Krooninen sairaus

tiivistelmä

kvantitatiivinen bio-kuvantaminen alusta on kehitetty analyysi ihmisen syövän levittämistä lyhytaikainen selkärankaisten ksenotransplantaatio määrityksessä. Kuusi päivää istutuksen jälkeen syöpäsolujen zebrafish alkioiden, automatisoitu kuvantamisen 96-kuoppalevyille kytketty kuvan analyysialgoritmeja määrällisesti leviää isäntä. Havainnot tässä mallissa korreloivat käyttäytymistä pitkällä aikavälillä jyrsijöiden ksenograftimalleja varten paneelien poorly- versus erittäin pahanlaatuisten solulinjojen peräisin rinta-, peräsuolen ja eturauhasen syöpä. Lisäksi syöpäsolut hajallaan mesenkymaalisten ominaisuudet osoittavat korkeampaa levittämistä kapasiteettia kuin solutyyppejä epiteelin ulkonäön. Lisäksi RNA-interferenssi vahvistetaan etäpesäke-vaimennin rooli E-kadheriinin tässä mallissa. Tämä automatisoitu määrällinen koko eläin bio-kuvantamisen määritys voi toimia ensilinjan

in vivo

seulonta askel syövän huumeiden tavoite löytö putki.

Citation: Ghotra VPS, hän S, de Bont H, van der Ent W, Spaink HP, van de Water B, et al. (2012) Automated Koko Eläinten Bio-Imaging-määritys Ihmisen Cancer levittäminen. PLoS ONE 7 (2): e31281. doi: 10,1371 /journal.pone.0031281

Editor: Laurent Renia, Agency for Science, Technology and Research – Singapore immunologian Network, Singapore

vastaanotettu: 02 elokuu 2011; Hyväksytty: 04 tammikuu 2012; Julkaistu: 08 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Ghotra et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat hollantilaisen Cancer Society (UL-2010-4670) ja EU FP7 ZF Cancer projekti (TERVEYS-F2-2008-201439). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

perinteinen syöpälääke näytöt suoritetaan käyttämällä solulinjoja kasvatetaan 2D kulttuuriin tai käyttämällä

in vitro

proteiini-sitoutumismääritykset. Syövän etenemisessä, on kuitenkin monimutkainen prosessi, dynaaminen vuorovaikutus syöpäsoluja ja organismi, joka liittyy geneettisiin muutoksiin johtavia vapautettu selviytymistä ja proliferaatiota, angiogeneesiä, invaasio ja metastaasi [1]. Ihannetapauksessa, geenit, jotka on rooli tässä prosessissa identifioidaan

in vivo

ablaatio tai hiljentäminen. Vaikka geneettinen hiiri malleja syövän ja ihmisen kasvainsolujen ksenotransplantaatio malleja jyrsijöillä edelleen välttämättömiä, tällaiset järjestelmät ovat kalliita, hitaita ja vähemmän mukautuvia suuren kapasiteetin määrityksissä syöpälääkkeen kohde- löytö. On olemassa selvä tarve kehittää nopeasti, puoliautomaattiset

in vivo

järjestelmiä keskisuuri tai suuri seulontaan sovelluksia prekliinisissä kohde löytö ja lyijy aineiden tunnistaminen.

Tältä osin seeprakalan ( ZF) tarjoavat monia ainutlaatuisia etuja tutkia mekanismeja, jotka ohjaavat syövän muodostumisen ja etenemisen. ZF ovat selkärankaiset, jotka voidaan nostaa hyvin moneen kustannustehokkaalla tavalla. Lähes täydellinen genomin sekvenssin paljastaa, että useimmat syövän geenien ja tuumorisuppressorigeeneille ovat hyvin säilyneitä ZF ja ihmisillä (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish) ja ZF muoto spontaani kasvaimia vastaavien histopatologisten ja geeni-ilmentymisen profiilit ihmisen kasvaimissa [2] – [4]. Tärkeää on, ksenotransplantaatio ihmisen syöpäsoluja on mahdollista [5], [6]. ZF alkioita, joita käytetään tätä tarkoitusta varten ei ole adaptiivisen immuunijärjestelmän, mikä lisää onnistumisen ksenotransplantaatio, kun ne tarjoavat mikroympäristön, jossa ihmisen kasvain solut lisääntyvät, siirtää, muodossa kasvain massat, ja stimuloivat angiogeneesiä [5] – [8].

ZF alkiot ovat erityisen käyttökelpoisia semi high-throughput mikroskooppinen analyysi alustoja, koska ne ovat läpikuultavia, ja voidaan säilyttää 96-kuoppaisilla levyillä. Optinen läpinäkyvyyttä ZF tarjoaa mielenkiintoisia mahdollisuuksia tutkimukseen mahdollistaa visualisoinnin metastaattisen prosessin suurella tarkkuudella [8], [9]. Viimeaikaiset havainnot osoittavat, että monenlaisia ​​farmaseuttisesti aktiivisten yhdisteiden laittoman fysiologisia vasteita ZF alkioiden ja estää sairauksien kehittymisestä samanlaisia ​​vaikutuksia nisäkkäiden järjestelmissä [10] – [12]. Nämä havainnot korostavat mahdollisuuksia ZF alkion ksenotransplantaatio mallia voidaan käyttää syövän Lääkekehitysprosessi. Kuitenkin tällä kertaa käyttäen ZF seuloa syöpään asiaan huume – ja geenikohteet rajoittaa ole kattavaa automatisoitu biotesteissä. Täällä sovellettu automatisoitu kuvantamisen ja kuva-analyysi menettelyjä ZF Ksenotransplantaation malli kehittää ensimmäinen puoliautomaattinen koko-organismi kvantitatiivinen bio-kuvantamisen määritys analysointiin syövän levittämistä selkärankaisen.

Tulokset

Olemme kehittäneet noninvasive, kvantitatiivinen koko eläin kuvantamiseen menetelmän levittämiseksi ksenotransplantaatio ihmisen syöpäsolujen ZF alkioiden 96-formaatissa. Kaikki vaiheet lyhyesti kuvattaviin kuvassa 1.

(A) ruskuaispussista kiinnittymisestä CM-Dil leimattuja kasvainsoluja Tg (Fli: EGFP) ZF alkiot 2 päivää jälkeistä lannoitusta. (B) Formaldehydi kiinteän 6 dpi alkioiden puettu 96-kuoppaisilla levyillä. (C) Automatisoitu kuva hankinta käyttämällä CLSM alustan varustettu liikkuva vaihe kaappaa useita Z pinoja alkiota kohden käyttäen 488 ja 561 nm laser linjat. (D ja E) automaattinen luominen laajennettu syvyys komposiitti kuvia. (F) Multiple laajennettu syvyys kuvaavan alkioiden makaa eri sivusuunnassa suuntauksia. (G) Automatisoitu yhtenäinen uudelleen suuntaamista kuvia. (H) sirontakuvio edustavat kasvainkeskusten taakka useita alkioita, jotka kuuluvat johonkin koeolosuhteissa.

Automatisoitu kuvankaappaus ja esikäsittelyä

CMDiI-leimattuja kasvainsoluja ruiskutettiin keltuaisen sac 2 päivän ikäiset FLI-EGFP alkioita [13] ja kiinteät 6 päivää implantaation jälkeen (dpi) (kuvio 1A). Kiinteä alkioiden puettu 96 hyvin lasin pohjalevyt automaattiseen kuvantaminen ( 5 minuuttia per levy) (kuvio 1 B). Epi-fluoresenssimikroskopialla ei havaita Disseminated kasvainsolujen johtuu liiallisesta tausta primaarikasvaimen massa. Siksi käyttäen konfokaali laser-skannaus mikroskooppi (CLSM) yhdistettynä automaattisen vaiheessa; Useiden z pinot alkiota kohden otettiin kiinni jokaiselle hyvin täysin automaattista menettelyä (kuvio 1 C, 1D ja video S1). Konfokaaliset kuvat oli muunnetaan automaattisesti jatkettu syvyys yhdistelmäkuvat (kuvio 1 E), joka oli järjestetty uudelleen yhtenäisen suunnan (kuva 1 F ja G), jotta automaattisten kvantitatiivinen kuva-analyysi (kuvio 1 H).

Automated moniparametrisissä analyysi syövän solu levittäminen

Todettuaan edellytykset automatisoitu kuvantamisen ja kuvan esikäsittelyä tuumorisolujen istutettu ZF alkioita; me myöhemmin kehitetty algoritmi automaattiseen analysointiin kasvainkeskusten taakka jälkikäsitellä ZF kuvia. Tätä varten Image-Pro pohjainen ohjelmisto on kehitetty, joka suoritettiin oleellisesti kolme päätehtävää (katso materiaalit ja menetelmät osassa yksityiskohtaista tietoa makron).

1) B uudelleen suuntautuminen kuvien (kuva 2): kaikki alkiot olivat automaattisesti kohdennettu uudelleen vaakasuorassa, pää kohti ja ruskuaispussi kohti pohjaa.

2) B-määritys injektion leimattujen tuumorisolujen (kuvio 3A-C): ruiskutusasennosta laskettiin kuvien perusteella segmentoidun GFP-kanavan (ja varmistettiin silmämääräisesti käyttämällä punaista kanava).

3) B havaitseminen kasvainkeskusten (kuva 3D ja E): Punainen kanava oli segmentoida käyttäen intensiteettikynnys ja pienin ja suurin alue suodattimet.

(A) Laajennettu syvyys kuva 6 dpi ZF alkio. (B) Harmaa arvo kuvan yhdistelmästä vihreä ja punainen kanavia. (C) Näön harmaa kuva levittämisen jälkeen sulkemisen suodatin optimoi määrittämiseen ääriviivat. (D) alkio segmentoitu levittämisen jälkeen intensiteettikynnys ja alue suodatin. Nuolenkärki osoittaa punainen esine ulkopuolella ääriviivat, joka ei kuulu segmentointia. (E) Rajattu kuva vain valitun objektin. (F) Alkio kierretty x ° vaakasuoraan suunnata. (G ja H) määrittäminen x aseman arvon painopisteen (

cm

) ja keskustan painopisteen (

cc

). (I) Vaaka flip kuvan vain, jos

cm

on vasemmalla puolella

cc

, jolloin kuvien pään alkion aina oikealle puolelle. (J) Kuva levittämisen jälkeen suljettu suodatin yhdistettyyn vihreä ja punainen kanava saada ääriviivat alkion. Point makaa 75% etäisyydellä äärivasemmiston alkion ääriviivat lasketaan. Y-akseli piirretään tässä X-asennossa ylemmän alentaa ääriviivat. Ylempi suorakaide 1 vedetään. (K) Ala suorakaide 2 piirretään. (L) Pystysuora flip kuvan vain, jos punainen intensiteetti suorakulmio 1 on suurempi kuin suorakulmio 2 (M) Kaaviokuva laskelmia vaiheiden E-I. Kaikkiaan tämä menettely johtaa kuvia, joissa pää on oikealla ja ruskuaispussi on pohjassa kuvan. Asteikko bar = 200 mikrometriä E ja I.

(A) Laajennettu syvyys kuva 6 dpi kiinteiden alkion jälkeen uudelleensuuntausta. (B) Alkio ääriviivat eriytyneiden GFP kanavan ja Y-akseli leikkaavien X-akseli 75% äärimmäisestä vasemmalta. (C) Laskettu imeytyspaikan 75% etäisyydellä äärivasemmisto ja 75% ylhäältä Y asentoon. (D) Segmentoitu punainen kanava osoittaa kasvainkeskusten taakkaa alkio. (E) mainitaan kasvainkeskusten. (F) Useita parametreja kasvainkeskusten taakan kohti laskettuna alkio. Jokainen numero kuvassa vastaa yhtä kasvain keskittyä. (G) kasvainkeskusten levittäminen yhdessä alkion edustettuina parvikuvio (koordinoi 0,0 edustaa laskettu pistoskohdan). (H) Yhdistetty parvikuvio osoittaa kasvainkeskusten levittäminen 39 pistetään alkioista. (I) kvantifiointi kumulatiivisen etäisyyden (CD). Jokainen täytetty neliö edustaa kumulatiivista etäisyyden injektiopisteen kaikkien tunnistettujen kasvainkeskusten yhdessä alkio. Mean kumulatiivinen etäisyys (MCD) on 39 pistetään alkioita tässä kokeessa on 15024 um. Asteikko bar = 200 mikrometriä A.

Data vietiin Excel ja useita numeeriset parametrit laskettiin kuvaamaan kasvainsolun taakka alkiota kohden. Näihin sisältyvät kokonaismäärään kasvainkeskusten, keskimääräinen etäisyys kasvainkeskusten pistoskohdasta, ja kumulatiivinen kuljetun matkan päässä injektiokohdassa (kuvio 3F). Koska ainoastaan ​​matkan kumulatiivisesti parametrin yhteenlaskettu määrä levittää solujen niiden etäisyys injektiokohdassa, päättelimme, että tämä parametri kuvaa parhaiten kasvain levittämistä kapasiteetti (kuva S1). Tiedot olivat edustettuina kaavioita näyttämällä sijainnit kasvainkeskusten suhteessa ruiskutuspistettä (koordinaateissa x, y = 0,0) kunkin alkion (kuvio 3G) tai kaikki alkiot yhden koetilalle (kuvio 3H). Näiden tietojen kumulatiivinen etäisyys kaikkien havaittujen kasvainkeskusten laskettiin alkiota kohden (CD) ja sen jälkeen keskimäärin kaikkien pistetään alkiot yhdessä koeryhmässä lopulliseksi kvantitoimiseksi kasvainsolun levittämistä (keskiarvo kumulatiivinen etäisyys (MCD) (Kuva 3I ja S1) .

me tehdään kokeita määrittämään varhaisin ajankohta, jonka ansiosta vankka syrjiä huonosti aggressiivinen ja erittäin aggressiivinen solulinjoissa. käyttäminen LnCAP ja PC3 sellaisenaan esimerkkinä eturauhassyövän [14] – [19] emme havainneet ero 2 dpi, MCD PC3 voitaisiin erottaa MCD LNCaP 4 dpi, ja 6 dpi MCD oli selvästi korkeampi PC3 verrattuna LnCAP vahvojen merkitys (kuva 4). Siksi 6 dpi valittiin analyysiin kaikissa lisäkokeita.

(A ja B) LnCAP (A) tai PC3-solut (B) istutettiin ja alkiot vahvistettu 2, 4 tai 6 dpi kuvantamiseen (im- kuvat ja automatisoitu kuva-analyysi (sirontakuvaajiin )). Alarivi kuvia (asteikko bar = 50 nm) näyttää zoom-in alueen merkitty pisteviivalla ylärivissä kuvia (asteikko bar = 100 um). (C) CD 2, 4 ja 6 dpi LnCAP (harmaa) ja PC3-pistetään alkioiden (musta) lasketaan scatterplots A ja B, vastaavasti. Tilastollinen testaus ero LnCAP ja PC3 eri dpi osoitetaan. * P 0,05, *** p 0,001.

karakterisoimiseksi kasvainpesäkkeitä tunnistaa tällä menetelmällä, laskimme keskiläpimitta segmentoidun punainen esineitä hännän alueella PC3 istutetaan alkioita. Keskimääräinen keskimääräinen halkaisija oli -15 um joitakin suurempia esineitä jopa ~45 um, mutta ei esineiden keskimääräinen halkaisija 8 um valitaan analyysiä varten sopiva kanssa yksilöllisten kasvainsolujen tai pieniä klustereita (kuvio 5A). Olemme lisäksi analysoitu tunnistaa kasvainkeskusten korkean resoluution kuvantaminen, 3D jälleenrakentamiseen, ja pinta-mallinnus (kuvio 5B ja video S2). Tämä vahvisti ja laajensi havainto, että yksittäinen tuumorisolut tai pienet klustereita tunnistettiin automatisoidun kuva-analyysi ja osoitti kasvainsolujen vuorovaikutuksessa isännän verisuoniston (kuvio 5B). Sulkea pois esineitä takia CMDiI merkintöjä, me pistetään mCherry leimattuja PC3-soluissa. Täysin samaa ominaisuuksiin punaisen tunnistettavien injektion jälkeen CMDiI-leimatun PC3, yksittäiset PC3-mCherry soluja havaittiin tiiviissä yhteistyössä isäntä verisuonia (kuvio 5C ja video S3). Lopuksi, kokeet, joissa käytetään unimplanted alkioiden (kuvio 6A) ja vertailu CM-Dil-leimattuja PC3-solut ruiskutetaan standardi FLI-EGFP tai Casper FLI-EGFP alkioiden puuttuvat kaikki pigmentit (kuvio 6B ja C), sulkea pois mitään vääriä positiivisia johtuen autofluoresenssia pigmentti soluja.

(A) kvantifiointi keskiläpimitta makro-tunnistaa kasvainsolun pesäkkeitä hännän alueella PC3-injektoitu alkioita. Saadut tiedot 5 alkioista. (B) Korkean resoluution kuvantaminen CM-Dil-leimattu PC3 kasvainsolujen pesäkkeitä. (B1) Makro-tunnistettu PC3 kasvainsolujen pesäkkeitä. (B2) Zoom-in alueella ilmoitettu

B

1 esittää kasvainsolujen yhdessä isännän verisuoniston. (B3 ja B4) Kolmiulotteisia jälleenrakennus ja pinta-mallinnus alueen insertin B2; arrowheads osoittavat kasvainsolun osittain sisällä distaalinen pituus- anastomoottisia alus (Video S2 ja S3). (C) Korkea resoluutio kuvantaminen PC3-mCherry kasvainsolujen pesäkkeitä. C1-4, kuten B1-4 ja PC3-mCherry. Mittakaava on 100 um B1 ja C1; 50 um B2 ja C2; 15 mikrometriä B3 ja C3; 10 um sisäkkeet B3 ja C3; 5 um B4 ja C4.

(A-C) Kussakin tapauksessa ylhäällä vasemmalla kuvassa vihreä merkkivalo (Fli-EGFP) ja oikeassa yläkulmassa kuvassa punainen signaali syöpäsoluja. Pohja kuvat osoittavat zoomaa boxed alueen vasemmassa yläkulmassa kuva tarjoamalla vihreä (vasen) ja punainen merkkivalo (keskellä) ja läpivalaisu (oikealla). Mittakaava on 100 um kuvat osoittavat koko alkio ja 50 pm zoomatulla kuvia. (A) Ei-istutettu FLI-EGFP alkio kuvattavan 8 vuorokautta hedelmöityksen. Joukko ei-istutettu alkioita ja tuumorisolujen lukumäärän (virheellisesti) todettu automaattisilla kuvantaminen ja kuva-analyysi menettelyä, oikeaan. (B) Fli-EGFP alkio kiinnittyy CM-Dil-leimattu PC3 kuvausaikaisilla 6 dpi. (C) Fli-EGFP Casper alkio kiinnittyy CM-Dil-leimattu PC3 kuvausaikaisilla 6 dpi.

Yhdessä tämä menetelmä poistaa tarpeen visuaalinen pisteytys ja mahdollistaa automatisoidun tuotannon ja arkistointi kuvien ja numeeriset tiedot kuvaavat levittämistä kasvainsolujen selkärankaisen organismissa. Lisäksi kasvaimen solut tunnistaa tällä automatisoidulla bio-kuvantamisen määritys, kasvain-isäntä vuorovaikutusten voidaan edelleen tutkia yksityiskohtaisesti korkean resoluution mikroskoopilla.

Määrityksen validointi: korrelaatio käyttäytyminen hiirimalleissa ja epiteelin versus haja fenotyyppi

osoittamiseksi sovellettavuutta automaattisten alustan erottaa huonosti aggressiivinen ja erittäin aggressiivinen syöpäsoluja, kolmea eri paneelit solulinjojen analysoitiin:

1) B eturauhassyövässä PC3 (erittäin metastaattinen hiirimalleissa, eturauhassyöpä /luumetastaasipotilailla, androgeenista riippumaton, hajallaan kasvun 2D kulttuuriin; mesenkyymisolujen markkereita) ja LNCaP (huonosti metastaattinen hiirimalleissa, eturauhassyöpä /imusolmuke; ilmentyminen eturauhas- erilaistumisen markkerit; epiteelin saarista 2D kulttuuriin; epiteelin markkerit) analysoitiin [14] – [19].

2) B Rintasyövän BT474 (metastaattinen hiirimalleissa; rintasyöpä invasiivisia duktaalikarsinooma /kanava; ER + /PR + /p53mutated; korkea Her2 ilmaisu; ”heikosti luminaalisen epiteelin kuten” fenotyyppi kulttuuri; vähensi ilmaus epiteelin markkereita) ja MCF7 (erittäin heikko metastaattinen potentiaali ilman ektooppisesti ilmaistuna onkogeenien, rinta adenokarsinooma /pleuraalieffuusio; ER + /PR + /p53 normaali, alhainen Her2, epiteelin saarista 2D kulttuurin epiteelin markkereita) analysoitiin [20] – [23 ].

3) B ja peräsuolen syöpä, SW620 (peräsuolen adenokarsinooma Dukes ’tyyppi C /imusolmuke etäpesäke; hajallaan kasvun 2D kulttuurin mesenkymaalisten markkereita) ja HT29 (peräsuolen adenokarsinooma /paksusuoli; epiteelin saarista 2D kulttuuri; epiteelin markkereita ) analysoitiin [24]. Silmiinpistävän, kunkin syöpä tyyppitestattu, levittäminen tässä ZF ksenografti- määrityksessä korreloi merkitsevästi metastaattinen kapasiteetti raportoitu hiiren malleja ja /tai ominaisuudet tiedetään liittyvän syövän etenemiseen lukien Differentiaatiomarkkerien tai epiteelin versus hajallaan fenotyypin (kuvio 7A ja B; kuvio S2 ). Nämä tiedot vahvistaa tämän lyhyen aikavälin automatisoitu bio-kuvausmenetelmä ja osoittaa, että se edustaa tehokas työkalu ennustaa aggressiivisuutta syöpäsolujen monimutkaisempia, pitkäaikainen

in vivo

järjestelmissä.

( A) sirontakuvaajaan edustus kasvainsolun levittämistä varten tarkoitettu eturauhasen (

ylempi

kaavioita), rinta (

keskellä

), ja peräsuolen syövän solulinjoissa (

alempi

kaavioita). Määrä pistetään alkioiden 2 biologisista rinnakkaista osoitetaan. (B) MCD määritetään data edustaa A. Tulokset esitetään keskiarvona ± s.e.m. * P 0,05, *** p 0,001. (C) 6 dpi alkio pistetään PC3 osoittaa kasvainkeskusten taakka määritetään segmentoitu punaisen kanavan (

jäljellä

), ja edustettuina parvikuvio (

oikea

). (D) automaattinen määritys alueen syrjäytymisen kasvainkeskusten noin implantaatiokohdasta ja alueella suoliston kehitys (

jäljellä

), ja loput kasvainkeskusten edustettuina parvikuvio (

oikea

). (E) MCD ennen (

musta

) ja jälkeen syrjäytyminen (

valkoiset pylväät

) varten tarkoitettu eturauhasen (

jäljellä

), rinta (

keski

), ja peräsuolen syövän linjat (

oikea kaavio

). Kertainen ero huonosti ja erittäin aggressiivinen solulinjojen on osoitettu. Tiedot esitetään keskiarvona ± s.e.m. * P 0,05, *** p 0,001. (F) MCD jälkeen syrjäytymisen PC3 ja MCF7 useita itsenäisessä kokeessa osoittaa toistettavuus. Tiedot esitetään keskiarvona ± s.e.m.

Laaja ZF solujen liike tapahtuu alueella ruskuaispussista, jossa suolen kehitys tapahtuu ajassa meidän analyysi [25]. Halusimme jättää mitään vaikutusta passiivisen vaeltamisen istutettu kasvainsoluja johtuu tästä kehitystapahtumasarjan lähellä ensisijainen istutusta alueella. Tästä syystä me laajentaneet makro ylimääräinen vaihe, jossa kaikki kasvainkeskusten neliön sisällä tämän alueen sisältäviä jätettiin analyysin puolueeton automatisoidusti (kuvio 7C ja D). Vaikka tämä voi johtaa aliarviointiin kumulatiivisen etäisyyden parametri, huomasimme, että tämä rajaus vaihe entisestään kasvattanut ikkunan väliin ei-aggressiivinen versus erittäin aggressiivinen solutyyppejä (Kuva 7E). Lisäksi analyysi useita itsenäisiä kokeita käyttäen PC3, BT474, ja MCF7, osoittivat, että tämä menetelmä on hyvin toistettavissa (kuvio 7F).

Laajensimme analyysin laajemmalle paneeli ihmisen syövän solulinjoista eri alkuperää kuten eturauhas-, rinta-, keuhko-, kolorektaalisen, ihon ja sidekudoksen. Mielenkiintoista, kun nämä rivit ryhmiteltiin niiden morfologian 2D kulttuuriin ja ilmentyminen epiteelin tai mesenkymaalisten markkereita, oli selvä korrelaatio korkean levittämisen kanssa hajallaan fenotyypin (yksi huomattava poikkeus oli HT1299, joka ei levittää tehokkaasti); kaikki solulinjat kasvaa epiteelin saarilla oli hyvin alhainen levittämistä kapasiteetti (kuvio 8A, taulukko S1). Me toiminnallisesti testattu rooli eräs tyypillinen merkki epiteelin fenotyypin, solun soluadheesiota reseptori E-kadheriinin. Tätä varten käytimme 4T1 hiiren rintasyöpäsoluihin, joilla on keskitason fenotyyppi, kasvaa klustereita löyhästi kiinnittyneitä soluja 2D ja ilmaista E-kadheriinin sekä joitakin mesenkymaaliset markkereita, kuten vimentiinista (kuvio 8B). E-kadheriinin hiljennettiin tuloksena täysin hajallaan fenotyypin 2D (kuvio 8B ja C) ja nämä solut ruiskutetaan ZF määrittää levittämisen kapasiteettia. Todellakin, shRNA kohdistaminen E-kadheriinin mutta ei kontrolloida shRNA voimakkaasti lisääntynyt levittämistä 4T1 soluihin ja automatisoitu bio-kuvantamisen menetelmän ansiosta merkittävästi toisistaan ​​4T1shCdh1 toisaalta ja 4T1Wt ja 4T1shCtr toisaalta (kuvio 8D-F).

(A) MCD paneelissa ihmisen syövän solulinjoista eri alkuperää. Määrä pistetään alkioiden on ilmoitettu.

Valkoiset palkit

osoittavat solulinjoilla osoittavat hajallaan fenotyypin 2D soluviljelmässä.

musta palkki

osoittavat solulinjojen kasvaa epiteelin saaria 2D kulttuuriin.

Harmaat palkit

osoittavat solulinjoissa väli- /mixed epiteelin /mesenkymaaliset ominaisuudet. (B) 4T1 rintasyövän soluja kasvaa saarten löysästi kiinnitetty kara-muotoinen solut (

jäljellä

) ja täysin hajallaan kasvua 4T1 solujen seuraavien E-kadheriinin hiljentäminen (

oikea

). (C) E-kadheriinin pinnalla ilmentymistä FACS. (D) sirontakuvaajaan esitys osoitti 4T1 variantteja. Määrä pistetään alkioiden 2 itsenäistä kokeesta. (E) Kuvat ovat alkioiden ruiskutetaan merkitty 4T1 variantteja. (F) MCD määritetään tiedot edustettuina D. Tulokset esitetään suhteessa villin tyypin 4T1 keskiarvona ± s.e.m. ** P 0,01. Mittakaava on 200 mikrometriä E.

Kaikkiaan lyhytaikainen keskipitkällä suoritusteho täysin automatisoitu koko-organismin bio-kuvantaminen on kehitetty, joka erottaa hyvällä toistettavuudella syöpäsolutyyppien että kasvaa saarilla tai on epiteelin markkereita tai on osoitettu olevan heikosti aggressiivinen hiirimalleissa solulinjoista, jotka ovat hajallaan tai enemmän mesenkymaaliset characterisitics tai tiedetään etäispesäkkeitä hiirillä. Se on yhteensopiva RNAi tunnistamiseen säätelijöitä syöpäsolun levittämistä ja mahdollistaa siirtyminen matalan resoluution nopea kuvantamisen korkean resoluution yksityiskohtainen analyysi vaikutuksia tutkittiin kasvaimen solujen ominaisuudet tai kasvainsolujen-isäntä vuorovaikutusten.

Keskustelu

Täällä olemme kehittäneet lyhyen aikavälin

in vivo

ZF ksenografti määritys, joka on yhteensopiva automatisoitu kuvantamisen 96-kuoppalevyille ja kytketty täysin automatisoitu analyysi kasvainsolun levittämisen. Tämä määritys on ensimmäinen automatisoitu koko elimistöön kuvantamiseen määritys selkärankaisessa, joka mahdollistaa opiskelun näkökohtia syövän etenemisen. Tuloksemme osoittavat, että tämä määritys vastaa tarkasti saatuja tuloksia kalliimpia ja paljon pienempi tekirjastoja kuten jyrsijä ksenografteissa.

ZF ksenograftimallia on aiemmin sovellettu syöpään muuttoliike tutkimuksiin [5] – [9]. On rajoituksia tässä mallissa, mukaan lukien mahdolliset erot vastaanottavassa mikroympäristön ja tarpeesta työskennellä lämpötiloissa, jotka ovat yhteensopivia selviytymisen ja migraatio nisäkässolujen samalla hetkellä suotuisa normaalille ZF fysiologia. Siitä huolimatta olemme muuttaneet koeolosuhteissa siten, että käyttäytyminen suuri paneeli ihmisen syöpäsolujen linjat eri alkuperää muistuttaa läheisesti tunnettuihin käyttäytyminen jyrsijöiden. Lisäksi työmme tarjoaa tämän mallin kanssa automaation kuvantamisen ja kuva-analyysi sekä tilastollista voimaa tarvitaan sovelluksen seulontaprosesseissa.

Tarjoamme proof-of-periaate tällaisen sovellettavuutta testaamalla tunnetulla säädin syöpäsolun muuttoliikettä. Paneelia käyttämällä solulinjoja osoitamme, että tämä kuvantamisen alustalla voi syrjiä solutyyppien enemmän epiteelin ominaisuuksia tai kasvaa saarilla verrattuna, joissa on enemmän mesenkymaalisten ominaisuuksia tai näyttämällä hajallaan fenotyyppi). Sitten yhdistää määritystä RNAi hiljentää solun adheesiomolekyyli, E-kadheriinin. Olemme nopeasti saada tietoja ~90 eläintä per koeryhmän kahteen biologiseen rinnakkaista tukeva estävää roolia E-kadheriinin syövän levittämiseen.

Yhdessä tämä suhteellisen nopeasti keskipitkän suoritusteho määritystä voidaan käyttää ensimmäisenä

in vivo

analyysiympäristön kohde löytö putki. Se tarjoaa automaatio- ja tilastollinen voima tunnistaa ne osumia laajamittaista in vitro RNAi seulonta pyrkimyksiä, jotka edellyttävät enemmän aikaa ja rahaa vaativia tutkimuksia hiirimalleissa. Tulevaisuuden suuntiin sisällyttämällä samalla automatisoitu analyysi induktion kasvaimen angiogeneesiä ja kasvainsoluproliferaation kaapata useita ominaisuuksia syövän etenemisen tämän bio-kuvantamisen määrityksessä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja ZF käsittely

Kaikki ihmisen syövän solulinjat saatiin ATCC ja viljeltiin mukaan tarjotaan protokollaa. ZF ja alkiot nostettiin, järjesti ja ylläpidetään standardimenetelmien mukaisesti noudattaen paikallisten eläinten hyvinvointia koskevien säännösten. Siirtogeeniset ZF linja Tg (fli1: EGFP) ilmentävät EGFP endoteelisoluissa villityypin tai ”Casper” tausta, pidettiin standardimenetelmien mukaisesti (https://ZFIN.org). PC3-mCherry soluja tuotetaan käyttäen pCMV-mCherry-bc-puro-Kl201 lentivirusvektorilla (toimitti Dr. R. C. Hoeben, Leiden University Medical Center, Leiden NL). 4T1-shCdh1 ja 4T1-shCtr solut syntyvät lentiviruksen transduktio käyttäen TRC shRNA rakentaa (Sigma).

implantaatio menettelyä

Nisäkkään solut leimattiin lipofiilisten fluoresoivien solujen Tracker (CM-Dil; heräte enintään 553 nm, paljon ei. C7000; Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Leimattu solususpensio laitettiin borosilikaattilasista kapillaari neulojen (1 mm: n ulkoläpimitta x 0,78 mm I.D .; Harvard Apparatus) ja intrayolk injektiot suoritettiin käyttäen Pneumaattinen Pico pumppu ja manipulaattori (WPI). Dechorionated 2 päivää jälkeistä lannoitusta ZF alkiot nukutettiin 0,003% tricaine (Sigma) ja joka on sijoitettu 10 cm: petrimalja päällystetty 1% agaroosilla. Ohjaamalla ruiskutuspaine ja kesto lukumäärä pistetään solujen asetettiin -100 alkiota kohden määritettynä standardin solun laskenta injektion pisaroita. Pistetään alkioita pidettiin muna veteen 34 ° C: ssa ja kiinteä 6 dpi 4% paraformaldehydillä.

Automatisoidut mikroskopia ja korkean resoluution kuvantamisen

Kiinteät alkiot käsin järjestettiin 96 hyvin lasi pohjalevyt (materiaali no.655892; Greiner) jokaisen hyvin sisältää yhden alkion. Tämä helppo tehdä alle 5 min per levy. Kuvan hankinta suoritettiin käyttäen Nikon Eclipse Ti CLSM, joka integroi kehittyneet optiikka fluoresenssidetektiojärjestel- ja skannaus laitteisto yhteen alustaan ​​ohjataan EZ C1 ohjelmisto. 488 ja 561 nm laser-valot käytettiin virittämään Tg (fli1: EGFP) alkiot ja DiI- positiivisia kasvainsoluja. Serial sagittaaliset (sivuttainen) kohdat vangittiin 6 dpi automatisoidusti tavalla (14 x 30 um) käyttäen suunnitelma Apo 4X Nikon kuiva tavoite 0,2 NA ja 20 WD. Kolmiulotteista kuvaa 0,5 pm vaihe Z pinot (1024 1024 polttotasojen, 50-74 um suunnassa) hankittiin käyttäen 40 × Nikon kuiva suunnitelma fluor tavoite 0,75 NA ja 0,66 WD.

Kuva-analyysi-ohjelmisto

Automatisoitu kuva esikäsittelyä, automaattinen analyysi ja 3D jälleenrakennus ja pinta-mallinnus suoritettiin Image-Pro Plus-pohjainen ohjelmisto Media Cybernetics.

laajennetun terävyysalue

käytetty ohjelmisto Z-pino väri kuvia konfokaalimikroskoopilla. Saatu harmaakuvia olivat pseudo värjätty vihreä GFP ja punainen CM-Dil leimattuja kasvainsoluja. Makro rakennettiin joka käyttää sekä kanavia eräajoa kaikki kansion kuvat. Ensin Z-pinon yhden, in-focus, yhdistelmäkuva tehtiin. Pikselit Z-pinon analysoitiin. Jokaisessa paikassa, pikseli tasosta, jolla on suurin varianssi tai paikallista kontrastia valittiin. Tämä pikseli käytettiin sitten lopullisen komposiitin kuvan.

Automatisoitu suunta alkioiden (kuva 2) B

kuva-analyysiin, kaikki alkiot on oltava sama suunta. Tätä makro kehitettiin joista kuvat muutettu siten, että kaikki alkiot vaakasuorassa, pää kohti ja ruskuaispussi pohjaa kohti kuvan.

Automatisoidut vaakatasaus: väri kuva muutettiin harmaa-arvo kuvaa antaa yhdistelmä GFP ja punainen kanavia. Alkio jälkeen segmentoidaan käyttämällä keskiarvoa voimakkuuden histogrammiarvo ja pienin ja suurin alue suodatin. Sitten suuntaan arvo segmentoidun kohteen määritettiin, jota käytetään antamaan alkion vaaka-asentoon.

Automatisoidut vaakasuoraan: X asema-arvo on massakeskipisteen määritettiin harmaa yhdistetty GFP ja punainen kanavia. Jos tämä arvo sijaitsi vasemmalle päässä painopisteen, kuva oli peilikuvana. Kaikissa tapauksissa tämä edellyttäen kuvia, joissa pää alkion oli suunnattu oikealle.

Automatisoidut pystyasennossa: ulko vaaka kantoja, piste makaa X-akselin 75% etäisyydelle äärivasemmisto alkion ääriviivat määritettiin. Tässä X-asennossa Y-akselia tehtiin ylhäältä alas ääriviivat. Suorakulmion tehtiin -20-20 pikseliä vaakasuunnassa laskettu 75% pisteen ja pystysuunnassa 80 pikseliä yläpuolella keskellä ylemmän Y-akselilla. Toinen suorakulmion piirrettiin identtiset vaaka parametrit ja pystysuunnassa 80 pikseliä alla keskellä alemman Y-akselilla. Keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti punaisen kanavan määritettiin molempien suorakulmioita. Jos intensiteetti oli suurempi ylemmässä suorakulmion verrattuna alempi suorakaide, kuva oli käännettynä pystysuunnassa. Sama menettely voidaan suorittaa käyttämällä GFP kanavaa jolloin kuvat on käännetty jos intensiteetti oli suurempi pohja suorakulmio. Silmämääräinen tarkastus osoitti, että tämä menettely, kaikissa tapauksissa tuloksena kuvissa, joissa ruskuaispussiin on suunnattu kuvan alaosassa.

automaattinen laskenta injektion paikan Cy3 leimattujen solujen

First vasemmanpuoleisin ja oikeanpuoleisin X kannat alkion ääriviivat määritettiin. Näistä X kantoja, pisteen makaa 75% äärimmäisestä vasemmalta määritettiin. Sitten, tämän X-asema ylimmän ja alimman Y kantoja määritettiin. Myöhemmin näistä Y kantoja pisteen makaa 75% ylimmästä Y-asema määritettiin, joka nimettiin mielivaltainen ruiskutuspisteestä.