Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nek11 kinaasi on mahdollinen välittäjäaine DNA vaurioita vastaus jonka ilmentymistä yliaktiivista alkuvaiheen kolorektaalisyövissä (CRC). Täällä käyttäen RNAi-välitteinen väheneminen, tutkimme rooli Nek11 vuonna HCT116 WT ja p53-null CRC soluja altistetaan ionisoivalle säteilylle (IR) tai kemoterapeuttisen lääkkeen, irinotekaani. Osoitamme, että ehtyminen Nek11 estää G2 /M pidätyksen aiheuttama näiden genotoksisten tekijöiden ja edistää p53-riippuvaista apoptoosia sekä läsnä ollessa ja poissa ollessa DNA-vaurioita. Mielenkiintoista, Nek11 ehtyminen johti myös pitkän aikavälin menetys solujen elinkelpoisuuden, joka oli riippumaton p53 ja pahentavat seuraava IR altistumista. CRC-solut ilmentävät neljä silmukoitumisvariantteja Nek11 (L /S /C /D). Nämä ovat pääasiassa sytoplasmista, mutta läpikäyvät nucleocytoplasmic shuttling välittyvät vieressä ydin- tuonnin ja viennin signaaleja C-terminaali ei-katalyyttinen domeeni. Vuonna HCT116-solut, Nek11S erityisesti on tärkeä rooli DNA-vaurioita vasteen. Nämä tiedot antavat vahvaa näyttöä siitä, että Nek11 edistää vaste CRC solujen genotoksisia aineita ja on välttämätöntä selviytymisen tai ilman altistumista DNA-vaurioita.

Citation: Sabir SR, Sahota NK, Jones GDD, Fry AM (2015) menetys Nek11 Estää G2 /M pidätys ja edistää solukuolemaa HCT116 peräsuolen syövän altistuneet solut terapeuttinen DNA: ta vaurioittavat aineet. PLoS ONE 10 (10): e0140975. doi: 10,1371 /journal.pone.0140975

Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, FRANCE

vastaanotettu: 15 elokuu 2014; Hyväksytty: 03 lokakuu 2015; Julkaistu: 26 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Sabir et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat apurahoja AMF The Wellcome Trust (082828; https://www.wellcome.ac.uk), Cancer Research UK ( C1420 /A9363; https://www.cancerresearchuk.org), Association for International Cancer Research (AICR 13-0042, https://www.aicr.org.uk), ja PhD stipendi yliopistosta Leicester (http : //www.le.ac.uk). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä länsimaissa. Nykyinen standardi hoidon CRC potilaille leikkauksen jälkeen liittyy kemoterapiaan yhdistelmiä, jotka sisältävät yleensä DNA: ta vaurioittavat aineet. Esimerkiksi, monet potilaat saavat FOLFIRI ensilinjan terapia, yhdistelmä foliinihappo, 5-fluorourasiili (5-FU) ja irinotekaani [1]. 5-FU on pyrimidiinin analoginen, joka estää DNA: n synteesiä estämällä DNA-polymeraasilla, kun taas foliinihappo voimistaa vaikutusta 5-FU estämällä tymidylaattisyntaasi. Irinotekaani on estäjä topoisomeraasi I, joka aiheuttaa yksiketjuisen DNA: n katkoksia, jotka tavallisesti sitten muunnetaan double-säikeen katkoksia (DSB: t). Nämä aktivoivat DNA-vaurioita tarkastuspisteiden ja syy pidätykseen solukierrossa G1 /S tai G2 /M.

DNA-vaurioita vastaus (DDR) on monimutkainen verkko solun prosesseja, jotka johtavat useisiin tuloksiin lukien DNA: n korjaukseen , solusyklin pysähtymiseen, vanhenemista ja apoptoosia [2, 3]. Erityinen tulos määräytyy monista tekijöistä, kuten taso ja tyyppi vaurioita, ja eheys eri DDR reittejä. Onnistuminen DNA: ta vaurioittavat aineet syövän hoidossa tukeutuu lisääntynyt herkkyys nopeasti pyöräily syöpäsolut ovat heikentyneet DDR reittejä. Nämä erot normaaleihin soluihin tarjota terapeuttinen ikkuna tarvitaan tehoa. Kuitenkin nykyinen valinta näiden aineiden perustuvat pääasiassa kasvaintyyppi liittyy merkittäviä haittavaikutuksia ja ymmärtää paremmin, mitkä tekijät määräävät vastauksen näiden lääkkeiden johtaisi tarkempia ja yksilöllisiä hoitoja.

DDR reittejä käynnistetään aktivoimalla ATM tai ATR vastauksena DSB: ihin, pysähtynyt replikointi haarukat tai muutoksia kromatiinirakenteeseen liittyy DNA addukteja [2, 3]. Aloittaa solusyklin pysähtymiseen, nämä kinaasit fosforyloivat loppupään tavoitteita kuten Chk1, Chk2 ja p53. Fosforylaatio p53 johtaa sen vakauttamiseen ja voimistunutta ilmentymistä sen transkription kohde, p21. Chk1 ja Chk2 fosforyloivat ja inaktivoida Cdc25 fosfataasin edistämällä sen hajoamisen tai soluliman sitomiseen. Yhdessä lisääntynyt ilmentyminen p21 ja menetys Cdc25 toiminto estää aktivointi CDK tarpeen G1 /S ja G2 /M siirtymiä. Tämä on kuitenkin pieni tilannekuvan mitä nyt ymmärretään olevan hyvin monimutkaisia ​​reittejä, joihin liittyy monia muita entsymaattisia, sääntely- ja rakenteelliset komponentit.

Yhdet proteiineja, jotka ovat alkaneet nousta tärkeänä säätelijöinä DDR ovat NIMA liittyvät, tai NEK, proteiinikinaasi perhe [4]. Tämä perhe koostuu yksitoista jäsentä, joista vähintään neljä, Nek1, Nek8, Nek10 ja Nek11, ovat epäillään roolit DDR [5-10]. Nek11 oli ensimmäinen näistä olevan osallisena, kun sen kinaasiaktiivisuus on todettu olevan koholla altistuneiden solujen DNA: ta vaurioittavat aineet ja replikaation inhibiittorit [9]. Lisäksi tämä aktiivisuus menetetään lisättäessä ATM /ATR-estäjä, kofeiini, mikä viittaa siihen, että Nek11 toimii alavirtaan ATM tai ATR. Uudemmat mekaaniset tutkimukset paljastivat, että Nek11 aktivoidaan läpi fosforylaatio Ser-273 by Chk1 altistettaessa solut ionisoiva säteily (IR) [7]. Aktivoidut Nek11 pystyy fosforyloimaan Cdc25A sivustoihin sisällä phosphodegron joka edistää rekrytointi β-TrCP. Tämä puolestaan ​​johtaa ubikitiinistä välittämää hajoamista Cdc25A ja solukierron pysähtymisen [11-13]. Toiset ovat väittäneet, että fosforylaatio riippuvaa hajoamista Cdc25 välittyy vaihtoehtoisia kinaasien, kuten kaseiinikinaasi 1 [14, 15]. Kuitenkin Nek11 on myös raportoitu olevan mahdollisesti merkitystä syövän biomarkkereiden kohonnut Nek11 ekspressiota havaittiin joukko peräsuolen adenoomien [16]. Siksi esitetyt testata onko Nek11 tarvitaan vasteen CRC solujen kliinisesti merkittäviä DNA: ta vaurioittavat aineet, sekä etsiä lisätodisteita rooli Nek11 DDR.

Tulokset

Nek11 vaaditaan IR aiheuttama G2 /M pidätys HCT116-solujen

Tutkitaan kuinka Nek11 voisi edistää DDR CRC solujen protokolla todettiin, että sallittu solusyklin etenemistä voidaan seurata virtaussytometrialla seuraavien Nek11 ehtyminen ja IR altistuminen (Kuva 1A). Nek11 oli kulunut loppuun käyttämällä kahta eri siRNA: iden, joissa tehoa Näiden oligonukleotidien vahvistivat seuraavat 72 tuntia transfektion RT-PCR: llä ja Western blot (S1A ja S1B kuviossa). Käyttämällä annosvälillä IR määritettiin, että HCT116 CRC solulinja osoitti suurta lisäystä G2 /M jae 16 tunnin kuluttua altistuksesta 10 Gy IR (S1C kuvio). Näin ollen näissä kokeissa, solut transfektoitiin ensin valvonta (GL2- lusiferaasi) tai Nek11 siRNA: t, ja sitten, sen jälkeen 56 tuntia, ne olivat joko käsittelemättömiä tai altistunut 10 Gy IR. Sen jälkeen vielä 16 tuntia, ne kerättiin analysoitavaksi propidiumjodidilla (PI) -pohjaisen virtaussytometria (kuvio 1 B ja 1C, S1D, S1E, S2A ja S2B kuviot).

. Kaavioesitys ajan kurssi solun hoitoja. 24 tuntia ymppäyksen jälkeen, solut transfektoitiin siRNA oligonukleotideja. 56 tuntia myöhemmin, solut olivat joko käsittelemättömiä tai säteilytettyjä (± IR). Ne kerättiin sitten ja kiinteä PI-pohjainen virtaussytometrialla jälkeen vielä 16 tuntia. B C. Seuraten kuvattua A HCT116 WT ja p53-null-solut transfektoitiin siRNA: t kuten ja hoitamattomana (B) tai käsiteltiin 10 Gy IR (C), ennen analyysiä virtaussytometrialla. Solujen jakauma mukaan virtaussytometrialla profiili on merkitty (2n, G1, 2n-4n, S; 4n, G2 /M). D-G. Histogrammit edustavat prosenttiosuutta pyöräily HCT116 WT (D, E) ja p53-nolla (F, G) solut G2 /M. H-K. Histogrammit esittävät osuus kaikista HCT116 WT (H, I) ja p53-nolla (J, K) solut Saharan 2n DNA. Histogrammit DK otetaan tiedot esitetään B ja C.

p

arvot lasketaan suhteessa siGL2.

Tämän protokollan käyttäminen, mitään merkittävää muutosta ei havaittu osa pyöräily solut G2 /M-vaiheen solusyklin jälkeen Nek11 väheneminen ilman IR (~ 30%; kuvio 1 D). Kuitenkin seuraava IR altistuksen, solut köyhdytetty Nek11 näytteillä huomattavaa vähentämistä G2 /M murto verrattuna soluihin köyhtynyt kontrollioligonukleotidit, jossa siNek11-2 aiheuttaa paluun pohjapinta taso G2 /M-soluissa (kuvio 1 E). Toteamme, että siNek11-2 antoi vankempi pudotus kuin siNek11-1 RT-PCR: llä ja Western blot. Jotta voidaan tutkia roolia p53 tässä vasteessa, samalla Kokeellinen lähestymistapa on sovellettu isogeenisiin HCT116 p53-null (p53

– /-) solut. Ehtyminen Nek11 jälleen yksin ei ollut merkittävää vaikutusta solusyklin jakelun puuttuessa IR, vaikka oli olemassa selvä vähentäminen G2 /M pidätys vastauksena IR hoitoon seuraavien Nek11 ehtymisen (kuvio 1 F ja 1G). Kuitenkin tässä tapauksessa, ei siRNA aiheutti täydellisen paluuta pohjapinta tasoilla G2 /M-soluissa viittaa siihen, että menetys G2 /M tarkastuspiste valvonnan puuttuessa Nek11 on osittain p53-riippuvaista.

Sekä mahdollistaa solusyklin jakelu voida määrittää, virtaussytometria-analyysi paljasti solukuoleman kuten ali-2n huippu. Vertailu prosentuaalinen tässä fraktiossa (suhteessa kaikkien solujen näytteessä) paljasti vaatimaton kasvu solukuoleman upon Nek11 ehtyminen ilman IR, vaikka merkitys (p 0,05) oli vain saavutettiin yksi oligonukleotidin (kuvio 1 H). Kuitenkin solukuolema lisääntynyt suuremmassa määrin Nek11 köyhdytetyn näytteistä seuraavat IR altistuksen viittaa siihen, että yhdistelmähoito parantaa solukuolemaa (kuvio 1 i). Sen sijaan, oli vain pieni lisäys osa-2n väestö HCT116 p53-null-soluissa Nek11 ehtyminen ennen IR altistusta, ja vaikka oli enemmän soluja Saharan 2n osa seuraavan IR altistuksen, ei ollut johdonmukaista lisäystä upon Nek11 ehtyminen (kuvio 1J ja 1K). Yhteenvetona toteamme, että induktio solukuoleman, joka johtuu yhdistetty Nek11 menetys ja IR altistuminen on pitkälti riippuvainen p53.

Nek11 tarvitaan estämään apoptoosin ja edistetään pitkäaikaisten solujen selviytymistä

PI-pohjainen virtaussytometrialla ilmoitetaan seuraavan solu- kuoleman Nek11 ehtyminen, tai ilman IR altistuksen, päätimme nimenomaan apoptoosin mittaamiseksi. Tätä varten noudatettiin samaa protokollaa kuin edellä, paitsi että virtaussytometrialla suoritettiin käyttämällä anneksiini V-pohjainen värjäys mitata plasmamembraanin menetys fosfolipidin epäsymmetriaa, joka syntyy apoptoosin aikana. Ehtyminen Nek11 ilman IR altistuminen johti ~ 2-3-kertainen apoptoosin HCT116 WT soluissa vahvistetaan, että Nek11 edistää selviytymistä ilman DNA-vaurioita (kuvio 2A). Lisäksi, kun taas altistus 10 Gy IR yksinään ei lisännyt prosenttiosuutta HCT116-WT apoptoosin alaisten solujen, siellä oli parannusta apoptoottisen osa seuraavan yhdistetty Nek11 ehtymisen ja IR altistumista verrattuna Nek11 ehtyminen yksinään (kuvio 2B). Vuonna HCT116-p53-null-solut, Nek11 ehtyminen yksinään ei aiheuttanut merkittävää apoptoosin lisääntyminen, vaikka oli vain pieni lisäys apoptoosin HCT116 p53-null soluja Nek11 ehtyminen yhdistettiin IR (kuvio 2C ja 2D). Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​saatu käyttämällä PI-pohjainen värjäys ja osoittavat, että menetys Nek11 johtaa p53-riippuvaisen apoptoosin induktio, joka pahentavat IR altistumista.

A-D. Seuraavat kuvatun protokollan kuviossa 1A, HCT116 WT (A, B) ja p53-null (C, D) solut transfektoitiin siRNA: illa, kuten on osoitettu, ennen säteilytystä ja analyysi anneksiini V-pohjainen virtaussytometrialla. Histogrammit edustavat prosenttiosuutta kaikkien solujen apoptoosin.

p

arvot ovat suhteessa siGL2. E. HCT116 WT ja p53-null-solut transfektoitiin siRNA: t kuten jälkeen 56 tunnin käsiteltiin ± 2 Gy IR. Solut kerättiin sen jälkeen vielä 16 tuntia ja levyille klonogeeniset määrityksissä (50 solua per levy siGL2, 500 solua levyä kohti muita hoitoja). Pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla. F. pesäkkeet E laskettiin ja% eloonjääminen määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. G. HCT116 p53-null-solut transfektoitiin joko siGL2 tai siNek11-2 jälkeen 56 tunnin ajan joko jätettiin käsittelemättä tai säteilytetty. Solut kiinnitettiin 48 tuntia IR ja värjättiin α-tubuliinin vasta-aine (vihreä). DNA Hoechstilla tarkkailla ydin- morfologia. Mittaviivat 10 um. H. Histogrammi esittää niiden solujen prosentuaalinen osuus, joilla on useita ytimiä käsittelyjen jälkeen osoitettu, kuten on kuvattu julkaisussa G. 500 solut laskettiin näytettä kohti ja keskimääräinen prosenttiosuus Monitumaisia ​​solujen määritettiin kahdella eri riippumattomassa kokeessa.

tutkia pitkäaikainen säilyminen, klonogeeniset määritykset suoritettiin, jossa solut köyhdytetty ohjaus- tai Nek11 siRNA 56 tuntia ja sitten altistettiin pienempi annos (2 Gy) IR ennen Maljauksen 16 tuntia myöhemmin. Kahden viikon kuluttua pesäkkeet kiinteä ja laskettiin (kuvio 2E ja 2F). Ensinnäkin, tämä osoittaa, että vaikka kontrolli köyhdytettyä näytteitä, tämä annos IR oli riittävä aiheuttamaan huomattavasti pienentää (~ 3-kertainen) pesäkkeiden määrä, ei ainoastaan ​​HCT116 WT-solut, mutta myös HCT116-p53-null-soluissa. Näin ollen vaikka IR ei indusoi merkittäviä solukuoleman tai apoptoosin lyhyin aikoina altistuksen jälkeen, se aiheuttaa pitkäaikaisia ​​menetys selviytymisen esiintyvää p53-riippumattomalla tavalla. Mielenkiintoista, ehtyminen Nek11 yksin oli myös voimakkaasti haitallinen vaikutus eloonjäämiseen, jossa on 5-kertainen väheneminen pesäkkeitä numero HCT116 WT-soluissa. Jälleen samanlainen lasku pesäkkeen lukumäärä nähtiin kanssa HCT116-p53-null-soluissa. Yhdistelmä Nek11 ehtymisen ja IR altistumisen seurauksena suurin menetys elinkelpoisuutta ~ 10-kertainen pieneneminen pesäkeluvussa sekä HCT116-WT ja p53-null-soluissa. Tämän vuoksi päättelemme, että pitkällä aikavälillä säilyttämään HCT116-solujen vähenee merkittävästi vastauksena IR altistumista, Nek11 väheneminen tai molempia. Lisäksi nämä vastaukset eivät riipu p53, mikä osoittaa, että p53-riippumattoman kuolema reittejä aktivoituvat.

tutkittava pitkän aikavälin menetys solujen eloonjäämisen näiden olosuhteiden jälkeen saattaa johtua mitoosi katastrofin mock tai Nek11- köyhdytettyä HCT116-solut olivat joko käsittelemättömiä tai alttiina IR- ja sitten kiinteät mikroskooppista analyysiä jälkeen vielä 48 tuntia. Läsnäolo suurten monitumaisten solujen osoitus epäonnistui mitoottisen osastojen (eli mitoosi katastrofi) nähtiin vastauksena joko Nek11 ehtyminen tai IR altistus (kuvio 2G). Kuitenkin kvantifiointi monitumaisia ​​soluja, osoitti, että ehtyminen Nek11 yksinään johti suhteellisen pieni taajuus mitoosi katastrofin, kun taas olennaisesti korkeampi taajuus havaittiin vasteena IR hoito yksinään (kuvio 2H). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin sekä WT ja p53-null-soluissa paitsi että mitoosi katastrofi vastauksena IR oli vieläkin selvempi p53-null-solut yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [17, 18]. Korkeaa tasoa mitoosi katastrofin aiheuttamien IR yksinään viittaavat siihen, että tämä on suurin syy alennetun elinkelpoisuuden nähty klonogeeniset määrityksissä. Kuitenkin alhaisempi mitoosi katastrofin aiheuttama ehtyminen Nek11 yksin pikemminkin puoltavat vaihtoehtoisin vähennetään pesäkkeen muodostumisen, kuten vahinkojen aiheuttaman vanhenemisen merkkejä.

Nek11 sovittelee G2 /M pidätys HCT116 käsitellyissä soluissa irinotekaani

CRC potilaat usein saavat irinotekaani, topoisomeraasi I: n estäjä, osana kemoterapiaa. PI-pohjainen virtaussytometrialla vahvisti, että HCT116-solut osoittavat annos-vaste tähän DNA vaurioittavan aineen, jossa on kertyminen solujen G2 /M 24 tuntia sen jälkeen käsittely (S3A kuvio). Protokolla käytettiin siksi, että antoi meille mahdollisuuden vertailla vasteen HCT116-WT ja p53-null solujen irinotekaanin että nähty IR. Tässä tapauksessa solut köyhdytetty Nek11 52 tuntia ennen kuin lisättiin irinotekaani 5 uM. Sen jälkeen vielä 20 tunnin ajan, solut kerättiin analyysiä varten virtaussytometrillä (kuvio 3A-3C ja S2C ja S2D kuviossa). Ensinnäkin tämä paljasti, että, kuten IR, kertyminen HCT116-WT solut G2 /M vastauksena irinotekaanin tukahdutettiin seuraavat Nek11 ehtymisen (kuvio 3D ja 3E ja S3B kuvassa). Samoin irinotekaanin indusoi G2 /M pidätys HCT116 p53-null-solut, jotka oli osittain tukahdutettiin Nek11 ehtymisestä (kuvio 3F ja 3G ja S3C kuvassa). Koska IR altistumista, havaitsimme, että Nek11 ehtyminen yksinään indusoi vaatimattomalla tasolla solukuoleman mutta tämä tehostettiin yhdessä irinotekaanin HCT116 WT soluissa (kuvio 3H ja 3I). Sen sijaan alemman ja vähemmän yhdenmukainen solukuolemaa havaittiin HCT116-p53-null-soluissa Nek11 ehtyminen tai ilman irinotekaanin (kuvio 3J ja 3K). Yhteenvetona toteamme, että irinotekaanin myös indusoi Nek11 riippuvan G2 /M pidätys, joka on osittain riippuvainen p53 tilaansa HCT116-soluissa, ja että irinotekaanin kasvaa solukuolemaa yhdistettynä Nek11 ehtyminen tavalla, joka on p53-riippuvaista. Siksi Nek11 todennäköisesti olla samanlainen rooli vasteen HCT116-solujen IR ja irinotekaania.

. Kaavioesitys ajan kurssi solun hoitoja. 24 tuntia ymppäyksen jälkeen, solut transfektoitiin siRNA oligonukleotideja. 52 tuntia myöhemmin, solut olivat joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 5 uM irinotekaanin. Ne kerättiin sitten ja kiinteä PI-pohjainen virtaussytometrillä sen jälkeen, kun vielä 20 tuntia. B C. Seuraten kuvattua A HCT116 WT ja p53-null-solut transfektoitiin siRNA: t kuten ja hoitamattomana (B) tai käsitelty irinotekaanin (C), ennen analyysiä virtaussytometrialla. Solujen jakauma mukaan virtaussytometrialla profiili on merkitty (2n, G1, 2n-4n, S; 4n, G2 /M). D-G. Histogrammit edustavat prosenttiosuutta pyöräily HCT116 WT (D, E) ja p53-nolla (F, G) solut G2 /M. H-K. Histogrammit osoittavat prosenttiosuuden HCT116-WT (H, I) ja p53-nolla (J, K) solut Saharan 2n DNA. Histogrammit DK perustuvat tietoihin B ja C.

p

arvot ovat suhteessa siGL2.

tunnistaminen neljä Nek11 silmukointivarianteista että tehdään nucleocytoplasmic shuttling

ensimmäinen karakterisointi ihmisen Nek11 kuvattu kaksi silmukoitumisvarianttia, pitkä versio 74 kDa, kutsutaan Nek11L, ja lyhyt versio 54 kDa, kutsutaan Nek11S [9]. Analysoimalla geenin ilmentymisen tietokantoja, tunnistimme kaksi otaksuttu silmukointivarianteista että me kutsutaan Nek11C ja Nek11D, jossa ennustettu koot 56 ja 69 kDa, vastaavasti. Kaikki neljä variantit on sama N-terminaalinen sekvenssi 466 tähteiden, joka kattaa katalyyttisen domeenin ja kahden ennustetun kiertynyt kelat. Nek11S ja Nek11C lopettaa pian sen jälkeen, joskin eri sekvenssit. Nek11L ja Nek11D ovat laajempia C-päät, aluksi jakaa ylimääräisen sama ~ 50 tähteet ennen päättyen vaihtoehtoista järjestystä (kuvio 4A). Sen määrittämiseksi, ovatko nämä vaihtoehdot olivat erillisiä ominaisuuksia, ensin luotu U2OS soluja, jotka pysyvästi ilmensivät GFP-merkittyä versiota kustakin Nek11 variantin. Näitä soluja käytettiin varten solunosasijaintia tutkimuksissa taas on osoitettu, että Nek11 ehtyminen häiritsee DDR näissä soluissa [7]. Olemme myös tuottaneet U2OS solulinja, joka ilmentää ”kinaasi-dead” (KD) versio Nek11L kanssa mutaatio kaksi olennaista katalyyttinen jäämiä (K61R /D158A) onko lokalisointi saattaisi olla aktiivisuutta riippuvaista.

. Kaaviokuva neljästä Nek11 proteiini-isoformit. Eri C-päät on osoitettu, ja pisteviivat osoittavat paikat, joissa proteiinit eroavat. Kannat kinaasidomeenin, rulla-kelat, jäännös numeroita ja ennustetut molekyylipainot on merkitty. B. Lysaatit U2OS: GFP-Nek11 stabiileja solulinjoja tai U2OS vanhempien solut analysoitiin SDS-PAGElla ja Western-blottauksella vasta-aineita Nek11, GFP: n ja α-tubuliinin. C. U2OS solut transfektoitiin konstruktien esitetty, ja sen jälkeen 20 tunnin ajan, käsiteltiin ± MG132: ssa 4 tuntia. Lysaatit analysoitiin Western blot, jossa on ilmoitettu. M.wts. (KDa) on merkitty jäljellä B ja C. D. GFP vain ja GFP-Nek11 solulinjoista kuten hoidettiin ± LMB 3 tuntia ennen kiinnitystä ja värjäystä GFP vasta-aineita. Mittaviivat 5 um.

Western blot-analyysi osoitti, että GFP-Nek11D variantti ekspressoitiin paljon alhaisempia verrattuna muihin varianttien stabiileja solulinjoja (kuvio 4B). Inkubointi proteasomin estäjä, MG132, johti valikoiva voimistumista tämän isoformin viittaa siihen, että Nek11D variantti on ainutlaatuinen joukossa nämä neljä variantit jolla sekvenssit, jotka kohdistuvat sen ubikitiinistä välittämän hajoamisen, oletettavasti sen ainutlaatuinen C-päässä (kuvio 4C). Immunofluoresenssimikroskopia paljasti, että vaikka Nek11L ja Nek11D isoformit rajoittuivat sytoplasmaan, Nek11S ja Nek11C havaittiin sekä sytoplasmassa ja tumassa (kuvio 4D). Kinaasi-kuollut Nek11L rajoitettiin sytoplasmaan kuin villityypin proteiini. Kuten Nek11 ilmoitettiin paikallistaa ja nucleoli [19], me arvioineet vaihtoehtojen saattaa välinen edestakainen sytoplasman ja tuman. Esto tumasta kanssa Crm1 estäjän, leptomycin B (LMB), aiheutti kaikki neljä Nek11 vaihtoehdot kerääntyä tumassa, joskin ilman selvää pitoisuus nucleoli. Kinase-kuollut Nek11L tehtiin myös nucleocytoplasmic shuttling osoittaa, että tämä ei ole riippuvainen sen entsymaattinen aktiivisuus.

tunnistaminen sekvenssit säännellä nucleocytoplasmic sukkuloimisen Nek11

kartta alueiden proteiinin tarvitaan ydin- tuonti ja vienti, olemme analysoineet lokalisoinnin sarjan Nek11 katkaisu mutanttien (kuvio 5A). N-terminaalisen katalyyttisen domeenin yksinään (tähteet 1-287) paikantuvat sytoplasmaan ja ei shuttle. Sen sijaan C-terminaalinen ei-katalyyttinen domeeni Nek11L (tähteet 288-645) oli sytoplasmista puuttuessa LMB, mutta keskittyy ytimen kanssa LMB. Tämä osoittaa, että se sisältää kuvioita tarpeen nucleocytoplasmic shuttling (kuvio 5B ja 5C). Koska kanoninen ydinvoiman lokalisointi ja vienti sekvenssit eivät olleet läsnä, me syntyy viisi lisärakenteelle edustaa C-terminaalista typistyk- Nek11L (kuvio 5A ja 5D). Konstrukti käsittää katalyyttinen domeeni ja molemmat rulla-kela motiiveja (tähteet 1-388) oli ydin- riippumatta LMB hoitoa, kun taas laajennettu konstruktio käsittää tähteet 1-541 käyttäytyi kuin täyspitkä proteiini on sytoplasman käsittelemättömissä soluissa ja ydinvoiman kanssa LMB ( Kuva 5E). Konstrukti, joka edusti aluetta konservoitunut kaikkien neljän Nek11 variantit, 1-466, näytteillä tasapuolisempaa ydinvoima-solulima jakautuminen muistuttaa S ja C variantteja, jotka päättyvät pian tämän vaiheen jälkeen. Kaltaisia ​​muunnelmia, tämä rakenne keskittynyt tumassa jälkeen LMB hoidon. Siksi ehdotamme, että kelattu-kela alueet sisältävät sekvenssejä, joita tarvitaan ydin- tuonti, kun taas alueen tähteiden 388 ja 465 sisältää tarpeelliset sekvenssit tumasta.

. Kaavioesitys GFP-Nek11L konstrukteja käytetään tutkimaan solunosasijaintia. Hallitseva lokalisointi sytoplasmaan (C), nucleus (N) tai tasaista jakautumista (C /N) ± LMB on aiheellinen. B. Western-blotit, joissa GFP: n ja α-tubuliinin vasta lysaatit valmistettiin U2OS soluja transfektoitiin ohimenevästi 24 tuntia kanssa Nek11L konstruktien ilmoitettu. Kinaasidomeeni sisältää tähteet 1-287, ja C-pään domeeni sisältää tähteet 288-645. M. WTS (kDa) on merkitty vasemmalle. C. U2OS solut transfektoitiin konstruktien esitetty, ja sen jälkeen 24 tunnin ajan, käsiteltiin ± LMB 3 tuntia ennen kiinnitystä ja värjäystä GFP-vasta-aineita. D E. Western-blotit ja immunofluoresenssilla värjäys suoritettiin kuten B ja C, vastaavasti, ja konstrukteja ilmoitettu. Mittaviivat 5 pm.

Nek11S on keskeinen rooli DNA-vaurioita aiheuttama G2 /M pidätys HCT116-soluissa

Voit selvittää kaikki neljä Nek11 silmukointivarianteista ilmaistaan ​​HCT116 solut, samoin kuin kolme muuta CRC solulinjat (HT29, SW480 ja SW620), kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin isoformi-spesifisiä alukkeita (S4A ja S4b kuviossa). Nämä tunnistaa mRNA: t kunkin variantin kaikissa neljässä solulinjoissa, jossa Nek11L ja Nek11C johdonmukaisesti on kaikkein ja vähiten runsas, tässä järjestyksessä (S4C kuvio). Sitten verrataan niiden runsaus näissä CRC solulinjoissa suhteessa, että kuolemattomaksi ihmisen colonocyte linja, HCEC. Tämä osoitti huomattavaa vaihtelua lisääntynyt Nek11S in HT29 ja lisääntynyt Nek11C in SW620 (S4d kuvio). Muutoin tasoa eri muunnelma ovat joko samanlaisia ​​tai pienempi verrattuna HCEC soluihin.

testaamiseksi edistää näiden silmukoitumisvariantit DDR vuonna HCT116-soluissa, kaksi siRNA: ita todensi, joka yhteistyössä depletes sekä pidempi isoformeja, Nek11L ja Nek11D, ja joka selektiivisesti kuluttaa Nek11S (S4E kuvio). Nämä levitetään sitten HCT116 WT ja p53-null-soluissa käyttäen protokollia kuvattu aiemmin analysoida vastauksia IR- ja irinotekaani PI-pohjainen virtaussytometrialla (S5 kuvio). Vuonna HCT116 WT-soluissa, oli vaatimaton väheneminen G2 /M-väestöstä, kun ehtyminen Nek11L /D vasteena IR, mutta ei vasteena irinotekaanin. Sen sijaan oli huomattava väheneminen G2 /M väestö vastauksena sekä hoitojen vaikutukset ehtyminen Nek11S (kuvio 6A-6C, S2E ja S2F kuvassa). Vuonna HCT116-p53-null-solut, pieni mutta merkittävä väheneminen G2 /M väestö nähtiin upon Nek11L /D ehtyminen vastauksena irinotekaanin mutta ei IR, kun taas Nek11S väheneminen johti huomattavaan vähenemiseen vastauksena sekä hoitojen (kuvio 6D -6F). Kuten ehtyminen koko Nek11, se oli huomattava, että osa G2 /M-soluissa palasi perustasoille kun köyhtyminen Nek11S WT, mutta ei p53-null-soluissa. Näin ollen, vaikka suhteellisen ehtyminen tehokkuus voi vaihdella, nämä tiedot osoittavat, että vähintään Nek11S on tärkeä rooli välittämisessä DNA-vaurion indusoiman G2 /M-pidätys HCT116-soluissa, kun taas vahvistavat, että tämä vaste on osittain p53-riippuvainen.

AL. Käyttäen kuvattujen kuviossa 1A säteilytetty kuvio 3A irinotekaanin hoitoon, HCT116 WT (AC, GI) ja HCT116 p53-null (DF, JL) solut transfektoitiin siRNA oligonukleotidien yhteistyöhön heikentävistä Nek11L ja Nek11D (L /D ), tai heikentäviä Nek11S tai lusiferaasi (siGL2). Histogrammit osoittavat prosenttiosuuden pyöräily solujen G2 /M (A-F) ja koko solujen sub-2n DNA (G-L).

p

arvot ovat suhteessa siGL2 kullekin käsittelylle.

tutkiminen osa-2n väestön kautta PI-pohjainen virtaussytometrialla paljasti, että ehtyminen Nek11S, mutta ei Nek11L /D, johti merkittävään kasvuun solukuoleman HCT116 WT soluissa altistetaan IR- tai irinotekaania (kuvio 6G-6I). Ehtyminen Nek11S, mutta ei Nek11L /D, johti myös merkittäviä määriä solun kuolemaan p53-null-soluissa altistetaan IR- tai irinotekaani (kuvio 6J-6L). Tämä jälkimmäinen tulos odottamaton annettiin edellisen havaintojen solukuoleman Nek11-köyhdytettyä soluja altistetaan näistä hoidoista on p53-riippuvaista. Kuitenkin ehtyminen Nek11S johti myös merkittävään kasvuun solukuoleman puuttuessa genotoksisten hoidon p53-null-soluissa viittaa siihen, että tämä ei ole täsmällistä vastausta eksogeenista DNA vaurioita.

Keskustelu

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että kinaasiaktiivisuus Nek11 stimuloidaan HeLa-soluissa altistetaan DNA: ta vaurioittavat aineet ja replikaation inhibiittorit [9]. Lisäksi Nek11 tunnistettiin näyttö geenejä tarvitaan G2 /M pidätys U2OS soluissa altistetaan IR, jossa Nek11 edistää Cdc25A hajoamista alavirtaan Chk1 [7]. Tässä osoitamme, että menetys Nek11 kumoaa G2 /M pidätystä ja vähentää solujen selviytymistä HCT116 CRC soluissa alttiiksi joko IR- tai kemoterapeuttisen aineen, irinotekaani. Lisäksi osoitamme, että Nek11 läpikäy nucleocytoplasmic shuttling tavalla muistuttaa muita DDR proteiineja. Näiden tietojen lisänäyttöä että Nek11 on tärkeä välittäjäaine G2 /M DNA-vaurioita vastaus sekä vaatimatta eloonjäämisen CRC soluja.

normaalit solut altistetaan DNA-vaurioita pidätys ensisijaisesti G1 /S siirtymä . Kuitenkin tämä tarkistuspisteen puuttuu usein syöpäsoluissa, jotka ovat menettäneet joko p53 tai Rb. Nämä solut ovat siksi riippuvaisia ​​G2 /M tarkastuspiste altistuessaan DNA: ta vaurioittavat aineet. Meidän tutkimukset osoittivat, että vaikka altistus HCT116-solujen sekä IR- ja irinotekaanin johtanut merkittävään kasvuun G2 /M jae, sopusoinnussa aktivoituminen G2 /M tarkastuspiste, tämä jae oli olennaisesti vähentynyt poistettaessa Nek11. Vuonna WT soluissa, Nek11 ehtyminen vähensi G2 /M-fraktion ja perustasolle läsnä pyöräily väestö tukee mahdollinen rooli Nek11 G2 /M tarkastuspiste sisään HCT116-soluissa. Kuitenkin p53-null-soluissa, G2 /M-fraktio, mutta vähensi merkitsevästi, pysyi yli lähtötason. Tämä viittaa siihen, että Nek11 paitsi asetetaan p53-riippumattoman G2 /M pidätys seuraavat DNA-vaurioita, mutta lisäksi estää p53-riippuvainen menetys G2 /M-soluja (kuvio 7).

kaavamainen malli havainnollistaa ehdotettu roolit Nek11 vastaukseen CRC solujen aineita, jotka hämmentää DNA eheys joko suoran DNA-vaurion tai pysähtynyt replikointi. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Nek11 sijaitsee alavirtaan ATM /ATR ja Chk1 ja pyrkii estämään mitoottisiin etenemisen edistämällä hajoamista Cdc25A. Tuloksemme osoittavat, että CRC-soluissa, Nek11 tarvitaan paitsi varmistaa G2 /M pidätys vaan myös suojaamaan p53-riippuvaista apoptoosia. Epäonnistuminen G2 /M tarkastuspiste voi johtaa solun kuolemaan p53-riippumattomalla tavalla osittain kautta mitoosi katastrofin.

Tämän mukaisesti, havaitsimme vaatimaton määrä kasvaa solujen sub 2N murto, ohjeellinen kuolla soluja, että Nek11-köyhdytettyä WT soluja altistetaan IR- tai irinotekaania, jota ei ole nähty p53-null-soluissa. Samoin erityisiä analyysi apoptoottisten osa anneksiini V-määritys paljasti, että pieni murto-osa Nek11-köyhdytettyä WT, mutta ei p53-null, solut altistetaan IR- tai irinotekaania tuli apoptoosin. Siten puuttuessa Nek11, jotkut HCT116-solut altistettiin eksogeeniselle DNA-vaurioita tehdään p53-riippuvaista apoptoosia, kun taas toiset oletettavasti palaamaan solusyklin p53-riippumattomalla tavalla. B