Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) esittelee kuten etenevä sairaus ulottuu precancerous, preinvasive, paikallisesti invasiivisia, ja etäpesäkeleesioita. Tunnistamaan biologisia polkuja heijastavat näiden asteittain, ja poikkeavasti ilmentyvien geenien liittyvät näihin polkuja, olisi mahdollisesti parantaa hoitomenetelmiä tuhoisan taudin.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kautta rakentamista ja analysointia SAGE kirjastot, olemme päättäneet transcriptome profiilit preinvasive carcinoma in situ (CIS) ja invasiivisia okasolusyöpä (SCC) on keuhko, ja verrannut niitä ekspressioprofiileja syntyy molemmista keuhkoepiteeliverrokkiin, ja precancerous metaplastiset ja dysplastic vaurioillesi

Ingenuity Pathway Analysis

. Liittyvien geenien ilmentymistä epidermaalisen kehitykseen, ja menetys liittyvien geenien ilmentymistä kanssa mucociliary biologia, ovat hallitsevia piirteitä CIS, pitkälti jaettu syövän esiaste. Lisäksi geenien ilmentymistä liittyy xenobiotic aineenvaihdunta /vieroitus on merkittävä piirre CIS, ja on suurelta osin ylläpidetään kohdunkaulan syöpä. Liittyvien geenien kudosfibroosi ja akuutin vaiheen immuunivasteen ovat ominaisia ​​invasiivisen SCC fenotyyppi. Lisäksi Tässä esitetyt tiedot viittaavat siihen, että kudoksen uudelleen /fibroosia aloitetaan alkuvaiheessa CIS. Lisäksi tämä tutkimus osoittaa, että muutos kopioluvun tila edustaa järkeenkäypää mekanismia ero geeniekspression CIS ja invasiivisia SCC.

Johtopäätökset /merkitys

Tämä tutkimus on ensimmäinen raportti laaja- skaalata ilmentymisen profilointi CIS keuhkoissa. Puolueettomat ilmentymisen profilointi näiden preinvasive ja invasiivisen vaurioita tarjoaa alustan jatkotutkinnan molekyylitasolla geneettisiä tapahtumia merkitystä alkuvaiheessa squamous NSCLC kehitystä. Lisäksi enintään geenien havaittiin äärimmäisissä eroja CIS ja kohdunkaulan syöpä voi olla mahdollisuuksia toimia biomarkkereita varhaiseen havaitsemiseen.

Citation: Lonergan KM, Chari R, Coe BP, Wilson IM, Tsao MS, Ng RT, et al. (2010) transcriptome profiilit Carcinoma in situ ja invasiivinen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kuin paljasti SAGE. PLoS ONE 5 (2): e9162. doi: 10,1371 /journal.pone.0009162

Toimittaja: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 lokakuu 2009; Hyväksytty: 07 tammikuu 2010; Julkaistu: 11 helmikuu 2010

Copyright: © 2010 Lonergan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rahoituksella Genome Kanada /Genome Brittiläinen Kolumbia, Kanada Cancer Society Research Institute (CCS # 20485) ja Kanadan Institutes of Health Canada (MOP200113 ja MOP 86731). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä arvioidaan aiheuttaa korkeimman syöpään kuolleisuus Yhdysvalloissa vuonna 2009 [1]. Molecular kohdistettuja hoitomuotoja suuntautuu signaalintransduktioreitteihin aktiivinen solujen lisääntymistä, erilaistumista, apoptoosin, ja angiogeneesi, on käytetty hoidossa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), mutta monipuolinen ja usein heikot tulokset [2], [ ,,,0],3], [4], [5], [6]. Yhtäaikainen kohdentaa useita signalointireittien on esitetty parannuksia kliininen vaste [6], edelleen tietoa biologisten reittien mukana keuhkosyöpä kehitys yhdessä tunnistaminen poikkeavasti ilmentyvien geenien näiden reittien, olisi odotettavissa helpottamiseksi kehittää uusia terapeuttisen intervention [7], [8].

carcinoma in situ (CIS) keuhkojen, ovat preinvasive vaurioiden squamous NSCLC, usein liittynyt histologisia, sytologisten, ja geneettiset poikkeamia, ja etenemistä kohdunkaulan syöpä tyypillisesti ensues [9], [10], [11], [12]. Koska nämä minuutin vauriot ovat optimaalisesti näkyvät Keski hengitysteihin loisteputki bronkoskopia tai LIFE (keuhko-imaging loisteputki tähystys) [13], [14], kokeelliset ja kliiniset tutkimukset ovat harvinaisia ​​(kuvio 1). Vaikka monet ilmaisun profilointi tutkimuksissa on raportoitu pitkälle keuhkokasvaimia [15], [16], alkuvaiheen (CIS ja paikallisesti invasiivisia) vauriot jäävät paljolti hyödyntämättä. Molecular geneettistä analyysiä preinvasive vaurioita, vapaa taustamelua liittyy yleisesti tutkittu kehittynyt kasvaimia, on olennaista tunnistaa keskeisten geenien ja vastaavien molekyylien polkuja taustalla aikaisin tapahtumia neoplastisen transformaation ja syövän kehittymisessä. Ymmärtäminen näistä varhaisista poikkeavuuksien on välttämätöntä nopea hoitotoimenpide tämän tuhoisan sairauden.

Bronkoskopia käyttäen A. valkoisen valon havaitsemista CIS vaurioita (merkitty nuolella), tai B. LIFE (keuhko-kuvitella loisteputki tähystys ) havaitsemista varten CIS vaurioita (merkitty nuolella). C. Histologinen jakso tunnistetaan CIS Vaurion keuhkoputkien epiteelin, jolle on tyypillistä laaja squamous kerrostuneisuus.

Laajamittainen geeniekspressiotutkimuksissa usein käyttää mikrosirun teknologia. Viimeaikaiset tutkimukset korostavat arvon räätälöityjä paneelit, tavoite valinta perustuu aiempaa tietoa geenien ilmentymisen, jotta paremmin vastaamaan transcriptome kudoksen kohteisiin; nimenomaan tutkimiseen käytetään NSCLC [17]. SAGE (serial analyysi geenin ilmentymisen) tarjoaa sekvenssin-pohjainen, ei-puolueellinen lähestymistapa kattava transcriptome analyysin, joilla ei ole aiempaa tietoa ilmaisun tarvitaan [18]. Lisäksi saatuja tietoja SAGE analyysi mahdollisesti vaikuttaa suunnitteluun sopivampi mikrosiruja kohdennettua tutkimus- ja diagnostisia tarkoituksia varten.

Aikaisemmassa tutkimuksessa, me kuvattu transcriptomes savu-vahingoittuneita keuhkoputken epiteelin ja keuhkoparenkyymistä tapa SAGE [19]. Täällä laajentaa analyysin tutkimaton preinvasive vaihe keuhkosyöpään kehitykseen, ja esittämään ensimmäisen kertomuksen laajamittainen ilmentymisen profilointi carcinoma in situ keuhkojen. Lisäksi kuvaamme transcriptomes invasiivisia okasolusyöpä (SCC), ja precancerous metaplastiset ja dysplasia (PC) leesiot, jotka ovat peräisin rakentamisesta ja analysoidaan eri SAGE kirjastoja, joka huipentui yli 22 megabases sekvenssitietojen. Kautta hyödyntäminen

Ingenuity Pathway Analysis

olemme tunnistaneet geenejä, jotka liittyvät epidermaalisen kehityksen ja xenobiotic aineenvaihdunnan /vieroitus komponentteina CIS vaurioita, ja geenejä, jotka liittyvät immuunivasteeseen ja kudoksen uudelleen /fibroosi komponentteina invasiivisia SCC. Lisäksi löysimme liittyviä geenejä mucociliary erilaistumista voidaan säädellä vähentävästi sekä IVY ja PC vaurioita. Me keskustella Ilmiön merkitystä näiden transkription poikkeamia alkuvaiheisiin keuhkosyövän kehitystä, ja esittää näkymä CIS transcriptome aiemmin tuntemattomia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksyi University of British Columbia-British Columbia Cancer Agency Research Ethics Board (UBC-BCCA REB). Kirjallinen suostumus saatiin kaikissa aineissa.

näytteet

keuhkoputken epiteelin (BE) harjaus yksilöt aiemmin kuvattu [19]. Biopsianäytteet mukana precancerous (PC) leesioita (metaplasiasta dysplasia), karsinooma in situ (CIS) leesioita, ja invasiivinen okasolusyöpä (SCC) kasvain kudosta. PC ja CIS näytteet saatiin autofluoresoivan bronkoskopia (kuvio 1). Kaikki koepaloja (paitsi ne, joita käytetään rakentamisessa kirjastoissa CIS-3, SCC-5, ja SCC-6) kerättiin RNA

myöhemmin

® [Applied Biosystems (Ambion Inc., Kanada)] ja säilytettiin – 85 ° C: ssa. Biopsia käytetään rakentamisessa kirjastossa CIS-3 oli upotettu OCT media, ja varastoitiin -85 ° C: ssa. Rakentamiseen kirjastojen SCC-5 ja SCC-6, RNA eristettiin kasvainkudoksen kahdeksan yksityisille guanidiiniisotiosyanaatti- ja uutetaan fenoli /kloroformilla. Kaikki aiheet vaikuttavat tässä tutkimuksessa olivat joko entisiä tai tupakoivat (taulukko 1).

SAGE kirjaston rakentaminen ja sekvenssinkäsittelylaitteen

Lukuun ottamatta kirjastojen rakentamisessa SCC-5 ja SCC -6, kukin näyte (biopsia tai keuhkoputkien harjaamalla, kuten aikaisemmin on kuvattu [19]), oli noudetaan RNA

myöhemmin

® (tai MMA: kirjaston CIS-3), ja homogenoitiin lyysiä /sitova. Kirjastojen SCC-5 ja SCC-6, RNA koottiin neljästä yksilöiden yhtä suuri määrä, ja ~19 ug kokonais-RNA upotettiin lyysi /sitovaa liuosta ja käytetään rakentamiseen kunkin kirjaston. Tuloksena lysaatit käytettiin suoraan SAGE kirjaston rakentamiseen mukaan MicroSAGE protokollan avulla

Nla

III ankkurointi entsyymi ja

Bsm

FI kuin koodaus entsyymin (www.ncbi.gov/SAGE ). Tämä lähestymistapa on esitetty, jolloin saatiin hyvin toistettavissa SAGE kirjastot [19]. Keskimäärin 10

5 SAGE tunnisteita ilman linkkeriä ja kahtena ditagia, sekvensoitiin per kirjasto; kaikki raaka SAGE tiedot on talletettu GEO (taulukko 1). Normalisointia, tag laskee kevennettäisiin 10

6 tageja kunkin kirjaston eli tageja miljoonasosaa (TPM).

Ryhmittelyanalyysi

arvioimiseksi samankaltaisuuden aste keskuudessa keuhkojen SAGE kirjastot syntyy tässä tutkimuksessa (kaksi PC-kirjastot, viisi CIS kirjastot, ja kuusi invasiivisia SCC kirjastot), ja niitä syntyy aikaisemmassa tutkimuksessa (14 BE kirjastot, ja kaksi keuhkoparenkyymistä kirjastot), cluster-analyysiä käytettiin. Tätä analyysiä varten 300 runsain tageja oli peräisin kustakin kirjastosta tuottaen sulautunut luettelo 1128 ainutlaatuisia tunnisteita. Sitten aineisto log

10 muunnetaan ja aihekokonaisuuksien käyttämällä

Genesis

käyttäen keskimäärin-sidoksen algoritmi ja euklidinen etäisyys metrinen [20]. Sillä tunnisteet määrä on nolla, tiedot on ei muunneta, ja säilytettiin kuin nolla.

Differential ilmentymisanalyysiä

Ellei toisin mainita, ero geenien ilmentyminen oli määritelty minimaalinen kolminkertaisesti ero (pyöristettynä yhteen desimaaliin) in keskimääräiseksi tag määrä (TPM) minkä tahansa kahden aineistoja vertailtavien. Lisäksi minimaalinen keskimääräiseksi tag laskien 40 TPM tarvittiin yli-ilmentävien aineisto. Tag-to-geenin kartoitus oli mukaan SAGE Genie tietokanta, 17 syyskuu 2009 versio [21] (cgap.nci.nih.gov/SAGE). Koska uusin julkaisu SAGE Genie ei automaattisesti tasata mitokondrioiden selostukset, käytimme manuaalisesti kartoituksen lähestymistapaa tunnistaa nämä selostukset.

Tietojen analysointi

Aineistot erilaisesti ilmaisi geenien analysoitiin pääasiassa kautta käyttö

Ingenuity Pathway Analysis

(IPA), versio 8.0 (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

toiminnallinen analyysi koko aineistojen

tunnistettu biologisten toimintojen ja /tai sairauksia, jotka olivat merkittävimmät että aineisto. Geenit aineisto jotka liittyivät biologisiin toimintoihin ja /tai sairauksia Ingenuity Pathways Knowledge Base pidettiin analyysiin (IPA voivat kartoitettu tunnukset).

Canonical koulutusjakson analyysi koko aineistojen

tunnistaneet tapoja valmistaa IPA kirjastosta kanoninen polkuja, jotka olivat merkittävimmät että aineisto, joka perustuu geenien sisällä aineisto, jotka liittyvät kanonisen väylän Ingenuity Pathways Knowledge Base.

myrkyllisyys lista analyysi koko aineistojen

tunnistanut Tox luettelot IPA kirjastosta Tox Listat, jotka olivat merkittävimmät että aineisto. Geenit aineisto, jotka liittyvät List katsottiin analyysiä varten. Jokaiselle näistä analyysien merkitys yhdistyksen välisen geenien aineisto ja määritetty biologinen toiminta ja /tai sairauden /kanoninen polku /myrkyllisyys lista, mitattiin Fischerin eksakti testi laskea p-arvo määrittää todennäköisyys, että yhdistyksen selitettiin sattumalta yksin.

Oma Pathways

on graafinen esitys biologisen suhteita geenituotteita, joita tukevat ainakin yhden viite kirjallisuudesta, oppikirjasta, tai kanoninen tallennetut tiedot Ingenuity Pathways Knowledge Base. Geenit näytetään käyttäen erilaisia ​​muotoja, jotka edustavat toiminnallinen luokka geenituotteen kuten legenda sisällä tarkkoja lukuja.

RNA: n eristämistä kliinisistä näytteistä

kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi RNA matched kasvain ja normaali keuhkoparenkyymistä kerättiin resekoitiin kudoksista. Lyhyesti, moniosaista kunkin kasvaimen leikattiin, jossa ensimmäisen ja viimeisen sarjan värjättiin H Applied Biosystems), mukaan valmistajan ohjeiden. Beeta-aktiini käytettiin endogeeninen kontrolli (aluke tuotekoodi 4352935E). Primer tuotekoodit testi geenejä olivat seuraavat: ECE2 (Hs00981189_g1), MAGEA9 (Hs00245619_s1), MAGEA11 (Hs00377815_m1), CLDN1 (Hs00221623_m1), CKS1B (Hs01029137_g1), POSTN: stä (Hs00170815_m1), ARTN (Hs00754699_s1), SFRP2 (Hs00293258_m1), UBE2S (Hs00819350_m1), C19orf48 (Hs00364147_m1), FBXO27 (Hs00381091_m1), MCM2 (Hs00170472_m1), NTS (Hs00175048_m1), SLC6A8 (Hs00373917_g1), ja SLC2A1 (Hs00197884_m1, Hs00892681_m1). Reaktiot ajettiin iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd., Mississauga, ON, Kanada). Erilainen ekspressio määritettiin käyttäen delta-delta-CT-menetelmällä. Kasvaimeen /normaali parenkyymin paria, kertamuutoksia laskettiin kunkin parin. Verrattaessa kasvaimia on brushings, kertamuutoksia laskettiin vertaamalla kunkin kasvaimen keskiarvoa ilmaus kuudesta BE näytettä. Keskimääräinen kasvaimen yli normaalin parenchyma kertainen muutos ja keskimääräinen kasvaimen yli BE kertainen muutos raportoidaan kullekin geeniä.

Gene annostus määritys

carcinoma in situ yksilöihin, joita käytetään kopioluvun profiloinnin olivat kerätty 10% puskuroituun formaliiniin. Mikrodissektion suoritettiin parafiinileikkeillä saada syöpäsoluja. Tyypillisesti yli 20 leikesarjojen olivat tarpeen, jotta saadaan riittävä materiaalia. DNA eristettiin talteen soluista proteinaasi K uutetaan fenoli /kloroformilla, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Koko genomin laatoitus polku array CGH analyysi suoritettiin käyttäen SMRT array version 2, kuten aikaisemmin on kuvattu [23], [24]. Tämä alusta sopii profilointiin formaliinilla parafiiniin upotettu materiaali [22], [23], [25], [26], [27], [28], [29], [30]. Genome segmentointi ja kopioluvun tila suoritettiin käyttäen aCGH-sileää array kuvadatan ja visualisoidaan käyttämällä SIGMA ohjelmistojen [31], [32], [33], [34]. Loss array elementit olivat annetaan arvo -1, säilytti elementtejä arvo 0, ja sai elementtejä arvo 1. Kaksikymmentä CIS Näytteet profiloitu yhteensä, ja kynnys geenispesifiseen kopioluvun voitto /tappio asetettiin 20 %. 20%: iin otettiin käyttöön pyrittäessä vähentämään havaitsemista vääriä tai satunnaisia ​​tapahtumia takia tausta perimän epävakaisuuden luonnostaan ​​näytteet, ja siten valitsemalla tällaisia ​​tapahtumia, jotka tapahtuvat, joilla on jonkinasteinen säännöllisyys.

Public microarray vertailutuloksia

Microarray ekspressiotietojen 53 ensisijaisen squamous kasvainten noudetaan Keuhkosyöpä Dataset at NCBI, GEO hakunumero GSE3141 [35]. Microarray ilmaisun tiedot 67 keuhkoputken harjausta haetaan sekapopulaatioon nykyiset ja entiset tupakoitsijat, profiloitiin sisäisesti. Kaikki microarray data oli RMA normalisoitu [36].

Tulokset ja keskustelu

SAGE tarjoaa puolueetonta ja kattavaa lähestymistapaa ilmaisun profilointi, rajoittaa vain syvyys sekvensointi valitsema tutkija, ja tarjoukset ainutlaatuisen tilaisuuden transkriptio löytö. Tämä on jyrkässä ristiriidassa mikrosiruanalyysi, jossa ilmaisun profiilia ja laajuus analyysi on ennalta kohde- suunnittelu tyypillisesti työllistää rajoitettu määrä yleisimmin ominaista geenit [17]. Aikaisemmassa tutkimuksessa, me kuvattu transcriptomes savu-vahingoittuneita keuhkoputken epiteelin ja keuhkoparenkyymistä tapa SAGE [19]. Täällä laajentaa analyysin paljolti tutkimaton alue varhaisvaiheen keuhkosyöpää kehittämistä ja esittämään ensimmäisen kertomuksen laajamittaisten geeniekspressioprofilointi carcinoma in situ (CIS) keuhkojen. Ymmärtäminen molekyyligenetiikan säätelevät preinvasive vaiheissaan kriittinen helpottaa varhaisen havaitsemisen ja välittömän hoitotoimenpiteitä ennen etenemistä kohdunkaulan syöpä alkaa. Nykyisessä tutkimuksessa esittelemme vertailevia analyysejä, painottaen geenien yli-ilmentynyt CIS ja kohdunkaulan syöpä transcriptomes, suhteessa ei-syöpä transcriptomes keuhkojen lukien keuhkoputkien epiteelin (BE), ja syövän esiasteita (PC: squamous metaplasiaa ja dysplasia).

Kaksikymmentäseitsemän keuhko SAGE kirjastojen koostuu 3997729 koko sekvenssin leimoilla (-40 megabases korkealaatuisia DNA-sekvenssin) analysoitiin tässä tutkimuksessa. Normaali keuhko edustaa 14 keuhkoputken epiteelin kirjastot (BE-1: stä BE-14) [19], [37]. Precancer vaihe edustaa kaksi kirjastot johdettu levyepiteelikarsinooma metaplasiaa (Met) ja suomuinen dysplasia (Dys). Okasolusyöpä keuhkojen viisi edustaa carcinoma in situ kirjastoissa (CIS-1: stä CIS-5), ja kuusi invasiivinen karsinooma kirjastot (SCC-1 läpi SCC-6) (katso Taulukko 1 ja taulukko 2). (On huomattava, että yksilöt käsittävät BE, PC, CIS, ja SCC aineistot olivat sekapopulaatioon nykyiset ja entiset tupakoitsijat.) Nämä tiedot on tunnistettu yli 129000 ainutlaatuinen sekvenssimerkkejä /potentiaali selostukset IVY vaurioita, ja lähes 140000 ainutlaatuinen sekvenssimerkkejä /potentiaali transkriptien invasiivisia squamous NSCLC.

analyysi alkuun 300 runsain tageja BE, CIS ja SCC SAGE aineistot

Ryhmittelyanalyysi.

Cluster analyysi tuotti odotetun ryhmittely SAGE kirjastojen, todistetaan näyte laatua. Tätä analyysiä varten 300 runsain tageja oli peräisin kustakin kirjastosta tuottaen sulautunut luettelo 1128 ainutlaatuisia tunnisteita. Keskimäärin sidos ryhmittely analyysi perustuu 1128 runsain SAGE tunnisteita, paljastaa, että kaikki syövän kirjastot (molemmat CIS ja invasiivisia SCC) klusterin yhdessä, ja erillään BE kirjastoista (kuvio 2A). Toteamme jotkut ryhmittely invasiivisen SCC kirjastot (neljä kuudesta). Samanlaisia ​​klusterointi havaitaan käytettäessä 500 tai top 1000 ainutlaatuinen tunnisteet per kirjasto (tuloksia ei ole esitetty).

. Cluster analyysi keuhkojen SAGE kirjastoja. Kaikki SAGE kirjastot tästä tutkimuksesta, mukaan lukien viisi karsinooma in situ kirjastoissa (CIS-1: stä CIS-5), kuusi invasiivinen okasolusyöpä kirjastot (SCC-1 läpi SCC-6), yksi suomuinen metaplasiaa kirjasto (Met), ja yksi levyepiteelikarsinooma dysplasia kirjasto (Dys), sekä 14 keuhkoputken epiteelin kirjastot (BE-1: stä BE-14), ja kaksi normaalia keuhkoparenkyymistä SAGE kirjastot (LP-1, LP-2; liittymistä GSE3708) luotu aiemmassa tutkimuksessa [19 ], [37], analysoitiin klusterianalyysillä käyttämällä keskimäärin-sidoksen algoritmia. Top 300 runsain tageja oli peräisin kustakin kirjastosta, ja analyysi perustui 1128 ainutlaatuisia tunnisteita yhteensä. Dendro-, haara pituus edustaa etäisyyttä. B-D. IPA toiminnallinen analyysi runsain geenien BE, CIS, ja kohdunkaulan syöpä aineistoja. Tag-to-geenin vastaavuudet top 300 runsain tunnisteet BE, CIS, ja SCC aineistoja, käytettiin IPA ydin analyysiä, joka koostuu 220, 231, ja 233 IPA oikeutettu kartoitettu tunnuksia, tässä järjestyksessä. Kolme sarjaa tietoja näytetään yhteen käyttäen IPA ydin vertailuja, ja viisi merkittävimmät toimintojen

Fysiologiset järjestelmän kehittäminen ja toiminta

on esitetty kunkin kolmen aineistot. Tiedot B lajitellaan mukaan eniten merkitystä BE, tiedot C lajitellaan mukaan eniten merkitystä CIS, ja datan D lajitellaan mukaan eniten merkitystä invasiivisia SCC. Oranssi viiva osoittaa raja-arvoa merkitys, esiasetetut p-arvo 0,05. Täydellinen luettelo tunnisteet /kartoitettu tunnuksia käytetään tähän tarkemmat tiedot taulukossa S1.

Ingenuity koulutusjakson analyysi.

luonnehtia ja vertailla keuhkoputken epiteelin ja syövän transcriptomes, me computated keskimääräiseksi tag laskee BE (14 kirjastot), CIS (5 kirjastot), ja invasiivisia SCC (6 kirjastot) aineistoja, ja myöhemmin valittujen runsaimmin 300 ainutlaatuinen tunnisteet kustakin aineisto analysointia varten (taulukko S1). Tunnisteet kartoitus mitokondrioiden-koodattuja geenien ja ribosomaalisen proteiinin geenit, havaittiin yhtä usein top 300 runsain tunnisteet, kaikilla kolmella aineistoja BE, CIS, ja SCC klo ~8% ja ~18%, tässä järjestyksessä. Käytimme ydin analyysi komponentti

Ingenuity Pathway Analysis

(IPA) luokitella näiden geenien mukaan biologisia toimintoja. Vain ne molekyylit, joissa on vähintään yksi funktionaalinen huomautus IPA Knowledge Base oikeutettuja analysointia, ja mukana 220 (BE), 231 (CIS) ja 233 (SCC) IPA voivat geenejä. Nämä analyysit osoittavat, että geenit luokan sisällä

Hiukset ja iho Development and Function

ovat erittäin ilmaistaan ​​CIS transcriptome suhteessa sekä BE ja SCC, sekä geenien luokkien

Hematologinen järjestelmän kehittäminen ja toiminta

ja

immuunisolujen liikenteenohjaus

ovat erittäin ilmaistaan ​​SCC transcriptome suhteessa sekä BE ja CIS. Siksi korkea liittyvien geenien ilmentymistä epidermaalisen kehitys on tunnistettu täällä tunnuspiirteeksi IVY transcriptome, ja korkea geenien ilmentymistä liittyy solujen liikkeen tunnuspiirteeksi SCC transcriptome. Kuva 2B-D yhteenveto näiden analyysien.

Huomionarvoista sekä IVY ja SCC aineistoja on runsaasti tunnisteita kartoitus vakioalueen Immunoglobuliinin raskaiden ketjujen. Itse asiassa SAGE tag IGHG1 on runsain tunniste sekä IVY ja kohdunkaulan syöpä aineistot (taulukko S1). Vaikka on mahdollista, että ilmentyminen näiden immunoglobuliiniketjuja peräisin soluttautumasta imukudokset ja ympäröivän strooman, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet ilmentymistä raskaan ketjun vakio ja vaihtelevia alueita immunoglobuliinien rintasyövän epiteelisoluissa [38], [39], [40], ja ilmaus IgG: n raskaan ja kevyen ketjun eri epiteelisyöpäsolujen mukaan lukien keuhkojen SCC [41]. Nämä immunoglobuliiniketjuja voivat edustaa syöpäsolun autovasta, ja kasvun edistämiseksi autokriini /parakriininen muoti [40]. Kiehtovan, runsaasti tunnisteita kartoituksen immunoglobuliinin raskaan ketjun transkriptien CIS preinvasive vaurioita keuhkojen, toisin kuin suhteellisen alhainen tunnistus sekä BE ja precancerous metaplastiset ja dysplastic vaurioita (täsmennettäisiin myöhemmin taulukot), viittaa siihen, että säätely ylöspäin näistä selostukset voi olla merkitystä aloittamista NSCLC.

Geenien ilmentyminen muuttuu yhteisiä carcinoma in situ ja syövän esiasteita

Siirtyminen terveen keuhkoputken epiteelin kohdunkaulan syöpä on ajateltu edetä kautta etenemistä histologisia ja geneettiset poikkeavuudet: BE PC CIS SCC, jossa PC edustaa syövän esiasteita (squamous metaplasiaa ja dysplasia). Levyepiteelikarsinooma metaplasiaa on ohimenevä komponentti normaalia haavan paranemista keuhkoputkien epiteelin, ja tyypillisesti päättää uudelleen eriytetty epiteelin koostuu pseudostratified Värekarvallinen ja erittävien solujen palauttaminen keuhkoputkien toiminto [42]. (Käsitteen PC tässä ei merkitse pakollista etenemisessä syöväksi, vaan viittaa vaurioita /häiriöitä, jotka huolimatta harvoin etenemisessä syöväksi, katsotaan esiasteita syöpään.) Sitä vastoin CIS vaurioita saada alhainen regressio taajuus on korkea ilmaantuvuus eteneminen kohdunkaulan syöpä [43], [44] ja on ominaista laajempi kerrostuminen squamous solutyyppejä verrattuna PC [9], [11], [12]. Tunnistamalla geenien ilmentyminen muuttuu yhteinen sekä PC ja CIS suhteessa BE, me keskittyä niihin geneettisiä tapahtumia, joita esiintyy varhain ja jatkuvat läpi CIS. Mukaisesti valintakriteereistämme (minimaalinen kolminkertaiseksi ero keskimääräiseksi tag runsaus; minimaalinen keskimääräiseksi tag runsaus 40 TPM yli-ilmentävien aineisto), 868 SAGE tunnisteita todettiin samalla tavoin ilmentää eri tavalla PC ja CIS suhteessa BE, joka koostuu 190 sääteli tunnisteet, ja 678 alassäädetty tunnisteet (kuvio 3A).

kriteerit ero geenien ilmentyminen määriteltiin minimaalinen kolminkertainen ero normalisoitu keskiarvo tag laskee, ja jossa on minimaalinen keskimääräinen tag runsaus 40 TPM yli-ilmentävien aineistoja. Up-nuolet osoittavat sääteli geeniekspression muutoksia; alas-nuolet osoittavat alassäädetty geeniekspression muutoksia; numeeriset arvot viittaavat määrän differentiaalisesti ilmaisi tunnisteita. Alueet salakuuntelun heijastavat geeniekspression muutoksia yhteiseen kahden aineistoja. A. Expression muutokset carcinoma in situ ja syövän esiasteita suhteessa BE. B. Expression muutokset syövän aineistoja sekä suhteessa keuhkoepiteeliverrokkiin ja precancerous aineistoja. BE: keuhkoputken epiteelin; PC: precancer; CIS: karsinooma in situ; SCC: invasiivinen levyepiteelikarsinooma.

Up-säännelty ilmentyminen muuttuu.

Noin 35% tagit säädellään ylöspäin CIS suhteessa BE (190 ulos 529 tunnisteet) olivat havaittiin olevan yleisesti säädellään ylöspäin PC vaurioita, ja noin 25% tagit säädellään ylöspäin PC vaurioita suhteessa BE (190 ulos 754 tunnisteiden) havaittiin olevan vastaavasti säädellään ylöspäin CIS (kuvio 3A). Katso taulukko S2 kuvaus näistä tagit säädellään ylöspäin sekä PC ja CIS. IPA toiminnallinen analyysi (perustuen 143 voivat kartoittaa tunnukset) osoittaa, että noin 35% näistä usein jopa geenien liittyy orvaskeden kehitykseen ja siihen liittyviä häiriöitä, kuten taulukossa 3. Sen lisäksi nämä geenit on kuvattu taulukossa 3, tarkastelu kirjallisuudessa tunnistettu muita geenejä sisällä PC /CIS sääteli aineisto liittyvän epidermaalisen kehittämisen ja SBSN, CNFN, CRCT1, lisäjäseniä pienen proliini-rikkaan perheen proteiinien (SPRR2E ja SPRR3), ja lisäksi jäsenet S100A perheen kalsiumia sitovia proteiineja. Monet näistä geeneistä koodaavat joko sisällä orvaskeden erilaistumisen kompleksi (EDC) lokukseen 1q21 [45], [46] tai sisällä säilytetyn lokuksessa 19q13 [47], ja määritä osat Sarveistuneiden solun kirjekuoren, rakenne, joka tarjoaa este suojaa orvaskeden sisäinen epiteelin vastauksena loukata tai vamma [48], [49].

IPA-reitin graafisesti geenien yleisesti säädellään ylöspäin CIS ja PC suhteessa BE, esitetään kuviossa 4. Kun otetaan huomioon molekyylivuorovaikutusten tunnistaa IPA, toiminnallinen yhdistysten keskuudessa desmosomien kadheriineja ja catenins ovat näkyvästi sisällä PC /CIS sääteli aineisto. Desmosomeja ovat välistä adheesiota risteykset tarjoavat mekaanista eheyttä epiteelin, ja tutkimukset osoittavat, että desmosomien kadheriineja moduloivat keratinosyyttien erilaistumista ja orvaskeden morfogeneesiin [50]. Tämä analyysi ehdottaa myös, että signalointiryöpyn välittämän jäsenten 14-3-3 perheen proteiinien, voi olla käytössä tässä. 14-3-3 sigma (SFN) välittää keratinosyyttien erilaistumista ja kerrostuminen orvaskeden [51]. Reitti kaavio esittää myös, että tiettyjä näkökohtia keratinosyyttien päätelaitteen erilaistumista voidaan välittää AP-1-transkriptiotekijän FOSL2, joka voi olla ylimääräinen rooli soluväliaineen remodeling. Todellakin, FOSL2 on todettu välittäjänä keuhkofibroosin [52]. Huomioiminen liittyvien geenien transkriptiotekijä HF1A PC /CIS vaurioita, on viittaavia remodeling /profibroottisia vastaus hypoksinen kasvuolosuhteet [53], [54], [55]. Todellakin, välillä on toiminnallinen yhteys hypoksia ja fibroosia on dokumentoitu kirjallisuudessa [56], [57], [58]. Expression muiden geenien tunnistettu tässä, kuten NCF1 (sääntely alayksikön NADPH-oksidaasin), ja hemi catabolic entsyymi HMOX1, on myös osoitus hapen liittyvän stressin vasteen ja kudoksen uudelleen /fibroosi [59], [60], [ ,,,0],61], [62]. On huomattava, että ylimääräinen IPA analyysi tunnistettu

maksafibroosi /Maksan stellate Cell Activation

ja

14-3-3 välittämä signalointi

merkittävinä luokkia

Canonical Pathways

, ja tunnistettu

maksafibroosi

merkittävimpänä luokan sisällä

myrkyllisyys Listat

(tuloksia ei ole esitetty).

155 geenit (IPA kartoitettiin tunnukset) ovat edustettuina ulos 190 SAGE tunnisteita ylös -regulated sekä IVY ja PC suhteessa BE. (Katso taulukko S2 otsikkotietoja.) Gene tuotteet sijoitetaan mukaan solunosasijaintia. Vain suorat yhteydet (eli suorassa kosketuksessa kahden molekyylin välillä) kesken yksittäisen geenin tuotteet on esitetty selvyyden vuoksi esityksen; viivat osoittavat proteiini-proteiini sitovia vuorovaikutuksia, ja nuolet katso ”vaikuttaa” vuorovaikutusta, kuten proteolyysin, ilmaisun, ja proteiini-DNA /RNA vuorovaikutusta. Liittyvien geenien epidermaalinen kehitykseen (katso taulukko 3) on korostettu.

lisäanalyysejä Gene ontologia käyttämällä

KERÄTÄÄN

käsinkirjoitustyökalun [63], samoin tunnistettu epidermaalinen kehityksen merkittävä komponentti n transcriptome yleisesti jopa geenien IVY ja PC vaurioita, suhteessa BE (kuvio S1A, taulukko S3).

alassäädetty ilmentyminen muuttuu.

suurin osa tunnisteiden alaspäin säädellään CIS suhteessa BE, todettiin yleisesti alassäädetty PC vaurioita (678 tunnisteet pois 904 tunnisteet), ja päinvastoin (678 tunnisteet pois 912 tunnisteiden alassäädetty PC suhteessa BE) (kuvio 3A) .