Krooninen sairaus

tiivistelmä

Scoparone, luonnollinen yhdiste eristettiin

Artemisia capillaris

, on käytetty Kiinan kasviperäisten lääkeaineiden hoitoon vastasyntyneen keltaisuutta. Signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STST3) edistää kasvua ja selviytymistä moniin ihmisen kasvaimista. Tämä tutkimus tehtiin sen tutkimiseksi anti-kasvain aktiivisuus scoparone vastaan ​​DU145 syöpäsolujen ja onko sen vaikutukset välittyvät estämällä STAT3 toimintaa. Scoparone esti leviämisen DU145 soluihin solusyklin pysähtymisen G

1 vaihe. Ohimenevä transfektio määritykset osoittivat, että scoparone tukahdutettu sekä konstitutiivista että IL-6-indusoidun transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3. Western blot ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysit osoittivat, että scoparone tukahdutti transkription STAT3 kohdegeenien, kuten sykliini D

1, c-Myc, surviviini, Bcl-2, ja Socs3. Tämän mukaisesti scoparone vähentynyt fosforylaatio ja ydinvoiman kertyminen STAT3, mutta ei vähentänyt fosforylaatiota Janus-kinaasi 2 (JAK2) tai Src, suuret ylävirran kinaasien vastuussa STST3 aktivointia. Lisäksi transkriptionaalista aktiivisuutta konstitutiivisesti aktiivisen mutantin STAT3 (STAT3C) estyi scoparone, mutta ei AG490, joka on JAK2 estäjä. Lisäksi scoparone hoito tukahdutti ankkurista riippumaton kasvu pehmeässä agarissa ja kasvaimen kasvua DU145 nude-hiirissä, samanaikainen alentaminen STST3 fosforylaatioon. Tietokonemallintaminen ehdotti, että scoparone voisi sitoa SH2 verkkotunnus STAT3. Tuloksemme viittaavat siihen, että scoparone saa aikaan kasvaimen vastaisen vaikutuksen vastaan ​​DU145 syöpäsolujen osittain estämällä STAT3 toimintaa.

Citation: Kim J-K, Kim J-Y, Kim H-J, Park K-G, Harris RA, Cho W-J, et al. (2013) Scoparone Kiinnostavuus Anti-Tumor Activity vastaan ​​DU145 syöpäsolujen kautta inhibitio STAT3 Activity. PLoS ONE 8 (11): e80391. doi: 10,1371 /journal.pone.0080391

Editor: Michael Muders, University Hospital Carl Gustav Carus Dresden, Saksa

vastaanotettu: toukokuu 31, 2013; Hyväksytty: 2. lokakuuta 2013. Julkaistu: 15 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: hänen työnsä tukivat avustuksia National Research Foundation [2012R1A2A2A01043867, 2012R1A2A1A03670452, ja Basic Science Research Program (2012-0001350)] rahoittama tiede, ICT Tulevaisuuden suunnittelu ja avustus Korean Health teknologian t Welfare, Korean tasavalta (A111345). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi yleisin syöpä ja kuudenneksi yleisin syy syövän kuoleman miehillä maailmanlaajuisesti [1]. Vaikka metastaattinen eturauhassyöpä reagoi aluksi androgeenideprivaatio hoitoa, useimmat potilaat lopulta edetä tilaan kastraatio vastustuskykyisten eturauhassyöpä (CRPC) [2,3]. Vaikka doketakselin kemoterapian, hoito metastasoituneen CRPC edelleen suuri kliininen haaste. Tässä yhteydessä signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STST3) signalointireitin on validoitu lupaava terapeuttinen kohde metastaattisessa eturauhassyövän: tämä proteiini on poikkeuksellisesti aktivoitu eturauhassyövässä ja edistää edistämiseen metastasointiin [4,5 ].

STAT3, yksi seitsemästä STAT perheen transkriptiotekijöiden, toimii alavirtaan efektori erilaisten sytokiinien, kasvutekijöiden ja hormonien, kuten IL-6, epidermaalinen kasvutekijä (EGF), ja leptiinin [6-9]. Vasteena solunulkoisten ärsykkeisiin, STAT3 aktivoidaan kautta fosforylaation Y705 ja S727 ei-reseptorityrosiinikinaasien, mukaan lukien JAK2: n ja Src, ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK: t) [10-12]. Fosforyloituu STAT3 proteiinit muodostavat dimeerejä että translokoituvat tumaan, jossa ne säätelevät transkription alavirtaan kohdegeenien. Vaikka sen fosforylaatio on ohimenevä ja tiukasti säädeltyä normaalissa ei-transformoitujen solujen, STAT3 on jatkuvasti aktivoitu erilaisissa ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien hematologiset maligniteetit (leukemia, multippeli myelooma ja lymfooma) ja kiinteitä kasvaimia (pään ja kaulan okasolusyöpä [HNSCC] , melanooma, paksusuolen, hepatooma, rinta-, ja eturauhasen syövät) [13-17]. Useat tutkimukset ovat saatu vakuuttavia todisteita onkogeenisel- rooli konstitutiivisesti aktiivisen STAT3 [13-20]. Pysyvät aktivointi STAT3 edistää monipuolista tuumorigeenisemmiksi ja metastasoituneen prosesseja transkription säätely eri geenien soluproliferaatiota (sykliini D

1, c-Myc, ja p21), eloonjääminen (Bcl-2, Mcl-1, ja surviviinia), etäpesäkkeiden (MMP-2 ja MMP-9), ja angiogeneesiä (VEGF). Siksi STAT3 nyt katsotaan edustavan lupaava molekyylikohteena kehittämiseen syövän hoitomuotoja käytetään sekä suoria että epäsuoria lähestymistapoja [13,14,21].

Scoparone (6,7-dimethoxycoumarin), suuri osatekijä Kiinan yrtti

Artemisia capillaris

(yin leuka), on käytetty hoitoon vastasyntyneen keltaisuutta Aasiassa [22,23]. Suojaava vaikutus scoparone vastaan ​​hyperbilirubinemian välittyy aktivoimalla konstitutiivisen androstane reseptori (CAR), ydin- hormonin reseptori, joka toimii transkriptiotekijä upregulate ilmentymistä osallistuvien entsyymien bilirubiinin puhdistumaan. Scoparone myös hallussaan useita muita biologisia ominaisuuksia, kuten antikoagulanttia, hypolipidemic, vasorelaxant, antioksidantti, ja anti-inflammatorisia vaikutuksia [24-28]. Esto transkriptionaalista aktiivisuutta tumatekijä-kappaB (NF-KB) näkyy vastuussa sen anti-inflammatorinen vaikutus [28]. Kuitenkin mahdollinen anti-kasvain aktiivisuus scoparone ja sen molekyyli- tavoitteet, muut kuin CAR: n ja NF-KB: n ei ole tutkittu laajasti. Tässä tutkimuksessa arvioimme kasvaimen vastainen aktiivisuus scoparone vastaan ​​DU145 androgeeni-riippumaton eturauhasen syövän solujen ja todettiin, että sen molekyyli- vaikutusmekanismit estoon liittyvän STAT3: n aktiivisuuden.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja plasmidirakenteet

Scoparone (6,7-dimethoxycoumarin), AG490 (a JAK2 estäjä), TNF-α, forskoliini (FSK), ja forboli-12-myristaatti-13-asetaatti (PMA), olivat Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). IL-6 saatiin BD Biosciences (San Jose, CA, USA). M67-Luc reportterikonstruktista ja ekspressiovektorit villityypin STAT3 tai konstitutiivisesti aktiivinen muoto STAT3 (STAT3C) [20] oli ystävällinen lahja Dr. James E. Darnell (Rockefeller University, New York, NY, USA) . Reportteri konstruktioita (NF-KB-Luc, AP-1-Luc, CRE-Luc, ja Egr-1-Luc) ja ilmentämisvektorilla Egr-1 kuvattiin aiemmin [29]. PTOPFLASH lusiferaasireportteri- konstrukti [30] ja ekspressiovektorin määräävän aktiivisen mutantin ihmisen β-kateniinin (An-β-kateniinin), joka sisälsi lukukehyksessä N-pään aminohapon deleetio 29-48 [31] ystävällisesti lahjoitti Dr. Hans Clevers (University Medical Center Utrecht, Utrecht, Alankomaat) ja Dr. Frank McCormick (University of California, San Francisco, CA, USA), tässä järjestyksessä. Tuottaa Vxy Puro-Luc rakentaa, cDNA, joka koodaa tulikärpäsen lusiferaasi monistettiin PCR: llä ja insertoitiin

Bam

H1

/Xho

1-kohtiin plasmidin Vxy-puro-[12].

Ethics selvitys

Kaikki kokeelliset menetelmät suoritettiin tiukasti mukaisesti sopivan hoitokäytännön eläintutkimukseen. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden että Kyungpook National University (Luvan numero: 2013-0015).

Soluviljely ja ohimeneviä transfektioanalyysissä

Ihmisen eturauhassyöpäsolulinjoissa (DU145 ja PC-3), joka on ikuistettu ihmisen eturauhasen epiteelisolujen linja (RWPE-1), ihmisen rintasyöpä solulinjoissa ( MCF-7 ja MDA-MB-231), ihmisen hepatosellulaarisen karsinooman solulinjoissa (HepG2 ja Hep3B), kohdunkaulan syövän solulinja (HeLa), ja paksusuolen syöpäsolulinjoissa (HT-29, HCT-116, ja HCT-15) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). DU145, PC-3, MDA-MB-231, HeLa, HT-29, HCT-116, ja HCT-15-soluja kasvatettiin RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS ; Hyclone, Logan, UT, USA) ja antibiootteja. MCF-7 ja Hep3B-soluja kasvatettiin DMEM: ssä (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja antibiootteja. RWPE-1-soluja kasvatettiin täydellisessä Keratinosyyttien seerumittomassa elatusaineessa (K-SFM; Invitrogen), joka sisälsi 50 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta, 5 ng /ml ihmisen rekombinantti EGF, ja antibiootteja. HepG2-soluja viljeltiin MEM (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja antibiootteja. Ohimeneviä transfektion määrityksissä, HepG2 (8 x 10

4), DU145 (3 x 10

4), ja PC-3 (3 x 10

4) Solut siirrostettiin 24-kuoppalevyille ja transfektoitiin jossa M67-Luc reportterikonstruktista (200 ng /kuoppa) kanssa tai ilman ekspressiovektorilla (100 ng /kuoppa) joko villityypin tai konstitutiivisesti aktiivisen mutantin STAT3 (STAT3C) käyttäen TransIT-LT1 transfektioreagenssi (Mirus Bio LLC, Madison, WI, USA). HepG2-solut transfektoitiin myös pTOPFLASH tai Egr-1-Luc toimittaja plasmidit (200 ng /kuoppa) kanssa tai ilman ekspressioplasmidien (100 ng /kuoppa) An-β-kateniinin tai Egr-1, vastaavasti. pSV40-β-galaktosidaasi-ilmentyminen plasmidia käytettiin sisäisenä kontrollina. 24 h transfektion jälkeen, soluja stimuloitiin IL-6 (10 ng /ml) 24 tunnin ajan, jos vaaditaan, ja sitten korjataan lusiferaasi ja β-galaktosidaasi määrityksissä. Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin vastaan ​​β-galaktosidaasin aktiivisuus.

Soluproliferaatiomääritys

soluproliferaatiomääritykset suoritettiin käyttäen WST-8 soluproleferaatiomäärityksessä kit, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheytenä 1,5 x 10

3 solua /kuoppa ja ilman seerumia 24 tuntia. Soluja stimuloitiin sitten 10% FBS: ää, kun läsnä on 0,1% DMSO: ta (vehikkeli) tai 0,1, 1, 10, 50, 100, 200, 500 tai 1000 pmol /l scoparone 72 tuntia. Sitten soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 2 tunnin ajan väliaineessa, joka sisältää WST-8-reagenssia (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani). Absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin määrittämiseksi solujen lisääntymisen.

virtaussytometrinen analyysi solusyklin

Virtaussytometrinen solusyklin analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, DU145 soluja (4 x 10

5 solua /100 mm viljelyastia) on synkronoitu G

0 /G

1 vaihetta seerumistarvaatio 24 tuntia. Perustuen aiemman raportin [32] osoittaa, että seerumin puutteessa DU145 soluja eteni G

1 S-vaiheen solusyklin kuluttua 27,5 h seerumin stimulaation, soluja stimuloitiin 10% FBS: n läsnä ollessa 0,1% DMSO tai scoparone (0,5 ja 1 mmol /l) 28 tuntia. Solut kerättiin, ja sitten analysoitiin FACSCalibur virtaussytometrillä (BD Bioscience).

Western blot-analyysi

Western blot-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu vähäisin muutoksin [12,29]. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin Immobilon-P-kalvolle (Millipore, Billerica, MA). Blokkauksen jälkeen kaivoa inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla vastaan ​​sykliini D

1, fosfo-pRb (ppRB), JAK2, fosfo-JAK2 Tyr1007 /1008 (pJAK2), Src, fosfo-Src-Tyr416 (pSrc), STAT3, fosfo-STAT3 Tyr705 (pSTAT3 Y705), fosfori-STAT3 Ser727 (pSTAT3 S727), surviviinia, c-Myc, SOCS3, ja Bcl-2 (Cell Signaling, Beverly, MA, USA); Sykliini E (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), ja β-aktiini (Sigma-Aldrich). Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) – tai IRDye-konjugoitu (IRDye 800CW ja IRDye 680LT, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) sekundaarisia vasta-aineita, ja signaalit havaittiin käyttämällä ECL Western blot -menetelmän avulla (Amersham , Buckinghamshire, UK) tai Odyssey Infrapuna Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA), tässä järjestyksessä. β-aktiini käytettiin proteiinin lastaus ohjaus. Signaali-intensiteetit kvantitoitiin densitometrisesti käyttämällä Image J ohjelmisto ja normalisoidaan vastaavat β-aktiini-signaaleja.

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analyysi

DU145-soluja inkuboitiin scoparone 1, 3, 6, 12 tai 24 h. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen QIAzol hajotusreagenssia (Qiagen, Valencia, CA, USA), ja 1 ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen RevertAid First Strand cDNA-synteesi kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) valmistajan ”ohjeet. Sillä qRT-PCR, 25-50 ng cDNA: ta käytettiin PCR-monistamiseen (hehkutus lämpötila: 60C) käyttäen Virta SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, Iso-Britannia) kanssa VIIa ™ 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems ). Hapan ribosomaalinen fosfoproteiini P0 (RPLP0; 36B4) käytettiin sisäisenä kontrollina. PCR kunnossa ja alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1.

Immunofluoresenssianalyysi

DU145-solut ympättiin lasipeitinlevyille ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Perustuu Western blot tulokset osoittavat vähentää pysyvästi STAT3 fosforylaatio 2-6 tunnin kuluttua scoparone hoidon, soluja käsiteltiin scoparone (0,5 mmol /L) 4 tuntia. Solut kiinnitettiin 95% etanolissa 15 minuutin ajan -20 ° C: ssa, ja sitten inkuboitiin vasta-aineiden pSTAT3 (Y705) tai STAT3 seurasi inkubointi Alexa Fluor 488- tai Alexa Fluor 568-leimattuja sekundaarisia vasta-aineita, vastaavasti. Solutumat värjättiin DAPI ja konfokaalisella kuvat saatiin ja yhdistettiin.

Anchorage riippumattoman kasvun määrityksessä

Soft agar pesäkkeiden muodostumisen määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu vähäisin muutoksin [12]. DU145 (1 x 10

4) solua 1,5 ml: ssa kasvualustaa sekoitettiin 1,5 ml: lla 0,5% agaroosia lämmitettiin sisältävään kasvualustaan ​​ajoneuvon (0,1% DMSO) tai 50, 100 tai 200 umol /l scoparone ja kerrokseksi 0,5% emästä agar 60 mm soluviljelymaljoille. Sisältävä elatusaine scoparone lisättiin vain kerran; myöhemmin, väliaine ilman scoparone lisättiin viikottain 21 päivää, kunnes suuria pesäkkeitä olivat selviä. Solut värjättiin kristallivioletilla pesäkkeiden laskentaa.

Molekyylimallinnus ja telakoinnin tutkimus

molekyylimallitus ja telakoinnin tutkimus tehtiin käyttämällä Surflex-Dock SYBYL versiossa 8.1.1 mukaan Tripos Associates (St . Louis, MO, USA), kuten aiemmin on kuvattu [33]. Kiderakenne STAT3 haettiin Protein Data Bank (PDB ID-koodi 1BG1) ja hienostunut varten telakointi prosessi [34]. Rakenne scoparone luotiin käyttämällä SYBYL paketti standardin side pituudet ja kulmat, ja minimoida käyttämällä konjugaattigradienttimenetelmä kunnes kaltevuus oli 0,001 kcal /mol kanssa Tripos voimakenttä. Gasteiger-Huckel maksu, jossa etäisyys riippuva dielektrinen funktio, sovellettiin minimointiprosessi. Kuva ennustetun vuorovaikutus luotiin molekyyli grafiikkaohjelmalla MOLCAD. Ajamisen jälkeen Surflex-telakointiaseman conformer paras kokonaispistemäärä valittiin ja käytettiin ennustamaan yksityiskohtaisten sitovien kuvioita onkaloon.

vakaiden solulinjojen ilmentävien tulikärpäsen lusiferaasi

Voit luoda retrovirukset ilmentävien tulikärpäsen lusiferaasi, Phoenix solut transfektoitiin Vxy Puro-Luc-konstrukti, kuten aiemmin on kuvattu [12]. DU145 solut transdusoitiin retrovirusten ilmentävien tulikärpäsen lusiferaasi ja valitaan puromysiinin (1 ug /ml) 2 viikon ajan. Valitut DU145 (DU145-Luc) solut tarkastettiin lusiferaasiaktiivisuus ja anti-proliferatiivista vaikutusta scoparone (julkaisemattomia tuloksia).

Vieraslajisiirteen kasvainmuoto ja immunohistokemiallinen analyysit

Kuusi viikkoa vanhoja joilta puuttuu kateenkorva BALB /c nude (nu /nu) hiirissä (Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japani) on sopeutunut alla valvotuissa vakio-olosuhteet viikkoa ennen kokeen mukaan opas Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institute of Health. DU145-Luc (5 x 10

6) solua 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin subkutaanisti oikeaan selän kyljen alueelle urospuolisten kateenkorvattomissa nude-hiirten (BALB /c Slc-

nu /nu

, 7viikko vanha). Halkaisija kasvaimen mitattiin ulkoisesti paksuus hallitsija välein 2 päivää, ja kasvaimen tilavuus (mm

3) arvioitiin. 7 päivän jälkeen, kun kasvaimet olivat saavuttaneet keskimääräinen koko on noin 20-25 mm

3, hiiret kuvannetaan IVIS kuvantamisjärjestelmä (Etu Life Sciences, Hopkinton, MA, USA), 10 min: n kuluttua i.p. injektio 100 ui XenoLight D-lusiferiinin (30 mg /ml, Caliper). Sitten eläimet jaettiin sattumanvaraisesti kahteen ryhmään (n = 8 /ryhmä) ja annetaan vatsaonteloon (i.p.) injektioita joko ajoneuvon tai scoparone (30 mg /kg) joka 2-3 päivä ja 18 päivää. Hiiret nukutettiin natriumpentobarbitaalilla (Entobar; Hanlim Pharmaceutical, Yong-In, Korea) ja kuvannetaan IVIS kuvantamisjärjestelmä. Ksenograftikasvaimissa irrotettiin tilavuuden mittauksen ja immunohistokemia. Immunohistokemiallista analyysia varten, kasvaimen kudokset poistettiin, formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin upotettu. Serial 4 um kasvaimen osat poistettiin parafiini ksyleenillä, vedettömät kautta laskeva laadut etanolia, ja joko värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Scoparone nostattaa antiproliferatiivinen vaikutus DU145 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen indusoimalla solusyklin pysähtymisen G

1 vaihe

arvioimiseksi syövän mahdollisuuksia scoparone eturauhasen syöpäsolujen

in vitro

, teimme WST-8-solujen lisääntymisen määrityksessä on kaksi androgeeni-riippumaton ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (DU145 ja PC-3) ja immortalisoitu ihmisen eturauhasen epiteeli- solulinjan (RWPE-1). Scoparone hoito 72 h merkittävästi inhiboivat DU145-solujen, joilla on IC

50-arvo 41,3 umol /l. Kuitenkin lääke kohdistama pieni kasvua estävä vaikutus PC-3 ja RWPE-3-soluja, jotka pitoisuus (kuvio 1A). Kuitenkin, molemmat solulinjat osoittivat alennetussa leviämisen suuremmissa pitoisuuksissa lääkeaineen ( 100 umol /l), joka on myös havaittu useita muita solulinjoja, jotka ovat peräisin rintasyövistä (MCF-7 ja MDA-MB-231), maksasolukarsinoomat (HepG2 ja Hep3B), kohdunkaulan syöpä (HeLa), ja paksusuolen syöpiin (HCT-15 HCT-116 ja HT-29) (kuvio 1A ja kuvio S1), mikä viittaa siihen, että scoparone on yleinen antiproliferatiivinen vaikutus syöpäsoluja.

A ja B. Scoparone estää leviämisen ihmisen syöpäsolujen linjat. Eturauhassyöpäsolut (DU145 ja PC-3), RWPE-1 (immortalisoitu ihmisen eturauhasen epiteelisolujen viiva), ja rintasyövän soluissa (MCF-7 ja MDA-MB-231) olivat ilman seerumia 24 tunnin ajan. Soluja inkuboitiin sitten kasvatusliuoksessa, jota oli täydennetty 10% FBS: n läsnä ollessa ajoneuvon (0,1% DMSO) tai osoitetut pitoisuudet scoparone 72 tuntia, ja solujen lisääntyminen määritettiin WST-8-määrityksessä. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina ajoneuvon ohjaus (määritelty 100%) ja ne edustavat keskiarvoja ± S.E.M. kolmen itsenäisen kokeen, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. B. Scoparone indusoi solusykliä pidätys G

1 vaihe DU145 soluissa. Seerumin puutteessa DU145-soluja stimuloitiin 10% FBS: ää, kun läsnä on ajoneuvon tai scoparone (0,5 ja 1 mmol /l) 28 tuntia, ja sitten suoritettiin virtaussytometria-analyysi solusyklin. Pylväsgrafiikka ilmaisee prosenttiosuuden solujen G

1 vaihe. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM Kolmen itsenäisen kokeen, kukin suoritettiin kaksinkertaisina.

*

P

0.001 vs. ajoneuvon hallinnassa;

#

P

0,005,

##

P

0.001 vs. seerumin stimulaatiota. C. Edustavia Western blot-analyysi solusyklin liittyviä proteiineja. DU145-soluja käsiteltiin scoparone (0,5 mmol /L) ja osoitetut ajat, ja sitten korjataan Western blot-analyysi. D. kvantitointi suhteellisen proteiinin tasoja. Signaali-intensiteetit kvantitoitiin densitometrinen analyysi ja normalisoitu vastaavan β-aktiini-signaalin. Ekspressiotaso kunkin proteiinin ilmaistiin suhteena suhteessa tason valvonta-aikana 0 h, joka on määritelty 1. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

*

P

0,05,

#

P

0,005 vs. ajoneuvon hallinnan kunakin ajankohtana.

edelleen selvittää antiproliferatiivinen vaikutus scoparone johtuu estämällä solusyklin etenemisen tai apoptoosin induktion, suoritimme virtaussytometrianalyysin analyysi solusyklin DU14 soluja, jotka olivat herkkiä kasvua estävää vaikutusta scoparone. Yhdenmukainen aiemman raportin [32], prosenttiosuus DU145 solujen etenee osaksi S-vaiheeseen solusyklin oli merkittävästi lisääntynyt kuluttua 28 h seerumin stimulaatiota. Läsnä ollessa scoparone, seerumin stimuloima kasvu S-faasin solujen populaation väheni, ja solujen määrä G

1 faasi samanaikaisesti lisääntynyt (kuvio 1 B). Kuitenkin osa G

1 huippu, osoittaa apoptoottisen solu- populaatio ei kasvanut scoparone. Siten DU145 soluissa, scoparone indusoi solusykliä pidätys G

1 vaihe ilman induktion apoptoosin.

G

1-vaiheen solusyklin pidätyksen aiheuttama scoparone vahvistettiin lisäksi tutkimalla solujen tasot solusyklin säätelyproteiineja, jotka edistävät G

1-S siirtyminen. Western blot-analyysit paljastivat, että scoparone nostivat solusykliä inhiboivan proteiineja, kuten p21 ja p27, jotka ovat inhibiittoreita sykliini /Cdk-kompleksia (kuvio 1C ja D). Sen sijaan se vähensi tasot solusyklin edistävät proteiinit sykliini D

1 ja fosforyloidun pRb (ppRB), vaikka se oli vain vähän vaikutusta ilmaisun sykliini E. Nämä havainnot osoittavat, että scoparone indusoi G

1-vaiheen solusyklin pidätyksen muuttamalla proteiinien tasoja, jotka vaikuttavat solusyklin etenemisen.

Scoparone estää konstitutiiviset ja IL-6-stimuloidun transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3

tunnistaa transkriptiotekijöiden, että on kohdistettu scoparone, arvioimme sen vaikutus transkriptionaalista aktiivisuutta useiden transkriptiotekijöiden, että tärkeä rooli syöpäsolujen lisääntymistä. Mielenkiintoista on, scoparone suppressoi voimakkaasti IL-6: n stimuloiman STAT3 transkriptionaalista aktiivisuutta (kuvio 2A) ja, kuten on raportoitu, tukahdutettu TNF-α-stimuloitujen NF-KB: n transkriptionaalisen aktiivisuuden. Scoparone myös hieman esti PMA-indusoidun AP-1 aktiivisuutta ja Egr-1 aktiivisuutta, kun se kohdistuu vähäinen vaikutus joko CREB- tai β-kateniinin-riippuvaisen transkription (kuva S2).

. Vaikutus scoparone toiminnasta transkriptiotekijöitä. HepG2-soluja lyhytaikaisesti kotransfektoitiin eri lusiferaasireportterista plasmideja vetämänä synteettiset promoottorit, jotka sisältävät sitoutumiskohtia asiaan transkriptiotekijöitä. 24 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin sopivalla ylävirran stimulaattorien ja scoparone 24 tuntia, ja sitten korjataan lusiferaasi ja β-galaktosidaasi määrityksissä. RLU, suhteellinen luminesenssi yksikköä. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM Kolmen itsenäisen kokeen, kukin suoritettiin kaksinkertaisina.

*

P

0,0005,

#

P

0,005 vs. toimittaja yksin;

**

P

0,005,

***

P

0,001,

##

P

0,01 vs. stimulaatiota. B. Scoparone estää sekä konstitutiivista että IL-6-stimuloidun transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3. DU145-soluja transfektoitiin ohimenevästi M67-Luc, synteettinen promoottori sisältää neljä kopiota STAT3 sitoutumiskohdan. PC-3-solut kotransfektoitiin M67-Luc-konstrukti ja ekspressiovektori villityypin STAT3. 24 h transfektion jälkeen, solut käsiteltiin IL-6: n läsnä ollessa scoparone 24 tuntia. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM Kolmen itsenäisen kokeen, kukin suoritettiin kaksinkertaisina.

*

P

0,005,

#

P

0,05,

##

P

0,01 vs. toimittaja yksin;

**

P

0,01,

***

P

0,005 vs. IL-6 stimulaatiota. C ja D. qRT-PCR ja Western blot -analyysit STAT3 alavirran kohdegeenien. DU145-soluja käsiteltiin scoparone (0,5 mmol /L) ja osoitetut ajat, ja sitten korjataan qRT-PCR: llä (C) ja Western blot (D) analyysit. mRNA-tasot on STAT3 kohdegeenien määritettiin qRT-PCR-analyysi (C) ja normalisoidaan tason RPLP0 /36B4. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.E.M. kolmen itsenäisen kokeen, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

*

P

0,05,

#

P

0,005 vs. ajoneuvon hallinnan kunakin ajankohtana. Proteiinin ekspressiotasoja (D) kvantitoitiin densitometrinen analyysi ja normalisoidaan vastaavan tason β-aktiini. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.E.M. Kolmen riippumattoman kokeen.

*

P

0,05,

#

P

0,005 vs. vehikkelikontrolli kunakin ajankohtana.

validoimiseksi estävä vaikutus scoparone on transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3, teimme ohimenevän transfektion määrityksissä käyttäen DU145 soluja, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen STAT3 ja PC-3-soluja puuttuu STAT3 [35]. Scoparone esti merkittävästi konstitutiiviset ja IL-6-avusteinen transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3: in DU145-soluissa (kuvio 2B, vasemmalla). In STAT3-negatiivinen PC-3-solut, kuten odotettua, pohjapinta lusiferaasiaktiivisuus oli erittäin alhainen; Lisäksi, IL-6 hoito ei lisätä reportterigeenin aktiivisuutta, joka ei vaikuttanut scoparone (kuvio 2B, oikea). Kuitenkin, yli-ilmentyminen villin tyypin STAT3 johti kasvaa lusiferaasiaktiivisuuden vastauksena IL-6-stimulaatio PC-3-soluja. Scoparone hoito vähensi huomattavasti IL-6-stimuloidun STAT3 aktiivisuutta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että scoparone estää sekä konstitutiivista että IL-6-stimuloidun transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3.

Jotta voitaisiin edelleen tutkia, scoparone voi tukahduttaa transkriptio STAT3 loppupään tavoitteet, suoritimme kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) analyysit STST3 kohdegeenien kuten sykliini D

1, c-Myc, surviviini, Bcl-2, ja Socs3. qRT-PCR-analyysit osoittivat, että scoparone alensi mRNA: n ilmentymisen tasot STAT3 kohdegeenien (kuvio 2C). Suostumuksella qRT-PCR-tuloksiin, se myös merkittävästi pienentynyt proteiinin tasot näiden geenien (kuvio 2D). Nämä havainnot osoittavat, että scoparone tukahduttaa of STAT3 kohdegeenin transkription.

Scoparone estää fosforylaatiota ja ydinvoiman kertymistä STAT3 riippumatta JAK2 ja Src

hahmotta- molekyylitason mekanismit esto STAT3 aktiivisuuden scoparone, arvioimme sen vaikutus STST3 fosforylaation DU145 soluissa. Scoparone vähensi tasot STAT3 fosforylaation Tyr705 (pSTAT3 Y705) ja Ser727 (pSTAT3 S727) in DU145-soluissa 2 h ja 30 min käsittelyn jälkeen, vastaavasti (kuvio 3A). Se vähensi myös IL-6-avusteinen fosforylaation STAT3 (kuvio 3B). Kokonaisproteiinia tasot STAT3 ei vaikuttanut scoparone käsittely (kuvio 3A ja B, ja kuvio S3). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen immunofluoresenssivärjäyksen on pSTAT3 Y705 osoitti, että pSTAT3 proteiinit pääasiassa tumassa ja DU145-soluja (kuvio 3C). Ydin- pSTAT3 signaali heikkeni merkittävästi scoparone-käsitellyissä soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että scoparone estää konstitutiiviset ja IL-6: n stimuloiman fosforylaation ja ydinvoiman kertymistä pSTAT3 on DU145-soluissa.

A ja B. Scoparone estää sekä konstitutiivista (A) ja IL-6-avusteinen (B) fosforylaatio of STAT3 at Tyr705 ja Ser727. DU145-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai scoparone (A), tai seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja sen jälkeen scoparone käsittely (0,5 mmol /L), 4 tuntia ennen stimulointia IL-6 (B) merkitty kertaa. Solut kerättiin Western blottauksella käyttäen vasta-aineita pSTAT3 (Y705), pSTAT3 (S727), ja STAT3. Proteiini tasojen määrä densitometrillä ja normalisoidaan vastaavan tason β-aktiini. Expression taso kunkin proteiinin ISS ilmaistiin suhteena suhteessa tasolle ohjaus ajankohtana 0 h (määritellään 1). Tulokset edustavat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

§

P

0,0005 ja

§§

P

0,005 vs. kontrolli hetkellä 0;

*

P

0,0005,

**

P

0,005,

#

P

0,01

##

P

0,05 vs. ajoneuvon hallinnan kunakin ajankohtana. C. Scoparone vähentää ydinaseiden kertymistä fosforyloitu STAT3. DU145-soluja käsiteltiin scoparone 4 h ja käsiteltiin immunofluoresenssivärjäyksen vasta-aineilla pSTAT3 (Y705) tai STAT3. Solujen tumat värjättiin DAPI, ja konfokaali kuvat hankittiin ja yhdistettiin. Mittakaava osoittaa 10 um. D. Scoparone ei estänyt fosforylaatiota JAK2 ja Src, kaksi suurta STST3 ylävirran kinaasien. DU145-soluja käsiteltiin scoparone varten ilmoitettu ajat, ja sitten korjataan Western blot-analyysi. Signaalin voimakkuudet kvantitoitiin densitometrinen analyysi ja normalisoitu vastaaviin β-aktiini signaaleja. Expression taso kunkin proteiinin ilmaistiin suhteena suhteessa tasolle ohjaus hetkellä 0 tuntia, joka määriteltiin 1.

*

P

0,05 vs. ajoneuvon hallinnan kunakin ajankohtana.

Voit selvittää estävää vaikutusta muihin scoparone on STAT3 fosforylaatioon johtuu tukahduttaminen alkupään signalointi tapahtumia, arvioimme vaikutus scoparone fosforylaatiota JAK2 ja Src, kaksi suurta ylävirtaan kinaasien vastuussa STST3 aktivointia. Scoparone ei vähentänyt proteiinin tasot konstitutiivisesti fosforyloidun JAK2 (kuva 3D) ja Src fosforylaatio ei vähennetty, vaan pikemminkin hieman koholla, jonka scoparone. Proteiinin kokonaismäärän ja mRNA-tasot JAK2 ja Src eivät muuta scoparone käsittely (kuva 3D ja Kuva S4). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että scoparone estää fosforylaatiota ja ydinvoiman kertymistä STAT3 riippumatta ylävirran kinaasien JAK2 tai Src.

Scoparone voi estää transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3 suoraan sitoutumisesta sen SH2-domeeni STAT3

edelleen vahvistaa, onko scoparone voivat säännellä STAT3 aktiivisuutta riippumatta ylävirtaan signalointia, PC-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti STAT3C, konstitutiivisesti aktiivisen mutantin STAT3, joka jäljittelee toiminnan fosforyloidun STAT3 korvaamalla kahden kysteiinitähteen sen SH2-domeenin ja aktivoi kohdegeenin transkription ilman ylävirran ärsykkeille [20].