Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on yleisimmin diagnosoitu syöpä vaikuttaa 1 6 miehillä Yhdysvalloissa. Ymmärtäminen molekyylitason eturauhassyövän etenemistä voi toimia välineenä varhaisen diagnoosin ja kehittää uusia hoitostrategioiden tähän sairauteen. Protein Kinase D1 (PKD1) on monitoiminen kinaasi, joka ilmentyy voimakkaasti normaalissa eturauhasessa. Vähentynyt ilmentyminen PKD1 on liittynyt etenemisen eturauhasen syöpä. Siksi synteettisiä tai luonnollisia tuotteita, jotka säätelevät tämän signalointireitille voivat toimia uusina hoitomuodot eturauhassyövän ehkäisyyn ja hoitoon. Curcumin, aktiivinen ainesosa kurkuma, on osoittanut, syövän ominaisuuksia modulaation kautta useilla eri molekyyli- reittejä. Tässä olemme osoittaneet, että curcumin aktivoi PKD1, jolloin muutokset β-kateniinin signaloinnin estämällä ydin- β-kateniinin transkription aktiivisuus ja nostamisesta kalvon β-kateniinin eturauhassyöpäsoluissa. Modulaatio Näiden solujen tapahtumia curcumin korreloi vähentynyt solujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumisen ja soluliikkuvuus ja parannettu solu-solu aggregaation eturauhassyövän soluissa. Lisäksi olemme myös ilmi, että inhibitio solun liikkuvuus, jonka curcumin välittää vähentämällä tasoja aktiivista cofilin, alavirran kohde PKD1. Voimakas anti-syöpä vaikutuksia curcumin

in vitro

heijastuivat myös eturauhassyöpäksenografti hiirimallissa.

in vivo

kasvaimen kasvun inhibitiota korreloi myös parannettu kalvo lokalisaatio β-kateniinin. Kaiken meidän havainnot tässä ovat paljastaneet uutta molekyylimekanismi curcumin toiminnan aktivaation kautta PKD1 eturauhassyöpäsoluissa.

Citation: Sundram V, Chauhan SC, Ebeling M, Jaggi M (2012) Curcumin Vaimentaa β- kateniinin Signaling eturauhassyöpäsoluissa kautta proteiinikinaasi D1. PLoS ONE 7 (4): e35368. doi: 10,1371 /journal.pone.0035368

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 04 lokakuu 2011; Hyväksytty: 15 maaliskuu 2012; Julkaistu: 16 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Sundram et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat COBRE Grant (P20 RR024219) NIH (https://www.ncrr.nih.gov/) ja avustuksia Yhdysvaltain puolustusministeriön (DOD) (https://cdmrp.army.mil/) MJ (DOD PC073643) ja SCC (DOD PC073887). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi yleisin kuolinsyy ja yleisimmin diagnosoitu syöpä miehillä Yhdysvalloissa [1]. Riski eturauhasen syöpä kasvaa eksponentiaalisesti ikävuoden jälkeen 50. Siten eturauhassyöpä on sijoitettu tulla suurempi haaste tulevina vuosina, koska yleiseen kasvuun pitkäikäisyys. Vaikka etiologiaa eturauhassyövän ei ymmärretä hyvin, sekä geneettiset ja ympäristötekijät näyttävät olevan tärkeitä rooleja taudin kehitystä. Yhteinen ensilinjan strategia eturauhassyövän hoitoon kuuluu kirurgiseen tai farmakologisen kastraation avulla androgeeniablaatio hoito. Vaikka androgeeniablaatio hoito on tehokas aikana alkuvaiheessa tauti, syöpä nopeasti etenee androgen riippumaton vaihe, johon ei tunneta tehokasta hoitoa on tällä hetkellä saatavilla. Siksi ymmärtäminen molekyyli- perusteella tauti on erittäin toivottavaa kehittää uudempia ehkäisy- ja eturauhassyövän hoitoon.

Protein Kinase D1 (PKD1) on evoluutiossa säilyneitä, ekspressoituvat seriini-treoniini-kinaasi, joka toistaa keskeinen rooli säätelyssä erilaisissa solun toimintoja, kuten solujen selviytymistä, proliferaatiota, liikkuvuuteen ja hyökkäys [2] – [8].

PKD1

geeni ilmentyy monissa elimissä korkein ilmaus dokumentoitu eturauhasen ja kiveksissä itusolujen [3], [9], [10]. PKD1 esittelee yhdistelmä rakenteelliset ja toiminnalliset ominaisuudet sekä PKC perhe (diasyyliglyserolin ja forboliesterin sitovat rakennedomeeneja) ja CaMK perhe (rakenteellinen homologia kinaasidomeenin ja substraatti ja estäjä spesifisyys). Siksi on ainutlaatuinen sisällä signaalitransduktion Cascade integroida signalointi tietoa ulkoisiin ärsykkeisiin ja muuntaa ne solunsisäistä vastetta moduloimalla erilaisia ​​alavirran polut [2]. Täten vapautuminen PKD1 vaikuttaa useiden signalointireittien, johtaen krooniseen sairauksia, kuten syöpää [2]. Edellinen työ meidän laboratorio on sekaantunut kriittinen rooli PKD1 eturauhassyövässä [11]. Meidän työ on paljastanut kyky PKD1 estää toimintoja β-kateniinin eturauhassyövässä [12]. Lisäksi, PKD1 on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa ja moduloivat toimintoja E-kadheriinin, androgeenireseptorin ja MAPKinase signalointireitteihin [13] – [18]. PKD1 estää myös soluliikkuvuus suoraan vuorovaikutuksessa ja moduloimalla toimintoja useita proteiinien mukana aktiini remodeling, kuten rintareppu laukaus fosfataasi (SSH1L) ja cortactin [19] – [23]. Lisäksi PKD1 tiedetään olevan osallisena estämällä hyökkäyksen, metastaasin ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) syöpäsolujen ekspressiota sääteleviä matriksin metalloproteinaasien (MMP: t) [24], [25] ja toiminnot etana transkriptiotekijän [26 ], tässä järjestyksessä. Näin ollen molekyylit, jotka moduloivat PKD1 ilmentymistä tai aktiivisuutta voi olla tärkeä rooli ehkäisyssä ja tai eturauhassyövän hoitoon.

Curcumin (kuvio 1A), aktiivinen ainesosa kurkuma, on myrkytön, diferuloyylimetaani yhdiste, joka on voimakas anti-proliferatiiviset, anti-inflammatorisia ja anti-oksidatiivisen ominaisuudet [27], [28]. Molemmat

in vivo

ja

in vitro

tutkimukset ovat osoittaneet kykyä curcumin tehokkaasti estää syövän kasvua [29] – [31]. Tämä voimakas syövän ominaisuus curcumin liittyy sen kykyyn samanaikaisesti moduloida toimintoja useissa eri molekyylipainon reittejä, mukaan lukien MAPK, EGFR ja NFKB polkuja [32]. Lisäksi curcumin myös säätelee ydinvoiman β-kateniinin /T-solujen tekijä (TCF) transkription aktiivisuutta. Kuitenkin tarkka molekyylitason mekanismeja curcumin välitteisen suppression β-kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta ei ole täysin ymmärretty.

A). Kemiallinen rakenne curcumin. B). Vaikutus kurkumiinista leviämisen eri eturauhassyövän solulinjoissa. LNCaP, C4-2, DU145 ja PC3 solujen hoidettiin curcumin tai ajoneuvon hallinnan DMSO 48 tuntia ja solujen lisääntymistä määritettiin käyttäen MTS-määritystä. Prosentuaalinen solujen lisääntymisen laskettiin normalisoimalla leviämisen curcumin käsiteltyjen solujen lisääntymistä ohjaus käsiteltyjen solujen. Pitoisuudesta riippuva esto soluproliferaatioon havaittiin curcumin hoitoon. Keskiarvo ± SE; n = 3; * P 0,05.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet vaikutusta kurkumiinista PKD1 aktivointia. Curcumin välittämä PKD1 aktivoitumisen tukahdutettu ydin- β-kateniinin /TCF transkription aktiivisuutta ja esti kasvua eturauhassyövän solulinjaa ja ksenografti eläinmalli. Aktivointi PKD1 myös parannettu solu-solu aggregaatiota ja esti soluliikkuvuus toiminnot

kautta

rikastuminen kalvo β-kateniinin ja esto cofilin aktiivisuuden. Kaiken kaikkiaan olemme paljastaneet uutta molekyylitason signalointireitin säätelee curcumin vaimentamaan eturauhassyövän kasvua.

Tulokset

Curcumin estää eturauhassyövän soluproliferaatiota

vapautettiin soluproliferaatiota on tunnusmerkki syöpäsoluja. Jotta voitaisiin määrittää anti-proliferatiivista aktiivisuutta curcumin (kuvio 1A), joka on paneelin eturauhassyövän solulinjoissa (varhainen passage androgen herkkä LNCaP, androgeenistä riippumaton C4-2, PC3 ja DU145), käsiteltiin vaihtelevilla curcumin 48 h ja arvioitu solujen lisääntymisen. Curcumin hoito esillä annoksesta riippuvaisen soluproliferaation inhibointi kaikissa eri eturauhassyövän soluissa (kuvio 1 B). Pariksi eturauhassyöpäsolulinja järjestelmä LNCaP (androgen herkkä) ja C4-2-solut (LNCaP johdettu, androgeeni-riippumaton) käytettiin lisätutkimuksiin.

Curcumin aktivoi PKD1

PKD1 on tarpeen normaali fysiologia eturauhasen solujen ja sen säätelyä alaspäin liittyy etenemisen eturauhasen syöpä. Sen vuoksi ei-toksinen, luonnollisia yhdisteitä, jotka upregulate ekspressiota tai aktiivisuutta PKD1 voi auttaa ehkäisyssä ja tai eturauhassyövän hoitoon. Sen määrittämiseksi, mikäli curcumin voivat moduloida ekspressiota tai aktiivisuutta PKD1, androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä C4-2-soluja käsiteltiin curcumin vaihtelevan ajankohtina, ja ilmaisu koko PKD1 (kuvio 2A) ja aktiivisen PKD1 (kuvio 2B) määritettiin käyttäen PKD1 ja fosfo PKD1 vasta-aineen vasta-aineita. Vaikka mikään merkittävä muutos koko PKD1 havaittiin, seuraavat curcumin hoidon (kuvio 2A), curcumin käsittely merkittävästi parannettu ilmaus aktivoitua PKD1 1 tunnin kuluessa hoidon (kuvio 2B ja kuvio S1A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös C4-2-soluissa, jotka yliekspressoivat PKD1 (C4-2-PKD1) (kuvio S1B) ja LNCaP-soluja (kuvio S1C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että kurkuma hoito voi tehokkaasti aktivoituvat PKD1 eturauhassyöpäsoluissa.

A). Vaikutus kurkumiinista PKD1 tasoilla. C4-2-soluja käsiteltiin 20 uM curcumin. Vaihtelevina ajankohtina, solut kerättiin, ja lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin PVDF-kalvolle ja tutkittiin täydellistä PKD1. β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. Bändi voimakkuudet densitometrisesti analysoitiin normalisoituivat p-aktiini tasot ja piirretään. Curcumin hoito ei aiheuttanut merkittävä muutos PKD1 ilme 1, 3 ja 6 tuntia. B). Vaikutus kurkumiinista aktivointi PKD1. Määrittämiseksi ilmentymisen aktivoidaan /fosforyloidun PKD1, blotit tutkittiin fosfo PKD1, yhteensä PKD1 ja β-aktiini-vasta-aineita. PPKD1 bändi intensiteetti normalisoidaan yhteensä PKD1 tasolle ja piirretään. Curcumin indusoi PKD1 aktivaatio /fosforylaatiota 1 h, kun taas mitään ilmeistä muutoksia ei havaittu ilmentyminen koko PKD1. Edustaja blots kolmesta kokeesta on esitetty kuviossa. Auto- mielivaltaisia ​​yksiköitä.

Curcumin käsittely rikastaa β-kateniinin lokalisointi on solukalvon

β-kateniinin on tärkeä solun proteiini, joka fosforyloituu PKD1. PKD1 on myös osoitettu lisäävän tasoja kalvon β-kateniinin ja solu-solu-vuorovaikutuksen eturauhassyöpäsoluissa [12]. Vaikutuksen määrittämiseksi kurkumiinin aktivaatio PKD1 membraanin β-kateniinin lokalisointi, kurkumiini käsiteltiin C4-2 soluja immunovärjättiin β-kateniinin ja käsitellään konfokaalimikroskopialla (kuvio 3). Kuten kuviossa 3 on esitetty, kurkumiini hoito rikastettu kalvo β-kateniinin lokalisointi C4-2-soluissa 1 tunnin kuluessa hoidon verrattuna vehikkelikontrolliin käsiteltyjen solujen. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös LNCaP-soluissa (kuvio S2).

C4-2-soluja viljeltiin lasipeitinlevyille yön yli 12-kuoppaisilla levyillä. Soluja käsiteltiin DMSO (ylempi kuva) tai curcumin (20 uM) (alempi paneeli) 1 tunti, pestään, kiinteä ja immunovärjättiin β-kateniinin (punainen) ja vasta-värjättiin DAPI (sininen). Korkeampi β-kateniinin värjäytyminen havaittiin solun pinnalla 1 h curcumin hoidon verrattuna DMSO-kontrollin käsiteltyjen solujen. Alkuperäinen Suurennukset 600 x.

Curcumin välitteistä parantamiseksi kalvon β-kateniinin inhiboi PKD1 siRNA

PKD1 on aiemmin osoitettu vaikuttavan solunosasijaintia β-kateniinin [12] . Siksi pyrimme roolin tutkimiseksi PKD1 vuonna curcumin välittämää rikastuminen kalvo β-kateniinin. Tätä tarkoitusta varten käytimme PKD1 erityisiä siRNA vaientaa PKD1 on C4-2-soluissa. PKD1 siRNA tehokkaasti vaiennettu PKD1 lauseke (yli 95%) vuonna C4-2 soluissa verrattuna salattu (ei-kohdennettu) siRNA (kuvio 4A). Sen jälkeen, kun estoa PKD1 ilmentymisen, C4-2-soluja käsiteltiin kurkumiinin ja käsitellään konfokaalimikroskopialla määrittää β-kateniinin ja PKD1 ilmaisun ja lokalisointi (kuvio 4B). Muokatussa siRNA transfektoituja soluja, kurkumiini hoitoon tehokkaasti parantaa β-kateniinin lokalisointi solukalvon (kuvio 4B, A2-D2) kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 4B, A1-D1). Kuitenkin, soluissa, jotka on transfektoitu PKD1 hiljentäminen siRNA, kurkumiini hoito ei ole rikastuttaa β-kateniinin kalvolle C4-2-soluissa (kuvio 4B, A4-D4). Nämä tiedot viittaavat siihen, että PKD1 on rooli kurkuma välittämää rikastuminen kalvo β-kateniinin eturauhasen syöpäsoluja.

A). Hiljentäminen PKD1 mukaan PKD1 erityisiä siRNA. C4-2-solut transfektoitiin 48 tuntia 25 nM ohjaus siRNA tai PKD1 siRNA, hajotettiin ja immunoblotattiin varten PKD1 ja β-aktiini käyttäen spesifisiä vasta-aineita. Kvantitointi proteiinin juovien voimakkuudet suoritettiin densitometrisellä analyysi. PKD1 tasot normalisoitiin p-aktiini tasot ja piirretään. Auto- mielivaltaisia ​​yksiköitä. Immunoblottaus osoittaa yli 95% suppressio PKD1 ilmentymisen transfektion PKD1 erityisiä siRNA (kaista 2) verrattuna kontrolliin siRNA-transfektoiduissa soluissa (kaista 1). B). Suppressio PKD1 estää rikastaminen kalvo β-kateniinin tasoja. C4-2 soluja viljeltiin peitinlaseil- yössä. Solut transfektoitiin ensin joko ohjaus siRNA (A1-D1, A2-D2) tai PKD1 vaimennusaineita siRNA (A3-D3, A4-D4) 24 tuntia, minkä jälkeen seuraa käsittely ajoneuvon ohjaus (DMSO) (A1-D1; A3 -D3) tai kurkumiini (20 uM) (A2-D2, A4-D4) 1 tunnin ajan. Solut immunovärjättiin β-kateniinin (punainen) tai PKD1 (vihreä) ja tuma laskuri värjättiin DAPI (sininen). Korkeampi β-kateniinin värjäytyminen havaittiin solun pinnalla ohjaus siRNA solujen 1 h curcumin hoidon (A2) verrattuna vehikkelillä (A1). Kuitenkin, siRNA-välitteisen vaimentaminen PKD1 (B3, B4) esti curcumin välittämää rikastuminen kalvon β-kateniinin värjäys solun pinnalla (A4 vs A3 ja A2). Alkuperäinen Suurennukset 600 × 2 × zoom.

Curcumin vaimentaa ydin- β-kateniinin signalointi

PKD1 moduloi β-kateniinin signalointireitin vuorovaikutuksessa, fosforyloimalla ja moduloimalla solunosasijaintia ja estämällä transkription aktiivisuus ydin- β-kateniinin [12]. Havaitsimme maksimaalinen PKD1 aktivointi curcumin hoitoa 1 h (kuvio 2B). Ohimenevä aktivoituminen PKD1 on osoitettu olevan pitkän aikavälin alavirtaan solujen vaikutuksia [12], [17]. Näin ollen, olemme edelleen määritti kurkumiinista kalvon β-kateniinin lokalisointi 24 tunnin kuluttua hoidon käyttämällä konfokaalimikroskopialla (kuvio 5A). Korkeampi kalvo β-kateniinin lokalisointi yhdessä alentunut soluliman β-kateniinin soluissa havaittiin 24 h curcumin hoidon (kuvio 5A). Lisäksi, 24 h kurkumiini hoitoa myös muuttanut solunosasijaintia PKD1 (kuvio 5A). Kun taas kontrollisolut, PKD1 oli ensisijaisesti sijaitsi sytoplasmassa, kurkumiini käsitellyt solut osoittivat PKD1 lokalisointi kalvo ja tumassa (kuvio 5A).

A) vaikutus curcumin hoidon solun lokalisoinnin β- kateniinin ja PKD1. C4-2 solut käsiteltiin curcumin (20 uM) tai DMSO: ssa 24 tuntia immunovärjättiin β-kateniinin (vihreä) tai PKD1 (punainen) ja vasta-värjättiin DAPI (sininen). Curcumin käsitellyt solut osoittivat alempi sytoplasmista ja korkeamman kalvo β-kateniinin värjäys verrattuna hallita soluihin. Lisäksi, kun PKD1 on pääasiassa sijaitsi sytoplasmassa kontrollisoluissa, kurkumiini käsitellyt solut osoittivat värjäytymistä ensisijaisesti solukalvon ja tuman (valkoiset nuolet), ja heikko sytoplasminen värjäys. Alkuperäinen Suurennukset 600 × 2 × zoom. B) vaikutus curcumin ydinaseiden β-kateniinin tasoja. Nuclear proteiinit eristetään C4-2 soluista hoidettu joko curcumin (20 uM) tai DMSO erotettiin PVDF kalvo ja käsiteltyjen immunoblottauksella käyttäen β-kateniinin vasta-aine. Histoni H1-proteiinia käytettiin latauskontrollina. Densitomet- kvantitoimiseksi β-kateniinin juovien voimakkuudet, normalisoida histoni H1 tasot on esitetty kaaviossa. Curcumin hoito merkittävästi vähentynyt tasot ydin- β-kateniinin verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin. Auto- mielivaltaisia ​​yksiköitä. C) vaikutus kurkumiinista β-kateniinin transkription aktiivisuus C4-2 eturauhasen syöpäsoluja. Β-kateniinin transkription aktiivisuus mitattiin lyhytaikaisesti transfektoimalla solut TCF lusiferaasireportteri–konstrukti, joka sisältää joko TCF-promoottorin sitoutumiskohtia (pTOP-FLASH) tai mutantti-TCF-promoottori sitoutumiskohtia (pFOP-FLASH) yhdessä sisäisen tarkastuksen plasmidilla, joka sisältää

Renilla

lusiferaasigeeni (PRL-TK). 3 tunnin kuluttua solut käsiteltiin kurkumiini (20 uM) tai DMSO: ta 24 tuntia. Β-kateniinin transkription aktiivisuus oli ensimmäinen normalisoitiin

Renilla

lusiferaasivaikutusta, ja ilmaistiin suhteena pTOP-FLASH /pFOP-FLASH aktiivisuutta. Aktiivisuus curcumin käsiteltyjen solujen normalisoitiin aktiivisuuden ajoneuvojen käsiteltyjen solujen (katsotaan 100%). Curcumin hoito vähensi merkitsevästi β-kateniinin transkription aktiivisuutta C4-2 soluissa verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin. Mean ± SE, n = 3, * p 0,01. D). Vaikutus kurkumiinista transkription sykliini D1. Transkription sykliini D1 analysoitiin käsiteltyjen solujen kurkuma tai ajoneuvon hallinnan 24 tuntia. Sen jälkeen, kun käänteisen transkription RNA: n cDNA: n, PCR-monistus sykliini D1 tai sisäinen kontrolli GAPDH suoritettiin käyttäen geenispesifisiä alukkeita. Monistetut tuotteet erotettiin 1% agaroosigeelillä. Densitometriset kvantitoimiseksi sykliini D1 kaistaintensiteettejä normalisoitu GAPDH tasolle on esitetty kaaviossa. Curcumin hoito vähensi ilmaus sykliini D1. Auto- mielivaltaisia ​​yksiköitä. E). Immunoblot-analyysit. Solulysaatit valmistettiin kurkumiini (20 uM) tai DMSO: ta käsiteltiin C4-2-solut erotettiin SDS-PAGE: lla ja käsitellään immunoblottauksella käyttäen spesifisiä vasta-aineita. Curcumin hoito merkittävästi vähentynyt sykliini D1 ilmentyminen, kun taas mitään vaikutusta ei havaittu ilmentyminen koko β-kateniinin, E-kadheriinin tai Wnt 3a. Edustavia immunobloteissa kolmen kokeen näkyvät.

β-kateniinin on kriittinen tekijä Wnt signalointiryöpyn. Nuclear β-kateniinin toimii yhteistyössä transkriptiotekijän muodostamalla kompleksin TCF ja parantaa ilmaisun useita molekyylejä, joilla on pro-onkogeenisen rooleja, mukaan lukien sykliini-D1, c-myc sekä c-jun. Koska PKD1 moduloi solunosasijaintia β-kateniinin ja koska curcumin välitteisen PKD1 aktivointi tehostaa kalvon lokalisaatio β-kateniinin, olemme analysoineet vaikutus tämän aktivoinnin ydinaseiden β-kateniinin ilmentymistä käyttäen immunoblottauksen ja β-kateniinin transkription aktiivisuus käyttämällä lusiferaasia reportteri järjestelmä C4-2 eturauhassyövän solut (kuviot 5B ja 5C). Curcumin hoito vähensi merkittävästi ydin- ilmentymistä β-kateniinin verrattuna dimetyylisulfoksidi (DMSO) käsiteltyjen solujen (kuvio 5B). Väheneminen ydin- β-kateniinin tasoilla korreloi vaimennuksen β-kateniinin transkription aktiivisuutta C4-2 (kuvio 5C). Jotta voitaisiin määrittää alavirran vaikutukset tukahdutetaan β-kateniinin aktiivisuutta, ilmentymisen sykliini D1 analysoitiin curcumin käsiteltiin C4-2-soluja. Mielenkiintoista, heikkenee huomattavasti ilmaus sykliini D1 mRNA (kuvio 5D) ja proteiinin tasot (kuvio 5E) havaittiin curcumin käsitelty C4-2 soluja. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös reaaliaikaisella PCR-analyysi (tietoja ei esitetty). Kuitenkin, mitään ilmeistä muutosta ei havaittu ilmentymistä Wnt 3a, β-kateniinin ja E-kadheriinin (kuvio 5E).

määritettiin myös vaikutus kurkumiinista β-kateniinin transkription aktiivisuus LNCaP-soluissa. Samanlainen C4-2-soluja, kurkumiini esti β-kateniinin transkription aktiivisuus (kuvio S3A) ja huomattavasti vähentynyt ilmentyminen sykliini D1 (kuvio S3B) LNCaP-soluissa.

Curcumin hoito estää onkogeeninen fenotyyppi eturauhassyöpäsoluissa

Tehostettu klonogeeniset potentiaali ja laski solu-soluadheesion ovat kaksi tärkeää ominaisuuksia syövän kasvua ja etäpesäkkeiden. Klonogeenisten kasvu ominaisuus on tarpeen syöpäsolujen perustaa primaarisen kasvaimen ja lopulta etäispesäkkeitä. Siksi tutkimme kyky curcumin estää kiinnittymisestä riippuvaisille ja ankkurointi riippumattomien pesäkkeiden muodostumista. Curcumin hoito esti kiinnittymisestä riippuvaisille ja kiinnityspisteen riippumattomien pesäkkeiden muodostumista annoksesta riippuvalla tavalla C4-2 eturauhassyövän soluissa (kuvio 6A, B). Anchorage riippumaton määrityksissä, curcumin hoitoon paitsi vähensi pesäkkeiden, vaan myös vähensi koko pesäkkeiden (kuvio 6B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin LNCaP-soluissa (kuvio S3C, D).

A). Anchorage riippuvainen pesäkemuodostusta. C4-2-soluja (2000) maljattiin yön yli, käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla kurkumiinin ja 14 päivää, ja tutkittiin niiden pesäkkeenmuodostuskyvyn. Edustavia kuvia on esitetty. Curcumin osoitti annoksesta riippuvaista inhibitiota kiinnittymisestä riippuvaisille pesäkemuodostusta. Keskiarvo ± SE; n = 3; *

p

0,05. B). Kiinnityspiste riippumaton pesäkemuodostusta. C4-2-soluja siirrostettiin 0,3%: isessa ja käsiteltiin vaihtelevilla curcumin varten 9 päivää. Pesäkkeiden lukumäärä laskettiin ja piirrettiin. Curcumin hoito esti ankkurointi riippumaton pesäkkeiden muodostumista C4-2 soluja. Keskiarvo ± SE; n = 3;

* p

0,01. C) Cell-cell -aggregaatioanalyysi. C4-2-soluja käsiteltiin kurkumiini (15 uM) tai DMSO: ssa 1 h kerättiin ja niistä määritettiin solu-solu-aggregaatiota inkuboimalla varovasti ravistellen olosuhteissa 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5 mM CaCl

2. 6 tunnin kuluttua inkuboinnin alikvootti reaktioseos analysoitiin ja valokuvattiin solu-solu-aggregaatiota alle faasikontrastimikroskooppia. Suurempi solu-solu-aggregaatit havaittiin curcumin käsitellyissä soluissa verrattuna DMSO-kontrollin soluihin. Alkuperäinen Suurennukset 100 ×.

Cell-soluadheesiota helpottaa solujen välinen kadheriinin-kadheriinin vuorovaikutus. Lisääntynyt kalvo lokalisointi β-kateniinin vahvistaa kadheriinin-kateniinin vuorovaikutusta ja parantaa siten solu-solu-vuorovaikutuksia [12]. Sen määrittämiseksi vaikutuksen tehostettu kalvo lokalisaation β-kateniinin, curcumin käsitelty C4-2 ja PKD1 yliekspressoivat C4-2 soluja (C4-2-PKD1), arvioitiin solu-aggregaatiota. Curcumin käsiteltiin C4-2 solut muodostivat suurempi solu-solu-aggregaatit kontrolliin verrattuna käsiteltyjen solujen (kuvio 6C). Mielenkiintoista, kun taas C4-2-PKD1 muodostunut suuri solu aggregaatteja, paljon suurempi solu-solu-aggregaatit havaittiin heti curcumin hoidossa näiden solujen (kuva S4). Nämä tiedot sotkea roolin kurkuma aktivaatio PKD1 solu-aggregaatiota.

Curcumin inhiboi solun liikkuvuus kautta PKD1 välittämän cofilin fosforylaation

Syöpäsolut yleensä ilmenee pa- solun motiliteettia helpottamiseksi etäpesäkkeitä. Näin ollen kyky chemopreventive tai kemoterapeuttisen aineen estävän solun liikkuvuus auttavat estämään syövän etäpesäke. Siksi tutkimme vaikutus kurkumiinista soluliikkuvuus käyttämällä ”haavan paranemista” ja Boyden kammioon määrityksiä. Kontrolliin verrattuna, kurkumiini hoito esti solun motiliteettia C4-2 eturauhassyöpäsolujen molemmissa määrityksissä (kuvio 7A, B). Samanlainen vaikutus solujen liikkuvuuteen havaittiin myös LNCaP (kuvio S3E).

A). Scratch määritys. C4-2 soluja kasvatettiin, kunnes konfluentteja, laattoina sisältäviä IBIDI inserttejä. Insertit poistettiin levyistä tuottaa aukkoja (kiinteä valkoinen viivat esittävät raon leveys; katkoviivoilla rajaa rako) ja vaihe kontrasti kuvia samalla alueella aukkoja otettiin vaihtelevin aikavälein läsnä ollessa tai poissa ollessa 20 uM curcumin. Curcumin hoito esti motiliteettia C4-2 eturauhasen syöpäsoluja. B). Boyden kammioon määrityksessä. Yhtä suuret määrät C4-2-solut ympättiin Boyden n kammioihin ja inkuboitiin, kun läsnä DMSO: ssa tai kurkumiini (20 uM) 24 tunnin ajan. Siirtyneet solut kiinnitettiin, värjättiin, lasketaan ja piirretään. Curcumin esti motiliteettia C4-2 soluja. Keskiarvo ± SE; n = 3; *

p

0,05. C). Vaikutus curcumin ilmentymistä koskevat aktiini remodeling proteiineja. Kokosoluliuotteista valmistettiin kurkumiini (20 uM) tai DMSO: ta käsiteltiin C4-2 soluja käsitellään immunoblottauksella käyttäen spesifisiä vasta-aineita. Densitometriset kvantitoimiseksi proteiiniryhmänä normalisoida p-aktiini taso näkyy kuvaajan. Curcumin indusoi selvästi lisääntynyt ilmentyminen toimeton fosfo-cofilin verrattuna DMSO käsitelty kontrolli soluja. Pieni muutos havaittiin myös ilmaus Arp3. Auto- mielivaltaisia ​​yksiköitä.

erittäin koordinoitua aktiini remodeling taustalla prosessi solujen liikkuvuutta. Remodeling kasvavasta edessä edellyttää orkestroitu toimintaa useiden molekyylien mukana F-aktiini uudelleenjärjestelyä. Aktiini liittyvät proteiinit (Arp) on tärkeä rooli haaroittumista aktiinifilamentin. Proteiini cofilin on aktiini monomeeri tuottavan molekyylin, joka on osallisena aktiinin remodeling. Cofilin aktivoituu linko (SSH) fosfataasin välittämän defosforyloinnilla reaktio ja inaktivoidaan LIM-kinaasi (LIMK)-välitteisen fosforylaation reaktioiden [2], [21]. PKD1 on taidokkaasti mukana estämällä solun liikkuvuus vuorovaikutuksessa, fosforyloimalla ja estämällä toiminnot monien motiliteetin liittyviä proteiineja kuten ritsa 1 like (SSH1L) fosfataasi [21]. Koska curcumin aktivoitu PKD1, pyrimme vaikutuksen tutkimiseksi kurkumiinista toiminnan ja tasot cofilin ja Arp3 proteiinin immunoblottauksella. Curcumin käsittely lisäsi tasot aktiivinen fosfo-cofilin in C4-2 eturauhasen syöpäsolujen, joilla on vähän tai ei lainkaan vaikutusta ilmaisun kokonaisproteiinista (kuvio 7C). Curcumin hoito aiheutti myös lievää laskua ilmentymisen Arp3 proteiinia. Nämä tiedot viittaavat mahdolliseen rooliin PKD1 vuonna curcumin estoa soluliikkuvuus

kautta

cofilin fosforylaation.

In vivo

vaikutuksia kurkumiinista eturauhassyövän kasvua

ksenografti hiiri mallia käytettiin tutkimaan

in vivo

vaikutus kurkumiinista eturauhasen kasvaimen kasvua ja β-kateniinin solunosasijaintia. Nude-hiiriin inokuloitiin subkutaanisesti androgeeni-riippumaton C4-2-soluja. Kasvaimen kehitys, hiirille annettiin sisäisen kasvaimen injektiot kurkuma tai ajoneuvon hallinnan. Päivänä 7 kasvaimen tilavuudet mitattiin ja kasvaimen kasvunopeus seuraavista curcumin hoidon määritettiin. Curcumin tehokkaasti inhiboi kasvaimen kasvua yli kaksi taittuu verrattuna kontrolli-käsiteltyjen hiirten (*

p

0,05) (kuvio 8A). Lisäksi havaitsimme muutos β-kateniinin solunosasijaintia in curcumin kasvaimen kudokset (kuvio 8B), samanlainen kuin

in vitro

havainnot (kuva 3 ja 5A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kurkuma estää eturauhassyövän kasvua säätelemällä β-kateniinin toimintoja.

A) vaikutus kurkumiinista eturauhasen syövän kasvua. C4-2 eturauhassyövän soluja käytetään tuottamaan ksenografteina nude-hiirissä. Kasvaimen kehitys, hiiriä käsiteltiin sisäistä tumorally kurkumiinin kanssa (n = 4) tai DMSO: ta (n = 3). Nopeus kasvaimen kasvua mitattiin 7 päivää ja prosentuaalinen kasvaimen kasvua seuraava hoito piirretään. Curcumin tehokkaasti estää eturauhassyövän kasvua. B) vaikutus kurkumiinista β-kateniinin lokalisointi. Kasvain kudoksia curcumin tai kontrollikäsitellyt hiiriä käsitellä IHC värjäystä käyttäen anti-β-kateniinin vasta-aine. Tehostettu värjäys membranous β-kateniinin havaittiin curcumin käsitellyissä hiirissä verrattuna kontrollihiiriin. Alkuperäinen Suurennukset 400 ×.

Keskustelu

häiriöstä PKD1, seriini-treoniinikinaasi, on liittynyt syövän etenemisessä [2], [4], [6]. PKD1 on ilmaistu korkeimmalla tasolla eturauhanen ja on keskeisessä asemassa normaalin fysiologian eturauhasen [9], [10]. Edellinen työ meidän laboratorio on paljastanut yhdistys PKD1 downregulation kanssa etenemistä eturauhassyövän [3], [11]. Meidän edellinen työ on myös valaistu roolia PKD1 E-kadheriinin fosforylaation, modulaatio soluliikkuvuus ja solu-solu aggregaation eturauhassyövän soluissa [13]. Lisäksi olemme osoittaneet, PKD1 vuorovaikutuksessa, fosforyloivat ja funktiota moduloivien β-kateniinin [12]. Luonnollinen makrolaktoni Bryostatiini 1 aktivoi PKD1 eturauhassyöpäsoluissa [12]. Aktivoitu PKD1 fosforyloi ja translokoituu ydin- β-kateniinin tumasta jolloin eston β-kateniinin /TCF transkriptionaalista aktiivisuutta [12]. Siten luonnollisia yhdisteitä, jotka moduloivat PKD1 aktivaatio voisi auttaa ehkäisyssä ja eturauhassyövän hoitoon. Curcumin on luonnollinen yhdiste, joka on tällä hetkellä kliinisissä tutkimuksissa ehkäisyyn ja hoitoon eri syöpiä [33] – [35]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että curcumin aktivoi PKD1, vaimentaa β-kateniinin /TCF transkriptionaalisen aktiivisuuden ja rikastaa kalvo β-kateniinin tuloksena tukahduttaminen eturauhassyövän kasvua.

β-kateniinin on monitoiminen proteiini, joka soittaa tärkeä rooli ontogenesis ja oncogenesis. Yhdessä TCF ja p300, se toimii transkriptiotekijän Wnt signalointireitillä [36]. Lisäksi β-kateniinin, sekä E-kadheriinin toiminnot solukalvon kriittiseksi osa vyöliitos parantaa solu-soluadheesion [37]. Siten dysregulaatio β-kateniinin on liittynyt kehittämiseen monia erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien eturauhassyöpä [36], [38], [39]. Olemme aiemmin osoittaneet uusi mekanismi β-kateniinin sääntelyn toiminnan kautta PKD1 [12]. Tässä me ovat osoittaneet, että kurkuma aktivoi PKD1 1 tunnin kuluessa hoidon (kuvio 2B). Lisäksi, käyttäen toimittaja lusiferaasianalyysissä, olemme osoittaneet, että β-kateniinin inhiboi curcumin, seuraavat PKD1 aktivaation (kuvio 5C).

Koska β-kateniinin on tärkeä signalointimolekyylin, sen toimintoja säädellään useiden reittien [40]. Vaikka kurkumiini on osoitettu estävän β-kateniinin /TCF transkription aktiivisuus [41], sen molekyylitason mekanismeja ei täysin tunneta. Tässä me ensimmäistä kertaa osoitettu, että curcumin vaimentaa β-kateniinin /TCF transkription aktiivisuutta

kautta

aktivaation PKD1 eturauhasen syöpäsoluja. Tutkimukset ovat myös raportoitu eston β-kateniinin transkriptionaalisen aktiivisuuden, kun curcumin hoitoon koolonkarsinoomasoluissa kautta kaspaasi-3-välitteinen hajoaminen β-kateniinin [42]. Emme kuitenkaan ole tarkkailla merkitty väheneminen yleisessä β-kateniinin ekspressiotasot eturauhassyöpäsolulinjoissa. A). C). A). A). C). * P 0,05.