen elinkelpoisuus määritettiin lopussa hoidon trypaanisinieksluusiolla menetelmällä. p 0,01 250 nM ja 500 nM annokset vs. ajoneuvon kaikissa kolmessa solulinjoissa.

Keskustelu

On hyvin ymmärrettävää, että AR on kriittinen kuljettaja eturauhasen syöpäsolun selviytymisen ja AR osuus eteneminen kohtalokas CRPC hoidosta huolimatta ADT [24]. Monissa tapauksissa Androgeenien jatkuvat solun sisällä CRPC kasvaimia huolimatta kastraatiotasojen seerumin Androgeenit [24], [32]. Kuitenkin androgeeni ligandista riippumatonta, mutta AR-riippuvainen mekanismeja, jotka edistävät myös eloonjäämistä CRPC solujen on raportoitu. Näitä ovat aktivaatio AR IL-6, AR-geenin monistamisen, ja AR transkriptivariantissa, että ei ole androgeenireseptorin ligandin sitova domeeni [7] – [9], [15]. Kaikki nämä mekanismit voivat edistää eturauhassyövän etenemiseen huolimatta ADT koska kukaan ei ole suoraan kohdistettu ADT.

Äskettäin osoitettiin, että AR proteiini edistää geenin ilmentymistä ohjelman eroaa sen kanoninen androgen ligandin ohjaama tavoitteet CRPC soluissa [17]. Yksi tällainen esimerkki on AR kohdegeenin

UBE2C

joka edistää ligandista riippumatonta eturauhassyöpä leviämisen [17]. Mitkä muut AR-geenituotteiden on kriittinen ligandista riippumatonta eturauhassyöpä solujen eloonjäänti on ollut epäselvä. Työmme osoittaa, että

c-Myc

onkogeeni on niin ligandista riippumatonta AR kohdegeenin.

c-Myc

yleisesti yliaktiivista eturauhassyöpä, ja

c-Myc

yliekspressio muuntaa normaalit eturauhasen epiteelisolujen geenitekniikalla hiirimalleissa eturauhassyövän ja antaa ligandista riippumatonta eturauhassyöpä solujen eloonjäämistä, mutta riippuvuus

c-Myc

ilme AR oli epäselvä [18], [20], [21], [33]. Osoitamme tässä, että

AR

ja

c-Myc

yleisesti yläreguloituja CRPC, ja varmistimme, että

AR

ja

c-Myc

säätelyä voimakkaasti korreloivat toistensa kanssa suuren joukon metastaattisen CRPC potilaan kasvaimia (kuvio 1).

vahvistaneet, että

AR

vaimennus johtaa menetykseen c-Myc ilmentyminen eturauhassyövässä, jotka ilmentävät koko -Pituus AR (LNCaP ja Abl) ja toisessa CRPC solulinjassa 22RV1 joka ilmentää sekä täyspitkä AR ja AR transkripti variantti. Vaikka emme voi sulkea rooli AR transkriptio muunnos edistää myös

c-Myc

ilmaus, tuloksemme AR RNAi LNCaP ja Abl ja tuloksemme kanssa AR yli-ilmentymisen M12 soluissa osoittavat, että täyspitkä AR on joka kykenee aktivoimaan

c-Myc

ilmentymistä (kuvio 4, kuva S4).

Kuten

AR

RNAi,

c-Myc

RNAi vähentää eturauhasen syöpä solujen selviytymistä androgeeni ligandista köyhdytettyä olosuhteissa samalla kosuppressio on

AR

ja

c-Myc

ei ollut tehokkaampi kuin tukahduttaminen joko proteiinia yksinään (kuvio 2, Kuva S1).

c-Myc

yli-ilmentymisen antaa ligandista riippumatonta selviytymisen eturauhasen syöpäsolujen (kuva S2), joka vastaa ensin kertomusta [21]. Osoitimme myös, että

c-Myc

yli-ilmentyminen vaimenee anti-kasvain aktiivisuus

AR

suppressiota RNAi (kuvio 2C). Siten, c-Myc vaikuttaa AR: n vaikutusten edistämiseksi ligandista riippumatonta eturauhassyöpä solujen eloonjäämistä.

Huolimatta siitä, että AR edistää ilmentymistä

c-Myc

hoito androgeenireseptorin ligandin ei lisätä

c-Myc

ilmentymistä (kuvio 3). Lisäksi hoito androgeenireseptorin ligandien ei tehostanut AR käyttöasteen

c-Myc

tehostajana (kuva 3). Tämä on ristiriidassa vaikutukset androgeenistimulaation ekspressioon

KLK3

geeni, hyvin kuvattu androgen-aktivoitu geeni, ja AR käyttöasteen

KLK3

tehostajana (kuva 3). Edelleen vahvistaa, että AR edistää ilmentymistä

c-Myc

ligandista riippumattomalla tavalla, käsittelimme syöpäsolujen uuden, voimakas androgeeniantagonistin MDV3100 [26]. Hoito MDV3100 tuoreessa satunnaistetussa, lumekontrolloitu faasin III kliinisessä tutkimuksessa parantanut eloonjäämisaste potilaiden kanssa CRPC [34]. Kuitenkin joillakin potilailla ei tuumorivaste, ja eteneminen AR jää tumassa [3], [6], [34]. Vaikka MDV3100 pienensi ilmentymistä

KLK3

, MDV3100 hoito ei vaikuttanut

c-Myc

ilmentymistä (kuvio S3). Nämä tiedot tukevat edelleen käsitystä, että AR edistää

c-Myc

ilmentymisen ligandista riippumattomalla tavalla.

c-Myc

on kriittinen tekijä ligandista riippumattoman eturauhassyövän etenemisen (kuvio 2, kuvio S2) [21]. Siksi tulevaisuudessa, on tärkeää mitata

c-Myc

ilmaisun ja funktion CRPC potilaan kasvaimissa etenee huolimatta täydellisempi androgeenireseptorin häiriöitä lääkkeiden, kuten MDV3100.

Tärkeiden on

c-Myc

alavirran tekijä AR vaikutuksista ligandista riippumatonta eturauhassyöpä solujen eloonjäämistä, käsittelimme syöpäsolujen BET bromodomain estäjä JQ1, huumeeseen tukahduttaa ilmentymisen bromodomain kohdegeenien; joista tärkein oli

c-Myc

[22], [23]. Ennestään tutkimuksissa, JQ1 käsittely in vitro ja in vivo vaimentaa c-Myc ilmentymistä ja toimintaa ja esti tuumorin kasvua ilman havaittavaa toksisuutta [22], [23].

vahvisti, että JQ1 eturauhassyövän hoitoon soluihin käyttämällä nanomolaarinen pitoisuuksilla, jotka saavutetaan samaa yleistä vaikutukset kuin RNAi-välitteinen tukahduttaminen

c-Myc

– c-Myc-mRNA: n ja proteiinin ehtyminen, tukahduttaminen c-Myc-toiminto, ja suppressio ligandista riippumattoman eturauhassyövän solujen eloonjäänti (kuvio 6 ). Kun otetaan huomioon osallistumista

c-Myc

kriittisissä fysiologisiin prosesseihin, kohdistaminen c-Myc-proteiinin yleensä useita solutyyppejä pitkäaikaisilla anto voi olla epätoivottavaa [35], [36]. Kliiniset tutkimukset ovat tarpeen määrittää turvallisuuden bromodomain eston. Kuitenkin tulokset tähän mennessä, mukaan lukien oma, viittaavat siihen, että tämä on lupaava tuumorin vastaista strategiaa hoitoon CRPC (kuvio 6) [22], [23].

Lopuksi, että AR valvonta ilmaus sen kohdegeenien, kuten

c-Myc

kudosspesifisellä tavalla viittaa siihen, että ihanteellinen aine tukahduttamista

c-Myc

ilmentymistä eturauhasen syöpäsolujen sanottuna olisi kohdennettava AR, itse. Itse asiassa, tutkimuksemme selventää, että androgeeni ligandista riippumatonta, mutta AR-riippuvaisia ​​

c-Myc

geenin ilmentymisen lisääntyminen on mekanismi, jolla AR proteiini edistää ligandista riippumaton selviytymisen eturauhasen syöpäsoluja. Meidän tutkimukset tukevat kelvollisuus pyrkimyksiä tukahduttaa AR: n ligandista riippumatonta toiminta ja ilmentyminen tärkeitä ligandista riippumatonta AR-kohdegeenien, kuten

c-Myc

(kuva 7). Drugs pystyvät ehkäisemään AR ilmaisun vasta nyt tulla testaukseen. Nämä lääkkeet ovat selektiivisiä AR hajottavia ja AR anti-sense-oligonukleotidit [37] – [40]. Odotamme tulokset kliinisissä tutkimuksissa turvallisuuden määrittämiseksi, spesifisyys, tehoa ja näiden aineiden miehillä, joilla on edennyt eturauhassyöpä.

Tällä hetkellä androgeenideprivaatio hoitoja, jotka häiritsevät androgeenien ligandin aktivointi AR käytetään pääasiassa tämän sairauden hoidossa. Näiden hoitojen tukahduttaa AR androgeenitasot ligandista riippuva toiminto ja tukahduttaa ilmaisun androgeenista ligandista riippuvaa (AD) AR-kohdegeenien. Vaikka nämä hoidot eturauhassyövän etenemistä on väistämätöntä. AR edistää myös ilmaus androgen ligandista riippumatonta reittejä kuten

c-Myc

.

c-Myc

geeni on yleisesti yliaktiivista eturauhassyöpä ja edistää androgen ligandista riippumatonta eturauhassyöpä etenemisen. Tämä malli viittaa vahvasti siihen, että AR tai c-Myc-hoitojen, täydentäisi nykyistä androgeenideprivaatioterapian strategioita.

Methods

Cell Culture

LNCaP ja 22RV1 solut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC), ja niitä kasvatettiin 10% hiilellä erotettua naudan sikiön seerumia kaikissa kokeissa. Abl-soluja, CRPC johdannainen LNCaP olivat ystävällinen lahja Zoran Culig, PhD ja kasvatettiin RPMI 10% hiilellä erotettua naudan sikiön seerumia. M12 eturauhassyövän soluissa, jotka ilmentävät tyhjän vektorin tai AR olivat ystävällinen lahja Stephen R. Plymate, PhD, ja kasvatettiin, kuten aiemmin on kuvattu [9].

RNAi kokeissa, LNCaP ja abl-solut transfektoitiin RNAi oligonukleotidien (

AR

: 5′-GACCUACCGAGGAGCUUUCUU-3 ’, ja

c-Myc

: 5′-GAGCUAAAACGGAGCUUUUdTdT-3′) käyttäen DharmaFECT 3 (Dharmacon) transfektioreagenssia lopullisen pitoisuuden 50 nM [41]. 22RV1-solut transfektoitiin siRNA: lla oligonukleotidien avulla Iipofectamine2000 (Life Technologies) transfektion reagenssin lopulliseen pitoisuuteen 50 nM. Solut kerättiin ilmoitettuina ajankohtina transfektion jälkeen.

R1881 (Sigma) suspendoitiin uudelleen 100% etanolia. MDV3100 ostettiin (Selleckchem) ja suspendoidaan uudelleen DMSO. JQ1 ostettiin Sigma ja suspendoitiin DMSO: ssa. Solujen kasvu määritettiin lopussa hoidon trypaanisinieksluusiolla menetelmällä (Life Technologies) seuraavien valmistajien ohjeiden mukaisesti. Kaikki soluviljelmäkokeita suoritettiin biologisen triplikaattinäytteet ja vahvistettiin toistetuista kokeista.

LNCaP-solujen stabiileja yli-ilmentymisen c-Myc tai tyhjän vektorin kertyi transfektoimalla LNCaP soluja pCDNA-DEST40-

c- myc

(ystävällisesti Rosalie Sears, PhD) tai pCMV6-AN-His (Origene) ja valitsemalla G418: lla.

Colony-muodostelman Pitoisuus

200000 LNCaP vakain yliekspressio tyhjän vektorin (EV) tai

c-Myc

maljattiin 10 cm ruokia. RPMI 10% hiilellä erotettua naudan sikiön seerumia, jota oli täydennetty 300 ug /ml G418: aa ja 10 ug /ml bikalutamidi hoitoon lisättiin soluihin joka toinen päivä 14 päivää. Seuraavaksi solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä ja värjättiin syto60 (Invitrogen). Kuvat otettiin Licor Odyssey kuvantamisjärjestelmä.

immunoblottauksella

immunoblottauksella kokeet suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [42]. Lopulliset kuvat saatiin Licor Odyssey kuvantamisjärjestelmä. Ensisijainen vasta käytettiin: AR (N-20, Santa Cruz); aktiini (Sigma) ja c-Myc (Epitomics). Toissijainen vasta-aineet hankittiin Licor.

QRT-PCR

-RNA uutettiin solupelleteistä tallennetaan RNAlater-reagenssia (Life Technologies) käyttäen MagMAX Kokonais-RNA Isolation Kit (Life Technologies) tai Trizol ( Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA-pitoisuus määritettiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop). 250 ng-1 ug RNA: ta (normalisoitu kullekin kokeelle) käänteiskopiointiin käyttäen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) satunnaisella alukkeita. Realtime (QRT) -PCR tehtiin käyttämällä 7500 Fast thermocycler (Life Technologies), jolla on seuraavat Sykliohjelma: 50 ° C 2 min, 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia dissosiaatio, 60 ° C 1 min /pidentyminen /lukea. 10 ui singleplex RTPCR reaktiot sisälsivät 1 x Taqman yleisstandardia Mastermix, 1X Taqman hydrolyysikoetin, ja 10 ng RNA yhtä cDNA mallia. Ihmisen beeta-aktiinin (# 4326315E) käytettiin endogeenista ohjaus. Primer tiedot ovat taulukossa S1.