Krooninen sairaus

tiivistelmä

nenänielusyöpä (NPC) etiologisesti Epstein-Barrin virus (EBV) infektio. Kuitenkin tarkka rooli EBV NPC synnyssä edelleen heikko. Aktivointi signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STST3) on yleinen ihmisen syövissä kuten NPC ja tärkeä rooli patogeneesissä ja etenemisen ihmisen syövissä. Interleukiini-6 (IL-6), on merkittävä tulehduksellinen sytokiini, on voimakas aktivaattori STAT3. Tässä tutkimuksessa, me raportoimme että EBV-tartunnan kuolemattomaksi nenänielun epiteelin (NPE) solut usein hankkivat tehostetun vaste IL-6 aiheuttama STAT3 aktivointi edistää niiden kasvua ja invasiivisia ominaisuuksia. Kiinnostavaa kyllä, tämä parantaa IL-6 /STAT3-vaste välittävät yli-ilmentyminen IL-6-reseptorin (IL-6R). Lisäksi IL-6R yli-ilmentymisen parannettu IL-6 aiheuttama STAT3 aktivaation tartuttamattomissa kuolemattomaksi nonyylifenolietoksylaattia solujen

in vitro

sekä edistänyt kasvua ja tuumorigeenisyystesti EBV-positiivisten NPC solulinja (C666-1)

in vivo

. Lisäksi esitetään ensimmäistä kertaa, että IL-6R yliekspressoitui kliinisistä näytteistä NPC. IL-6 ekspressiota voitaisiin myös voimakkaasti havaita stroomasoluissa NPC ja korkeampi veressä kiertävän IL-6 löydettiin seerumeista etukäteen-vaiheen NPC potilailla verrattuna verrokkeihin. Siksi IL-6R yliekspressio yhdistettynä parannettu IL-6 /STAT3 signalointi voi helpottaa pahanlaatuisiin EBV-tartunnan premaligni NPE solujen syöpäsoluja, ja parantaa pahanlaatuiset ominaisuuksia NPC soluja.

Citation: Zhang G , Tsang CM, Deng W, Yip YL, Lui VW-Y, Wong SCC, et al. (2013) Enhanced IL-6 /IL-6R: n signaloinnin edistää kasvua ja pahanlaatuiset Properties in EBV-tartunnan Premalignit ja syöpä Nenänielun epiteelisolujen. PLoS ONE 8 (5): e62284. doi: 10,1371 /journal.pone.0062284

Editor: Qian Tao, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 12 joulukuu 2012; Hyväksytty: 19 maaliskuu 2013; Julkaistu: 01 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke rahoittaa GRF myöntämät apurahat Hongkongin Research Grant neuvosto (Grant numero: 776608M, 779810M, 780911M on SWT) ja RGC sponsoroi Area of ​​Excellence Teema (Grant numero: AoE /M-06/08-MLL). VWL tukee Patricia L. Knebel Fund on Pittsburgh Foundation, USA, Career 512 Development Program on erikoistunut ohjelma huippututkimuksen (SPORE) pään ja kaulan syöpä (5P50CA097190-05), pään ja kaulan alueen syöpä SPORE Developmental Research Award (5P50CA097007). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nenänielusyöpä (NPC) on selvä päätyypissä kaulan syövän esiintyvyys on korkea Kaakkois-Aasiassa [1]. Tämä pahanlaatuisuus on tunnusomaista Epstein-Barr-virus (EBV) -infektio, sekä sen erittäin tulehduksellinen strooman ja metastaattisen luonne [2]. EBV on läsnä lähes kaikissa tapauksissa eriytymättömän NPC endeemisillä alueilla ja on pitkään arveltu olevan tärkeä etiologinen tekijä NPC synnyssä. Silti tähän mennessä tarkka rooli EBV NPC synnyssä on epäselvä [3] – [5]. Rooli tulehduksellisten sytokiinien syövän synnyssä on vakiintunutta, mutta niiden vaikutukset EBV-tartunnan premaligni ja syöpä nenänielun epithelia huonosti määritelty.

kumulatiiviset tiedot osoittavat, että useita tekijöitä ovat mukana NPC synnyssä lisäksi tai yhdessä EBV-infektio [4], [6]. STAT3 aktivointi on yleinen ihmisen syövissä, mukaan lukien sekä hematologisia ja kiinteitä kasvaimia [7]. Konstitutiivisen aktivaation STAT3, osoittaa lisääntyneen ekspression fosfo-STAT3 (p-STAT3), on raportoitu 70% NPC yksilöiden [8] – [10]. Normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa, STAT3 aktivointi on yleensä ohimenevää ja on tiukasti säänneltyä. Tuumorisoluissa, konstitutiivinen aktivointi STAT3 voi johtua epänormaalista ja jatkuva autokriinisen ja /tai parakriinisellä signaloinnin, mukaan lukien interleukiini-6 (IL-6) signalointia [11] – [13]. IL-6 aktivoi STAT3 sitoutumalla spesifisesti sen vastaavan reseptorin solun kalvoon, eli IL-6R: ään. Kun IL-6 sitoutumisen IL-6-reseptorin aktivoi reseptoriin liittyvän kinaasien (JAK1, JAK2 ja Tyk2), joka sen jälkeen aiheuttaa fosforylaation ja dimerointi STAT3 (aktivointi STAT3). Aktivoitu STAT3 sitten kulkeutua tumaan aiheuttaa kohdegeenin transkription [14], [15]. Konstitutiivinen STAT3 aktivointi edistää kasvaimen kasvua ja selviytymistä sekä invaasio, epiteelin-mesenkymaalitransitioon ja angiogeneesissä [16] – [18]. Tuoreessa tutkimuksessa ehdotetaan, että IL-6-välitteinen STAT3 aktivointi voi välittää iNOS induktio NPC, jolloin muodostuu mutageenisen DNA vaurioita, jotka saattavat vaikuttaa sen synnyssä [19].

Huolimatta kehittyvien biologista merkitystä STAT3 aktivaatio NPC, tarkkaa mekanismia sen aktivoitumisen edelleen heikosti määritelty, erityisesti yhteydessä EBV-infektion [20]. L1-TR promoottori EBV-koodattu onkogeeni, LMP1 sisältää STST3 vastaavan elementin [21]. STAT3 aktivointi voisi aiheuttaa transkriptio LMP1 EBV-tartunnan NPC soluissa. Lisäksi LMP1 ilmaisu ylössäätelee IL-6-tuotannon [22], [23], joka aktivoi STST3 signalointi luoda positiivista palautetta silmukka STAT3 /LMP1 /IL-6 /STAT3 activatioin monistaa STST3 signalointia EBV-tartunnan NPC soluissa [22 ].

IL-6-ajettu STAT3 aktivaatio on erityisen merkitystä NPC synnyssä.

In vivo

, tulehduksellinen strooman voi edustaa voimakas lähde IL-6 ajaa STAT3 aktivaation EBV-tartunnan nenänielun epiteelin (NPE) solujen edistää kasvaimien syntyyn ja taudin etenemistä. Vaikka IL-6 on keskeinen sytokiini välittäjänä STAT3 signaloinnin roolia IL-6 /STAT3 signalointia EBV-tartunnan premaligneja NPE soluja ei ole aiemmin raportoitu. Olemme aiemmin vakaa EBV infektion kuolemattomaksi nonyylifenolietoksylaattia soluissa [24], [25]. Näitä EBV-tartunnan NPE solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa tarkastella monimutkainen suhde STAT3 aktivointi ja EBV-infektio. Mielenkiintoista, havaitsimme ensimmäistä kertaa, että vakaa EBV infektion kuolemattomaksi nonyylifenolietoksylaattia soluissa johtivat usein voimistaa niiden vastausten IL-6 aiheuttama STAT3 aktivointia. Lisäksi STAT3 aktivaatio näissä EBV-tartunnan NPE soluissa voimistaa heidän ankkurointiriippumattomuudeksi ja invasiivisia ominaisuudet

in vitro

. Mekanismit tehostetun IL-6-induced STAT3 aktivaation signalointia EBV-tartunnan nenänielun soluihin tutkittiin tässä tutkimuksessa ja sen kliinistä merkitystä NPC tutkittiin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausuntoja

tutkimuksissa, joissa koehenkilöillä hyväksyi Institutional Review Board of University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster, ja kaikki aiheet tarjotaan kirjallinen lupa ennen tutkimukseen osallistumista. Eläin tutkimukset hyväksyttiin valiokunnan elävien eläinten käyttö opetuksessa Tutkimus yliopiston Hong Kong. Kaikkensa käytettiin ehkäistä kärsimystä ja minimoida numerot hiirien tarvitaan kussakin kokeessa.

Solut ja soluviljelmä

perustaminen ja karakterisointi kuolemattomaksi nonyylifenolietoksylaattia solulinjan NP460hTert on kuvattu aiemmin [26 ]. Perustaminen muiden nonyylifenolietoksylaattia solulinjojen NP550-cyclinD1-hTERT, NP550-CDK4-hTERT, NP361-cyclinD1-hTERT raportoidaan erikseen. Vakaa EBV-infektio saavutettiin näissä kuolemattomaksi nonyylifenolietoksylaattia solut ja niiden viljelyolosuhteet ovat aikaisemmin raportoitu [24], [25]. EBV-infektio ja soluviljelmä NPE soluja suoritettiin aikaisemmin raportoitu [24]. Ihmisen NPC solulinjat CNE2, C666-1, HONE1 viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa (Sigma, St Louis, MO, USA), joka sisälsi 10% FBS: ää, 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Plasmidit

plasmidi ilmaista konstitutiivisesti aktiivisen mutantin STAT3 (pBabe-STAT3-C), IL-6-promoottorin lusiferaasireportteri- konstruktilla (pGL3-IL-6-Luc), ja m67 lusiferaasireportteriplasmidi käytetään havaitsemista varten STAT3 aktivointi (luc-m67) oli ystävällisesti Dr. JF Bromberg, Department of Medicine, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, USA [27]. PUC-IL-6R, jota käytetään IL-6R: n luovutti ystävällisesti Dr. R. Stefan (Institute of Biochemistry, Christian-Albrechts-yliopisto, Saksa) [28]. Retroviraalinen ekspressiovektori (pBabe-IL-6R), jota käytetään yli-ilmentää IL-6R muodostettiin insertoimalla IL-6R -fragmentti pUC-IL-6R-osaksi pBabe-vektorin Sali-kohtaan. LMP1 ekspressioplasmidin (pcDNA 2117), jota käytettiin aiemmassa tutkimuksessa [29] oli antelias lahja tri D. P. Huang Kiinan University of Hong Kong.

Western-blottaus-analyysi

Western blot analyysit tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [26]. Nuclear uutteet valmistettiin viljelemällä soluja käyttämällä NE-PER Ydin- ja Sytoplasmiset Extraction reagenssit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käytetyt vasta-aineet voidaan havaita IL-6R: n, sykliini D1 ja β-aktiini ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineet STAT3, p-STAT3 (Tyr705) ja Bcl-2 hankittiin Soluviestintä (Danvers, MA, USA). Vastaiset vasta-c-myc, anti-Flag-hankittiin Sigmalta. Vasta-aine LMP-1 hankittiin Dako (Glostrup, Tanska). Toissijainen vasta-aineita käytettiin piparjuuriperoksidaasi-sidottu vasta-aineita, Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Detection antigeenin Western blotting suoritettiin ECL Plus kemiluminesenssin reagenssit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) mukaan valmistajan ohjeiden.

Elektroforeettisen-liikkuvuuden siirtymän (EMSA) B

EMSA suoritettiin että manufactor ohjeen mukaisesti käyttämällä kaupallisesti saatavilla kitti STAT3 aktivointia (Thermo Scientific). Lyhyesti, kokosoluekstraktien (4 ug proteiinia), joka on valmistettu IL-6-käsitellyn ja käsittelemättömän soluja inkuboitiin biotiini-leimattu korkean affiniteetin seerumin indusoituva elementti (hSIE) kaksipuolinen oligonukleotidi (GATCCATTTCCCGTAAATC). Geelielektroforeesin jälkeen sitoutunut STAT3: oligonukleotidi elektroblotattiin 350 mA Biodyne B membrances (nylon) ja kiinnitetään käyttäen UV-silloittajaa. Kalvot sitoutuneen oligonukleotidin siirretty estettiin, leimattu streptavidiini-HPR konjugaattia 1:1000 keskittyminen, ja altistuvat ECL Plus kemiluminesenssin reagenssit (GE Healthcare) mukaan valmistajan ohjeiden. Su- on STAT3: oligonukleotidikompleksit havaittiin 30 minuutin jälkeen esi-inkuboinnin anti-STAT3-aineella (Santa Cruz).

TranswellTM invaasiomääritys

Boyden kammio invaasiomääritys suoritettiin käyttämällä TranswellTM kammion Milipore Company (6,4 mm halkaisijaltaan 8,0 um huokoskoko) mukaisesti aiemmin julkaistu menetelmä [30]. Solumigraation määritettiin keskimäärin solujen määrä siirtynyt kymmenen satunnaisesti valittua mikroskooppisia kentät x 400 suurennuksella. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmen kuopan.

Transient plasmiditransfektiolla ja lusiferaasireporttiterilla määritys

Lipofectamine

™ 2000 (Invitrogen) käytettiin ohimenevä plasmidi-DNA-transfektio mukaan valmistajan ohje. Mittaamiseksi STST3 transaktivaatioaktiivisuuden toiminnan HONE1 ja HONE1-EBV-solut, 0,8 ug m67 lusiferaasireportteri (luc-m67) plasmidia kohden näytettä käytettiin. Detection of STAT3 aktivointi suoritettiin kotransfektoimalla RcCMV STAT3-C tai kontrollivektori kanssa lusiferaasireportteriplasmidi. Mittaamiseksi IL-6-geenin promoottorin aktiivisuutta HONE1 soluissa, 0,8 ug pGL3-IL-6-Luc näytettä kohti käytettiin. Suhde tulikärpäsen lusiferaasi reportterikonstruktio ja Renillaa käytettiin 200: 1. Kolmekymmentä kuusi tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Kit (Promega, Madison, WI, USA). Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus normalisoitu arvoa vastaan ​​Renilla Lusiferaasisignaali.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

RNA eristettiin näytteistä käyttäen TRIzol (Invitrogen). RNA käänteisesti cDNA: ksi käyttäen SuperScriptII käänteistranskriptaasia (Invitrogen) mukaan aiemmin julkaistujen menetelmien [26]. Koettimet ja alukkeet suunniteltiin käyttämällä Universal Probe Kirjastot (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Reaktioseos koostui 0,4 ul: forward-aluketta (10 uM), 0,4 ul taaksepäin-aluketta (10 uM), 10 ui LightCycler master mix, 4 ui autoklavoitiin Milli-Q-vettä, 0,2 ui koetinta ja 5 ui cDNA: ta. Reaaliaikainen PCR suoritettiin My IQTM2 Real Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Geenispesifisiä alukkeita ja koettimia käytetään tutkimuksessa on lueteltu taulukossa 1. Suhteelliset mRNA-transkriptien geenien tutkittiin normalisoitiin tasoon sisäisen valvonnan transkriptio GAPDH.

Anchorage riippumattomaan kasvuun

Soft agarissa pesäkkeiden määritystä käytettiin määrittämään ankkurointi riippumaton kasvu EBV-tartunnan ja infektoitumattomiin soluihin. Pohja agar (0,6%) valmistettiin sekoittamalla 6% Bacto-agar ja väliaineessa 01:09 suhteessa. Kaksi ml ylemmän agaria (0,3%) sekoitetaan 1 x 10

5-solut maljattiin sitten päälle pohjan agar. Koot pesäkettä 3 viikon kuluttua inkubaation. Vain pesäkkeitä 0,2 millimetriä laskettiin. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmen kuopan.

tuumorigeenisyyden määrityksessä nude-hiirissä

C666-1-soluja (1 x 10

6 solua) ektooppisesti ekspressoivat IL-6R-kerättiin ja suspendoitiin 50 ul: aan PBS: ää, ja sekoitetaan sitten yhtä suuren tilavuuden Matrigel

™ tyvikalvon Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Kokonaistilavuus 100 ui solususpensiota injektoitiin kylkeen 6-8 viikkoa vanhojen urospuolisten nude-hiirten. Kun kasvaimen kasvua on perustettu, kasvaimen kokoa mitattiin joka toinen päivä. Kasvaimen tilavuus (keskiarvo ± SD) laskettiin pituus x leveys

2/2 [31].

MTT-määritys

Lyhyesti, 1 x 10

3 solua kuoppaa kohti ympättiin 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin yön yli. Tämän jälkeen kasvualusta korvattiin RPMI, joka sisälsi 1% FBS: ää kanssa tai ilman ihmisen rekombinantti-IL-6 ja inkuboitiin edelleen varten ilmoitettuina ajankohtina. Sen jälkeen 20 ui MTT-leimausreagenssia (5 mg /ml PBS: ssä, Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen lisättiin 200 ui DMSO: liuottamiseksi formatsaanikiteet. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm käyttäen monilevylukija (Merck Eurolab, Dietikon, Sveitsi). Kukin datapiste edustaa keskiarvo ± SD kolmesta kaivojen kohti hoitoryhmässä.

immunohistokemia

Tissue mikrosiru (TMA), joka sisältää ohjaus- ja NPC kudosnäytteet saatiin NPC kudospankkia perustama Center for nenänielusyöpä Research (RGC rahoitetaan Area of ​​Excellence teema). Osastossa immunohistokemia poistettiin vaha ksyleenillä ja niihin lisätään arvostellaan alkoholia. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla liukuu 3% vetyperoksidia 10 minuutin ajan. Antigeenin haku, kaikki laseja inkuboitiin 10 mmol /l sitraattipuskuria (pH 6,0) ja 93 ° C: ssa 10 min, ja jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan. Tämän jälkeen leikkeet huuhdeltiin PBS: llä ja käsiteltiin normaaliin esto seerumin (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) 30 minuutin ajan. Anti-humaani IL-6-vasta-aineen ja anti-humaani IL-6R-vasta-aineita (Santa Cruz) laimennettuna PBS: ään (1:100) levitettiin osiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Huuhtelun jälkeen, kaikki osastot inkuboitiin edelleen 1 h biotiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen ja piparjuuriperoksidaasiin konjugoitu streptavidiini seuraa kromogeenin, diaminobentsidiinillä (Dako). Counterstaining suoritettiin hematoksyliinillä ennen kuivumista ja asennusta. Negatiiviset kontrollit tehtiin lisäämällä estävän peptidin korvata sitoutuminen ensisijaisen vasta-aineita antigeeneille.

ELISA IL-6

Kiertävä pitoisuudet IL-6 seerumeista valvonnan ja NPC potilaiden ja supernatantit solulinjoja kvantitoitiin käyttämällä ELISA-määritystä varten IL-6 (R 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä koko tämän tutkimuksen.

Tulokset

EBV-infektio ikuistettu nonyylifenolietoksylaattia solujen parannettu vastauksensa STAT3 aktivaation aiheuttamien IL -6

Olemme aiemmin raportoitu vakaiden EBV infektion telomeraasiestäjä kuolemattomiksi NPE solulinja (NP460hTert) [24]. Kun tutkittiin vasteita IL-6, havaitsimme, että EBV-tartunnan NP460 (NP460hTert-EBV-solut) johdonmukaisesti näytetään paljon korkeampi p-STAT3 (Tyr 705) verrattuna terveille NP460hTert soluihin, kun IL-6 altistuksen (kuvio 1A ). Olimme myös pystyä näyttämään jatkuvaa induktion p-STAT3 at pidemmän aikaa pistettä, kun IL-6 hoitoa (kuvio 1 B). P-STAT3 voitiin havaita jopa 12 tunnin in EBV-infektoituneissa soluissa (kuvio 1 B). Vuonna ohjaus infektoitumattomiin soluihin, taso p-STAT3 jo palannut perustasolle 0,5 tuntia (kuvio 1A ja B). Tämä havainto tukee edelleen, että IL-6-indusoidun STAT3 aktivointi on paljon tehostua EBV-infektoituneissa soluissa verrattuna infektoimattomiin niistä. Pystyimme vahvistaa tehostetun aktivoinnin STAT3 IL-6 hoitoa NP460hTert-EBV soluissa tumaansiirtymiseen p-STAT3 (kuvio 1 C), mikä osoittaa hyperactivation of STAT3 IL-6 EBV-tartunnan NPE soluissa, mutta ei EBV-negatiivinen vastine. Tämä parannettu aktivointi STAT3 IL-6 hoitoa NP460hTert-EBV-solujen varmistettiin lisäksi EMSA (kuvio 1 D). Spesifisyys EMSAn STAT3 aktivointia vahvistettiin su- STAT3 /DNA-kompleksi sitoutumisen jälkeen spesifistä vasta-ainetta STAT3 (kuvio 1 E). Tehostaminen IL-6-aiheuttama STAT3 aktivaatio havaittiin myös toisessa kuolemattomaksi nonyylifenolietoksylaattia solulinja, NP550-cyclinD1-hTERT (äskettäin kuolemattomiksi yhdistetty toiminta hTERT ja sykliini D1; käsikirjoitus valmisteilla) (kuvio 1 F). Parannettu STAT3 aktivoituminen havaittiin myös EBV-tartunnan NPC solulinja, CNE2, vaikka vähemmässä määrin (kuvio 1G), kun verrattiin kuolemattomaksi NPE solulinjoissa. Mitä korkeampi taso p-STAT3 syöpäsoluissa jälkeen IL-6 hoito saattaa selittää heikomman vastaus tehostetun STAT3 aktivoinnin jälkeen EBV-infektio. Tämä heikompi vaste EBV-tartunnan CNE2 osoitettiin kokeiden toisto. Yhdessä läsnä EBV-infektio (sekä EBV-tartunnan NPE ja EBV-tartunnan NPC-solut), IL-6 indusoi hyperactivation of STAT3.

EBV-tartunnan ja infektoitumattomien NP460hTert soluja käsiteltiin IL-6: ssa 50 ng /ml (A) 10, 20 tai 30 minuuttia, ja (B) 0,5, 1, 2, 4, 8 tai 12 tuntia. Kokosolulysaateille valmistettiin ja ilmentyminen p-STAT3 (Tyr 705) analysoitiin Western blot. Yhteensä STAT3 havaittiin kontrollina Proteiinilisäyksen. (C) Tumauutteet valmistettiin EBV-tartunnan ja infektoitumattomien NP460hTert solujen kanssa tai ilman IL-6 hoitoa (50 ng /ml 30 minuutin ajan), ja suoritettiin Western blot-analyysi p-STAT3 ilmentymistä. Histoni 1 havaittiin kontrollina ydin- ote lastaus. (D) kokosoluproteiinikuviot lysaatit valmistettiin käsittelyn jälkeen IL-6 osoitetun ajan ja altistettiin sitten EMSA-analyysi käyttäen biotiini-leimattua hSIE koetinta (joka sisältää STAT DNA: ta sitova elementit). For ”kylmä” kilpailu, uutteet esi-inkuboitiin leimaamattoman hSIE koetin 200-kertainen molaarinen ylimäärä 20 minuuttia ennen analyysiä. (E) Minkään supermuutoksena määritys suoritettiin inkuboimalla uutetta anti-STAT3-vasta-ainetta 30 minuutin ajan, ennen kuin EMSA-analyysi. STAT3 erityinen supershifted kompleksi havaittiin jossa vahvistettiin spesifisyys EMSA tehostetun STST3 aktivaation EBV-tartunnan NP460hTert IL-6 stimulaatiota. (F) NP550-cyclinD1-hTERT ja EBV-tartunnan NP550hTert-cyclinD1 oli joko käsitelty tai ei käsitelty IL-6: ssa lopulliseen pitoisuuteen 50 ng /ml 30 minuutin ajan. Ekspression p-STAT3 (Tyr 705) analysoitiin Western-blottauksella. STAT3 ilmentyminen seulottiin kuten latauskontrollina proteiineja. (G) CNE2 ja EBV-tartunnan CNE2 solut joko käsiteltiin tai ei käsitelty IL-6: ssa lopulliseen pitoisuuteen 50 ng /ml 30 minuutin ajan. Ekspression p-STAT3 (Tyr 705) analysoitiin Western-blottauksella. STAT3 ilmentyminen seulottiin kuten latauskontrollina proteiinien eri solupopulaatioiden.

IL-6R-yli-ilmentyminen on osallisena voimistaa IL-6-välitteistä STAT3 aktivaation EBV-tartunnan kuolemattomiksi NPE-solujen

Seuraavaksi tutkimme oleva mekanismi tällaisen parannetun vasteen EBV-tartunnan NPE solujen IL-6. Kuten IL-6 Ilmaisee signaloinnin kautta solun pinnalla suorassa vuorovaikutuksessa IL-6R, tutkimme IL-6R: n EBV-tartunnan NPE soluissa ja infektoitumattomien kanssa. Yllättäen, yli-ilmentyminen IL-6R-proteiinin sekä kohonneeseen IL-6R-mRNA-transkriptit havaittiin Western-blottauksella ja reaaliaikaisella PCR: llä, vastaavasti, NP460hTert-EBV-solut (kuvio 2A 2B). Mielenkiintoista on, että proteiinin tasolla IL-6R ei ollut suoraan suhteessa sen transkriptin tasolla. Kuitenkin proteiinin taso tietyn geenin ei voi olla täysin riippuvainen transkription tasolla. Ilmentymistason tiettyä proteiinia, voidaan myös säädellä translaation jälkeisen hajoamisen. Lisäksi yli-ilmentyminen IL-6R-retroviruksen geeninsiirron NP460hTert soluissa myös siirrettävä tehostettua vastata IL-6-indusoidun STAT3 aktivaation (kuvio 2C). Lisäksi parannettu STAT3 aktivointi IL-6 NP460-EBV-soluja voidaan neutraloida anti-IL-6R-vasta-aineen käsittelystä (kuvio 2D). Kaikki nämä tulokset osoittivat, että IL-6R yliekspressio NP460hTert-EBV soluilla on keskeinen rooli välittämisessä tehostetussa reagointikykyä STAT3 aktivointi IL-6 hoitoa.

(EN) IL-6R: EBV infektoiduista ja infektoimattomien NP460hTert solut analysoitiin Western blotilla. Immunoblottauksella varten β-aktiini palvelee proteiini latauskontrollina. (B) Kokonais-RNA uutettiin ja ekspressiotasot IL-6R-mRNA: n NP460hTert ja NP460hTert-EBV-solut analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikainen RT-PCR: llä. MRNA-tasot IL-6Rα normalisoitiin solun GAPDH mRNA. Tiedot kerättiin kolmena erillisen kokeen. *

p

0,05

. (C) NP460hTert solut infektoitiin retroviraaliekspressiovektoreiden, pBabe-IL-6Rα tai pBabe tyhjiä vektoreita. Transdusoitu stabiilisti soluja käsiteltiin IL-6 50 ng /ml 30 minuutin ajan. Solulysaatit valmistettiin ja tutkittiin IL-6Rα ja p-STAT3 (Tyr 705) Western blot. Immunoblottings varten STAT3 ja β-aktiini näkyvät säätimet Proteiinilisäyksen. (D) NP460hTert ja NP460hTert-EBV-soluja esi-käsiteltiin anti-IL-6R-vasta-ainetta 5 ug /ml 30 minuuttia ennen IL-6 hoitoa. Ekspression p-STAT3 analysoitiin Western blot. Immunoblottaus täydellistä tasoa STAT3 proteiinin näkyy valvonta Proteiinilisäyksen. (E) jälkeen EBV-infektio, EBV-tartunnan NP460hTert soluissa ja sen infektoimattomat vanhempien solut jatkuvasti jatkoviljeltiin. Solut lysaatit valmistettiin soluista, jotka oli kuljetettiin 56, 99 ja 133 kertaa (nimetty varhainen, keski ja myöhäinen passage). Ekspression IL-6R analysoitiin Western-blottauksella. Immunoblottauksella varten β-aktiini sisällytettiin kontrolli Proteiinilisäyksen. (F) tasot IL-6R-ilmentymisen soluissa havaittiin Western blot useita pariksi infektoimattomissa ja EBV-tartunnan solulinjoissa, mukaan lukien EBV-tartunnan ja ei-tartunnan paria NP460hTert, NP550-CDK4-hTERT, NP361-cyclinD1- hTERT, NP550-cyclinD1-hTERT. β-aktiini lausekkeita näytettiin proteiinimäärän ohjaus.

pyrkivät sitten tutkia IL-6R: n yli-ilmentyminen oli suora seuraus EBV-infektion tai seurauksena asteittainen valinta EBV-tartunnan NP460hTert solut yli-ilmentävät IL-6R upon pitkittynyt kohtia. Ilmentymistasojen IL-6R: n eri kohtia EBV-tartunnan ja infektoitumattomien NP460hTert soluja verrattiin. Havaitsimme hyvin maltillista IL-6R ilmaisun varhaisessa kulkua EBV-tartunnan NP460hTert soluissa, ja siellä oli asteittainen kasvu IL-6R ilmentymistä NP460hTert-EBV-solujen upon pitkäaikainen kulttuuri (kuvio 2E). Huomaa, että tällainen muutos on IL-6R-tasoja ei havaittu infektoitumattomassa NP460hTert solujen yli pitkittynyt viljelmät (kuvio 2E). Tämä viittasi voimakkaasti siihen, että yli-ilmentyminen IL-6R on selektiivisiä kasvua etu EBV-tartunnan saaneiden NP460hTert soluja ja aktiivisesti valittu viljelmässä. Yli-ilmentyminen IL-6R havaittiin myös kolmessa muussa vakaasti EBV-tartunnan kuolemattomaksi NPE solulinjoja äskettäin perustettu laboratoriossamme yhdistetyn toimia telomeraasin kanssa CDK4 tai sykliini D1 (NP550-CDK4-hTERT-EBV; NP361-cyclinD1-hTERT-EBV , NP550-cyclinD1-hTERT-EBV) [25], mutta ei terveillä kollegansa (NP550-CDK4-hTERT; NP361-cyclinD1-hTERT; NP550-cyclinD1-hTERT) (kuvio 2F). Yksityiskohtaiset ominaisuudet Näiden äskettäin kuolemattomaksi nonyylifenolietoksylaattia solulinjoja julkaistaan ​​erikseen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen IL-6R on selektiivisiä kasvua etu EBV-tartunnan nonyylifenolietoksylaattia solujen ja aktiivisesti valitaan pitkien kohtia.

konstitutiivisen aktivaation STAT3 voimistaa kasvua ja pahanlaatuisten ominaisuuksien EBV-infektoitujen solujen

pyrittiin tutkimaan joitakin biologisen tärkeyden aktiivisen valinnan IL-6R ilmentymistä EBV-tartunnan NPE soluissa. Yksi hypoteesi on, että EBV-infektio voi aiheuttaa stressiä kuolemattomaksi nonyylifenolietoksylaattia soluihin [5] ja STAT3 aktivointi voi voittaa stressistä johtuvaa kasvun pysähtymisen nonyylifenolietoksylaattia soluissa jälkeen EBV-infektion ja edistää niiden selviytymistä. Aktivointi STAT3 tiedetään aktivoida joukko alavirran kohde tapahtumia voimistaa kasvua ja pahanlaatuisten ominaisuudet syöpäsolujen [16]. Siksi tutkittiin jos STAT3 aktivointi voi voimistaa kasvua ja pahanlaatuisten ominaisuudet EBV-tartunnan NPE soluissa. Määräävässä asemassa olevan jatkuvasti aktiivisen mutantin muodossa STAT3 (STAT3C) transfektoitiin EBV-tartunnan ja infektoitumattomien NP460hTert soluja, jotta saavutetaan konstitutiivisen aktivaation STAT3 (kuvio 3A). Pystyimme tarkkailla maltillista ekspression c-myc: n ja Bcl-2, mukaisesti konstitutiivisen aktivaation STAT3: EBV-infektoituneissa soluissa verrattuna ohjata infektoimattomia soluja (kuvio 3A). IL-6 hoitoa yllä myös pidempi ja vahvempi ilmaisu sykliini D1 EBV-infektoituneissa soluissa (kuvio 3B). Densitometrisesti käytettiin analyysiin sykliini D1 tasolle 0,5, 1, 2, 4 tunnin (t) EBV-infektoiduissa soluissa ja infektoitumattomien solujen jälkeen IL-6-hoitoa. Sykliini D1 taso on yliaktiivista IL-6-käsiteltyjen EBV-infektoituneissa soluissa 2 taittuu 4 tunnin kohdalla (kuvio 3B). Sen sijaan, sykliini D1 tasolla IL-6-käsitellyn ei-infektoidut solut vain marginaalisesti voimistunut 0,5 tunnin ajan, ja enää lisätä muita ajankohtina (kuvio 3B). Tämä data viittaa siihen, että IL-6 voi differentiaalisesti nostaa ilmaisun sykliini D1 EBV-infektoiduissa soluissa, mutta ei ei-infektoiduissa soluissa. Mielenkiintoista, konstitutiivinen aktivoituminen STAT3 mukaan STAT3C ilmaisu myös tehosti invasiivisia ominaisuuksia NP460hTert-EBV verrattuna ohjaus infektoimattomien NP460hTert solut analysoituna Matrigel invaasiomääritys (kuvio 3C). Lisäksi IL-6 käsittely parantaa myös invasiivista ominaisuudet NP460hTert-EBV-soluja (kuvio 3D). Konstitutiivisen aktivaation STAT3 mukaan STAT3C ilmentyminen NP460hTert-EBV soluissa indusoi myös vankka kiinnityspiste riippumattomaan kasvuun pehmeässä agarissa, mikä viittaa rooli STAT3 aktivaation edistämiseksi tuumorigeenisia muutosta EBV-tartunnan kuolemattomaksi NPE soluissa (kuvio 3E). Numerot sekä koot kiinnityspisteen itsenäisen siirtomaat STAT3C ilmentävien NP460hTert-EBV-solut lisääntynyt verrattuna ohjata solujen tartunnan tyhjän pBabe vektorin (kuvio 3E). Kaikki nämä havainnot osoittivat, että STAT3 aktivointi parantaa kasvua ominaisuuksia EBV-tartunnan kuolemattomaksi NPE soluja, mikä saattaa selittää valintaa IL-6R yliekspressio fenotyypin EBV-tartunnan NPE solut tekevät niistä enemmän alttiita IL-6 aiheuttama STAT3 aktivointi.

(A) c-Myc ja Bcl-2 indusoitiin STST3-C ilmentymistä NP460hTert ja NP460hTert-EBV soluissa. FLAG-merkitty STAT3-C transdusoitiin ja valittiin NP460hTert ja NP460hTert-EBV soluissa. Western blotting-analyysi paljasti ekspressiota FLAG osoittaa onnistuneen ilmentymisen STAT3C. Expression of c-myc: n ja Bcl-2 indusoitui sekä NP460hTert ja NP460hTert-EBV-soluissa, sen jälkeen STAT3-C ilmentymistä. (B) Tehostettu ekspressio sykliini D1 IL-6-käsitellyn NP460hTert-EBV-solujen havaittiin kontrollieläimiin verrattuna NP460hTert soluihin. Soluja käsiteltiin tai ei käsitelty IL-6: ssa lopulliseen pitoisuuteen 50 ng /ml määritettynä ajankohtana. Vasemmassa paneelissa, ilmaus sykliini D1 analysoitiin Western blottauksella proteiinin ilmentymisen. Oikeanpuoleisessa paneelissa, densitometrisesti käytettiin määrällisesti ilmaisua sykliini D1 viitaten aktiini. Pitkäaikainen ilmentyminen sykliini D1 havaittiin IL-6-käsiteltyjen EBV-infektoiduissa soluissa, mutta ei IL-6-käsiteltyjen NP460hTert soluissa. (C) STAT3-C-ilmentävien NP460hTert ja NP460hTert-EBV-solut osoittivat parannettu invasiivisuus verrattuna vektorisäädön soluihin. Invasiivisen kyky mitattiin laskemalla solujen lukumäärä, jotka kulkivat Matrigel-päällystetty kalvo 24 tunnissa. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmen kuopan kolminkertaisista kokeista. *,

#

p

0,05. (D) IL-6 hoito tehostetun cell invasion of NP460hTert-EBV-solujen

in vitro

. NP460hTert-EBV-solut ladattiin ylempi hyökkäyksen kammion kanssa tai ilman käsittelyä IL-6 (50 ng /ml). 24 tunnin kuluttua solut tunkeutuu alempaan kammioon värjättiin ja laskettiin. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmen kuopan kolminkertaisista kokeista. *

p

0,05. (E) pBabe vektori ohjaus- ja STAT3-C-ilmentäviä soluja (1 x 10

5) maljattiin pehmeässä agarissa. Kolme viikkoa myöhemmin, kuvia pesäkkeiden otettiin. Pesäkkeitä, joiden läpimitta (≥0.2 mm) laskettiin. Pesäkkeiden lukumäärät on esitetty ovat keskiarvoja ± SD kolminkertaisista tuloksia. *

p

0,05

IL-6 ylössäätelee LMP1 ilmentymistä EBV-tartunnan nonyylifenolietoksylaattia ja NPC solujen

Olemme aiemmin raportoitu, että STAT3 aktivaatio voisi upregulate LMP1 *

p

0,05. *

p

0,05. *

p

0,05.