Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pennogenyl saponiinit ovat aktiivisia yhdisteitä monien kasvilajien ja näin ollen monet polyherbal muotoiluja . Näin ollen suurta kiinnostusta on osoitettu niiden kuvaamista ja tutkimuksessa niiden farmakologisten ja biologiset ominaisuudet, erityisesti syövän vastaista. Tämä nykyinen tutkimusraportit arvioinnista sytotoksisten vaikutusten ja selvitys molekyylitason toimintamekanismit kahden pennogenyl saponiinit (PS 1 ja PS 2) eristettiin

Sudenmarja

L. juurakot ihmisen kohdunkaulan adenokarsinoomasolulinja HeLa . Määrittämään solujen elinkelpoisuuden yhdisteillä käsiteltyjen käytimme reaaliaikaista soluproliferaation analyysin ja totesi, että pennogenyl saponiinit PS 1 ja PS 2 inhiboi voimakkaasti tuumorisolujen kasvun IC 50-arvot 1,11 ± 0,04 ug /ml ja 0,87 ± 0,05 ug /ml, vastaavasti. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että kaksi yhdistettä indusoi apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla, ja laski mitokondrion kalvon potentiaalia HeLa-soluissa alkuvaiheessa apoptoosin. Kvantitatiivinen PCR ja Western Blot-analyysi osoitti, että kaksi saponiinit huomattavasti mRNA: n ilmentymisen FADD ja BID sekä indusoi kaspaasi-8 kautta, joita on korotettu prokaspaasi-8 käsittely käsiteltyjen solujen. Tulokset Tämän tutkimuksen viittaavat siihen, että sekä ulkoista kuoleman reseptori ja luontainen mitokondrioiden reittejä osallistuvat ohjelmoidun solukuoleman.

Citation: Stefanowicz-Hajduk J, Bartoszewski R, Bartoszewska S, Kochan K, Adamska A, KOSINSKI I, et ai. (2015) Pennogenyl Saponiineja alkaen

Sudenmarja

L. Pakotettava ulkoisten ja sisäisten Pathway apoptoosin ihmisen kohdunkaulasyövän HeLa Cells. PLoS ONE 10 (8): e0135993. doi: 10,1371 /journal.pone.0135993

Editor: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 28 heinäkuu 2015; Julkaistu: 21 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Stefanowicz-Hajduk et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Puolan tiede- ja korkeakouluopiskelijoiden avustuksen Nr N N405 669140 (JR Ochocka) ja laadusta – edistää mukaisen tuen Johtava National Research Centre (tietääkseni) vuosille 2012-2017. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, decicion julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

steroideihin saponins ovat ryhmä sekundäärimetaboliitteja joita löytyy lukuisia yksisirkkaisten kasveja. Näin ollen ne ovat osatekijöitä monien kasvien huumeiden ja folk lääkkeet, erityisesti Orient alkuperästä [1], jossa yhteisiä lähteitä saponiinit ovat lajeja

Liliaceae

perhe. Yksi tärkeistä saponiinia kantava suvun tästä perhe on

Pariisi

, joka sisältää yli kahdenkymmenen kasvilajeja. Nämä lajit sisältävät pääasiassa pennogenyl ja diosgenyl glykosidit [2], jotka ovat fysiologisesti aktiivisia yhdisteitä [3, 4] ja on tärkeä rooli hoidossa kasvainten, hemostatic häiriöt, tulehdus ja sieni-infektio [5-7]. Kansanlääkinnässä, ne ovat hyödyllisiä hoidossa traumaattiset, käärmeen purema, paise, parotiitti ja utaretulehdus.

Paljon huomiota kiinnitetään sytotoksista aktiivisuutta pennogenin saponiinit eristettyjen

Pariisi polyphylla

[8-10]. Nämä komponentit osoittavat merkittävää antiproliferatiivista toimintaa maksassa, rinta- ja eturauhassyövän solut [11, 12]. Viimeaikaiset tiedot osoittavat, että pennogenyl glykosidit hallussaan antimetastaattisia vaikutus melanoomasolujen [13] ja

in vivo

syövänvastainen aktiivisuus maksasyövän [14]. Vahvuus Näiden vaikutusten kasvainsoluihin on monipuolinen ja on tiiviisti yhteydessä kemiallisen rakenteen saponiinia yhdisteitä, jotka on enimmäkseen tunnettu [10, 15-17].

Huolimatta lukuisista phytochemical tutkimuksissa, on varsin harvat tutkimus jotka yrittävät tutkia mekanismeja pennogenyl saponiinit toimia kasvainsoluja, lähinnä niiden alhainen sisällön kasveissa [9, 13, 14].

Tämä tutkimus tutkii mekanismia sytotoksisten vaikutusten kaksi pennogenyl saponiinit (PS) eristetty

Sudenmarja

L. ihmisen kohdunkaulan adenokarsinooma (HeLa). Saponiinit saatiin

Pariisi

juurakoita ja kemiallisesti tunnistettu edellisessä tutkimuksessa [18]. Rakenne yhdiste PS 1 määritettiin pennogenin 3-

O

-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside

and yhdiste PS 2 kuten pennogenin 3-

O

-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside. Nämä yhdisteet ovat vahvoja antituumoriominaisuuksia testatuista soluista. Kuitenkin mekanismit niiden sytotoksisen toiminnan, mukaan tietomme, jäävät osittain selvitetty [19]. Yksi mahdollinen mekanismi, joka on tärkeä rooli inhibitio HeLa-solujen proliferaatio on apoptoosin induktio kautta kaspaasien aktivaatio liittyy luontaisia ​​signalointireitin [19]. Tutkimuksessamme olemme olettaa, että sekä pennogenyl saponiinit indusoivat apoptoosin myös aktivoitumisen kautta kuoleman reseptorivälitteisen reitin.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Dulbeccon modifioitu Eaglen Medium (DMEM), penisilliiniä, streptomysiiniä, L-glutamiinia, DMSO, PBS, 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) väriaineen ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

eristäminen ja kemialliset ominaisuudet kahden tutki pennogenyl saponiinit iältään

P

.

quadrifolia

juurakoita tehtiin ja kuvattu aiemmin [18]. Lyofilisoitu yhdisteet liuotettiin DMSO: hon pitoisuutena 1 mg /ml.

solulinja kulttuuri

Ihmisen kohdunkaulan adenokarsinoomasolulinja (HeLa S3) ja ihmisen keratinosyyttien (HaCaT) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, USA). Solulinjoja viljeltiin DMEM: ssä, jota on täydennetty 10% (v /v) FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 2 mM L-glutamiinia, ja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa.

MTT-määritys

solujen elinvoimaisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 2×10

3 solua /kuoppa ja käsiteltiin 24 tuntia yhdisteiden kanssa PS 1 ja PS 2 pitoisuutena, joka on 0,1-10,0 ug /ml. DMSO lisättiin kontrollisoluihin lopulliseen konsentraatioon 1,0% (v /v), joka liittyy maksimipitoisuuden liuottimen yhdisteitä käytettiin kokeessa. Käsittelyn jälkeen MTT: tä (0,5 mg /ml) lisättiin elatusaineeseen ja soluja inkuboitiin 3 tuntia 37 ° C: ssa. Absorbanssi formatsaanipitoisuus liuosta mitattiin 570 nm: ssä levylukijaa (Epoch, BioTek Instruments, USA). Tulokset ilmaistaan ​​IC50 keskiarvoina (± SD, keskihajonta) ainakin kahden itsenäisen kokeen.

xCELLigence soluproleferaatiomäärityksessä

reaaliaikainen seuranta solujen elinkelpoisuuden, käytimme xCELLigence järjestelmä (ACEA Biosciences, USA). Solut ympättiin tiheydellä 2×10

4 /kuoppa E-levyn 16 (ACEA Biosciences, USA), joka sisälsi 100 ui väliaineessa kuoppaa kohti. Kun solut merkitään log-vaihetta, yhdisteet PS 1 ja PS 2 lisättiin lopullisina konsentraatioina 0,1-10,0 ug /ml. Lopullinen DMSO-pitoisuus kuopissa ei ylittänyt 1,0% (v /v). Soluja inkuboitiin yhdisteiden kanssa ja tarkkailtiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä. RTCA ohjelmisto v. 1.2.1 käytettiin laskettaessa puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC50) arvot. Kaikki kokeet suoritettiin kahtena kappaleena kolmesta itsenäisestä toistoa.

trypaanisini määrityksessä

soluja (1×10

5 solua /kuoppa) inkuboitiin testattavien yhdisteiden pitoisuudessa 1,0 -5,0 ug /ml. 24 tunnin kuluttua solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen 0,2% (v /v) trypaanisinisen liuosta (lopullinen konsentraatio) ja solujen laskuri (Kreivitär Automated Cell Counter, Life Technologies, USA). Kokeet toistettiin vähintään kaksi kertaa.

Hoechst-värjäys apoptoosia varten analyysi

apoptoottinen vaikutus yhdisteiden analysoitiin käyttämällä sinisen fluoresoivan Hoechst 33342 väriainetta (Life Technologies). HeLa-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 5×10

5 /kuoppa. Soluja käsiteltiin yhdisteillä PS 1 ja PS 2 liuotettiin DMSO: hon lopulliseen pitoisuuteen 1 ug /ml. DMSO-konsentraatio ei ylittänyt 0,1% (v /v). 24 tunnin kuluttua solut värjättiin lopullinen konsentraatio 0,5 ug /ml väriaineen PBS: ssä 25 minuutin ajan CO

2-inkubaattorissa ja sitten niitä tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla (Leica, Sveitsi).

DNA: n uutto ja pirstoutumista määritys

HeLa-soluja ympättiin tiheydellä 5×10

6 solut 100 mm: n viljelyastioihin ja yhdisteillä käsiteltyjen lopullisessa pitoisuudessa 1,0 ug /ml. 48 h kuluttua solut kerättiin ja lyysattiin lyysipuskurissa (1% NP-40 20 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5). Sen jälkeen, kun solujen hajoamista, supernatantti otettiin talteen ja käsiteltiin 1% SDS ja RNaasi A: ta (Sigma-Aldrich), jonka lopullinen pitoisuus oli 50 ug /ml. Soluja inkuboitiin 2 h 56 ° C: ssa. Seuraavaksi proteinaasi K: n (2,5 ug /ml) lisättiin supernatanttiin ja näytteitä inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. DNA saostettiin 3 M ammoniumasetaatin ja jääkylmää etanolia loppukonsentraatioon 70% (v /v). Saatu DNA-pelletti liuotettiin TE-puskuriin (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) ja sille suoritettiin elektroforeesi 1,5% agaroosigeelissä etidiumbromidilla.

apoptoosimäärityksessä

induktio apoptoosi arvioitiin sitoutuminen anneksiini V-fykoerytriini /7-amino-aktinomysiini (PE /7-AAD) solun fosfatidyyliseriinin. Solut (1×10

5) käsiteltiin kahden yhdisteen pitoisuutena 0,5-5,0 ug /ml 24 h. Nämä pitoisuudet arvot saponiinien valittiin osoittaa merkittäviä muutoksia useissa apoptoottisten solujen. DMSO: n konsentraatio kontrollina näyte ei ylittänyt 0,5% (v /v). Solut kerättiin ja värjättiin käyttäen Muse anneksiini V ja Dead Cell Assay Kit (Merck Millipore, Saksa), seuraten protokollaa valmistajan toimittamat. Apoptoottisia soluja analysoitiin sitten Muse Cell Analyzer (Merck Millipore). Kokeet toistettiin vähintään kaksi kertaa.

arviointi mitokondrion kalvon potentiaalia

Hela-soluja ympättiin tiheydellä 1×10

5 solua /kuoppa ja käsiteltiin kahden yhdisteen klo pitoisuus 1,0-10,0 ug /ml. Näiden pitoisuuksien arvot valittiin osoittaa mitokondrioiden alkuvaiheessa solun hoitoon. DMSO: n konsentraatio kontrollina näyte ei ylittänyt 1% (v /v). 3 tunnin kuluttua altistuksen, solut kerättiin ja valmistettiin käyttäen Muse MitoPotential Kit (Merck Millipore) mukaan valmistajan protokollaa. Prosentuaalinen depolarisoituneiden /elävien solujen määritettiin Muse Cell Analyzer. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kaksi kertaa.

Reaaliaikainen PCR

cDNA: n synteesi ja reaaliaikaisen PCR-reaktiot suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alankomaat) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pitoisuus RNA mitattiin ja cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, USA), mukaan valmistajan protokollaa.

Reaaliaikainen PCR geeniekspressiota paneelit.

cDNA saatiin soluista, käsiteltiin yhdisteillä sekä soluista käsiteltiin ohjattu ajoneuvo, levitettiin Applied Biosystems TaqMan Array Human Apoptosis 96-kuoppaisille levyille (Life Technologies 4414072). Jokainen levy sisältää 88 määritykset apoptoosin liittyvät geenit ja 4 määrityksiä ehdokas endogeenisen kontrolligeenin. PCR-reaktiot asetettu mukaan valmistajan ohjeiden ja suoritetaan ABI7500 Real Time PCR-järjestelmä. Tuloksena tiedot analysoitiin ABI 2,05 ohjelmisto perustuu vertailevaan DCT menetelmä [21]. Validoida paneelit tuloksia, me itsenäisesti analysoitu (RT-PCR) kaikki merkitsevästi muuttunut selostukset sekä geenien ennallaan tasolla.

mittaaminen ilmaisun käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (qRT-PCR).

varmistamiseksi edelleen ilmentymisen määriteltyjen geenien käytimme erityisiä Taqman (BAX määritys id Hs00180269_m1; BCL2 määritys id Hs00608023_m1; GAPDH määritys id Hs02758991_g1; 18S rRNA määritys id Hs99999901_s1; FADD määritys id Hs04187499_m1; BID määritys id Hs00609632_m1; TNFSF10 määritys id Hs00921974_m1; DEDD2 määritys id Hs00370206_m1; BAD määritys id Hs00188930_m1) ja TaqMan One-Step RT-PCR Master MixReagents (Life Technologies) kuten aiemmin on kuvattu [22]. Tuloksena tiedot analysoitiin ABI 2,05 ohjelmisto perustuu vertailevaan suhteellinen standardikäyrän menetelmää [23].

Western Blot analyysi

Hela-soluja käsiteltiin kahden yhdisteen PS 1 ja PS 2. käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-puskuriin (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Proteiinin kokonaismäärän konsentraatio määritettiin Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, USA). Näytteet erotettiin elektroforeettisesti käyttäen edeltäkäsin värjättyjä SDS-PAGE-geelien (Bio-Rad Laboratories) ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF). Kalvot pidettiin 4 ° C: ssa yön yli 3% BCA (Sigma-Aldrich) PBS /Tween-20, ja sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla on yksi seuraavista: p-aktiini (ab 1801, Abcam, UK), Bid (ab 32060, Abcam), Bcl-2 (ab 59348, Abcam), kaspaasi-8 (sc-81661, Santa Cruz Biotechnology, USA). Pesun jälkeen PBS /Tween-20, kalvoja inkuboitiin vuohen anti-kani-IgG- tai vuohen anti-hiiri-IgG HRP konjugoitua sekundaarista vasta-aineita (Bio-Rad Laboratories). Immunodetektio suoritettiin tehostetun kemiluminesenssin (ECL) havaitseminen kit (Bio-Rad Laboratories). Proteiini merkit analysoitiin ChemiDoc varustetussa Image Lab ohjelmisto v. 4.1 (Bio-Rad Laboratories).

Tilastollinen

Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskihajonta (SD) . Tilastollinen vertailuja tuloksia arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä.

Tulokset

saponiiniseokset yhdisteet PS 1 ja PS 2 laski HeLa ja HaCaT solujen elinkelpoisuuden

Vaikutus

P

.

quadrifolia

pennogenyl saponiinit soluihin elinkelpoisuus tutkinut xCELLigence, joka perustuu sähköisen impedanssin mittaamiseen anturin elektrodien E-kuoppiin ja mahdollistaa jatkuvan, määrällinen seuranta solujen [24]. Muutoksia soluissa elinkelpoisuutta, numero, morfologia ja aste tarttuvuus vaikuttaa elektrodin impedanssin jota kuvataan parametri nimeltä Cell Index (CI) [25, 26]. CI käytetään laskettaessa IC 50-arvo jokaisessa mittauspisteessä kokeen.

HeLa-soluja käsiteltiin yhdisteillä PS 1 ja PS 2 (0,1-10,0 ug /ml) 24 tuntia. Järjestelmän annettiin arvioida IC50-arvot kullekin yhdisteistä. Altistuminen HeLa solujen saponiineille johti merkittävään lasku solujen elinkelpoisuuden. Käsittelyn jälkeen yhdisteen PS 1 ja PS 2, saadut IC 50-arvot olivat 1,11 ± 0,04 ug /ml ja 0,87 ± 0,05 ug /ml, vastaavasti (taulukko 1).

IC50-arvot xCELLigence järjestelmä saatiin perustuu sigmoidisten annos-vaste-kaava ja lasketaan kokeiden toisto (n = 3). Vahvistaa tulokset xCELLigence järjestelmä, teimme MTT-määritystä käyttäen samaa pitoisuusalue kahden saponiinit (0,1-10,0 ug /ml) HeLa ja HaCaT-soluja. Soluja käsiteltiin 24 h ajan, ja tallennetaan IC50-arvot yhdisteiden saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta (taulukko 1).

käytetään kontrollinäyte DMSO ollut mitään inhibitiota vaikutusta soluihin. Tuloksemme osoittavat, että nämä kaksi pennogenyl saponiinit oli annoksesta riippuvainen ja ajasta riippuvainen aktiivisuus (kuvio 1 ja kuvio 2). Elinkelpoisuuden HeLa-solujen vähentynyt inkubaation aikana soluja yhdisteiden kanssa. Muuttuu merkittävästi solujen adheesion havaittiin 5 h kuluttua hoidon solujen kanssa saponiinit. Solujen elinkelpoisuus vähensi myös yhdessä suurempien pitoisuuksien PS 1 ja PS-2

soluja inkuboitiin pennogenyl saponiinit PS 1 (A) ja PS 2 (B) eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan. Numeerinen etiketit käyrät edustavat yhä pitoisuusarvot yhdisteiden (0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 ug /ml, vastaavasti).

IC50-arvot saponiinit laskettiin joka perustuu annos-vaste-käyrät solun indeksi, jonka xCELLigence järjestelmän. Virhepalkit edustavat standardipoikkeamaa.

Sama kokeet suoritettiin ei-kasvain-ohjaus cell line-ihmisen keratinosyyttejä. IC 50-arvot olivat 1,01 ± 0,01 ug /ml yhdistettä PS 1 ja 0,94 ± 0,04 ug /ml PS 2 (taulukko 1).

Reaaliaikainen solujen analyysi ja MTT-määritys osoitti voimakkaampi sytotoksinen vaikutus saponiinia PS 2 on tutkittu soluihin. Lisäksi tämä vaikutus on vahvistettu trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä.

vaikutus saponiinit indusoiman apoptoosin

Vahvista apoptoottisen vaikutuksen kahden pennogenyl yhdisteet, HeLa-solut (sen jälkeen, kun hoidetaan 24 h) värjättiin anneksiini V-PE /7-AAD ja analysoitiin Muse analysaattori. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla. Yhteenlaskettu apoptoottinen hinnat (kokonaisprosenttiosuus aikaisin ja myöhään apoptoottiset solut) saadulla yhdisteellä PS 1 olivat 10,71%, 41,35% ja 62,48% pitoisuuksien 0,5, 3,0 ja 5,0 ug /ml, vastaavasti. Apoptoottisen hinnat yhdisteen PS 2 oli 13,80%, 57,37%, 76,12% pitoisuuksien 0,5, 3,0 ja 5,0 ug /ml, vastaavasti (kuvio 3).

Solut analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V: -PE /7-AAD värjäystä menetelmällä. Jakelu apoptoottisten solujen määritettiin näytteen käsittelemättömien solujen (A) ja sen jälkeen inkuboimalla soluja 0,5% DMSO: ta (B), yhdiste PS 1 (CE) ja PS 2 (FH) pitoisuutena 0,5, 3,0 ja 5,0 ug /ml, vastaavasti. Soluja käsiteltiin 24 h ajan, ja koko laajuus apoptoosin (apoptoosin rate) määritettiin verrattuna DMSO-kontrollin (I). Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Merkittäviä eroja suhteessa kontrolliin on merkitty ”*” (p 0,05).

arvioida muutoksia kromatiinin jakauma soluissa, joita käsiteltiin kaksi yhdistettä, teimme visualisoinnin cellular ytimet Hoechst 33342 väriainetta. Värjäyksen jälkeen kromatiinin kondensaatio ja ydinvoiman pirstoutuminen HeLa-soluissa havaittiin verrattuna kontrollisoluihin inkuboitiin DMSO: n kanssa (kuvio 4). Koe vahvisti apoptoosin induktiosta soluissa käsitelty saponiinit.

Nuclear kromatiinin tila on arvioitu Hoechst 33342 värjäys altistuksen jälkeen solut 1 ug /ml yhdisteen PS 1 (A) ja PS 2 ( B) 24 h (pitoisuus arvoon liittyvät IC 50 arvot saponins). Soluja käsiteltiin saponiinit osoittavat kondensoitu kromatiinin suhteessa kontrolliin soluja inkuboitiin 0,1% DMSO: ta (C). Nuolet edustavat apoptoottisia soluja.

Lisäksi tulokset esillä kuviossa 5 esittävät vahingoittumattomana DNA ohjaus soluissa, kun taas yhdisteet, käsitellyt solut osoittivat DNA: n fragmentoituminen ominaista apoptoottisten tumien.

Kaistat 1 ja 1 a edustaa DNA käsittelemättömän solut; kaistat 2, 2a – solut käsiteltiin 0,1% DMSO (ctrl); kaista 3 – solut, joita käsiteltiin yhdisteellä PS 1; kaista 4-solut, joita käsiteltiin yhdisteen PS 2. Soluja inkuboitiin yhdisteiden kanssa pitoisuutena 1 ug /ml 48 h (pitoisuus arvoon, jotka liittyvät IC 50-arvot yhdisteiden). M-DNA tikkaat (Thermo Scientific).

Euroopan pennogenyl yhdisteet PS 1 ja PS 2 moduloidut mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨm) HeLa-solujen

Menetys mitokondrion sisemmän kalvon läpäisevä potentiaali on luotettava indikaattori mitokondriohäiriöitä ja solujen terveyttä. Tämä vaikutus on usein havaittu olevan yhteydessä alkuvaiheessa apoptoosin. Käsittelyn jälkeen HeLa-soluja, joilla on tutkittu yhdisteitä, tila mitokondrioiden kalvot solujen arvioitiin Muse järjestelmän. Ohjaus solut osoittivat korkean fluoresenssi kertymisestä johtuvaa fluoresoivaa kuluessa sisäkalvon ehjä mitokondrioita. Soluja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa saponiinien osoitti fluoresenssin vähenemiseen. Prosenttiosuus depolarisoituneiden /elävien solujen yhdisteellä käsitellyissä PS 1 oli 9,20%, 14,48%, 35,52% pitoisuuksien 1,0, 5,0 ja 10,0 ug /ml, vastaavasti. Arvot yhdisteen PS 2 oli 8,98%, 35,82%, 47,26% pitoisuuksien 1,0, 5,0 ja 10,0 ug /ml, vastaavasti (kuvio 6). Saadut tulokset osoittavat, että mitokondriot rooli apoptoosin soluissa käsiteltiin kahden tutkittiin saponiinit.

solujen jakautuminen, joille mitokondrion potentiaali määritettiin inkuboinnin jälkeen käsittelemättömillä soluilla (A), solut 1,0% DMSO: ta (B), yhdiste PS 1 (CE) ja PS 2 (FH), jonka pitoisuus on 1,0, 5,0, 10,0 ug /ml, vastaavasti. Soluja käsiteltiin 3 tuntia ja laajuus mitokondrion solun Depolarisaatio määritettiin verrattuna DMSO-kontrollin (I). Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Merkittäviä eroja vertailuryhmään nähden on merkitty ”*” (p 0,05).

Kaksi pennogenyl saponiinit lisääntynyt mRNA ilmentymä FADD ja BID HeLa-soluissa

Määritä laajuus testattiin yhdisteiden apoptoottisten reittien ilmentyminen 88 liittyvien geenien testattiin qPCR (qPCR ihmisen apoptoosin array). Niistä tutkittiin määrityksissä tämän joukko, lisäkokeita varten kaksi ryhmää geenejä valittiin-geenejä, joiden ekspressio on muuttunut merkittävästi, ja niitä, joilla ilmentymisen verrattavissa kontrolliin. Tulosten varmistamiseksi PCR paneelit, reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR: ää käytettiin. Analyysi osoittaa muutokset mRNA ilmentymisen Fas liittyvän kuolindomeeniin (FADD) ja BH3 vuorovaikutuksessa domain kuolema agonisti (BID) käsittelyn jälkeen kahden saponiinit (Kuva 7). Lisäksi mRNA: n taso BCL2 liittyy X-proteiinia (BAX) lisäsi merkittävästi HeLa-soluissa inkuboitiin yhdisteen PS 1 24 tuntia. Lisäksi, kuten kuviossa 7 on esitetty, mRNA: n ekspressio kuoleman efektoridomeenin, joka sisälsi 2 (DEDD2), B-solulymfooma-proteiinia 2 (BCL2), BCL2 antagonisti solukuoleman (BAD) ja tuumorinekroositekijä (ligandi) superperheen jäsen 10 (TNFSF10) oli verrattavissa kontrolliin.

soluja stimuloitiin yhdisteiden PS 1 ja PS 2 pitoisuutena 1,0 ja 0,5 ug /ml, vastaavasti, ja inkuboitiin 24 tuntia. MRNA-tasot mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä kokeissa. Kukin näyte ajettiin kahtena kappaleena ja suhteellinen määrä mRNA normalisoida 18S rRNA sisältöä ja ilmaistuna kertamuutosta kontrolliin (0,1% DMSO). Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Merkittäviä eroja vertailuryhmään nähden on merkitty ”*” (p 0,05).

vaikutukset saponins proteiinin ilmentymistä Bcl-2, Bid ja prokaspaasi-8

edelleen selvittämiseksi mekanismi apoptoosin HeLa-soluissa, joita käsiteltiin yhdisteillä, tutkimme proteiinien Bcl-2, Bid ja prokaspaasi-8. Soluja inkuboitiin saponiinit pitoisuudessa 1 ug /ml ja vertailunäyte (0,1% DMSO) 5 h (hetkestä, kun muutokset proteiinin tasot olivat merkittävästi). Proteiinien ekspressiota havaittiin Western blot.

β

aktiini käytettiin sisäisenä latauskontrollina. Saadut tulokset osoittavat, että saponiinit hoito vähensi proteiinin taso Bcl-2 (kuvio 8A), kun taas Bid ekspressio lisääntyi verrattuna vertailunäytteeseen (kuvio 8B). Vahvista rooli ulkoinen tie indusoiman apoptoosin yhdisteet, muutoksia prokaspaasi-8 ekspressiotaso havaittiin. Kuvio 8C esittää vähentynyt merkittävästi proteiinin tason käsitellyssä HeLa-soluissa.

HeLa-soluja inkuboitiin yhdisteen kanssa PS 1 ja PS 2 pitoisuutena 1,0 ug /ml (konsentraatio arvoon liittyvät IC50 arvot saponiineja) 5 h ja proteiinien ekspression käsitellyissä soluissa määritettiin Western blot -analyysillä. PS 1 ja PS 2 väheni Bcl-2 (A) ja prokaspaasi-8 (55 kDa) (C) proteiinin tasot ja lisääntynyt Bid (B) proteiinin ilmentymisen soluissa. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja kukin proteiinin tason liittyi 0,1% DMSO-kontrollin näyte. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. Merkittäviä eroja vertailuryhmään nähden on merkitty ”*” (p 0,05).

Keskustelu

Pariisi

juurakot ovat pitkään käytetty kiinalaiset kuin korjata verenvuodon, mikrobi-infektio ja tulehdus [27, 28]. Lisäksi juurakot ovat laajalti käytössä syövän ehkäisyssä ja hoidossa perinteisen lääketieteen [29]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että otteet

Pariisi

lajien ja niiden tärkeimpien aktiivisten komponenttien steroideihin saponins hallussaan antituumoriominaisuuksia vastaan ​​eri solulinjoja [11, 19, 29-34]. Kuitenkin vain harvat papereita, jotka yrittävät tutkia mekanismeja sytotoksista vaikutusta pennogenyl saponiinit on julkaistu tähän mennessä [11, 14, 19].

Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutuksen kaksi

P

.

quadrifolia

pennogenyl saponiinit ihmisen kohdunkaulan syöpäsolu HeLa. Testatut yhdisteet osoittivat merkittävää antiproliferatiivista aktiivisuutta ihmisen soluja. Saadut tulokset kokeessa, jossa RTCA järjestelmän osoittavat, että sekä saponiinit osoittavat annoksesta riippuvainen ja ajasta riippuvaa estä- vaikutus proliferaatioon HeLa-soluissa. Yhdiste PS 2 on hieman vahvempi aktiivisuus kuin PS 1, joka voi johtua eroista molekyylin rakenteiden saponiinit (yksi ylimääräinen ramnoosia jäännös PS 2 sokeria ketju. Kuvio 9). Analyysien välistä suhdetta bioaktiivisuutta saponiinit ja kemiallinen rakenne osoittavat, että sokerin osa on tärkeä rooli aktiivisuuden steroidimolekyyliin [32, 35, 36]. Saponiinit samalla steroideihin osan näytteille eri syövän vastainen vaikutus. Yhdisteet, joilla on enemmän sokeria osissa on vahvempi aktiivisuutta soluihin [12].

Kokeet suorittaa määrittää sellaista solukuoleman että molemmat pennogenyl saponiinit aiheuttamaa apoptoosia. Apoptoosi on ominaista tyypillinen morfologiset ja biokemialliset tunnusmerkkejä, kuten solun kutistuminen, tuman DNA pirstoutuminen ja kalvo kupliminen [37]. Kaikki nämä muutokset havaittiin soluja inkuboitiin kahden testattu pennogenyl saponiinit. Analyysi solujen yhdisteillä käsiteltyjen ja värjättiin fluoresoivalla värillä osoittaa ydin- pirstoutumista ja muodostumista kondensoidaan ytimeksi. Tuloksemme saatu kokeen elektroforeettinen erottaminen uutettu DNA käsitellyistä soluista tukevat näitä havaintoja.

Early tunnusmerkki apoptoosin on plasmamembraanin menetys epäsymmetrian jossa molekyylit fosfatidyyliseriinin kulkeutua sisemmästä ulkopintaan solukalvon niin, että riippuva fosfolipidi-sitoutuva proteiini (anneksiini V) voidaan helposti sitoa ne [38-40]. Tutkimuksessamme havaitsimme merkittävä väestönkasvu määrän apoptoottisia HeLa soluja inkuboitiin tarkastetun saponiinit ja tämä vaikutus esiintyi annoksesta riippuvaa mallia.

Haitallisia apoptoosin aiheuttamiseksi ovat ulkoisia kuolema reseptorin reitin ja luontainen mitokondrioita polku [41-43]. Ulkoista signalointireittejä liittyy kalvo syöttämällä reseptoreita, jotka kuuluvat tuumorinekroositekijä (TNF) reseptorin geenin superperheen [44, 45]. Tähän mennessä rasvahapposyntetaasi ligandi /reseptori (FasL /FasR) ja TNF-α /TNFR1-mallit on parhaiten tunnettu niistä. Linkittämistä FasL FasR tuloksia apoptoosin herkkien solujen kautta rekrytointi sovittimen molekyyli FADD ja FADD liittyvän prokaspaasi-8 kuolemaan reseptoriin [45-49]. Kuolema indusoivan signalointikompleksiin DISC muotoja, mikä johtaa solun kuolemaan [50]. Meidän tiedot osoittavat, että kaksi pennogenyl yhdisteet huomattavasti mRNA: n ilmentymisen FADD käsitellyissä soluissa. Lisäksi yhdiste PS 1 ja PS 2 indusoi kaspaasi-8 esitetyllä kautta lisääntynyt of prokaspaasi-8 käsittely yhdisteillä käsiteltyjen HeLa-solut. Aktivointi kaspaasin 8 syntyy DISC on joskus riittämätön tuottamaan kaspaasi signalointiryöpyn tarpeeksi vahva suorittamisen solukuoleman. Tässä tapauksessa signaali vaatii vahvistusta kautta mitokondrioiden riippuvaisten apoptoottisten reittien [51]. Proteiini, joka yhdistää kaspaasi signalointikaskadissa ja mitokondrioita on Bcl-2-perheen jäsen Bid. Aktivoitu muoto Bid (tBid) translokoituu mitokondriot, joissa se toimii kanssa proapoptoottiset proteiinien Bax ja Bak aloittaa vapauttamaan proapoptoottiset tekijöiden mitokondrioiden [52]. Tutkimuksessamme havaitsimme huomattavaa kasvua, BID mRNA ja proteiinin ilmentyminen HeLa-soluissa inkuboitiin testattavien yhdisteiden kanssa. Mielenkiintoista, mRNA ilmaus BAX oli paljon suurempi PS 1-käsitellyissä soluissa.

Toiminnan Bid ja Bax vastustetaan jonka antiapoptoottisten Bcl-2-perheen jäsen, kuten Bcl-2, joka voi estää mitokondrion proapoptoottiset tapahtumia [53]. Bcl-2-perheen proteiinien vaikutuksia mitokondrion kalvon läpäisevyyden [41, 45, 53], ja osallistuu huokosten muodostumisen kalvoon. Läpäisevyys siirtyminen (PT) seuraa aina häiriöitä mitokondrion sisemmän kalvon läpäisevä potentiaali ΔΨm [54, 55]. Menetys potentiaali on usein havaittu olevan yhteydessä alkuvaiheessa apoptoosin [56-58]. Meidän analyysi osoittaa, että Bcl-2-proteiinin ilmentyminen väheni käsiteltyjen solujen sekä yhdisteet.

Lisäksi meidän kokeet osoittavat, että nämä kaksi pennogenyl saponiinit depolarisoituneiden kalvon potentiaalia merkittävästi HeLa-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla . Tämä vahvistaa osallistumista luontainen mitokondrioiden väylän solun apoptoosin.

Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet mekanismeja antitumor toiminnan kaksi saponiinit ja päätellä, että sekä ulkoista kuolema reseptorin reitin ja sisäisen reaktiotien osansa apoptoottisessa yhdisteiden vaikutuksen HeLa-soluissa. Erityisesti signaalin polkuja solukuolemaa edellyttävät lisätutkimuksia erityisesti kahden pennogenyl komponentit on eristetty

P

.

quadrifolia

juurakot voisi olla mahdollinen lääke hoidettaessa ihmisen kohdunkaulan syövän.