Krooninen sairaus

tiivistelmä

ylimääräinen biologinen monimuotoisuus trooppisten metsien satamiin rikas kemiallinen monimuotoisuus on valtava potentiaali lähteenä uusien bioaktiivisten yhdisteiden. Erityisen mielenkiintoisia ovat uudet ympäristöjä mikrobien löytö. Sloths – puissa nisäkkäät esiintyy yleisesti lowland metsissä Panama – kuljettaa monenlaisia ​​mikro- ja makro-organismien niiden karkea ulompi hiukset. Kirjoittajat raportoivat ensimmäistä kertaa eristämisen monipuolinen ja bioaktiivisia kantoja sieniä saamattomuus hiukset, ja niiden taksonominen sijoitus. Kahdeksankymmentä-neljä isolaatit sieniä saatiin kulttuurin pinnalta hiukset, jotka kerättiin elävä kolmivarpaisia ​​sloths (

Bradypus variegatus

, Bradypodidae) in Soberanian National Park Panaman tasavallassa. Phylogenetic analyysit paljastivat monipuolinen joukko Ascomycota kuuluvien 28 erillistä operatiivisten taxonomic yksikköä (Otus), joista useat ovat poikkeavat aikaisemmin tunnettuja taksonien. Seitsemänkymmentäneljä isolaatteja viljellään liemi ja raa’at uutteet testattiin bioaktiivisuuden

in vitro

. Löysimme monenlaisia ​​toimia vastaan ​​kantojen loisia, jotka aiheuttavat malarian (

Plasmodium falciparum

) ja Chagasin tauti (

Trypanosoma cruzi

), ja vastaan ​​ihmisen rintasyövän MCF-7 . Viisikymmentä sieni uutteet testattiin antibakteerinen aktiivisuus uudessa antibiootti profiilin näytön nimeltään BioMAP; Näistä 20 oli aktiivisia vähintään yhtä bakteerikantaa, ja yksi oli epätavallisen bioaktiivisuuden gram-negatiivisten bakteerien, joka viittaa mahdollisesti uusi toimintatapa. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että on tärkeää tutkia uusia ympäristöjä bioaktiivisten sieniä, ja osoittaa ensimmäistä kertaa Taksonikoostumus ja bioaktiivisuus sieniä laiskuuden hiukset.

Citation: Higginbotham S, Wong WR, Linington RG, Spadafora C , Iturrado L, Arnold AE (2014) laiskiainen Hair uutena lähteenä Sienet kanssa voimakas anti-Loisperäiset, Anti-Cancer ja antibakteerinen bioaktiivisuus. PLoS ONE 9 (1): e84549. doi: 10,1371 /journal.pone.0084549

Editor: Joy Sturtevant, Louisiana State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 15 marraskuu 2013; Julkaistu: 15 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Higginbotham et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Kansainvälinen Cooperative Biodiversity ryhmät ohjelma (ICBG-Panama https://www.icbg.org/myöntää numero 2 U01 TW006634-06) ja College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta valtava nousu menot kansainvälisessä terveydenhuollon viimeisten 20 vuoden aikana, tartuntataudit muodostavat edelleen valtavan taakan globaaliin terveyteen [1]. Krooninen infektiotaudit, kuten malarian ja monipuolinen laiminlyötyjä trooppisia sairauksia (NTDS) vaikuttavat miljoonia ihmisiä joka vuosi, pääasiassa naisia ​​ja lapsia kehitysmaissa [2]. Nopea leviäminen antibioottiresistenssin on pienentänyt arsenaalia hoitoon monet tartuntataudit, jossa Viime aikoina pandrug resistenssin saadaan sairauksia, jotka ovat vastahakoiset hoitoon tahansa tunnetun huumeiden [3]. Samalla ei-tarttuvat taudit nousevat esiintyvyyttä verrattuna tartuntatautien: 2008 syöpä vastasi noin 7,8 miljoonaa kuolemantapausta (noin 13% kaikista kuolemantapauksista maailmassa; [4]).

Luontaistuotteet ovat yksi merkittävimmät lähteet uusien lääkkeiden tänään. Noin 50% kaikista lääkkeistä käyttöön vuosina 1981 ja 2006 oli luonnon tuotteen alkuperän [5], ja lisäksi 34 luonnontuote-pohjainen huumeiden käynnistettiin vuosina 1997 ja 2007 [6]. Koska löytö penisilliini yli 80 vuotta sitten, sienet ovat vaikuttaneet valtavasti luonnontuote lääkekehityksen, joka tarjoaa lukuisia korvaamaton lääkkeitä kuten β-laktaami antibiootit, griseofulviini, siklosporiini, fusidiinihappo, ja lovastatiini [7]. Kuitenkin viime vuosina osuma-korko bioaktiivisuus sienistä on hidastunut, mahdollisesti osoittaen lähestyvästä sammumiseen ”alhainen roikkuu hedelmiä” – sen helposti ja usein käytettyjen sienet, kuten maaperän mikrosienet – lähteinä uusien bioaktiivisten metaboliittien.

Yksinkertainen arvioiden mukaan kokonaismäärä sienilajien olemassa yli 5000000, mutta vähemmän kuin 100000 sienilajien on kuvattu [8], [9]. Tämä viittaa siihen, että tutkitaan uusia ympäristöjä, jotka voivat olla koti aiemmin aiemmin kuvaamaton sienet voivat olla erittäin tuottavia. Esimerkiksi viimeaikainen tutkimus trooppisten sieni endofyytit on kuvattu trooppinen lehdet kuin ”monimuotoisuuskeskus” [10], [11], [12], että on osoittautunut hedelmälliseksi lähteenä uuden bioaktiivisia yhdisteitä (katso [13] tarkistamista) .

Gloer [14] ehdotetaan, että tuotannon sekundäärimetaboliitteja sienten voidaan vaikuttaa selektiivisesti paineet opetetaan muihin organismeihin. Tämä viittaa siihen, että ympäristössä, jossa monia eri lajeja esiintyy lähellä saattaa olla erityistä potentiaalia lähteinä bioaktiivisten metaboliittien. Yksi tällainen tutkimaton ympäristö on sieni microbiome liittyvät karkean, sienimäinen hiukset kolmivarvaslaiskiaiset (

Bradypus variegatus

), arboreal nisäkäs esiintyy yleisesti lowland sademetsien Keski-Amerikassa.

turkki kolmivarpaisia ​​sloths koostuu kahdesta erillisestä kerroksesta: sisempi kerros hienoa, pehmeä karva lähellä ihoa, ja ulompi kerros karkeaa karvat, jotka ovat poikkileikkaukseltaan soikea ja noin 0,4 mm leveä [ ,,,0],15]. Nämä peitinkarvassa kantaa poikittaiset halkeamat, jotka ovat koti näennäisesti kaikkialla läsnä vihreä levä, yleisimmin suvun

Trichophilus

[16]. Levä on tavallisesti ajatellaan säätää naamiointi varten sloths vastaan ​​kirjava tausta niiden elinympäristön, mutta tämä ei ole vahvistettu tietoja. Suutari

et al.

[16] ehdotetaan, että exopolymeric aineita, joita levä voisi rohkaista kasvua hyödyllisiä bakteereja. Laiskuus hiukset on yleisesti asuu syanobakteerien ja piilevät, samoin kuin erilaisia ​​makro-organismien (esim torakat, sukkula, ja koi toukat; [16]). Kuitenkin vähän tiedetään yhteisöjä sienten laiskuuden hiukset.

pyrki paljastaa uusia lähteitä huumeita hoitoon vektorivälitteisten tautien, syöpä, ja bakteeri-infektioita, käytimme kulttuuri lähestymistapa tutkia sieni yhteisöt liittyvät karkea, ulompi hiukset

Bradypus variegatus

Panama. Kirjoittajat raportoivat eristäminen sienistä kanssa bioaktiivisuuden vastaan ​​

Trypanosoma cruzi

, syy asiamiehen Chagasin tauti;

Plasmodium falciparum

, syy agentti malarian; ihmisen rintasyövän MCF-7; ja erilaisia ​​gram-negatiivisia ja gram-positiivisia ihmisen patogeenisten bakteerien. Phylogenetic analyysejä käytettiin tunnistamaan näitä sieniä hienompaa ja vankempaa tasolla kuin on mahdollista käyttää tyypillinen tietokanta-matching menetelmiä yksin. Tuloksemme viittaavat siihen, että laiskiainen hiukset on mielenkiintoinen uusi lähde tärkeitä bioaktiivisia sienten paljon mahdollisuuksia tutkia viittä muuta säilynyt laiskiainen lajeja poikki neotropics.

Materiaalit ja menetelmät

Hyväksyntä näytteenottoon laiskuuden hiusten saatiin Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Smithsonian Tropical Research Institute ja keräys luvat saatiin Panaman autoridad Nacional del Ambiente (ANAM). Yksi näyte karkea ulompi hiukset kerättiin noin alaselän kunkin yhdeksän elävän kolmivarpaisia ​​sloths kohtasi 2011 helmikuussa varrella Pipeline Road Soberanian National Park, Panaman tasavalta (N 9 ° 9 ’, W 79 ° 44’ [17]). Hair näytteet sijoitettiin steriileihin Falcon-putkiin puoli jossa on silikageeliä ja varastoida huoneenlämmössä jalostukseen asti.

eristäminen ja viljely sieniä

Jokainen hiukset huuhdeltiin steriilillä vedellä poistaa roskat ja löyhästi liittyvien mikro-organismeja. Aseptisissa olosuhteissa hiuksia leikattiin paloiksi noin 2,5 cm pitkä ja asetetaan pinnalle perunadekstroosiagaria (PDA) tai 2% mallasaga- (MEA) steriiliin Petri levyt. Levyt suljettiin Parafilmillä, inkuboitiin huoneenlämmössä, ja tarkistetaan uusien sienen kasvun vuorokaudessa 2 viikon ajan. Rihmastoa leikattiin aseptisesti kultakin levyltä ja siirrettiin axenic kulttuuriin samalla välineellä. Bakteerin tallennetaan olo seteleitä huoneenlämmössä (ts kuten agar tulpat kanssa rihmastoa steriilissä tislatussa vedessä) ja on arkistoitu keräämisessä International Cooperative biologista monimuotoisuutta Group (ICBG) Smithsonian Tropical Research Institute Panama (liittymiset saatavana pyynnöstä).

Sieni tunnistaminen

Yhteensä genomista DNA: ta uutettiin tuoreista viljelmistä sienet mukaan Arnold Lutzoni [11]. Ydin- ribosomaalinen sisäinen transkriptio- välilevyt ja 5.8S geenin (ITSrDNA) ja viereisen osan ydin- ribosomaalisen suuren alayksikön (LSUrDNA) monistettiin yhtenä fragmentti käyttäen alukkeita ITS1F tai ITS5 ja LR3 seuraavat Hoffman

et al.

[18]. PCR-tuotteet visualisoitiin käyttämällä SYBR vihreä elektroforeesin jälkeen 1% agaroosigeelillä ja toimitetaan Arizona yliopisto Genetics Core uudelleenjärjestäminen, normalisoinnin ja kaksisuuntainen Sanger sekvensoinnilla. Sekvenssit koottiin automaattisesti ja emäkset kutsutaan käyttämällä

Phred

ja

phrapilla

[19], [20] kanssa orkestrointi by Mesquite [21], sen jälkeen manuaalinen editointi Sequencher 4,5 (GcneCodes Corp.) . Sekvenssejä verrattiin vastaan ​​NCBI ei-tarpeeton tietokantaan BLASTIN [22] arvioida taksonominen sijoitus ja toimitettiin GenBank alle liittymistä nos. KF746076-KF746159 (taulukko S1).

Koska tunnistus perustuu vain BLAST ottelut on käsiteltävä varoen (esim [23]) käytimme fylogeneettinen analyysejä voitaisiin tarjota entistä päättelyyn suhteen taxonomic kuuluminen. Sequence tiedot 84 sieni isolaatteja ladattiin yhtenä ryhmänä osaksi Mesquite [21] ja linjassa MUSCLE [24]. Tuloksena linjaus, joka tunnistaa klustereita helposti saatettavissa kohdakkain sekvenssit, oli sopimatonta yhden fylogeneettiseen analyysin takia esiintyvyys epäselvä ja unalignable alueilla. Sekvenssit, jotka kohdistettu johdonmukaisesti toisiinsa jaettiin ryhmiin ilmeisesti läheistä sukua olevista kannoista. Tuloksena ryhmät analysoitiin erillisinä aineistoja seuraavasti: Kaikki sekvenssit kussakin ryhmässä verrattiin vastaan ​​NCBI-tietokanta käyttäen BLASTN. Top 50 osumia jokaisen sekvenssin ladattu ja suodatetaan (1) tarpeeton sekvenssit, ja (2) sekvenssit mahdollisesti väärin tunnistettu kantojen ja unvouchered yksilöt (katso [23]). Ainakin yksi sekvenssi luotettavasta kantakokoelmaan sisällytettiin kuhunkin datajoukko, ja yksi tai kaksi outgroups valittiin lajeista läheisesti nimetty sekvensseihin aineisto (valitsema kirjallisuuskatsauksen).

Kukin saatu tietokokonaisuus oli kohdistettu erikseen lihas. Sekvenssit kussakin linjaus trimmattiin johdonmukainen aloitus- ja päätepistettä, ja suuntaus laatu varmistettiin silmämääräisesti Mesquite. Kaikki rinnastukset toimitettiin TreeBASE (https://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S14945). Evoluutiomalliin oli päätellä käyttäen jModeltest [25], [26]. Phylogenetic puita päätellä suurimman uskottavuuden vuonna GARLI [27], joka tukee määritetty 100 bootstrap replikaatissa toteutettu cipres portaalin [28], ja käyttämällä Bayesin menetelmiä MrBayes (käsiksi cipres [28]). Jälkimmäisessä analyysit koostuivat 5 miljoonan sukupolvien neljä ketjua, satunnainen lähtö- puita, ja näytteenotto jokaisen 1000. puu. Täydellisyys arvioitiin perustuen asymptootit on -ln li arvot ja arviointi keskihajontojen split taajuuksia. Posterior todennäköisyydet edellyttäen inferentially riippumattomia arvoja tukemaan topologinen suhteet ja niihin liittyvät tuki arvot suurimman uskottavuuden analyysejä. Tulokset kunkin fylogeneettinen analyysi verrattiin koskevaa kirjallisuutta kullekin taksonominen ryhmä, jotta suhteet tunnettuja taksonien olivat sopivia, mikä tarjoaa luottamus osalta meidän sijoittamista laiskuuden hiusten sieniä.

valmistaminen sieni otteet

yksi agartulppa kutakin kantaa valittiin lisäanalyysiä siirrettiin steriileissä olosuhteissa tuoreeseen levyyn 2% monoetanoliamiini ja inkuboidaan työtason huoneen lämpötilassa, kunnes noin 50% levy peitettiin rihmaston kasvua. Viisitoista agarpalalla (kukin 5 mm halkaisijaltaan) leikattiin steriilillä korkkiporaa steriileissä olosuhteissa ja siirrettiin pulloihin, jotka sisälsivät 37 ml 2% mallasuutetta liemi (MEB). Pulloja inkuboitiin tasoravistelijalla (28 ° C, 125 rpm) 2 viikkoa.

Nestemäisiä viljelmiä sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa etyyliasetaattia ja sekoitetaan 2 minuutin ajan 9000 rpm Polytron (Lauda- Brinkmann, Delran, NJ, USA). Sienibiomassasta poistettiin suodattamalla vakuumissa Whatman suodatinpaperin (# 1), ja suodos uutettiin kahdesti 01:01 tilavuuden etyyliasetaattia. Vesipitoinen kerros heitettiin pois, ja orgaaninen kerros kuivattiin ja varastoitiin -80 ° C: ssa.

Biotestejä

Raaka orgaaniset uutteet sieni-viljelmiä käytettiin biologisissa määrityksissä vastaan ​​polttoväli kantoja aiheuttavat mikrobit malaria (

Plasmodium falciparum

) ja Chagasin tauti (

Trypanosoma cruzi

), ja rintasyöpää vastaan ​​MCF-7, kuten on kuvannut Higginbotham

et al

. [29]. Bioaktiivisuus uutteet, jotka oli laimennettu DMSO: hon (10 ug /ml), mitattiin kasvun hidastuminen prosentteina (% IG) verrattuna negatiiviseen kontrolliin (DMSO ilman uutetta, 0% IG).

BioMAP analysoi

antibiootti vaikutusprofiili näyttö, BioMAP (Anti

bio

tic

m

oodi

ction

p

ROFILE; [30]), käytettiin testaamaan aktiivisuutta 50 raakaa orgaaniset uutteet vastaan ​​15 ihmisen patogeenisten bakteerien. Uutteet voimakkaiden bioaktiivisuuden laimennettiin sarjaksi (16 2-kertaisia) ja uudelleen seulottiin sama paneeli bakteereita. Kasvukäyrät piirrettiin kirjaamalla OD

600 arvot tunnin välein 24 tunnin ajan ja pienin (MIC) myöhemmin laskettiin jokaiselle otteen. Perustamaan riippumaton pitoisuudesta bioaktiivisuusprofiileja jokaisen otteen, raaka MIC-arvot normalisoituivat tuloksena arvoalueella 0 (ei käytössä) 1 (useimmat bioaktiivisten). Nämä toiminta profiileja verrattiin sitten profiileja tunnettuja antibiootteja kuuluvat kaikki suuria rakenteellisia luokkia. Tämä menetelmä on tehokas ennustaa rakenneluokka tuntemattomien antibiootti yhdisteiden monimutkainen tai Raakaseokset [30].

Tulokset ja keskustelu

Yhteensä 84 sieni isolaattien tarkasteltiin karkea ulompi hiukset yhdeksän elävät yksilöt kolmivarvaslaiskiaiset (

Bradypus variegatus

) kohtaamansa Pipeline Road Soberanian National Park Panaman tasavallassa. Hiusten näytteet kuljetettiin laboratorioon steriiliin Falcon-putkiin, jotka oli puoli täytetty silikageelillä, kuivausaine, joka on tehokas tallentamiseksi sieni kudoksen [31], [32]. Jokainen pala laiskuuden hiukset sijoitettu agar tuotti useita sieni-isolaattia, jotka edustavat erilaisia ​​morphotypes. Phylogenetic analyysit axenic kantojen paljasti laaja ryhmä sieniä, joista jotkut näyttävät olevan uusia verrattuna aiemmin havaittu tai sekvensoidaan taksonien (taulukko 1, kuvio 1). Monet näistä isolaateista näyttää bioaktiivisuus

in vitro

loisia vastaan, jotka aiheuttavat malarian ja Chagasin tauti, rintasyöpä soluja, ja sekä gram-positiivisia ja gram-negatiivisia ihmisen patogeenisten bakteerien (taulukko 2; taulukko 3).

topologia jokainen puu heijastaa ML analyysi, ja arvot yli oksat osoittavat ML bootstrap arvojen ja Bayesian posterior todennäköisyydet ( 0,50 ja 0,75, vastaavasti). Outgroups ja luokitusjärjestelmän mukaan näytteenotto jokainen puu todensi kirjallisuustutkimusten (katso menetelmät). Taksonominen päätelmät on esitetty taulukossa 1. Kuvio 1 (A): Sijoitus F5073 ryhmässä 17; (B) F4847 ryhmässä 18; (C) F4831a ryhmässä 19; (D) F4819 ryhmässä 20; (E) F4801 ryhmän 5; (F) F4806 ryhmässä 7; (G) F4886 ryhmässä 8; (H) F5071 ryhmässä 15; (I) F4812-F4816, F4830, F4831, F4845, F4852-F4856, F4860, F4873, F4882, F4883 ja F4900-F4902 ryhmään 1. (J) F4803, F4817, F4820, F4823, F4824, F4826, F4827, F4829, F4837, F4841, F4842, F4846, F4848, F4857, F4858, F4861, F4862, F4870, F4872, F4875, F4878, F4879, F4894, F4896 , F4908, F4909, F5069 ja F5074 ryhmässä 2; (K) F4818 ja F4839 ryhmässä 10; (L) F4877, F4890 ja F4897 ryhmässä 11; (M) F4828 ja F4898 ryhmässä 12; (N) F4876 ja F4881 ryhmässä 13; (O) F4863 ja F4884 ryhmässä 6; (P) F4821, F4874, F4889 ja F4913 ryhmässä 3; (Q) F4802, F4807, F4825, F4844, F4906 ja F5068 ryhmässä 4; (R) F4850 ja F4891 ryhmässä 9; (S) F4904 ja F4905 ryhmässä 14; ja (T) F5070 ja F5072 ryhmässä 16.

Fylogeneettinen analysoi

84 sieni- isolaatit olivat 28 operatiivisten taxonomic yksikköä (Otus), joka 95% sekvenssin samankaltaisuus (taulukko 1). Kaksi runsain Otus edusti 34 (40,5%) isolaateista. Loput 50 isolaatit edustivat 26 erillistä Otus.

BLAST vertailuja GenBank edellyttäen alustavia arvioita taksonominen sijoitus ja samankaltaisuutta aikaisemmin sekven- sienet (taulukko 1). Kaikki isolaatit olivat Ascomycota. Neljäntoista isolaateista oli ylhäältä ottelun sivistymätön Fuuga-klooneja ja 23 oli alkuun ottelu viljeltyihin mutta tunnistamattomia sieniä. Loput 47 näytteestä oli otteluiden nimetty kantoja, jotka alustavasti ehdotettu sijoitettavaksi Sordariomycetes (Xylariales, Glomerellales, Hypocreales), Dothideomycetes (Botryosphaeriales ja Pleosporales), ja eurotiomycetes (Eurotiales). Enemmän luotettavasti määrittää taksonominen sijoitus, sekvenssit analysoitiin käyttämällä suurimman todennäköisyyden ja Bayesin menetelmiä.

Sekvenssit, jotka kohdistettu hyvin toisiinsa jaettiin klustereiksi luoda 20 ryhmää näennäisesti samankaltaisia ​​lajien (taulukko 1, kuvio 1). Yksi ryhmä sisälsi 29 sekvenssejä sloth-hiukset sienet, yksi ryhmä sisälsi 20-sekvenssit, ja loput 18 ryhmät sisälsivät 1 ja 6 välillä sekvensseihin. Välillä 34 ja 165 sekvenssit erotetaan läheistä sukua taksonien koottiin jokaiselle ryhmälle tehdä ei-tarpeeton aineistoja, johon yksi tai kaksi sopiva outgroups lisättiin perustuu kirjallisuuskatsaukseen.

jälkeen fylogeneettiseen analyysejä, korkean tason identiteetit (luokka, järjestys, perhe) voitaisiin luotettavasti osoitetaan 82 sienet, jotka edustavat 15 perheitä ja 10 tilaukset (taulukko 1, kuvio 1). Suurin osa (81,7%) ja nämä olivat Sordariomycetes. Sienet Tämän luokan ovat hyvin dokumentoituja lähteitä bioaktiivisten metaboliittien (esim [33], [34]). Jäljellä olevat isolaatit olivat Dothideomycetes (15,9%) ja eurotiomycetes (2,4%).

Kahdeksankymmentä isolaattien voitaisiin luotettavasti osoitetaan 15 sukuihin (taulukko 1, kuvio 1). Kaksi isolaattia annettiin lisää alustavia fylogeneettiseen mainospaikkoja. F4886 (kuvio 1 (G)) tunnistettiin

Robillarda

sp. tai jäsenenä läheistä sukua olevan suvun sisällä Amphisphaeriaceae. Eristää F4831a (kuvio 1 (C)) on merkitty jäseneksi

Paraconiothyrium

sp. tai läheistä sukua suvun sisällä Montagnulaceae. Kaksi yleisintä sukuihin,

Pestalotiopsis

sp. ja

Hypocrea

sp., eristettiin 7 9 ja 5 9 saamattomuus hiukset näytteitä, vastaavasti.

Isolate F4891 (kuvio 1 (R)) ei näytä liittyvän läheisesti tahansa nimetty sekvenssit GenBankin ja voi vain todettiin mahdollisesti jäsenenä tilauksen Pleosporales (Dothideomycetes). Eristä F4850 (kuvio 1 (R)) oli 96% sekvenssin samanlaisuus sen lähimpään ottelun GenBank, sivistymätön maaperän sientä klooni (taulukko 1; [35]). Lisäksi analyysit ovat perusteltuja, jotta voidaan vahvistaa, onko isolaattien F4891 ja F4850 ovat uusia sienilajien. Yleensä tunnisteiden määrittämä phylogenetic analyysit tarkasti sovitettu kuin alkuun BLAST osuu kullekin eristää (taulukko 1).

bioaktiivisuus laiskuuden hiukset isolaattien

laiskiainen hiukset sieniä, jotka viljeltiin nestemäisessä alustassa ja uutettiin etyyliasetaatilla testattiin bioaktiivisuuden. Meidän pitää uutteet olevan erittäin bioaktiivinen, jos ne aiheuttivat vähintään 50% kasvun eston (eli ≥50% IG) loisia tai syöpäsolujen

in vitro

.

Kaiken kaksi 70 (2,5%) uutteita testattiin olivat erittäin aktiivisia vastaan ​​

P. falciparum

, kahdeksan 62 (12,9%) uutteita testattiin olivat erittäin aktiivisia vastaan ​​

T. cruzi

, ja 15 73 (20,6%) uutteita testattiin olivat erittäin aktiivisia vastaan ​​MCF-7 rintasyövän solulinjan (taulukko 2). Useimmat uutteet bioaktiivisuus olivat aktiivisia vain yhdessä kokeessa (taulukko 2). Bioaktiivisia Kannat eristettiin yhtä usein monoetanoliamiinista ja PDA (taulukko 2). Erityisesti läheistä sukua isolaattien usein erosivat bioaktiivisuuden: esimerkiksi kolme 20 tunnistetun eris-

Hypocrea

sp. (Taulukko 1) oli bioaktiivisuus vain vastaan ​​MCF-7-rintasyöpäsolujen; kolme oli tehoaa MCF-7 rintasyöpäsolujen ja

T. cruzi

(taulukko 2); ja yksi oli aktiivinen vain metisilliiniresistenttiä

S. aureus

(taulukko 3).

Niistä 16 sienet oli korkea% IG ainakin yhdessä

in vitro

määrityksessä, 13 kuului Hypocreales (Hypocreaceae, Bionectriaceae ja Nectriaceae) . Loput kolme sienet kuuluivat Valsaceae (Diaporthales), Amphisphaeriaceae (Xylariales) ja Trichocomaceae (Eurotiales). Malarialääkkeet ja syöpälääkkeen toiminta on aikaisemmin raportoitu kirjallisuudessa näistä suhteellisen hyvin tutkittu sieni suvusta (esim [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]). Kuitenkin meidän tulokset edustavat, parhaan tietomme mukaan ensimmäiset raportit anti-trypanosomal aktiivisuutta

Cytospora

(Valsaceae) ja

Bionectria

(Bionectriaceae).

kantojen määrä erittäin bioaktiivisten vastaan ​​

T. cruzi’in

(taulukko 2) on erityisen kiinnostava, koska me niin harvoin kohtaavat mikrobeja bioaktiivisuuden tässä määrityksessä: vain 104 2698 sieni- endofyytit (3,9%) meidän yleinen kulttuuri kokoelma ovat erittäin bioaktiivisia vastaan ​​loinen [29]. Tällä hetkellä ainoa hoitoja saatavilla tämän sairauden ovat NITROFURAANIT ja benznidazole, jotka molemmat liittyvät tällaisten toksisia sivuvaikutuksia, että hoito on usein hylätty [44].

50 sieni uutteet seulottiin BioMAP, 20 oli bioaktiivinen vastaan ainakin yksi testi organismi (taulukko 3). Valtaosa isolaattien (16 20) tehoaa bakteerien BioMAP määrityksessä kuului perheiden Lasiosphaeriaceae (Sordariales), Glomerellaceae (Glomerellales), Valsaceae (Diaporthales), Botryosphaeriaceae (Botryosphaeriales), ja Amphisphaeriaceae (Xylariales). Loput neljä sienet kuuluivat Nectriaceae, Bionectriaceae ja Hypocreaceae (Hypocreales). Gram-positiivisia bakteereja havaittiin paljon useammin kuin gram-negatiivisten bakteerien (taulukko 3).

Viisi isolaattia (

Colletotrichum

sp. F4806 (kuvio 1 (F));

Cytospora

sp. 1, kanta F4818 (kuvio 1 (K));

Fusarium

sp. 1, kanta F4898 (kuvio 1 (M));

Lasiodiplodia

sp. 1, kanta F4807 (kuvio 1 (Q)), ja

Lasiodiplodia

sp. 1, kanta F4844 (kuvio 1 (Q)) oli erityisen voimakas aktiivisuus BioMAP määrityksessä ja valittiin lisätestausta. Sarjalaimennettua uutteet uudelleen testattiin aktiivisuus paneelin 15 bakteerien ja bioaktiivisuusprofiileja rakennettiin käyttämällä normalisoitua MIC-arvot (taulukko 4).

ote

Lasiodiplodia

sp. 1 ( kanta F4807) oli erityisen mielenkiintoinen, koska se oli voimakas ja spesifinen aktiivisuus gram-negatiivisten bakteerien (taulukko 4). bioaktiivisuus profiili eristää ei vastaa minkään tunnetun antibioottiluokille aiemmin testattu BioMAP määrityksessä, mikä viittaa siihen, mahdollisesti uudenlainen vaikutustapa (katso [30]). Aiheuttamat infektiot kehittyvien monilääkeresistenteistä (MDR) gramnegatiiviset bakteerit ovat tulossa merkittävä kliininen huolenaihe maailmanlaajuisesti [45]. Nämä infektiot yleisimmin sisältävät MDR

Pseudomonas aeruginosa

, laajakirjoisia β-laktamaasia tuottavat Enterobacteriaceae, ja MDR

Acinetobacter baumannii

[46]. Tuoreet tiedot viittaavat siihen, että infektiot jäljittää

Staphylococcus aureus

verenkiertoon -bakteerit ovat laskussa, mutta infektioiden

Escherichia coli

, yleisin gram-negatiiviset lajit infektioita aiheuttavan ihmisen verestä isolaatteja, ovat yleistymässä [47]. Tämä raportti [47] korostetaan myös vähäisyys antibioottien kehitteillä gram-negatiivisten bakteerien, eniten vaivaa keskitetään grampositiivisten MRSA. Yleistyminen MDR organismien johtuu pääasiassa liikakäytön laajakirjoisten antibioottien ja huono antibiootti hoito [48]. Siksi spesifisyys ote kannasta F4807 Gram-negatiivisten kantojen on erittäin arvokas ja tavoittelemisen arvoista tarkempaa analysointia.

Sienet eristetty Tässä tutkimuksessa taksonomi- yhdenmukaisia ​​ryhmiä sienten tiedetään esiintyvän maaperässä ja kasveissa taudinaiheuttajien, saprotrophs tai endofyytit [11], [49]. Sloths voi kohdata tällaisia ​​sieniä muuten ilmasta spora tai suora kontakti, kun ne laskeutuvat puista, jotta ulostaa ja virtsata, jolloin ne kaivaa reikä maaperään, että ne myöhemmin peitä lehtikarikkeen [50]. Silmiinpistävän, verrattuna suuri kokoelma endofyytit peräisin maakasveihin Panama ([29]; 1269 kannat) paljasti, että sekvenssit 29 isolaatteja laiskiainen hiukset olivat identtisiä kantoja saatu kasveista (100% samankaltaisuus yli koko jakson pituus). Niinpä tämä tutkimus laajentaa tunnettujen isäntäkirjo ja ekologinen tila oletettujen endofyytit. Jotkut näistä sienistä voidaan liittää suoraan viherlevää että elää karkeat hiukset sloths, aivan kuten endolichenic sienet liittävät vihreitä levät jäkälää thalli ja ovat usein taksonomisesti samanlaisia ​​endofyytit samassa ympäristössä [51], [52].

Mahdolliset rooleja näiden sienten terveyttä sloths ei ole tutkittu. Araújo Xavier

et al

. [50] raportoitu sieni-infektioiden

B. variegatus

aiheuttama sienipatogeeni

Microsporum

(joka myös aiheuttaa ihottumaa ihmiselle [53]), mutta tämä suvun ei talteen esillä olevassa tutkimuksessa tai aiemmissa työn Suutari

et al

. [16]. Toisin kuin ihmisen microbiome, jossa sienet käsittävät 0,01% mikrobien communites ulkopintojen kuten ihon [54], Suutari

et ai

. [16] kertoi, että sienet edusti 8% kasviston tutkimuksiin laiskuuden-hiukset mikrobeja. Korkea runsaus ja monimuotoisuus sienten liittyy saamattomuus hiukset yhdistettynä niiden biologinen aktiivisuus, voivat puhua biologinen merkitys sloths että on vielä tutkimaton.

kiireellisesti uusia lääkkeitä edelleen edustaa yhtä ihmiskunnan suurimmista haasteista . On yleisesti sovittu, että valtaosa bioaktiivisia mikrobien vielä löytäjäänsä [9] ja äskettäin löydetty mikrobien taxa pitää tärkeänä lupauksen novel kemiaa. Runsaasti todisteita viittaa uudenlaisia ​​ympäristöjä lupaavia lähteitä vielä undescribed mikro-organismien [55]. Tässä olemme osoittaneet, että hiukset kolmivarvaslaiskiaiset (

Bradypus variegatus

) Panama on runsaasti erilaisia ​​bioaktiivisia sieniä. Eristetyt kannat tässä mukana jäseniä joitakin hyvin tutkittu suvusta (esim, Hypocreales, Pleosporales), mutta myös jäseniä tutkittu ilmiö tai mahdollisesti uusia ryhmiä (esim

Endomelanconiopsis

sp. F4801;

Robillarda

sp . F4886; Ascomycota sp. F4891; Ascomycota sp. F4850). Arvioimme, että ylimääräisiä uusia taxa voitiin löytää laiskiainen hiukset laajentamalla keruun menetelmiä erilaisiin medioihin ja käyttävät suuren läpimenon menetelmiä arvioida paikkakunnan koostumukseen. Oletamme myös, että eri eliösystematiikan voidaan eristää sloths muilla alueilla, jopa yhteisöt endofyytit vuonna trooppisia kasveja eroavat huomattavasti alueellisesti mittakaavassa [56], [57]. Näin työmme viittaa siihen, että hedelmällistä etsintä laiskuuden mikrobiston takuuaika on sovellusmahdollisuuksia lääkekehityksen.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Laiskuus hiukset sieni tunnus ja Genbank-numerot.

doi: 10,1371 /journal.pone.0084549.s001

(DOCX) B

Kiitokset

Kiitämme Bryson Voirin varten kokoelma laiskiainen hiukset näytteitä. Kiitämme Phyllis D. Coley, Thomas A. Kursar, Meg Crofoot ja Santosh Jagadeeshan varten hyödyllisiä kommentteja ja muuta apua, ja Malkanthi Gunatilaka Jakob Riddle varten sekvenssianalyysillä. Kiitämme hallituksen Panaman ja erityisesti henkilöstön Panaman autoridad Nacional del Ambiente (ANAM), helpottamiseksi tähän tutkimukseen. Kiitämme Smithsonian Tropical Research Institute (STRI) tukemaan kaikkien logististen näkökohtien tämän työn ja monet opiskelijat ja avustajia jotka ovat osallistuneet tämän tutkimusaineiston.