Krooninen sairaus

tiivistelmä

RND3 /RhoE on pieni Rho GTPaasina säätelyyn osallistuvan erilaisten solun käyttäytymistä. Häiriöstä RND3 on yhdistetty kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeitä. Keuhkosyöpätapauksista johtava syy syövän liittyvän kuoleman lännen ja ympäri maailmaa. Ilmentyminen RND3 ja sen kohdunulkoinen roolia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) pysyvät löytäjäänsä. Täällä raportoimme että RND3 oli alassäädetty kolmessa NSCLC solulinjoissa: H358, H520 ja A549. Alas-säätely RND3 johti hyper-aktivointi Rho Kinase ja Notch signalointi. Uudelleen käyttöön RND3 tai estävät selektiivisesti Notch signalointia, mutta ei Rho kinaasisignaloinnin, tukossa leviämisen H358 ja H520-soluissa. Mekanistisesti Notch solunsisäinen domeeni (NICD) proteiinia runsaasti H358-soluissa säätelee RND3 välittämä NICD proteasomin hajoamista. RND3 säännelty H358 ja H520-solujen lisääntymisen kautta Notch1 /NICD /Hes1 signalointi akselin riippumaton Rho-kinaasi.

Citation: Tang Y, Hu C, Yang H, Cao L, Li Y, Deng P, et ai. (2014) RND3 Säätelee Keuhkosyöpä Cell Proliferation kautta Notch Signaling. PLoS ONE 9 (11): e111897. doi: 10,1371 /journal.pone.0111897

Editor: Jeremy J.W. Chen, Institute of Biomedical Sciences, Taiwan

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 29 syyskuu 2014; Julkaistu: 5. marraskuuta 2014

Copyright: © 2014 Tang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Key sitaattina National Clincial Research Center for Respiratory Disease, National Key Scientific Tekniikka Support Program: Collaborative innovaatio of Clinical Research keuhkoahtaumatauti ja keuhkosyöpä, No. 2013BAI09B09. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien kehittyneissä maissa. Päätyyppiä keuhkosyöpään on pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Edistysaskelista huolimatta nykyinen lääketiede, yleinen 5 vuoden pysyvyys potilaiden diagnosoitu NSCLC on noin 15%, mikä osoittaa, että (1) meillä ei ole tehokas tapa estää NSCLC; ja että (2) emme täysin ymmärrä NSCLC. Toistumisen maligniteetin ja kemoterapian resistenssin kaksi merkittävää rajoituksia hoidossa keuhkosyövässä. Kiinnostaa, useita pahanlaatuisia kasvaimia, jotka ovat resistenttejä ovat tiiviisti sääteli Notch signalointi [1]. Rooli Notch signaloinnin NSCLC on kiistanalainen. Jotkut tutkimukset ovat raportoineet, että aktiivinen Notch1 esti kasvua noin NSCLC-solujen [2], [3], kun taas uudempi tutkimus osoitti, että Notch1 aktivoiva mutaatio noin 10% NSCLC johti huonoon ennusteeseen potilailla [4]. Siksi lisätutkimukset Notch signaloinnin NSCLC on välttämätöntä ymmärtää tämän taudin ja voi olla hyödyllistä hoitoon NSCLC.

RND3, joka tunnetaan myös nimellä RhoE, on pieni GTPaasina osallisena säätelyssä monenlaisia solun käyttäytymistä, kuten solun tukirangan, jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja apoptoosin [5] – [9]. Biologisen toiminnan RND3 ensin tunnistettiin ROCK1 repressorin, joka säätelee aktiinin dynamiikka [5]. Viime aikoina tutkimukset ovat laaja toiminta RND3 syövän ja neuroni järjestelmän kehittämiseen. Mielenkiintoista, RND3 säätyy alas eri syöpäsoluja, kuten rinta- syöpäsolujen [8], maksasyövän [10], okasolusyöpä [11], mesenkymaaliset kasvainsoluissa [12], jne. Kuitenkin, tutkimukset ilmaisun ja biologinen toiminta RND3 NSCLC ovat hyvin rajalliset.

rooli RND3 säätelyssä solusykli raportoitu vuosikymmen sitten. Pakko yliekspressio RND3 estää solujen lisääntymisen ja seerumin aiheuttama S-vaihe tulo, riippumaton RhoA-ROCK signalointia, mikä osoittaa, että monimutkaiset signalointi on osallisena solusyklin säätelyssä [13]. Tuore julkaisu tutkitaan erittäin mielenkiintoinen suhde RND3 ja Notch signalointi [7]. Poisto RND3 johti säätely ylöspäin Notch signalointi hiirissä ependyymisoluissa, edistää proliferaatiota näissä soluissa. RNAi-välitteinen RND3 alassäätöä kahdessa solulinjoissa, MDA MB-231 ja HepG2, edistänyt soluproliferaatiota, solusykliä ja hyökkäystä. Kuitenkin rooli RND3 keuhkojen syövissä, erityisesti NSCLC, jää epäselväksi. Tämä tutkimus, ensimmäistä kertaa, paljastaa patogeeninen roolit RND3 NSCLC, mukaan lukien seuraavat: 1) RND3 on säädellä vähentävästi A520, H358 ja A549, kolme keuhkosyövän solulinjat; 2) pakotettu ilmentymä RND3 in A520 ja A358 solut estää soluproliferaatiota; 3) RND3 välittämä solujen lisääntymistä säädellään Notch signaloinnin sääntelyn kautta translaation jälkeisen modifikaation.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja stabiilien solulinjojen

H358 (ATCC, CRL-5807), H520 (ATCC HTB-182) ja A549 (ATCC, CCL-185) soluja viljeltiin RPMI-1640 (Life Technologies, Cat # 11875-085) plus 10% naudan sikiön seerumia (Life Technologies, Cat # 16000-044) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Life Technologies, Cat # 15140-148). HBEC soluja viljeltiin Keratinosyyttejä seerumia (Life Technologies, Cat # 17005-042) plus naudan aivolisäkeuutteella (Life Technologies, Cat # 13028-014) ja yhdistelmä-humaani EGF (Life Technologies, Cat # PHG0311).

RND3 cDNA subkloonattiin lentivirusvektori pWPI-polio-eGFP. 293 T (Invitrogen, Carlsbad, CA) soluja transfektoitiin lentivirusvektorin ilmentävät RND3 ja kaksi auttaja vektorit, pMD2 ja psPAX2, tuottaa lentivirus. H358 ja H520-soluja infektoitiin sitten viruksen MOI-arvolla 10. infektion tehokkuus varmistettiin GFP: n ilmentymisen avulla fluoresenssimikroskopialla. Infektoituja soluja valittiin puromysiini (2 ug /ml). Yksi klooni valittiin stabiilien solulinjojen, H358-RND3 ja H520-RND3.

solujen määrä mittauksen kokeissa solut synkronoitu: ssa 12 h ja 10

5-solut kustakin ryhmästä viljeltiin kasvatusliuoksessa. Solujen lukumäärä laskettiin 24 tunnin välein yhteensä 5 päivää.

Immunoblottausmääritys

Protein näytteiden western blot analyysiä uutettiin RIPA-puskuria (Thermo Scientific, Cat # 89900) sekä proteaasi- estäjä cocktail (Roche, Cat # 11836153001) ja fosfataasi estäjät (50 mM NaF, 2 mM Na

3Vo

4, 4 mM natriumpyrofosfaatti). Kaupallisesti saatavilla vasta-aineet olivat peräisin seuraavista lähteistä: MYPT1 (2634 S), fosfori-T853 MYPT1 (4563 S) ja PDK1 (3062) Cell Signaling Technology (MA, USA); MLC2 (PA5-17624) ja fosfo-Ser20 MLC (PA5-17727) Thermo Scientific Piercen (IL, USA); ROCK1 (sc-5560) ja RND3 (sc-53874) Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Hes1 (ab71559) ja Notch1 (ab27526) olivat Abcam (MA, USA). Vastaavaa proteiinia lastaus varmennettiin intensiteetti GAPDH (sc20357, Santa Cruz, CA) blot.

mRNA louhinta ja qRT-PCR

Yhteensä-RNA uutettiin Trizol reagenssia (Life Technologies, 15596-026). qRT-PCR suoritettiin käyttäen SYBR green menetelmä, jossa perusseosta puskurisysteemiä. Alukkeiden sekvenssit olivat seuraavat: RND3: CTATGACCAGGGGGCAAATA /TCTTCGCTTTGTCCTTTCGT; Jag-1: CTATGATGAGGGGGATGCT /CGTCCATTCAGGCACTGG; Jag-2: TGGGATGCCTGGCACA /CCGGCAGATGCAGGA; Dll-1: GAGGGAGGCCTCGTGGA /AGACCCGAAGTGCCTTTGTA; Dll-4: GCATTGTTTACATTGCATCCTG /GCAAACCCCAGCAAGAGAC; Notch1: CACTGTGGGCGGGTCC /GTTGTATTGGTTCGGCACCAT; Hes1: AGGCGGACATTCTGGAAATG /CGGTACTTCCCCAGCACACTT; GAPDH: GAGTCAACGGATTTGGTCGT /TTGATTTTGGAGGGATCTCG.

BrdU

solut synkronoidaan ja sitten viljeltiin kasvatusväliaineessa 12 h seurasi BrdU (bromodeoksiuridiini) käsittely 30 minuuttia ennen sadonkorjuuta. Anti-BrdU-vasta-ainetta (hiiri, BD, 552598, 1:1000) inkuboitiin 4 ° C: ssa 16 h, ja toisen vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta, joka oli konjugoitu Alexa Fluor 594 (1:200) ostettiin Invitrogen ( A11032). Inkubointiaika oli 1 tunti huoneenlämpötilassa, valolta suojattuna. Tumat visualisoitiin DAPI (4 ’, 6’diamidino-2-fenyyli) (Vectashield, Vector Laboratories, Inc. H1000), ja kuvat hankittiin fluoresenssimikroskopialla (DMI 4000B, Leica, Mannheim, Saksa).

tilastollinen analyysi

tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD Useamman ryhmässä vertailussa, yksisuuntainen ANOVA, jonka jälkeen Student-Newman-Keuls menetelmää käytettiin. 2-ryhmä vertailujen parittoman, kaksihäntäinen opiskelijan

t

testillä. Kaikki analyysit suoritettiin SigmaPlot 11,0 (Systat, San Jose, CA, USA). Arvo P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

RND3 säätyy alas kasvun myötä Notch ja Rho-kinaasin aktiivisuus H358 ja H520-solujen

Kaksi ihmisen NSCLC solulinjat, H358 ja H520, käytettiin tässä tutkimuksessa. Ihmisen keuhkoputken epiteelisolut (HBEC) käytettiin normaalia valvontaa. Olemme havainneet RND3 ilmaisu sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Verrattuna HBEC soluihin, RND3 ilme oli huomattavasti säädellä vähentävästi H358 ja H520-solut (Fig. 1A-C). RND3 oli ensimmäinen tunnistettu ROCK1 endogeeninen inhibiittori, joka säätelee solun tukirangan. Täällä tutkimme Rho kinaasisignaloinnin tunnustelemalla kaksi hyvin tunnettu Rho-kinaasin substraatteja näissä kolmessa solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa. 1D-G, fosforylaatiota myosiinifosfataasin, kohdistaa alayksikkö 1 (MYPT1) ja myosiinin kevytketju 2 (MCL2) on merkittävästi lisääntynyt H358 ja H520-soluissa, mikä osoittaa, hyper-aktivoitu Rho-kinaasin toimintaa. Kuitenkin ROCK1 ekspressiotaso ei ollut erilainen eri solulinjoissa (Fig. 1 H). Voimakas Rho-kinaasi-1-aktivaattori [14], PDK1, jotka voisivat kilpailla RND3 sitoutua ROCK1, ilmentymisen taso oli myös ei muuttunut H358 ja H520-soluissa verrattuna HEBC solut (Fig. S1). Kiinnostaa, lisäksi säädelty Rho kinaasisignaloinnin, myös havaittu hyper-aktivoitu Notch signalointi H520 ja H358 verrattuna HBEC soluihin (kuvio. 1I, 1J), mistä on osoituksena kertyminen Notch 1 aktiivinen muoto Notch solunsisäinen domeeni (NICD). Sekä Rho Kinase ja Notch on tutkittu laajasti eri soluissa ja geneettisiä malleja. Biologisen roolin aktivointi näiden kahden signalointireiteissä NSCLC, ja suhde RND3 alassäätöä ja NICD ylössäätöä in keuhkosyövässä ei ole vielä tunnettu.

(A) RND3 mRNA havaitaan qRT- PCR on säädellä vähentävästi H358 ja H520 verrattuna HBEC. (B) RND3 proteiinin ilmentymisen tasot soluissa Western blot. (C) Densitometria määrällistä Länsi kaistan intensiteetin B. (D), (F), (H) (I) western blot havaita fosforyloitu MYPT1, fosforyloitiin MLC2, ROCK1 ja NICD soluissa. (E), (G) (J) Densitometria määrällistä Länsi kaistan intensiteetti osoitti säätely ylöspäin Rho-kinaasin aktiivisuuden ja NICD ilmaisun H358 ja H520-soluissa verrattuna HBEC. Western blotit määrällisesti kolmesta itsenäisestä kokeellista toistoa. BrdU-positiiviset solut kvantitoitiin 8 kuvaa otettu neljä dioja. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SD

inhibitio lisääntymisen stabiili yliekspressio RND3 on H520 ja H358

tutkimiseksi ektooppinen rooli vähentää RND3 ilmentymisen H520 ja H358-soluissa, olemme muodostuneen solun linjat, jotka ekspressoivat stabiilisti RND3-GFP käyttämällä lentivirus järjestelmää. RND3 ilmentyminen varmistettiin sekä anti-RND3 (tunnistaa endogeeninen ja eksogeeninen RND3) ja anti-GFP (havaitsee eksogeenisen RND3 vain) vasta-aineita (Fig. 2A ja 2C). H358-RND3 ja H520-RND3 pysyvästi ilmensivät RND3 2,7 kertaa ja 4,4 kertaa suuremmat kuin H358 ja H520-soluissa, vastaavasti (Fig. 2B ja 2D). Seuraavaksi tutkimme leviämisen määrä kahden stabiilin solulinjoja käyttämällä BrdU. Solut synkronoitu seerumin puutteessa ja sitten viljeltiin kasvatusväliaineessa 12 h, jonka jälkeen BrdU hoito 30 min ennen sadonkorjuuta. Solut siirrettiin levyihin Cytospin värjäyksessä ja kuvantaminen. Lisääntyminen korko osoitetaan BrdU positiivista värjäytymistä oli merkittävästi vähentynyt H358-RND3 solujen verrattuna H358-soluissa (kuvio. 2E ja 2F). Sama tulos havaittiin H520-RND3 soluja verrattuna H520-soluissa (kuvio. 2G ja 2H). Olemme myös lasketaan suhde BrdU + solun GFP + soluja, kuten on esitetty kuviossa. S2. Suhde oli merkittävä suurempi H358 (50%) ja H520 (41%) soluja, verrattuna H358-RND3 (15%) ja H520-RND3 (11%) soluja, vastaavasti (Fig. S2A ja S2B). Lisäksi 1 x 10

5 solua kustakin ryhmästä synkronoitu ja sitten viljeltiin. Solujen lukumäärä laskettiin eri aikapisteissä (päivä 0, 1, 2, 3, 4 ja 5). Havaitsimme merkittävän kasvun solujen määrässä H358 ja H520-soluissa. Kuitenkin tämä korotus huomattavasti heikennetty sekä H358-RND3 ja H520-RND3 solut alkoivat Päivä 2 (Fig. 2 I ja 2J). Yhdessä pakko yliekspressio RND3 vuonna H358 ja H520 voisi vähentää leviämisen nopeus näiden solujen. Tuumorin solujen kasvua on yksi tärkeimmistä strategioita syövän hoidossa. Rooli RND3 estossa leviämisen näiden kahden NSCLCs tekee mahdollisen kohteen syövän hoitoon.

(A) (B) muodostuksen H358 solulinjan stabiilisti ilmentävät GFP-merkitty RND3. RND3 ilmentyminen varmistettiin molempien RND3 ja GFP vasta-aineita. (C) (D) muodostuksen H358 solulinjan stabiilisti ilmentävät GFP-merkitty RND3. RND3 ilmentyminen varmistettiin molempien RND3 ja GFP vasta-aineita. (E) (F) H358-RND3 on pienempi leviämisen verrattuna sellaisiin H358 soluja havaitaan BrdU. (G) (H) H520-RND3 on pienempi leviämisen verrattuna sellaisiin H520 soluja havaitaan BrdU. (I) (J) Solujen lukumäärä määrällisesti eri ajankohtana. Keskimäärin kolme näytettä kussakin aikapisteessä esitettiin tässä kuviossa. Western blotit määrällisesti kolmesta itsenäisestä kokeellista toistoa. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD

palauttamalla RND3 pyöristettyjä Rho Kinase ja Notch signaloinnin H520 ja H358-solujen

Osoitimme korkeampi Rho Kinase toimintaa ja NICD ilmaisun yhdessä alennettu RND3 ekspressiotaso H520 ja H358-soluissa verrattuna normaaliin keuhkojen epiteelisolujen, HBEC (Fig. 1). Me seuraavaksi tutkitaan, onko korrelaatio välillä alemman RND3 ilmaisun ja korkeammat Rho-kinaasin ja NICD ilme. NiCd ilmentyminen alassäädetty yli 3,5-kertaisesti H520-RND3 soluja verrattuna H520-soluissa (kuvio. 3A ja 3B). Fosforyloitu myosiinikevytketjua fosfataasi, alayksikkö 1 (pMYPT1) ja myosiinikevytketjua (pMLC2) on alassäädetty 2.5- ja 1.8-kertaiseksi, in H520-RND3 solujen verrattuna H520-soluissa (kuvio. 3C ja 3D). Vuonna H358-soluissa, havaitsimme saman suuntaus NICD ilmaisun ja Rho-kinaasin aktiivisuus kun RND3 yliekspressoitui. NiCd ilmentyminen väheni 2,9-kertaisesti H358-RND3 solujen verrattuna H358-soluissa (kuvio. 3E ja 3F), kun taas pMYPT1 (2,46-kertainen) ja pMLC2 (1,83-kertainen) myös laski H358-RND3 solujen verrattuna H358 solut (Fig. 3G ja 3H). Lisäksi yliekspressio RND3 on H358 ja H520-solut eivät muuta ilmaus Notch-ligandin, kuten on esitetty kuviossa. S3. Expression of human Jagged-1 (jag-1), Jagged-2, (jag-2), Delta-like-1 (dll-1) ja Delta-like-4 (dll-4) mRNA mitattiin qRT-PCR . Ei ole tilastollista merkittävää muutosta ilmentymistä näiden mRNA: H358 ja H520 verrattiin H358-RND3 ja H520-RND3, vastaavasti (Fig. S3A ja S3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että RND3 voisi säädellä sekä Rho-kinaasi ja NICD signalointia H358 ja H520-soluissa. RND3 on säädin estämällä Rho Kinase aktivointi ja NICD ilmaisun NSCLCs. RND3 välittämä Notch signalointi modulaatio ei läpi säännellä Notch ligandin ilmentymisen.

(A) (B) Vähentynyt NICD ilmentyminen H520-RND3 solujen verrattuna H520 soluihin. (C) (D) Vähentynyt Rho Kinase aktiivisuutta H520-RND3 solujen verrattuna H520 soluihin havaitaan spesifisten vasta-aineiden pMYPT1 ja pMLC2. (E) (F) Vähentynyt NICD ilmentyminen H358-RND3 solujen verrattuna H358 soluihin. (G) (H) Vähentynyt Rho Kinase aktiivisuutta H358-RND3 solujen verrattuna H358 soluihin havaitaan spesifisten vasta-aineiden pMYPT1 ja pMLC2. Western blotit määrällisesti kolmesta itsenäisestä kokeellista toistoa. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD

esto Notch signalointi esti leviämisen H520 ja H358-solujen

osoittaneet, että pakko yliekspressio RND3 mukaan lentivirusta sekä H520 ja H358-solut 1) estivät proliferaatiota (Fig. 2) ja 2) esti aktivoinnin Rho-kinaasi ja Notch /NICD signalointia. Sen määrittämiseksi, mitkä signalointireitin voi myötävaikuttaa proliferaationopeus, kemialliset estäjät levitettiin soluihin. Olipa Fasudil, Rho estäjät [15], [16], voi vaikuttaa solujen lisääntymisen korko H358 ja H520-solujen? Tuloksemme osoittivat, että Rho-kinaasin aktiivisuuden Fasudil ei muuttanut proliferaatiota H520 ja H358-solut (Fig. S4). Kuitenkin yhdiste E [17], tietty Notch signalointi estäjä, voi vaimentaa proliferaation molemmissa solulinjoissa (Fig. 4). Hoito yhdisteellä E vähensi leviämisen H358 40% verrattuna dimetyylisulfoksidin käsitellyn kontrolliryhmän osoitetaan BrdU (Fig. 4A ja 4B). Lisääntyminen korko laski vain 32%: n valvonnan H520 ryhmässä (Fig. 4C ja 4D). Testaamiseksi mahdollisen sytotoksisuuden yhdisteen E, arvioimme solukuoleman trypaanisineä värjäystä. Pitoisuudella 5 nM yhdistettä E, emme havaitse merkittävää solukuolemaa verrattuna ei-hoitoryhmässä sekä H358 ja H520-soluissa (kuvio. S6, kuva 2 ja 6 verrattuna 1 ja 5, vastaavasti), mikä viittaa siihen sytotoksisuuden yhdisteen E kaikissa kolmessa solulinjoissa tässä pitoisuudessa oli minimaalinen. Me entisestään yhdisteen E pitoisuus 50 nM ja 500 nM, ja todettiin, että vain alle 5% solukuolemaa havaittiin 50 nM ryhmässä (kuvio. S6, kuva 3, 7 ja 11), kun taas massiivinen solukuolema ( 50%) aiheutti suuren annoksen yhdistettä E (500 nM, Fig. S6, kuva 4, 8 ja 12). Koe käyttäen selektiivisignaloinnin estäjiä ehdotti, että RND3 alassäätöä välittämän NICD ylössäätöä voi olla tärkeämpi rooli leviämisen H358 ja H520-soluissa ja että tämä lisääntymistä ei ole Rho Kinase riippuvainen.

(A) (B) soveltaminen yhdistettä E lohkojen leviämisen H358 soluja havaitaan BrdU. Soluja käsiteltiin yhdisteen E: n lopullinen pitoisuus 5 nM ja synkronoitu seerumin ehtyminen seurasi kasvu median 12 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin BrdU: ssa 30 minuuttia ennen kuin se on korjattu analyysiä varten. (C) (D) soveltaminen yhdistettä E lohkojen leviämisen H520 soluja havaitaan BrdU. Soluja käsiteltiin yhdisteen E: n lopullinen pitoisuus 5 nM ja synkronoitu seerumin ehtyminen seurasi kasvu median 12 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin BrdU: ssa 30 minuuttia ennen kuin se on korjattu analyysiä varten. BrdU-positiiviset solut kvantitoitiin 8 kuvaa otettu neljä dioja. Tiedot edustavat keskiarvo ± S.D.

RND3 säätelee lisääntymistä säätelemällä NICD /Hes1 signalointi akseli H520 ja H358-solujen

Notch signalointi on tärkeä solusyklin säädin. Esto Notch signalointi estää niiden kasvun eri solujen [18] – [20]. Huomattavasti, tuoreessa tutkimuksessa Chang et al. ryhmä osoitti, että NICD säätelee orvaskeden solujen lisääntymisen kautta lisäävä säätely Hes1 vuonna RND3 hiirien [21]. Siksi tutkimme Hes1 ilmaus meidän soluissa. Hes1 on säädelty 5-kertaiseksi H520 ja H358 verrattuna HBEC solut (Fig. 5A ja 5B). Yhdenmukainen heikennetty proliferaationopeus havaittiin H520-RND3 ja H358-RND3 soluja (Kuva. 3E-3H), Hes1 ilmentyminen myös alas-säädellä 2-kertaiseksi ja 2,5-kertaiseksi näissä kahdessa soluissa riviä verrattuna H520 ja H358, vastaavasti (Kuva. 5C-5F), mikä viittaa siihen, että NICD esto välittämää pienenemistä leviämisen määriä H520-RND3 ja H358-RND3 solut voivat olla kautta alassäädetty Hes1 ilme.

(A) (B) Hes1 oli säädellään ylöspäin H520 ja H358-soluissa verrattuna HBEC soluihin. (C-F) Hes1 ilmaisu pieneni kun RND3 stabiilisti yli-ilmennetään H358 ja H520-soluissa. (G) (H) ohimenevä yliekspressio RND3 vuonna H358-soluissa alassäädetty NICD ja Hes1 annosalueella riippuvaisella tavalla. (I) (J) esto proteasomin aktiivisuuden MG132 (loppupitoisuus 15 uM) poisti RND3 annostus riippuvat NICD alassäätöä in H358-soluissa. Western blotit määrällisesti kolmesta itsenäisestä kokeellista toistoa. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D. *

p

0,05 kontrolliin verrattuna (ryhmä 0); #

p

0,05 verrattuna ryhmään 1; $

p

0,05 verrattuna ryhmään 3. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD

Jos haluat määrittää suhdetta RND3 ja NICD, teimme annos riippuvainen ilmaus RND3 vuonna H358-soluissa . myc-RND3 transfektoitiin väliaikaisesti H358-solujen eri annoksilla (0, 1 ug, 3 ug, 5 ug). Sitten tutkimme ilmaus NICD ja Hes1 Western blot. Lisääntynyt RND3 ilmaisu, NICD ja Hes1 ekspressiotasot laskivat (Fig. 5G ja 5H). Ei ole yllättävää, Hes1 mRNA, joka on NICD kohdegeenin muutetaan vastaavasti (Kuva. S5 täytetty musta palkki). Emme kuitenkaan ei havainnut mitään muutosta Notch1 mRNA (kuva. S5 tyhjä bar), huolimatta vähentynyt merkittävästi proteiinin tason takia RND3 yliekspressio, mikä viittaa siihen, että RND3 säännelty NICD jälkeisellä translaation tasolla, koska NICD tasoa säädellään proteasomin hajoaminen [22]. Me esti proteasomiaktiivisuus avulla MG132 ja totesi, että RND3 annostus riippuvat NICD hajoaminen oli täysin tukossa (kuva. 5I ja 5J), mikä viittaa translaation jälkeistä säätelevän roolin RND3 in NICD hajoamista.

RND3 säätelee leviämisen kautta Notch1 signalointia keuhkoadenokarsinooma soluissa

H358 solulinja on peräisin keuhkojen bronchioalveolar syöpä ja H520-solulinja on peräisin keuhkojen squamouse cell carcinoma. Kuitenkin merkittävä alatyyppi NSCLC oli keuhkon adenokarsinooma. Niinpä me vahvistaneet tutkimuksessa yksi keuhkojen adenokarsinooma solut, A549, kuten on esitetty kuviossa. 6. RND3 oli alassäädetty yhdessä säädelty Rho Kinase ja Notch1 signalointia A549-soluja verrattuna HBEC soluihin (Fig. 6A ja 6B). Kvantitoimme ylössäätöä kertaiseksi muutoksen kaksi signalointi. Tulokset osoittivat kuvassa. 6C. Rho kinaasisignaloinnin oli säädelty lähes 4 kertaa osoituksena pMYPT1 tasolla; Notch1 signalointi olivat ajan säädellään 5 kertaa osoituksena NICD tasolla. Esto Notch1 signaloinnin Yhdiste E tukossa leviämisen A549-solut (Fig. 6D ja 6E). Sytotoksisuutta Yhdisteen E A549 arvioitiin myös Trypan blue -värjäyksellä. Kuten osoitti kuvassa. S6 (kuva 9 ja 12), 5 nM Yhdiste E ei aiheutunut merkittäviä kuolema verrattuna perustilaan A549-soluissa. Mekanistisesti RND3 säännelty solulisäkasvumäärityk- kautta NICD /Hes1 signalointi. Yliekspressio RND3 tukahdutti NICD ja Hes1 ilmaisun annoksena riippuvainen tavalla A549-solut (Fig. 6F ja 6G). Meidän havainnot A549-soluja olivat yhtäpitäviä tuloksia H358 ja H520-soluissa, mikä viittaa RND3-NICD-Hes1 signalointi oli yleisesti molekyylitason mekanismi säädellä NSCLC solun kasvu. Yhdessä korkeampi NICD ja Hes1 ilmaisun ja alemman RND3 ilmaisun havaittiin H520, H358 ja A549-solut verrattuna HBEC soluihin. Uudelleen RND3 esti NICD ja Hes1 ilmaisua, mikä johti vähentynyt proliferaatio hinnat H520 ja H358-soluissa. Tukos Notch1 signaloinnin esti soluproliferaation H358, H520 ja A549-soluja. RND3 säännelty NICD runsautta kautta pakottaen sen proteasomaalisten hajoamista NSCLCs.

(A) RND3 mRNA havaitaan qRT-PCR säädellä vähentävästi A459 verrattuna HBEC. (B) (C) western blot havaita fosforyloitu MYPT1, NICD soluissa. (D) (E) Hakemus Yhdisteen E lohkojen leviämisen A459 soluja havaitaan BrdU. Soluja käsiteltiin yhdisteen E: n lopullinen pitoisuus 5 nM ja synkronoitu seerumin ehtyminen seurasi kasvu median 12 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin BrdU: ssa 30 minuuttia ennen kuin se on korjattu analyysiä varten. (F) (G) ohimenevä yliekspressio RND3 A549-soluissa alassäädetty NICD ja Hes1 annosalueella riippuvaisella tavalla. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D. *

p

0,05 kontrolliin verrattuna (ryhmä 0); #

p

0,05 verrattuna ryhmään 1; $

p

0,05 verrattuna ryhmään 3. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD

Keskustelu

RND3 kuuluu Ras superperheen ja on pieni Rho GTPaasia että säätelee erilaisia ​​solun toimintoja ja sairauksia. Se oli alun perin tunnistettiin ROCK1 endogeeninen inhibiittori. RND3 sitoutuu ROCK1 inhiboimaan alavirran signalointia [5]. Viime aikoina tutkimukset ovat korostaneet kriittisen roolin RND3 eri syöpätyyppien. RND3 säätyy alas monissa syövissä, kuten maksasyövän [10], [23], mesenkymaaliset kasvainsolut [12], ja eturauhassyövän [12]. Kuitenkin joidenkin syöpien, RND3 on säädelty, kuten haiman kasvaimissa [24], [25], koolonsyöpäsolulinjaa [25] ja jotkut melanoomat [26]. Nämä erot osoittavat, että RND3 on erityisiä rooleja eri solulinjoja. Mielenkiintoista, koska geenin erittäin liittyvät kasvaimia, tutkimuksen roolista RND3 NSCLC on erittäin puutteellinen. Tutkimuksessa osoitettiin RND3 yli-ilmentyminen saattaa liittyä epäsuotuisaan ennusteeseen pienisoluista keuhkosyöpää [27], [28], kun tarkka rooli RND3 NSCLC ei ole vielä tutkittu. Täällä kertoi, että RND3 on säädellä vähentävästi H358, H520 ja A549-soluja, ja tämä alassäätöä edistää kasvua näiden kahden solulinjoista ja on riippuvainen säädelty Notch signalointi.

Yksi tärkeimmät strategiat kuivatuksen syöpä estämällä hallitsemattoman kasvainsoluproliferaation. Kuitenkin puute spesifinen esto on suurin ongelma klinikalla. Ymmärtäminen ainutlaatuinen sääntelymekanismiin solusyklin syöpäsoluja suosisi löytö uusien lääkkeiden ja uusien hoitojen syövän. RND3 yliekspressio fibroblasteissa estää S-vaiheessa merkintä estämällä sykliini D1 ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla [13]. Samassa tutkimuksessa, yliekspressio sykliini D1 ei pelasta RND3 välittämä solusyklin pysähtymiseen, mikä viittaa siihen, että muut pelaajat ovat mukana solusyklin säätelyssä. Eturauhasen syöpäsoluja, RND3 ilmentyminen indusoi solujen pidätettiin G2 /M sijasta G1, kuten nähdään fibroblasteissa, mikä viittaa siihen, että RND3 on kyky säädellä solusyklin etenemisen eri vaiheissa [29]. Tuloksemme osoittivat, että Notch /Hes1 signalointi on kriittinen RND3 puute välittämää kasvua H358, H520 ja A549-soluja. Tämä havainto laajentaa ymmärrystä RND3 tehtävänä syövän solukierron säätelyssä ja myös potentiaalinen kohde NSCLC hoitoon.

RND3 ilmentyminen korreloi solujen vaeltamiseen in kehittämiseen ja sairauksia. Kahdessa tuoreessa tutkimuksessa havaittiin, että RND3 säännellään neuroni maahanmuuton Rho Kinase riippuvainen signalointi [30], [31]. Samaan aikaan syöpiä, alas-säätely RND3 liittyy läheisesti invaasio ja etäpesäkkeiden [10], [23], [32]. Mahdollinen mekanismi voi myös olla kautta RhoA /ROCK1 signalointi. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että sekä NICD ja Rho-kinaasi aktivoidaan H358, H520 ja A549-soluja verrattuna HBEC. Uudelleen RND3 estämällä sekä signalointireittejä. Kuitenkin vain lovi signalointi estäminen estää hyper-kasvun H358 ja H520-solut; Rho-kinaasin inhibitio ei. Lisätutkimukset tutkia sääntelyn tumorigeneesin, muuttoliikkeen ja tuumorisolujen apoptoosin vasteena Rho Kinase esto olisi tarpeen ja mielenkiintoinen.

Notch on evoluutiossa konservoitunut transmembraanireseptoriproteiinia mukana kehityksessä ja sairauksia. Ligandin stimulaatio, Notch voi halkaista γ-sekretaasi. Solunsisäinen osa (NICD) voi translokoituvat tumaan transkription aloittamiseksi. Pakko ilmentymisen Notch 1 esti kasvua A549 soluviljelytutkimuksista [2]. Kuitenkin riippumaton tutkimus on hakenut tätä käsitystä [33]. Viime aikoina Notch 1 aktivointi mutantti on löydetty noin 10% NSCLC, ja mutaatiot koitui huonompi ennuste potilailla [4]. Tämä kiista osoittaa, ainakin, että 1) toiminta Notch 1 NSCLC on hajautettu eri soluissa ja eri syövän vaiheissa; 2) Notch1 ilmaisu olisi otettava huomioon, kun hoidetaan potilaita; 3) on kiireesti roolin ymmärtämiseksi Notch1 in NSCLC. Tässä tutkimuksessa, meidän tiedot osoittivat, että Notch signalointi aktivoidaan H358 ja H520-soluissa, ja tämä aktivointi ajoi leviämisen näiden kahden solun kautta Hes1. RND3 voisi tukahduttaa H358, H520 ja A549-solut lisääntymistä vastavaikuttamalla Notch signalointia translaation jälkeistä tavalla.

Hiljattain julkaistu tutkimus korosti, että RND3 oli alavirtaan välittäjänä Notch signaloinnin okasolusyöpää (SCC) ihon epiteeli [34]. Ne kirjoittajat ehdottivat, että RND3 on transkriptionaalinen tavoite aktivoitujen Notch1, ja RND3 ehtyminen estää Notch signalointi välittämällä tumaansiirtymiseen että NICD kautta vuorovaikutuksessa importins. Tutkimuksessamme havaitsimme, että RND3 yliekspressio tukahdutti Notch signalointi estämällä NICD hajoamista. Nämä eroavuudet voivat johtua 1) eri solulinjaa käytettiin tutkimuksessa; 2) todennäköisempää, näiden kahden asetuksen rinnakkain soluissa, työskentelee mekanismin palautteen tarkasti valvoa Notch signalointi.

Expression of RND3 nimenomaista oli juuri säännelty ihmisen kasvaimen kudoksissa. RND3 oli säädelty kolorektaalisyövässä verrattuna normaaliin ihmisen peräsuolen kudos [35]. Vaikka down-regulation RND3 oli havainto ihmisen maksan kasvainkudoksessa ja ihmisen ruokatorven okasolusyöpä kudoksissa verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa vastaavasti [11], [36]. Vaikka eri ekspressiokuviota RND3 löydettiin eri kasvaimia ihmisen, RND3 ilmentyminen tiiviisti kasvainsoluproliferaation, solujen vaeltaminen /etäpesäke ja diagnoosi /ennustetta. Koska RND3 oli säädellä vähentävästi NSCLC soluissa ja alas-säätely RND3 edisti NSCLC-solujen lisääntymistä, olisi mielenkiintoista ja välttämätöntä arvioida RND3 ilmentymistä ihmisen keuhkosyövän kudosnäytteet.

Yhdessä olemme ensimmäinen ryhmä ilmoittaa, että RND3 on säädellä vähentävästi H358, H520 ja A549-solut, mikä johtaa hyper-aktivointi Notch ja Rho kinaasisignaloinnin. Mekanistisesti RND3 säätelee leviämisen H358, H520 ja A549-soluja kautta NICD /Hes1 signalointi akselilla.

tukeminen Information

Kuva S1.

Expression of PDK1, Rho Kinase aktivaattori, säilyy muuttumattomana H358 ja H520-soluissa verrattuna HBEC soluihin.