Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

muuntimet ja aktivaattori transkriptiosta 3 (STAT3) on tärkeä rooli tuumorisolun invaasiota ja etäpesäkkeiden. Tavoitteena tässä tutkimuksessa tutkittiin vaikutuksia STAT3 Knockdown nude mouse ksenografteissa haiman syöpäsoluja ja taustalla geenin ilmentymistä.

Methods

STST3 shRNA lentivirusvektorilla rakennettiin ja infektoitiin SW1990-soluissa. qRT-PCR ja western immunoblot tehtiin havaitsemiseksi geenin ilmentymisen. Nude-hiiren ksenografti määrityksiä käytettiin muutosten arvioimiseksi fenotyypit näistä stabiileja soluja in vivo. HE värjäämällä käytettiin arvioimaan kasvainsolun invaasiota ja immunohistokemia suoritettiin analysoida geenin ilmentymistä.

Tulokset

STAT3 shRNA onnistuneesti vaiennetaan ilmentyminen STAT3 mRNA: ta ja proteiinia SW1990-soluissa verrattuna kontrollisoluihin. Kasvuvauhti STAT3-vaiennettu tuumorisoluja nude-hiirissä väheni merkittävästi verrattuna kontrolliryhmässä vektori kasvaimet ja vanhempien solujen syntyvän kasvaimia. Kasvain invaasio astiaan ja lihasten myös vaimennetaan STAT3-vaimennettu kasvaimissa verrattuna kontrolleihin. Kollageeni IV ilme oli täydellinen ja jatkuva ympäröivä kasvaimia STAT3-vaiennettu SW1990-soluissa, kun taas kollageeni IV ilmaisu oli puutteellinen ja katkonaista ympäröivä ohjaus kasvaimia. Lisäksi mikroverisuonitiheys oli merkitsevästi pienempi STST3-vaiennetaan kasvaimia kuin vanhempien tai valvontaa kasvaimia SW1990 soluja. Lisäksi MMP-7 ilmentyminen väheni STST3-vaimennettu kasvaimissa verrattuna vanhempien SW1990 ksenografteissa ja valvontaa. Sitä vastoin, IL-1β ja IgT7α ei muuttunut.

Johtopäätös

Nämä tiedot osoittavat selvästi, että STAT3 on tärkeä rooli säätelyssä kasvaimen kasvun, invaasio, ja angiogeneesin, jotka voisivat olla teko vähentämällä MMP-7 ilmentymisen haiman syöpäsoluja.

Citation: Li Hd, Huang C, Huang Kj, Wu Wd, Jiang T, Cao J, et al. (2011) STST3 Knockdown Vähentää Haimasyöpä Cell invasiivisuus ja matriksimetalloproteinaasi-7 Expression nude-hiirissä. PLoS ONE 6 (10): e25941. doi: 10,1371 /journal.pone.0025941

Editor: Marcelo G. Bonini, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 20, 2011; Hyväksytty 13 syyskuuta 2011; Julkaistu: 03 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tukea (nro 09QA1404600), jonka tieteellisen tutkimuksen rahasto Science and Technology komissio Shanghai kunta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on tappava sairaus ja on neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat länsimaissa [1]. Uusimmat tiedot arvioidaan, että 43140 uutta tapausta diagnosoitiin vuonna 2010 noin 36800 liittyviä kuolemia Yhdysvalloissa [2]. Vaikka kirurginen resektio tarjoaa potentiaalisen parannuskeino, haimasyöpä on usein diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa puutteen vuoksi oireita tai epäspesifisiä oireita, joten leikkaus mahdotonta. Palliatiivinen kemoterapia voi parantaa elämänlaatua ja mahdollisesti vaikuttaa säilymiseen. Nämä ovat johtaneet hyvin synkkä ennuste haimasyövän potilaille, ts mediaanielossaolosta on noin 3-6 kuukautta ja 5 vuoden pysyvyys on alle 5%. Riskitekijöitä haimasyöpä ovat tupakointi, alkoholin kulutus, ruokavalion korkea punaisen lihan mutta alhainen vihannekset ja hedelmät, krooninen haimatulehdus, ja suvussa. Kuitenkin molekyylimekanismeja vastaava haimasyövän kehitykseen ei ole selvitetty, eikä vahvistanut suuntaviivat haiman syövän ehkäisyyn. Siksi uusia lähestymistapoja diagnosoida haimasyövän aikaista varmistaa tehokas hoito ovat huomattavasti tarvitaan.

Signaalin muunnin ja aktivaattori transkription (STAT3) geeni kuuluu STAT-proteiinin perheen transkriptiotekijöiden. Vastauksena sytokiinien ja kasvutekijöiden, STAT perheen jäsenet fosforyloituu reseptoriin liittyvän kinaasien, jotka muodostavat homo- tai heterodimeerejä ja translokaatiota tumaan solujen sitoutumaan DNA: han ja säätelevät ilmentymistä kohdegeenien. STAT3 on aktivoitu fosforylaatiota tyrosiinin 705 ja seriini 727 vasteena erilaisten sytokiinien ja kasvutekijöiden (kuten interferoni, EGF, ja interleukiinit). STAT3 on tärkeä rooli välittämisessä solujen eri prosessit (esim., Solujen kasvuun, apoptoosin ja erilaistumisen) [3]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että onkogeeniset STAT-3-proteiinia konstitutiivisesti aktivoitu monissa ihmisen syövissä [4] – [6]. Sen sijaan, estämällä STAT-3 signalointireitti tukahdutetaan syöpäsoluinvaasiota erilaisissa syövissä [7] – [9]. Haimasyövän, aktivointi STAT-3 edistää kasvainsolujen kasvua, invaasiota ja etäpesäkkeiden, mikä johtaa huonoon potilaan selviytymistä. Molekyylirakennetta, STAT3 voi säädellä VEGF: n ilmentymistä ja MMP-2: n geenien [10] – [11]. Nämä kaksi geeniä, yhdessä MMP-7, MMP-9, bFGF, IL-1β ja IgT7αα liittyvät läheisesti kasvaimen etenemiseen (angiogeneesi, invaasio ja metastaasi) [12] – [14]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme hyödyntäneet STAT3 shRNA lentivirus hiljentää STST3 ilme. Edellinen tietoa ryhmämme ehdottaa, että knockdovvn STAT3 esti hyökkäyksen haimasyövän SW1990-soluissa

in vitro

ja merkittävästi vähentynyt VEGF ja MMP-2: n ilmentymisen [7]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme onko hiljentäminen of STST3 haiman syöpäsoluissa moduloi tuumorisolukasvua ja invasiivisuus nude mouse ksenografteissa ja määrittää taustalla signalointi mekanismeista käyttäen cDNA microarray.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja lentivirus infektion

ihmisen haimasyövän solulinja SW1990 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja penisilliini /streptomysiinillä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja 95% ilmaa inkubaattorissa. Hiljentää STAT3 ilmentymisen, rakensimme lentivirusvektorilla kuljettaa STAT3 shRNA kuten aiemmin on kuvattu [7]. SW1990-soluissa (1 x 10

5) ympättiin kuhunkin kuoppaan ja niitä kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä ja infektoitiin sitten negatiivinen kontrolli lentivirusvektorilla (Genechem, Shanghai, Kiina) tai lentivirusvektori kuljettaa STAT3 shRNA moninkertaisinfektiolla infektio (MOI) 40. Kolmen päivän kuluttua solut altistettiin

vivo

invaasiomääritys.

Quantitative real-time käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR)

Kokonais-RNA eristettiin vanhempien SW1990 ja negatiivinen kontrolli vektori tai STAT3 vektori-infektoitujen SW1990-soluihin käyttämällä Trizol-reagenssia Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). RNA puhdistettiin sitten käyttäen RNeasy mini kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Qiagen, Valencia, CA, USA). Seuraavat kvantifiointi, 1 ug kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä tehtiin ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi käyttäen PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japani) 37 ° C: ssa 15 min ja 85 ° C: ssa 5 s.

qPCR suoritettiin sitten havaita geeniekspressioiden näillä juuri syntetisoidun cDNA. Spesifisten alukkeiden PCR-reaktiossa olivat seuraavat: MMP-9, 5′-CGGAGTGAGTTGAACCAG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-GTCCCAGTGGGGATTTAC-3′ (taaksepäin), jossa on tuotteen koko 118 bp; MMP-7, 5’-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-AAATGCAGGGGGATCTCTTT-3′ (taaksepäin), jossa on tuotteen koko 169 bp; IL1-β, 5’-CTGAGCTCGCCAGTGAA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-GGTCTGTGGGCAGGGAA-3′ (taaksepäin), jossa on tuotteen koko 239 bp; bFGF, 5’-AGAGCGACCCTCACATCAAG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-TCGTTTCAGTGCCACATACC-3′ (taaksepäin), jossa on tuotteen koko 224 bp; IgTα7, 5’-GCGGCCACTCGGTCTGTGTGGAC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-GGAGACTGTAGGACAAGGTCAC-3′ (taaksepäin), jossa on tuotteen koko 303 bp; p-aktiini, 5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’ (taaksepäin) tuotteen kanssa koko 294 emäsparia. qPCR monistukset suoritettiin käyttäen DNA Engine Opticon System (Bio-rad, Foster City, CA, USA) SYBR Esiseos Ex Taq (Takara). Tarkemmin, 1 ui Käänteistranskriptioreaktio seosta käytetään määrällisiä PCR-reaktion kokonaistilavuudessa 20 ui. PCR-sykliä olivat 95 ° C 30 s ja sen jälkeen 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 30 s. Nämä tiedot analysoitiin mukaan vertailevan Ct menetelmän ja normalisoidaan p-aktiinin ekspressiotasot kussakin näytteessä. Suhteellinen ekspressiotasot kohdegeenien jälkeen normalisointi endogeeniseen sekvenssiin, oli antanut 2

-ΔΔ

Ct

.

Meillä on myös suoritettu PCR array kokeita RT

2 Profiler Human tuumorimetastaasit PCR Array (PAH-028A) alkaen SuperArray Bioscience (Frederick, MD, USA). Tämä joukko sisältää 89 geenit ja viisi ”siivous geenit” 96-kuoppalevylle. Me käytetään tämän taulukon havaita knockdovvn STAT3-välitteisen geenin ilmentymisen mukaan valmistajan protokollaa. Kukin reaktio sisältyi 40 ng kokonais-RNA ja oikea negatiiviset kontrollit (ei käänteistranskriptio ja templaattia). Näytteet analysoitiin kolmena kappaleena, ja data normalisoitiin GAPDH tasot käyttäen ΔΔCt menetelmää.

Proteiinin uutto ja Western immunoblot

Solut lysoitiin radioimmunosaostuskokeella puskurissa (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Kiina), joka sisälsi 1 mmol /L fenyylimetaanisulfonyylifluoridia jäillä 15 min. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-proteiinin määrityskittiä (Beyotime). Lysaatit sekoitettiin sitten SDS-PAGE -näytepuskuria, ja keitettiin 5 min. 30 ug kokonais-solun sitten erotettiin 8% tai 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Kalvot värjättiin 0,5% Ponceau S, joka sisälsi 1% etikkahappoa, jotta voidaan arvioida tasa kuormaus- ja hyötysuhdetta. Membraanit blokattiin sitten 5% naudan kuorittua maitoa yön yli ja primaarisen vasta-aineen 4 tuntia huoneen lämpötilassa. Pesun jälkeen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), membraaneja inkuboitiin edelleen peroksidaasilla konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Havaitsemaan positiivisen proteiinivyöhykkeet, parannettu kemiluminesenssin reagenssia Millipore (Bedford, MA, USA) käytettiin. Ensisijainen vasta-aineet olivat seuraavat: MMP-7: R ja β-aktiini peräisin Biomart (Shanghai, Kiina) laimennoksena 1:1000. Toissijainen vasta-aineet sisältyvät peroksidaasikonjugoitua AffiniPure vuohen anti-hiiri- tai anti-kani-IgG: Jackson ImmunoResearch (West Baltimore Pike West Grove, PA, USA).

Nude hiiren kokeissa

Kuuden viikon ikäisiä SPF grade BALB /c-nude-hiiriä ostettiin Institute of Zoology, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). Nämä hiiret ruokittiin normaalia jyrsijöiden ruokavalion ja vesi

mielin määrin

aseptisessa laminaarivirtausmittaria huone 60% -70%: n kosteus 25 ° C: ssa. Kaksi viikkoa saapumisen jälkeen, 50 ui solu liuokset (joka sisälsi 2 x 10

6 logaritmisen kasvuvaiheen kasvainsoluja) injektoitiin kynsien pad hiirten ihon alle. Sitten hiiriä tarkkailtiin päivittäin ruokavalio kulutusta, ulosteet ja psyykkinen, ja kasvaimen koon ja painon mitattiin joka viides päivä. Pituus ja leveys kasvain mitattiin Vernier jarrusatulat ja lasketaan käyttäen kaavaa kasvaimen tilavuus = pituus x leveys

2 x 0,5. Eläinten käyttö tässä tutkimuksessa kokoaa kanssa Opas hoito ja koe-eläinten käytön. Tutkimus hyväksyi Science and Technology komissio Shanghai kunta (License # SYXK2009-0086).

Immunosytokemia ja immunohistokemia

tuumorisoluja viljellään lasipeitinlevyille pestiin PBS: llä kolmena kappaleena ja kiinnitetty 4% formaldehydiä. Endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus soluista blokattiin 3% vetyperoksidia. Peitinlasit inkuboitiin sitten 1% naudan seerumin albumiinia PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen kanssa 30 min. Peitinlasit sitten vastavärjättiin hema- ratkaisu.

immunohistokemiallisella värjäyksellä, 4 um: n leikkeitä leikattiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu kudospaloista ja sitten parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin peräkkäisten pesujen etanolia. Sitten leikkeitä kuumennettiin mikroaaltouunissa keski- tehon 8 min sitraattipuskurissa, pH 6,0 lämmön aiheuttamaa epitoopin haku. Leikkeet altistettiin salpauksesta endogeenisen peroksidaasin aktiivisuuden ja ei-spesifinen sitoutuminen primaarisen vasta-aineen ja sitten kohdistaa proteiinin lokalisaatio ensimmäisen vasta-aineen ja visualisoinnin kanssa sekundaarisen vasta-aineen ja värin reaktiolla, kuten edellä on kuvattu.

primaaristen vasta-aineiden sisältyy: MMP-7: R kollageeni IV tai PECAM-1 peräisin Bioworld Technology (Louis Park, MN, USA) laimennoksena 1:100. Toissijainen vasta-aineet vuohen anti-hiiri- tai anti-kani IgG: tä konjugoituna peroksidaasin DAKO EnVision (DAKO Corp., Carpinteria, CA).

Värjätyt kasvainsoluja ja parafiinileikkeet tarkistettiin ja pisteytetty valon mikroskooppia patologi sokkoutettu hoitoryhmään. Positiivisuus värjättyä kasvainsolujen peitinlaseil- ja parafiinileikkeet määriteltiin värjäämällä intensiteetti ja% tuumorisolujen: värjäytymisen intensiteetti MMP-7 ilmentyminen on luokiteltu semikvantitatiivisesti negatiiviseksi ja heikko, kohtalainen, ja voimakkaasti positiivinen (0, +, ++ ja +++, vastaavasti). Tutkimuksessamme geenien ilmentyminen pidettiin positiivisena, jos värjäytyminen intensiteetti oli kohtalainen tai vahva ja prosenttiosuus positiivisten värjätyt solut 20%. Kuitenkin pienten verisuonten tiheyden positiivisiksi värjäytyneiden PECAM-1 määriteltiin positiiviseksi 400 tehon mikroskooppikenttää kuten aiemmin on kuvattu [15].

Tilastollinen analysointi

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 12.0 ohjelmisto (SPSS, Chicago, IL, USA). Aineisto tiivistää keskiarvo ± SD mahdollisuuksien ja analysoitiin käyttäen Student-Newman-Keuls testi määrittää tilastollista merkittävyyttä. P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

knockdovvn STAT3 ilmaisun käyttäen STAT3 shRNA

: n merkityksen osoittamiseksi STAT3 haimasyövän, suoritimme geeni pudotus käyttävien kokeiden STAT3 shRNA in SW1990-soluissa. Olemme todenneet, että STST3 shRNA onnistuneesti pudotettiin STST3 ilmentymistä SW1990-soluissa, eli qRT-PCR tiedot osoittivat, että STST3 shRNA vektori esti STST3 mRNA ilmentymistä verrattuna kontrollivektoreihin (

P

= 0,004), kun taas Länsi-immunoblottauksella tiedot osoittivat STAT3-proteiinin inhiboitui merkittävästi in STAT3 shRNA-transfektoiduissa SW1990-soluissa (

P

= 0,003) (kuvio 1).

A, qRT-PCR: llä. Vakaa STAT3 shRNA ja ohjaus vektori transfektoitiin SW1990-soluihin ja vanhempien SW1990-solut kasvatettiin ja RNA eristettiin qRT-PCR-analyysi STAT3 mRNA: n ekspression *

P

0,01 verrattuna SW1990 tai kontrollivektori-transfektoiduissa soluissa. B, Western immunoblottaus. Nämä solut kasvatettiin totaalisoluproteiinia uuttamalla ja Länsi immunoblottaus analyysit STST3 proteiinin ilmentymisen.

Suppression kasvun ja invaasion STAT3 shRNA transfektoitujen SW1990 solut nude-hiirissä

pistetään vakaa STAT3 knockdown tai säätökennoja kynteen pad nude-hiirten. 10 päivän tuumorin istuttamisen, huomasimme, että kasvuvauhti STAT3-vaiennettu tuumorisoluja pieneni merkitsevästi (kuva 2). Olemme myös havainneet, että ilmentyminen kollageeni IV-proteiinin ympäröivien tuumorisolujen kontrollien tuumoreiden oli puutteellinen ja epäjatkuva, kun se oli täydellinen ja jatkuva kasvaimia STAT3-vaiennettu SW1990-soluissa immunohistokemiallisella värjäyksellä (kuvio 3A B). Kasvainsolun invaasio kyky havaittiin HE-värjätty kudos ksenografteissa valomikroskoopissa. Lisäksi kasvaimen invaasio astiaan ja lihas oli yleisempää kontrollien tuumoreiden kuin STST3-vaiennetaan kasvaimet (kuva 4). Prosenttiosuus aluksen ja lihasten hyökkäystä STST3-vaiennetaan kasvaimia oli 22,22% (2/9) ja 33,33% (3/9) verrattuna 60% (6/10), 80% (7/10) ja 70% (7 /10), 80% (8/10) vuonna SW1990 kasvain ja negatiivisen kontrollin kasvain, vastaavasti. Mikroverisuonitiheys oli merkitsevästi pienempi STST3-vaiennetaan kasvaimia kuin vanhempien tai valvontaa kasvaimet SW1990 solujen (

P

= 0,007 ja

P

= 0,021, vastaavasti, kuvio 5). Nämä tulokset osoittavat, että STST3 keskeinen rooli sääntelyn kasvaimen kasvua, invaasio ja angiogeneesi.

Lapsen tai kontrollivektorille ja STAT3 shRNA transfektoituja SW1990 soluja kasvatettiin soluviljelmässä ja ruiskutettiin nude mouse kynsien tyynyt . Kasvaimen tilavuus mitattiin joka viides päivä enintään 30 päivän kuluessa kasvainsoluinokulaation .. *

P

0,05 kontrolliin verrattuna vektorin tai vanhempien kasvaimia.

tuumoriksenografteja alkaen kontrollivektorilla ja STAT3 shRNA-transfektoidut solut altistettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä kollageeni IV-proteiinin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kollageeni IV ilmaisun (punainen nuoli) on täydellinen ja jatkuva STAT-3-vaiennetaan kasvain (A), mutta eheys kollageeni IV tuhoutui osoituksena epätäydellinen ja epäjatkuvaa (punainen nuoli) värjäys (B). × 400 suurennus.

Nämä nude mouse -ksenografteja otettu kudoksista käsitellä HE värjäystä. A ja B, x 400 suurennus, C ja D, x 100 suurennus. Kasvainsolun invaasiota pienten suonten on yleisempää kontrollivektorille kasvaimet (merkitty punaisella nuolella A), mutta ei ilmeistä STST3-vaiennetaan kasvaimet (B). Lihaksen valloitti ja tuhosi (musta nuoli), jonka tuumorisolut (punainen nuoli) on SW1990 solujen C, mutta raja on selvä välillä lihas (musta nuoli) ja kasvaimen (punainen nuoli) D.

Kudosleikkeet nude-hiiren -ksenografteja värjättiin immunohistokemialla anti-PECAM-1-vasta-aine. PECAM-1 positiivisia pienten verisuonten kasvaimia laskettiin mikroskoopilla ja tiivistää. Määrä pienten suonten oli 13,00 ± 2,36 per suuritehoiset kenttä (N = 9) in STST3-vaimennettu kasvaimissa verrattuna 16.30 ± 2,45 (n = 10) vanhempien SW1990 kasvaimet ja 15,80 ± 2,57 (n = 10) vektorisäädön kasvaimissa . Nämä erot olivat tilastollisesti merkitseviä. * P 0,01 vs. vanhempien SW1990 kasvaimia, ** P 0,05 vs. kontrolli vektori kasvaimia.

ilmentyminen kasvaimen invaasion ja metastaasin geenit seuraavissa STST3 pudotus

määrittää geeni ilmentymistä näissä STST3-kaatamalla kasvaimia käyttäen ihmisen kasvaimen etäpesäke PCR array (# PAHS-028A) alkaen SuperArray Bioscience. PCR array tiedot viittaavat siihen, että kolme geeniä, eli MMP-7, IL-1β ja IgT7α, olivat vaimentua (vähennykset 2,54-kertainen, 23.90-kertaiseksi, ja 5,39-kertaiseksi) in STST3-vaimennettu kasvaimia verrattuna kontrolliin ja vanhempien SW1990 kasvaimia. Kuitenkin kahdeksan geeniä voimistunut,: SYK (3,38 taittuu), MYCL1 (4,85 taittuu), MMP-11 (4,59 taittuu), MMP-3 (10,88 taittuu), MMP-10 (19,93 taittuu), CST-7 (3,34 taittuu ), CDH11 (2,01 taittuu) ja IL-8Rβ (7,06 taittuu).

Alennettu MMP7 mRNA ja proteiinin ilmentyminen in STST3-vaiennetaan kasvaimia

validoitu tietoja array kokeita ja suorittaa ylimääräisiä analyyseistä qRT-PCR (Kuva. 6A S1) ja Länsi immunoblottaus (kuvio 6B) ja totesi, että MMP-7, MMP-9 mRNA ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt STST3-vaimennettu kasvaimissa verrattuna vanhempien ja ohjaus kasvaimet (

P

= 0,033 ja

P

= 0.002

vs.

SW1990, vastaavasti tai

P

= 0,0001 ja

P

= 0,011

vs.

ohjaus kasvaimia, vastaavasti). IL-1β mRNA ilmentyminen väheni myös merkittävästi vuonna STST3-vaimennettu kasvaimissa verrattuna vanhempien ja ohjaus kasvaimet (

P

= 0,01 ja P = 0,0001

vs.

SW1990 ja ohjaus kasvaimia, vastaavasti). Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa bFGF tai IgT7α mRNA: n ilmentymisen välillä STAT3-vaiennettu kasvaimia tai valvontaa (Fig. 6A). MMP-7 ilmentymisen proteiinitasolla oli merkittävästi vaimentaa STST3-vaiennetaan kasvaimia, mutta MMP-9 ei vaikuttanut merkittävästi (kuvio 6B).

, qRT-PCR. RNA eristettiin ksenograftien ja altistetaan qRT-PCR-analyysit. B, Western blot. Solun kokonaisproteiinia uutettiin nude-hiiret, ksenograftit ja altistettiin Western blot-analyysit. **

P

0,01; *

P

0,05 kontrolliin verrattuna vektorin tai vanhempien kasvaimia, vastaavasti.

alennetulla MMP-7 ilmentymisen STST3-äänieristys kasvainsoluja ja ksenograftien

vahvista nämä tiedot suoritimme immunosytokemiassa on STAT3 pudotus solut ja paljaan hiiren ksenograftit. Tuloksemme viittaavat siihen, että STST3-vaiennettu SW1990 soluja tai ksenografteissa ilmaistuna pienempi MMP-7-proteiinin solulimassa verrattuna vanhempien ja ohjaus soluja ja ksenograftit (kuvio 7), joka on sopusoinnussa invaasio pidättyvyyttä paljaan hiiren ksenografteissa. Nämä tulokset osoittavat, että STST3 sääntely invaasion kapasiteetin haimasyöpäsoluissa liittyy downregulation MMP-7 ilme.

syöpäsolujen vanhempien, vektorisäätö ja STAT3-vaiennettu SW1990 soluja kasvatettiin yksikerroksinen tai nude hiirillä. Yksikerroksista solut ja tuumoriksenografteja alistettiin sitten immunosytokemian ja immunohistokemia värjäystä MMP-7-proteiinia. A vanhempien solut; B, STAT3-vaiennetaan soluissa; C, vanhempien kasvaimet; D, STAT3-silecnced kasvaimia. X 400 suurennos. Punainen nuoli, kasvainsolut.

Keskustelu

STST3 shRNA onnistuneesti pudotti ilmaus STAT3 mRNA ja proteiini SW1990-soluissa verrattuna ohjaamaan vektori-transfektoitujen SW1990-soluissa. Sitten injektoitiin ihonalaisesti kontrollivektorilla ja STAT3 shRNA transfektoitiin SW1990-soluja nude-hiiriin. Tuloksemme viittaavat siihen, että kasvuvauhti STAT3-vaiennettu tuumorisoluja nude-hiirissä oli merkittävästi vähäisempää kuin ohjata vektori soluihin. Kasvain invaasio astiaan ja lihas oli harvinaista, että STAT3-vaiennettu kasvaimia kuin verrokeilla kasvaimia. Expression kollageeni IV proteiinin ympäröivä kasvainsolut oli täydellinen ja jatkuva kasvaimista STAT3-vaiennettu SW1990-soluissa, kun taas kollageeni IV ilmentyminen oli epätäydellinen ja epäjatkuva sisällä ohjaus kasvaimia. Lisäksi mikroverisuonitiheys oli merkitsevästi pienempi STST3-vaiennetaan kasvaimia kuin vanhempien ja valvonta kasvainten SW1990 soluja. Molekyylitasolla, MMP-7 ilmentyminen väheni STST3-vaimennettu kasvaimia verrattuna kontrolliin ja vanhempien SW1990 ksenograftit. Tiedot nykyisestä tutkimuksen osoittavat selvästi, että STST3 ei olla ratkaiseva rooli sääntelyn kasvaimen kasvua, invaasio ja angiogeneesi.

Emme kuitenkaan ei löytänyt merkittäviä muutoksia MMP-9-proteiinin ilmentymistä, vaikka ilmaus MMP-9 mRNA väheni. Syynä tähän ero voi johtua kudoksen estäjä metalloproteinaasien 1 (TIMP-1) pieneni, kun STST3 hiljentäminen johti aktivoitu MMP-9 lisääntyy, mikä laski ilmentyminen MMP-9 mRNA kautta negatiivista palautetta [16], [17]. Lisäksi nykyinen data ehdottaa myös joitakin eroavaisuuksia PCR array ja qRT-PCR data. Itse asiassa PCR-array on uusi tekniikka tutkia erilainen ekspressio kohdegeenien mRNA-tasolla, joilla on korkea suoritusteho, herkkyys ja spesifisyys. Kuitenkin nämä tiedot aina tarvitse vahvistaa käyttämällä qRT-PCR, joista osa voidaan tutkia (vahvistettu) käyttäen qPCR. Tästä syystä voi johtua suunnitella aluketta ja vaikea hallita hehkutus lämpötila johtaa ei-spesifisten monistukset PCR-array. Siten qRT-PCR tiedot voisivat olla tarkempia ja luotettava. Vaikka olemme osoittaneet joitakin geenejä, jotka voimistunut jälkeen hiljentäminen of STAT3 ilmaisun, haluaisimme korostaa geenejä, jotka vaimentua seuraavat STST3 hiljaisuus nykyisessä tutkimuksessa.

STST3 on keskeinen transkriptiotekijä, joka on onkogeeninen ihmisen soluihin [18], [19]. Janus-kinaasi (JAK) /STST3 signalointi on tärkeä rooli sääntelyn solujen kasvua ja erilaistumista ja kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden erilaisissa ihmisen syövissä [20] – [22]. Haimasyövän, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, sopimatonta ja konstitutiivisen aktivaation STAT3 [23], [24]. Aiemmassa tutkimuksessa ryhmämme raportoitu alas-säätely STAT3 ilmaisun tukahdutti hyökkäystä kapasiteetti haimasyöpäsoluissa

in vitro

[7]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että hiljentäminen of STAT3 ilmaisun tukahdutti kasvaimen kasvun ja invaasion ja mikroverisuonitiheys nude-hiirissä. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​aiemman

ex vivo

tutkimuksen [25], jossa kirjoittajat osoittivat, että ilmentyminen fosforyloidun STST3 ihmisen mahakarsinoo- korreloi merkitsevästi kasvaimen invaasio ja ennusteen

ex vivo

.

Aikaisemmat tutkimukset muiden ja meistä ovat osoittaneet, että STAT3-lisääntynyt mikroverisuonitiheys voi johtua STAT3 induktion VEGF-ilmentymisen [7], [26]. Toisessa tutkimuksessa myös näyttöä siitä, että tukahduttaminen invaasio ja etäpesäkkeiden mukaan STAT3 Knockdown riippui VEGF alas-säätely koolonkarsinoomasoluissa [27]. Lisäksi vähentynyt MMP-2 on keskeinen syy suppressioon kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden seuraava vaiennettu STAT-3: n ekspressio ihmisen melanooman [5]. MMP tärkeitä rooleja kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden jonka hajoaminen komponenttien tyvikalvoissa ja soluväliaineen [28] – [30]. Yhä useammat tutkimukset osoittavat, että tietyt MMP proteiinit kohdistetaan STST3 [31], [32]. Xie et al todennut, että STAT3 aktivaatio edisti invaasio melanoomasolujen kautta MMP-2-geenin transkription [33]. Lisäksi MMP-1 ja MMP-9 havaittiin säänneltävä STAT3, joka on keskeinen rooli kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [34], [35]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että pudotus on STAT3 ilmentymisen pienentynyt MMP-7 ilmentymistä haiman syöpäsoluissa ja nude-hiiri-ksenografteissa. MMP-7 on pienin proteiinin MMP perhe, mutta omaa korkeimman soluväliaineen (ECM) -degradative aktiivisuutta erilaisia ​​ECM komponentit; Näin ollen, se voi laukaista aktivointi MMP Cascade ja se liittyy läheisesti tuumorin invaasiota ja etäpesäkkeiden [36] – [39]. Haimasyövän, MMP-7 on osoitettu olevan osallisena kasvainsolun irtaantuu alkuperäisestä sivustosta ja sen jälkeen saada hyökkäys kapasiteettia [40], [41]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että MMP-7 voi olla suora tavoite STST3 mahalaukun ja rintasyövän solujen [42], [43], joka on johdonmukainen päätelmä haiman syöpäsoluja.

Nykyisessä tutkimuksessa , käytimme nude mouse naula pad malli sijasta rutiini paljaan hiiren kylkeen malli syöpäsoluja. Etuna kynsien pad malli on, että tämä malli testaa ei vain hyökkäyksen kyky tuumorisolujen astiaan ja lihasten, mutta myös tietty menetelmä nivusimusolmukkeista etäpesäkkeet kasvainsolujen. Kuitenkin potilaalle tehdä kasvain malli on paras havaitsemiseksi invaasiota ja etäpesäkkeiden kykyä syöpäsoluja. Haimasyövän, olemme kohdanneet useita ongelmia, mukaan lukien tekniikka pistää kasvainsoluja haimaan, leikkaus indusoimaan korkea kuolleisuus, ja epävarmuus kasvaimen invaasion ja metastaasien (eri primäärikasvaimissa haima). Tässä yhteydessä nude mouse naula pad malli on helppoa ja luotettavaa. Nämä nykyiset tiedot viittaavat siihen, että STST3 Knockdown muuttunut merkittävästi hyökkäys kyky haimasyöpäsoluissa ilman etäpesäkkeitä imusolmukkeisiin sekä koe- ja kontrolliryhmissä. Tämä voi johtua siitä, että ajanjakso kokeissa (30 päivää). Tämä tutkimus osoitti myös vaikutuksia STAT3 Knockdown haiman syöpäsoluja

in vivo

, joka vahvisti aiemmat

in vitro

tietojen STST3 tärkeä rooli edistettäessä kasvaimen kasvu, invaasio ja angiogeneesi , kun taas tukahduttaminen STAT3 ilmaisun teki estää haiman syöpäsolujen kasvua, angiogeneesin, ja hyökkäystä. Nämä toiminnot on STAT3 voi toimia säätelyn avulla sen alavirran geenien, mukaan lukien cyclinD1, Bcl-2, VEGF, ja MMP-2, jotka kaikki on mainittu aikaisemmissa tutkimuksissa [26], [44], [45]. Vuonna meidän tutkimuksessa havaitsimme, että STAT3 inhibitio voi vähentää MMP-7 ilmentymistä haiman syöpäsoluissa. Jatkotutkimuksissa pitäisi keskittyä onko vaiennettu STAT3 ilmaisun käyttämällä STST3 shRNA tai sen estäjä kuten ei-reseptori tyrosiinikinaasi on käyttökelpoinen uutena adjuvanttiterapiana kemoterapiaa haimasyövän potilaille.

tukeminen Information

Kuva S1 .

qRT-PCR-analyysi SYK, MYCL1, MMP-11, MMP-3, MMP-10, CST-7, CDH11, ja IL-8Rβ ilmentymisen paljaan hiiren ksenografteissa. RNA eristettiin hiiren ksenograftien ja altistetaan qRT-PCR-analyysi. Tiedot osoittivat, että ilmentyminen MYCL1, MMP-3, MMP-10 ja IL-8Rβ oli up säännelty, mutta SYK oli säädellä vähentävästi STAT3 hiljaisuus kasvain kontrolliin verrattuna vektorin tai vanhempien kasvaimia. Sitä vastoin ilmaus CST-7, CDH11, MMP-11-mRNA: n ei ollut eroa kunkin kasvaimen näytteestä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0025941.s001

(TIF)