Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

histonideasetylaasi estäjät (HDACis) uudelleen ilmaista vaiennetaan kasvainten synnyssä ja ovat parhaillaan kliinisissä kokeissa. Vaikka HDACis tiedetään aiheuttavan geenin ilmentymisen, joka on yhtä suuri määrä geenejä vaimentua, kun HDAC inhibition. Mekanismi takana downregulation jää epäselväksi. Täällä voimme tarjota todisteita siitä, että useat DNA korjaus geenit vaimentua HDAC esto ja tarjota mekanismi johon E2F1 transkriptiotekijän prosessissa.

Menetelmät /Principal Havainnot

hakeminen analyysi Functional Annotation (AFA ) microarray tietojen eturauhassyöpäsolujen käsiteltiin HDACis, löysimme useita geenejä DNA-vaurion vasteen ja korjaus reitit vaimentua mukaan HDACis. AFA paljasti rikastaminen homologisen rekombinaation (HR) DNA: n korjaukseen geenien BRCA1-reitin, sekä geenejä säädellään E2F1 transkriptiotekijä. Eturauhassyöpä solut osoittivat pienentynyt DNA korjaus kapasiteetti ja lisääntynyt herkistyminen kemiallis ja radio-DNA: ta vaurioittavat aineet upon HDAC esto. Rekrytointi keskeisten HR korjaus proteiineja paikalle DNA vaurioita, sekä HR korjaus kapasiteetti oli vaarantunut upon HDACi hoitoa. Perustuu AFA tietojen me arveltu, että E2F transkriptiotekijät voivat olla rooli downregulation keskeisten korjaavien geenien upon HDAC eston eturauhassyövän soluissa. ChIP analyysi ja Lusiferaasimäärityksiä paljastavat, että downregulation keskeisten korjaavien geenien välittyy vähentynyt rekrytointi E2F1 transkriptiotekijän eikä aktiivisen tukahduttamisen tukahduttavaa E2Fs.

Johtopäätökset /merkitys

Tutkimuksemme osoittaa että useat geenit DNA korjaukseen liittyvä reitti vaikuttaa upon HDAC esto. Downregulation korjaus geenien on vuoksi lasku määrä ja promoottori rekrytointi E2F1 transkriptiotekijän. Koska HDAC esto vaikuttaa useita reittejä, jotka voivat vaikuttaa DNA: n korjaukseen, vaarantunut DNA korjaukseen upon HDAC esto voisi johtua myös useita muita reittejä lisäksi ne tässä tutkimuksessa. Kuitenkin meidän tutkimus ei tarjota oivalluksia mekanismia, joka hallitsee downregulation HR DNA korjaus geenit päälle HDAC esto, mikä voi johtaa perusteita käyttö HDACis klinikoilla.

Citation: Kachhap SK, Rosmus N, Collis SJ , Kortenhorst MSQ, Wissing MD, Hedayati M, et al. (2010) alassäätely rekombinaation DNA korjaus geenit HDAC esto in Eturauhassyöpä välittyy läpi E2F1 transkriptiotekijä. PLoS ONE 5 (6): e11208. doi: 10,1371 /journal.pone.0011208

Editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Saksa

vastaanotettu 17. maaliskuuta 2010 Hyväksytty: 25 toukokuu 2010; Julkaistu: 18 kesäkuu 2010

Copyright: © 2010 Kachhap et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukee lentoemäntä Medical Research Institute, David Koch Fund joka tarjosi Eturauhassyöpä Foundation, Eturauhassyöpä Foundation Grant, erikoistunut ohjelma huippututkimuksen Grant P50-58236, ja AEGON. MDW tukee tri Saal van Zwanenberg Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigeneettiset geenin ilmentymisen säätelyyn uskotaan aikaan sekä kromatiinin modulaattorit, jotka muuttavat N-pään hännät histonien ja DNA: n metyloinnin entsyymejä, jotka mety- CpG klustereita promoottorialueet eukaryoottisten genomien [1], [2 ], [3]. Syöpäsolut moduloida epigeneettisenä koneiston hiljentää kasvain ja metastaattisen vaimentimet saada valikoivaa kasvua ja invasiivisia ominaisuuksia [4], [5], [6]. HDAC-luokan I ja luokan II entsyymien muodostamaan komplekseja yhteistyössä repressors kuten Nurd ja SMRT /NCOR kompleksit [7]. Syöpäsolut, mukaan lukien eturauhassyöpä (PCA), rekrytoida eri HDAC liittyy näiden suurten multi-proteiini co-repressori kompleksit vaientaa kasvainten synnyssä ja tämä toimii yhtenä perustelut käytön HDACis syövän hoitoon [8], [9] .

aktiivisuus sekä luokan I ja luokan II HDAC: t estävät lyhytketjuisia rasvahappoja (Fenyylibutyraatin, valproaattihapon (VPA)) ja hydroksaamihappoihin (Vorinostat, Trichostatin A), kun taas bentsamideilla (MS-275) näyttävät olevan erityinen I luokkaan HDAC [8]. Kääntäen, luokka III HDAC, The sirtuins, eivät inhiboi mitään näistä aineista [10]. Äskettäin Vorinostat on hyväksynyt FDA hoitoon ihon T-solujen lymfooma. Me ja muut ovat osoittaneet, että hoito PCA HDACis tai DNA metyylitransferaasi inhibiittorit lievittää tukahduttaminen, aiheuttaen reexpression on vaiennettu tuumorisuppressoreilla johtaa solusyklin pysähtymiseen, vanhenemista ja apoptoosia [11], [12], [13]. Yhdistelmä HDACis muiden lääkkeiden kanssa on osoitettu olevan tehokas erilaisia ​​syöpiä. Vaikka HDACis on tunnettu upregulate useita geenejä, paradoksaalisesti yhtä suuri määrä geenejä on tukahdutettu, kun HDAC inhibition [14], [15], [16]. Tukahduttaminen geenien upon HDAC esto voi olla seurausta epäsuorien toimien repressors jotka aktivoituvat ja aiheuttaa tukahduttaminen käytettäessä HDAC passiivinen tavalla, tai sortotoimien voitaisiin saada aikaan aktiivisen rekrytoinnin HDAC-entsyymeistä edistäjille valittujen geenien [17]. Polkuja, jotka ovat vaimentua upon HDAC eston luoda asetuksia hoitomuotoja, jotka ovat tehottomia niiden läsnäoloa. Viimeaikaiset raportit viittaavat siihen, että HDACis kuten fenyylibutyraattia, VPA, MS-275 ja SAHA: voi voimistaa säteilyherkkyydestä syöpäsolujen [18], [19], [20], [21]. Transkription downregulation tiettyjen geenien mukana homologinen rekombinaatio (HR) ja ei-homologisen lopussa liittymällä (NHEJ) DNA: n korjaukseen reittejä ovat sekaantuneet [18], [19], [20], [22].

Double säikeen katkoksia (DSB: t) voidaan saada aikaan endogeenisia aineita, kuten reaktiivisia happiradikaaleja ja replikointi stressiä pysähtynyt lisääntymään haarukat, tai voi indusoida eksogeeniset aineet kuten ionisoivan säteilyn [23]. On yhä selvempää, että DNA-vaurio tunnustellaan proteiinikomplekseina, nimeltään DNA-vaurioita antureita, mikä puolestaan ​​aiheuttaa signaalitransduktion Cascade rekrytoivat välittäjänä ja efektoriproteiinit vaurioituneen sivustoja, mikä korjaamiseen DNA [24]. Riippuen vahingon laajuus, edelleen signaalitransduktio varoittaa solun joko viivästyttää solusyklin läpi tarkistuspisteen aktivoinnin korjattavaksi prosessit on suoritettu kokonaan, tai apoptoosin [24]. Kutakin DNA-vaurioita havaitaan ja korjataan erilliset DNA: n korjaukseen reittejä. MRN kompleksi, joka koostuu MRE11-RAD50-NBS1 välittäjänä monimutkainen havainnoi DSB ja rekrytoi pankkiautomaatti, PI3K-kuin kinaasi, paikalle DSB [25]. ATM aktivoituu jälkeen värväyksen DSB: ihin ja fosforyloi loppupään alustojen aloittamista signaalin transduktioprosessissa [26].

ATM ja liittyvien kinaasien, ATR ja DNAPK, fosforyloida histoni variantti γ-H2AX at ser-139, joka lataa sen sivustoja DSB ja kattaa megabases reunustavat DSB: t; Tämä muodostaa säteilytys indusoi pesäkkeitä. Fosforyloitua γ-H2AX rekrytoi useita sovittelija proteiinit [27]. Näistä välittäjäaineiden ovat BRCA1 liittyy valvonta monimutkainen ja 53BP1. Signaali transduktio Cascade on laajennettava edelleen anturin tarkastuspiste kinaasien, CHK1 ja Chk2, jotka aktivoituvat, kun fosforylaatio ATM ja ATR. ATM ja ATR yhdessä CHK1 /Chk2 kinaasien fosfo- useita efektori substraatteja, jotka sisältävät BRCA1, Rad51, p53, ja MDM2 [28]. Fosforylaatio p53 johtaa sen vakauttamista, aiheuttaa solusyklin pysähtymisen induktion kautta p21, tai siinä tapauksessa, että suurempi DNA-vaurioita, apoptoosin. Pysähtynyt replikointi haarukat, jotka johtuvat DNA-vaurioita ja replikointi stressi, ovat havaitsee PCNA liittyvien Rad9-Rad1-Hus1 tai 911 monimutkainen, jonka rekrytointi jumiutuneet sivuston välittyy replikointi proteiini A ja ATR. Lopullinen efektoriproteiinit että korjata vaurioitunut DNA aktivoituvat ja palvelukseen edellä mainitut kinaasien ja välittäjänä proteiineja paikalle vahinkoja ja korjaus alkaa.

Geenit DNA korjaukseen reitit tiukasti säädeltyä sekä transkriptiota ja post transkription tasolla. Tällä transkription tasolla E2F transkriptiotekijät ovat olleet tiedossa olevan rooli säätelyssä korjaus proteiineja. On yhdeksän tunnettua E2F transkriptiotekijöitä, jotka voidaan jakaa transkription aktivaattoreita (E2F1, E2F2, E2F3a) ja repressorien (E2F4-8); E2F3b on oletettu toimia repressori [29]. E2F1 ja E2F4 ovat sekaantuneet säätelyyn CHK1, BRCA1 ja RAD51 geenit [30], [31], [32].

Äskettäin raportoimme romaani ”multiple-loop, double-kuutio” cDNA microarray suunnittelu, analysoida HDAC estäjä aiheuttamiin muutoksiin geenien ilmentyminen poikki herkkiä ja resistenttejä PCa solulinjat [16]. Soveltamalla analyysi Functional Annotation (AFA) tietoihin asettaa edellä microarray kokeilu huomasimme, että useat geenit HR korjaus- ja DNA-vaurioita vastaus koulutusjakso on vaimentua upon HDAC esto. Tässä raportissa osoitamme transkription downregulation useiden DNA-vaurioita muuniresponssigeeneinä PCA soluissa upon HDAC esto, tarjoavat toiminnallista näyttöä siitä, että HR korjaus väylän heikentynyt DNA: n korjaukseen ja tarjota rooli E2F1 transkriptiotekijän downregulation DNA vaurioita muuniresponssigeeneinä.

tulokset

AFA paljastaa HDACis downmodulate useita geenejä DNA-vaurioita ja vastereitissä PCA

AFA suoritettiin meidän äskettäin julkaissut microarray data asettaa kaksi Eturauhassyövän solulinjoja (PC3 ja DU-145) käsiteltiin vorinostat (aiemmin tunnettu nimellä SAHA) ja VPA [16]. Analyysi paljasti downregulation useiden geenien mukana DNA-vaurion vaste ja korjaus (taulukko 1). Proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen analyysi microarray tiedot paljastivat useita geenejä, jotka liittyvät E2F1 ja brca1 reitit olivat vaimentua sekä HDACis yli 1,3 kertaisesti kummassakin PCa soluissa linjat (Fig. 1a). Monet näistä vaimentua geeneistä ovat mukana HR DNA korjaukseen liittyvän reitin. Yllättäen NHEJ polku liittyviä geenejä, erityisesti DNAPK ja Ku, ei vaikuttanut meidän paneelit. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että RAD51 on vaimentua, kun HDAC-inhibiittori on käsitelty useita erilaisia ​​solulinjoja [18], [19], [20]. Meidän microarray data paljasti, että lisäksi Rad51 ja niihin liittyvät geenit, erilaisia ​​geenien DNA-vaurio vasteen ja korjaukseen liittyvä reitti, kuten BRCA1, Chk1, Topo IIα, Hus1, ja bubR1: tä, olivat vaimentua, kun HDAC-inhibiittori hoidon (Fig. 1b) .

a) DU145 ja PC3-soluja käsiteltiin kahdella eri HDACis (vorinostat (SAHA, 1 uM), ja VPA (valproaattihapon, 1 mmol) ja itämisaika (2 päivää ja 4 päivää). AFA paljastaa alaspäin sääntelyn geenien mukana DNA-vaurioita ja vasteen (katso taulukko 1). AFA tulokset proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen osoittavat BRCA1 ja E2F vuorovaikutuksessa verkkojen vaikuttaa HDAC esto. Color koodi edustaa kuin 10

-n

p-

-arvoja Wilcoxonin-summa testi. b) DNA korjaavien geenien vaimentua ≥1.3 kertaiseksi sekä PC3 ja DU-145-solut käsittelemällä sekä VPA ja vorinostat. c) validointi AFA tehtiin Q-PCR-analyysi osajoukko geenien vaimentua kun 1,5 mM VPA hoitoon. Tulokset kuvataan kertaluokkamuutos yli käsittelemätön kontrolli soluja.

Jotta ymmärtää seuraus downmodulation ja saada lisää oivalluksia mekanismia taustalla downmodulation, suoritimme edelleen analyysi käyttämällä kahta PCa solua linjat (DU-145 ja LNCaP) käyttäen HDAC estäjä VPA. Vahvistamaan meidän microarray data, teimme Q-PCR-analyysi osajoukon korjaavien geenien. Tuloksemme osoittivat, että kaikki geenit Testatut vaimentua molemmissa solulinjoissa, paitsi Hus1 joka vaimentua ainoastaan ​​LNCaP-soluissa (kuvio. 1c). BRCA1, Rad51 ja Chk1 tiedetään säänneltävä E2F transkriptiotekijä [30], [31]. Koska AFA paljasti rikkauden downmodulation of E2F1 kohdegeenien, kuten E2F1 itse, tutkimme transkriptio taso sekä aktivaattori (E2F1) ja -repressori- E2F (E2F4 ja 6) transkriptiotekijöitä. Tuloksemme osoittavat, että E2F1 oli merkittävästi vaimentua molemmissa solulinjoissa käsiteltiin VPA, kun repressori E2Fs ei vaikuttanut joko solujen linjat, kun VPA hoitoon (Fig. 1 c).

Downmodulation DNA korjaavien geenien HDAC esto aiheuttaa lisääntyneen herkkyyden eturauhassyövän solujen DNA: ta vaurioittavat aineet

Aiemmat raportit ryhmämme ja muut ovat osoittaneet, että HDACis kuten VPA voi vähentää leviämisen eturauhasen syöpäsolujen [11], [16]. HDACis on myös tiedetään toimivan säteilyherkistimet [18], [19], [20]. Oletimme, että downmodulation DNA korjaavien geenien päälle HDAC esto johtaisi lisääntynyt herkkyys eri DNA: ta vaurioittavat aineet. DU-145-solut altistettiin klonogeenisten selviytymisen määritykset käsittelyn jälkeen yhdistelmä HDACis ja eri aineet, jotka indusoivat DSB, kuten säteilyn, sisplatiinin ja hydroksiurea. Radioherkkyyttä klonogeenisten määritys suoritettiin lisäämällä annokset VPA: n läsnä ollessa yhä annoksen säteilyä. Kuten odotettua, VPA ei radiosensitize DU-145-soluja, ja oli kasvu herkkyys kasvaa annoksia (Fig. 2a). Viime aikoina on osoitettu, että vika homologinen rekombinaatio voi johtaa muutoksiin huumeiden herkkyys profiilin, mikä tekee BRCA1 puutteellinen rintasyöpiä herkkä mitomysiini C, sisplatiini, etoposidi ja muiden lääkkeiden, jotka tuottavat kaksijuosteisia vaurioiden [33]. Olemme väitti, että tämä voi olla totta HDACi käsiteltyjen PCa soluja, jossa on laskua BRCA1 koulutusjakson liittyvien geenien ilmentymisen. Klonogeeniset jotka suoritettiin käsittelyn jälkeen DU-145-solujen kanssa VPA yksinään tai yhdistelmänä sisplatiinin ja hydroksiurean, paljasti, että verrattuna yksinään, yhdistelmä VPA joko hydroksiurean tai sisplatiinin huomattavasti vähentynyt klonogeeniset eloonjäämisen (Fig. 2b ja c) .

a) klonogeeninen määritys suoritettiin DU-145-hoidon jälkeen eri annoksilla VPA 48 tuntia ennen säteilytystä eri annoksilla säteilyä. Ylälevy esitetään edustavat klonogeeniset levyt 0Gy ja 4 Gy säteily kaaviossa esittää eloonjääntifraktio jälkeen VPA hoitoja ja säteilytys. Virhepalkin edustaa keskihajonta kolmen erillisen kokeen. b) klonogeeninen määritys suoritettiin DU-145-soluja käsiteltiin 1,5 mM VPA ja sisplatiinia (100 nM ja 250 nM) 48 tuntia. Virhepalkin edustaa keskihajonta. c) klonogeeninen määritys suoritettiin DU-145-soluja käsiteltiin 1,5 mM VPA ja hydroksiurean (0,5 mM ja 1 mM) 48 tunnin ajan. Virhepalkin edustaa keskihajonta.

HDAC esto VPA johtaa lasku DNA: n korjaukseen proteiineja HR ja DNA Damage Response reitin

Herkkyys eri DNA: ta vaurioittavat aineet upon HDAC esto voisi olla seurausta vaarantunut tai subnormal DNA korjaukseen kyky käsitellyissä soluissa. Tämä voidaan tuomat downregulation DNA korjaavien geenien upon HDAC esto. Säteilylle herkäksi HDACis on yhdistetty lasku Rad51 geenin ilmentymisen PCa [20]. Jos ensimmäinen testi, onko VPA aiheuttaa lasku kaksinkertainen lohkon murtuma DNA korjaus kapasiteetti Eturauhassyövän soluja teimme neutraali comet arvioida DNA korjaukseen kyky eturauhassyöpäsolujen upon HDAC esto [34], [35]. Koeolosuhteissa käytetään, emme löytäneet mitään tilastollista eroa takaosan liike VPA käsiteltyjen ja käsittelemättömien kontrolli soluja ilman säteilyä. Kuitenkin ilman VPA hoidon altistettujen solujen 4 Gy Säteilytyksen pystyivät korjaamaan suurimman osan vaurioitunut DNA 4 tunnin kuluessa. Kuitenkin jälkeen VPA hoitoon sekä eturauhassyövän solulinjoissa osoittivat merkittävästi korkeampia hännän hetkiä 4 tuntia altistuksen jälkeen 4 Gy Säteilytyksen viittaa vähensi DNA korjaus kapasiteetti (Fig. 3a). Sen määrittämiseksi, onko DSB korjaus on vaarantunut HDAC esto, käytimme H2AX pesäkkeitä välys indikaattorina tehokkaan DSB korjaus. DU-145 ja LNCaP-soluja käsiteltiin VPA ja säteilytettiin 2 Gy, 4 Gy, ja 6 Gys säteilyn. Solut kiinnitettiin 4 h korjaus- ja koetettiin Pa

139 fosforyloidun H2AX vasta-aineita. Kuten odotettua, kasvu H2AX pesäkkeitä havaittiin PCa käsitellyissä soluissa VPA, joka osoittaa vähenemistä DNA korjaus kapasiteetti (Fig. 3b). Vaarantunut DNA korjaus voi olla seurausta väheneminen kokonaismäärät korjaus- proteiinin ja /tai vähenemistä lokalisoinnin tai rekrytointi korjauksen proteiinien vahingoittuneeseen alueeseen. Voit testata näitä mahdollisuuksia, ensin tutkineet tason korjaus proteiinien osoitettiin olevan downmodulated meidän microarray aineisto jälkeen VPA hoitoon. Monet näistä geeneistä, kuten Rad51, BRCA1 ja Chk1, indusoidaan päälle DNA vaurioita [24]. Tutkimaan, ovatko nämä proteiinit pysyvät vaimentua upon HDAC esto jopa upon DNA-vaurioita, suoritimme analyysimme puuttuessa ja läsnä ollessa säteilyn. Lisäys yhteensä H3 asetylointi DU-145 ja LNCaP-soluissa osoittaa, että VPA ei aiheuta tehokasta maailmanlaajuista HDAC: n inhibition annos Kokeisiin käytettiin (Fig. 4a ja tietoja ei ole esitetty). Suurempaa VPA aiheuttaa lasku BRCA1 ja Rad51 sekä DU-145 ja LNCaP, kun taas muut korjaus proteiineja, kuten DNAPK ja NBS1 säilyvät ennallaan (kuvio. 4b ja c). BRCA1-proteiinin taso ei ole tasaista solussa, ja piikit eri ajankohtina riippuen vaiheen solusyklin. Jotta ymmärtää, kun BRCA1 on vaimentua VPA käsitellyissä soluissa, lysaatit kerättiin kunakin ajankohtana hoidon jälkeen. BRCA1 todettiin vähentävän jo 18 h käsittelyn jälkeen (Fig. 4c), joka osoittaa nopean vasteen HDAC inhibition. Säteilytys Eturauhassyövän soluja, post hoito VPA, osoitti tietty DNA-vaurioita vastaus ja korjaus proteiineja, kuten ATR ja NBS1 pysyivät muuttumattomina, kun taas DNAPK aiheutettiin kun VPA hoitoon läsnäollessa säteilyn (Fig. 5a). RAD51, BRCA1 ja CHK1 todettiin pysyvän vaimentua jopa säteilytettäessä VPA käsitellyissä soluissa. BRCA1 on ydinaseiden proteiini, joka jakaa sytoplasmaan tietyin edellytyksin. Sen varmistamiseksi, että hoito VPA tuloksia downregulation BRCA1- ydinvoiman osastoon, DU-145-soluja käsiteltiin VPA ja säteilytetään 48 h käsittelyn jälkeiset 4 Gy säteilyn. Tumauutteita valmistettiin näitä soluja immunoprobed varten BRCA1. Kuten on esitetty kuviossa. 5b, VPA käsitellyt solut on downregulation BRCA1-proteiinin jopa säteilytyksen jälkeen.

a) Neutraali comet suoritetaan eturauhassyövän soluissa, joita käsiteltiin 1,5 mM VPA: ssa 48 tuntia ja säteilytettiin 6 Gy γ- säteilyä, jota seuraa 4 h korjaus välein. Säteilyttämätön soluja (0Gy) kanssa ja ilman VPA hoitoa ei osoittanut mitään merkittävää eroa komeetan hännän hetkiä. Käyrä kuvaa keskimäärin hännän hetki 50 solua virhepalkista ilmaisee SD-arvo kolmesta kokeesta. Vertailut on suoritettu käyttäen opiskelijan t-testiä. b) Immunofluoresenssi osoittaa H2AX Pa

139 värjäytymistä DU-145-solut käsiteltiin 1,5 mM VPA 48 tuntia ja säteilytetään 4Gy säteilyllä seurasi 4 tunnin korjausajan. Kuvaaja osoittaa kvantitointi H2AX pesäkkeitä valvonta (sininen pylväs) ja käsiteltiin (punainen sarake) DU-145 ja LNCaP. Virhe palkki edustaa keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta.

a) Western blot, joka osoittaa asetylaatio histoni H3 proteiinin DU-145-soluissa sen jälkeen, kun hoidon eri annoksilla VPA: ssa 48 tuntia. b) DNAPK ja NBS1 proteiinin tasot VPA käsiteltiin DU-145-solut 48 tuntia. c) Western blot, joka osoittaa RAD51 ja BRCA1-proteiinin tasot LNCaP ja DU-145-soluja käsiteltiin vaihtelevilla annostus VPA: ssa 48 tuntia. Tahran oikealla näkyy DU-145-solut käsiteltiin 1,5 mM VPA vaihtelevia ajankohtina tutkittiin varten BRCA1-proteiinin.

a) PCA solulinjoja käsiteltiin 1,5 mM VPA 48 tuntia, säteilytettiin erilaisia ​​annoksia säteily, testattiin eri korjausta proteiinien western blottauksella. Säteilyttämätön (0Gy solua) myös mukana. b) kokonaismäärä ja tumauute VPA (1,5 mM 48 h) käsitellään DU-145-solujen kanssa ja ilman säteilytystä koestettiin BRCA1 proteiinia. Säteilyttämätön (0Gy solua) myös mukana. c) Top paneeli esittää TOPO IIα proteiinin tason ydin- ote DU-145-solujen upon VPA hoitoon. Pohjalevy on agaroosigeelillä osoittaa TOPO IIα toimintaa samalla otteita, kaista 4 on negatiivinen kontrolli.

Tuloksemme oli ilmoittanut selvä vähentäminen TOPO IIα transkriptipitoisuuksissa käsittelemällä VPA. TOPO IIα ratkaisee katenoida DNA indusoimalla ohimenevän DSB ja myöhemmät uudelleenligaatiolla [36]. TOPO IIα on liitetty erilaisia ​​soluprosesseja, mukaan lukien DNA: n replikaatiota, transkriptiota ja kromosomi erottelu [37]. Odotimme downregulation TOPO IIα proteiini jälkeen HDAC esto. Yllätykseksemme huomasimme TOPO IIα proteiini ylössäädellään kun VPA kohtelu sekä eturauhasen solulinjoissa (Fig. 5c ja tietoja ei näytetty). Tutkia tämä johtaa kasvuun aktiivisuus TOPO IIα proteiinia, käytimme ydin- ote VPA käsitelty DU-145-solujen mittaamiseksi decatenation aktiivisuuden TOPO IIα. Kuten nähdään Fig. 5c, VPA käsitellyt solut decatenated kinetoplast DNA tehokkaammin kuin käsittelemätön kontrolli-soluja. Tämä viittaa siihen, että vaikka TOPO IIα on vaimentua on tran- kun HDAC esto on olemassa translaation jälkeen asetuksella jolloin proteiini vakiintui HDAC esto.

Rekrytointi keskeisten HR DNA korjaukseen proteiinit vaikuttavat upon HDAC esto johtava vähenemiseen HR DNA: n korjaukseen

ja -alue rekrytointi välittäjänä ja DNA: n korjaukseen proteiinien säteilytys aiheuttama pesäkkeitä on tarpeen tehokkaan DNA: n korjaukseen esiintyy [24]. Olemme tutkineet, onko lasku DNA-vaurioita vastaus ja korjaus proteiinit päälle HDAC eston myös vähensi rekrytoinnissa DNA korjaus proteiineja vahingoittuneeseen alueeseen. VPA käsiteltiin DU-145 ja LNCaP-solut säteilytettiin 4 Gy säteilyn ja sen jälkeen vahvistetaan sen jälkeen neljän tunnin korjaus.

Immunofluoresenssi suoritettiin BRCA1 ja RAD51 sekä fosforyloidut H2AX proteiineja. Oli vähentynyt selvästi värjäystä BRCA1 ja RAD51 pesäkkeet päälle VPA hoitoon; kontrollisoluja toisaalta osoitti diskreetti BRCA1 ja RAD51 pesäkkeitä, jotka colocalized fosforyloidun H2AX (Fig. 6a ja b). Värjäytymisen ja lokalisointi NBS1 kuitenkin pysynyt ennallaan jälkeen VPA hoidon (Fig. 6a). Kvantitoimme määrä BRCA1 ja RAD51 pesäkkeet laskemalla ne solut, joilla on yli kaksikymmentä H2AX pesäkkeitä. Kuten kuviossa 6c, huomasimme, että siellä oli merkittävä väheneminen määrän korjaus pesäkkeitä sekä korjaus- proteiinien yhteydessä VPA hoitoon. Sekä LNCaP ja DU-145-solut osoittivat pistemäinen sytoplasmista värjäytymistä sekä RAD51 ja BRCA1. Nämä tulokset osoittavat, että lisäksi downregulation, on heikentynyt rekrytointi korjauksen proteiinien vahingoittuneeseen alueeseen päällä HDAC esto.

a) Immunofluoresenssianalyysi DU-145-solut käsiteltiin 1,5 mM VPA 48 tuntia ja säteilytetään 4Gy säteilyn koestettiin BRCA1 (punainen) ja NBS1 (vihreä). Tumat vastavärjättiin DAPI. Soluliman BRCA1 (nuoli) nähdään VPA käsitellyissä soluissa ehdottaa heikentynyt rekrytointi BRCA1 VPA käsitellyissä soluissa. b) Immunofluoresenssianalyysi LNCaP-soluja käsiteltiin 1,5 mM VPA: ssa 48 tuntia ja säteilytettiin 4Gy säteilyn koestettiin H2AX Pa

139 (punainen) ja RAD51 (vihreä). Tumat vastavärjättiin DAPI. Solut, joilla on 25 H2AX Pa

139foci analysoitiin. Soluliman RAD51 (nuoli) nähdään VPA käsitellyissä soluissa ehdottaa heikentynyt rekrytointi BRCA1 VPA käsitellyissä soluissa. c) kvantifiointi lukumäärän BRCA1 ja RAD51 pesäkkeet colocalizing kanssa H2AX Pa

139 pesäkkeitä DU-145 ja LNCaP-hoidon jälkeen 1,5 mM VPA ja säteilytys 4Gy säteilyn. Yhteensä 100 solua, joiden 25 H2AX Pa

139foci laskettiin. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeama keskiarvosta. d) FACS-analyysi, joka esittää HR korjaus määritys käyttäen plasmidia reportterikonstruktio LNCaP-soluissa hoidon jälkeen vaihteleva pitoisuus VPA.

Onko tämä johtaa lasku HR korjaus oli seuraava kysymys tutkimme. Tätä varten käytimme plasmidiin perustuva lähestymistapa pääsi HR tehokkuutta LNCaP. Me tuotti EGFP rekombinaation reportterikonstruktio kloonaamalla promoottorittoman EGFP ylävirtaan pEGFPN1 vektorin. Bcll sivusto suunniteltiin tässä geenissä aiheuttavan DSB: ihin. EGFP-geeni ennen CMV-promoottorin mutatoitu, sillä seurauksella, että toiminnallisuus EGFP olisi vain palauttaa, kun on tehokas HR korjaus. Kuten kuvassa 6d, oli merkittävä väheneminen määrän HR taitavia LNCaP upon VPA hoitoon. Nämä tulokset selvästi osoittavat osallistumista HR koulutusjakson PCA soluissa upon HDAC esto.

E2F1 osallistuu downregulation keskeisten korjaus proteiinien upon HDAC esto

Koska meidän tiedot osoittivat transkription downregulation korjaavien geenien upon HDAC esto, tutkimme histoni H3 asetylaatio tilan promoottorit osajoukko vaimentua geenien avulla ChIP määrityksiä. Kiehtovan, meidän tulokset osoittivat laskua H3 asetylointi tilan proksimaalisen promoottorin alueiden kaikkien geenien tutkittu (Fig. 7a). Väheneminen asetylaatioon promoottorialueiden liittyy myös lisääntyminen sitoutumisen transkription repressori proteiinien promoottorit [7]. Tutkia transkriptiotekijöiden jotka voivat aiheuttaa transkription tukahduttamisesta DNA korjaavien geenien upon HDAC esto keskityimme huomiomme E2F transkriptiotekijät. BRCA1 ja Rad51 kaksi E2F sitoutumiskohta proksimaalisessa promoottori alueella [31]. Sekä BRCA1 ja Rad51 on tukahdutettu hypoksisissa olosuhteissa rekrytointi E2F4 /p130 transkriptio repressors. Hypoksisissa olosuhteissa, E2F1 ja E2F4 samanaikaisesti sitoa BRCA1 promoottori kahden vierekkäisen E2F auttaakseen aikaan transkription tukahduttamisesta BRCA1-geenin ilmentymisen [30], [31]. Samoin Chk1 ja bubR1: tä on transkription sitoutumiskohtia E2F transkriptiotekijöitä ja aiheuta E2F1 [32], [38].

a) ChIP analyysi VPA (1,5 mM 48 h) käsitellään DU-145-soluissa for asetyloitu histoni H3 asema edistäjiä korjaavien geenien. Baari kaavio on densitometrian käsittelyyn agaroosigeelistä esitetty normalisoitu tuloa. b) Activator ja repressori E2F proteiinin tasot VPA (1,5 mM 48 tuntia) käsiteltyjen solujen LNCaP ja DU-145 cells.E2F pysyivät vaimentua upon VPA hoitoon, vaikka säteilytyksen 4Gy säteilyllä, kuten on esitetty DU-145-solut, säteilyttämätöntä (0Gy ) solut toimivat säteilyn säätö. c) lusiferaasireporttiterilla määrityksissä DU-145 ja LNCaP-soluja, käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla VPA käyttäen proksimaalinen promoottorialueita, johon sisältyy E2F sitovat alueet vaimentua korjaavien geenien. d) pelimerkin analyysi E2F käyttöasteen promoottorialueiden vaimentua geenejä. ChIP suoritettiin käyttäen vasta-aineita E2Fs (1, 4, ja 6) VPA (1,5 mM: ssa 48 tuntia) käsiteltiin ja valvonta DU-145-soluja. Bar kaavio esittää densitometrinen lukemat normalisoitiin vastaaviin sisääntuloihin.

Koska E2F1 transkripti vaimentua jonka HDACis, me arveltu, että HDAC: n inhibointi voi lisätä sitoutumisen tukahduttavia E2Fs ja vaimentua korjaavan geenin promoottorit, ja siten johtaa aktiivinen tukahduttaminen DNA korjaus geenit. Ensin tutkittiin proteiinin tasot sekä aktivaattorin ja tukahduttavaa E2Fs hoidon jälkeen VPA molemmissa LNCaP ja DU-145-soluja. Mukaisesti transkriptio tasoilla, E2F1 proteiini taso vaimentua upon VPA hoitoon, kun tukahduttava E2Fs (E2F4 ja 6) ei muuttunut. E2F1 jäi vaimentua jälkeenkin induktion DNA-vaurioita säteilyttämällä (Fig. 7b). Siten on olemassa ero vaste aktivaattori ja tukahduttavaa E2Fs että HDAC esto. On raportoitu, että viittaavat kasvu E2F1 transkriptioaktiviteettia aikana hermosolujen apoptoosin upon HDAC esto [39]. Tämä voi olla kudos-riippuvainen, koska vorinostat välittämä HDAC inhibitio johtaa downregulation of E2F liittyvien geenien multippelimyelooma [40]. Edelleen, sitoutuminen E2F1 että Arhi promoottori osoitettiin vähennetään HDAC estäjä trikostatiini [41]. Vaikka olemme huomanneet, E2F1 proteiinin tasot vaimentua, kun HDAC inhibition, oli mahdollista, että aktiivisuus jäljellä poolin E2F1 lisättiin jälkeen HDAC inhibitio. Tämän tutkimiseksi, me kloonattu proksimaalinen alueilla BRCA1, Rad51, ja Chk1, joka kattaa E2F sitoutumiskohdat, pGL3 perus lusiferaasireportterigeenin vektori. VPA käsitelty DU-145 ja LNCaP-solut transfektoitiin promoottori reportteri rakentaa yhdessä ohjaus Renilla sivektorissa. Lysaatit alistettiin dual lusiferaasianalyysissä. Meidän data paljasti merkittävän downregulation kaikista geenin promoottorit kun VPA hoidon kanssa BRCA1 promoottori on kaikkein vaikuttaa, verrattuna ohjata soluihin (kuvio. 7c). Onko tämä liittyy vähentynyt sitoutuminen E2F1 tai lisääntyneeseen sitoutumiseen tukahduttavia E2F4 tai E2F6 sen vaimentua geenin promoottorit oli seuraava kysymys me osoitettu. Primerit siru määritykset suunniteltiin kylki E2F sivustoja proksimaalisilta edistäjiä BRCA1, Rad51, Chk1 ja bubR1: tä geeneistä. Chromatin välillä VPA käsiteltyjen ja käsittelemättömien kontrollisolujen immunosaostettiin käyttäen vasta-aineita E2F1, E2F4 ja E2F6. PCR-monistus saostunut kromatiinin DNA paljasti promoottori täyttöaste näiden transkriptiotekijöiden. Vahvistavia aiemman raportin, teimme löytää samanaikaisesti täyttöasteen E2F1 ja E2F4 että BRCA1 ja Rad51 geenin promoottorit ja löysi samanlaista mallia varten bubR1: tä promoottori. Tuotteidemme koeolosuhteissa, emme löytäneet E2F6 sitoutuminen jollekin promoottorien tutkittu. Vaikka E2F1 sitoutui voimakkaasti promoottori alueille käsittelemättömiä kontrolleja, oli merkittävä väheneminen E2F1 rekrytoinnin yhteydessä HDAC esto (Fig. 7d). Toisin kuin meidän hypoteesi, huomasimme, että downregulation korjaus geenien ei ole seurauksena aktiivisen tukahduttamisen tukahduttavaa E2Fs, mutta kokonaismäärän vähentymiseen rekrytoinnissa aktivaattori E2F1 että promoottorit.

Keskustelu

aikana kehitys PCa, tiettyjen DNA korjaukseen reitit ovat inaktivoitu, seurauksena, joka PCa hankkii genomin epästabiilisuuden. Tämä selittää korkeammalle endogeenisen DNA-vaurioita PCa soluja kuin normaalit solut [42], [43]. Jatkuvan solujen eloonjäämistä, muut DNA vaurioita vastaus ja korjaus reittejä indusoidaan ja ylläpidetään.