Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa. Ennuste on edelleen synkkä vähän etukäteen hoidossa. Metformiini on lääke, jota käytetään yleisesti hoidettaessa tyypin II diabetesta. Viimeaikaiset epidemiologiset tiedot paljastivat, että suun kautta metformiinin liittyy pienempi riski haimasyövän, mikä viittaa sen mahdollisuudet uutena lääke tähän tautiin. Useat tutkimukset ovat osoittaneet

in vitro

syövän vastaisen toiminnan metformiinin, mutta tyypillisesti käytetään pitoisuudet olivat paljon korkeampia kuin

in vivo

pitoisuus plasmassa ja kudoksessa saavutetaan suositeltuja terapeuttisia annoksia metformiinin ja alhainen pitoisuudet metformiinin oli vain vähän vaikutusta proliferaatioon haimasyövän soluja. Olemme tutkineet vaikutusta pieninä pitoisuuksina metformiinin eri alaryhmien haimasyöpäsoluissa ja totesi, että nämä selektiivisesti inhiboivat CD133

+ mutta ei CD24

+ CD44

+ ESA

+ soluja. Olemme myös tutkineet vaikutusta pieninä pitoisuuksina metformiinin solujen invaasiota ja

in vivo

kasvainten muodostumista, mikä osoittaa

in vitro

ja

in vivo

syövän vastaista toimintaa. Metformiini liittyi vähentäminen fosfo-Erk ja fosfo-mTOR riippumaton Akt ja AMPK fosforylaation. CD133

+ haimasyövän soluja pidetään syövän kantasoluja, jotka vaikuttavat uusiutumiseen, etäpesäke ja kestävyys adjuvanttia hoitomuotojen haimasyöpä. Tuloksemme luoda perusta metformiinin kanssa nykyisillä lääkkeillä parantaa ennustetta tämän taudin.

Citation: Gou S, Cui P, Li X, Shi P, Liu T, Wang C (2013) pieninä pitoisuuksina metformiinin selektiivisesti estävät CD133

+ soluproliferaatiota Haimasyöpä ja Have syövän Action. PLoS ONE 8 (5): e63969. doi: 10,1371 /journal.pone.0063969

Editor: Joseph Najbauer, Pécsin yliopisto Medical School, Unkari

vastaanotettu: 10 helmikuu 2013; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2013; Julkaistu: 08 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Gou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Natural Science Foundation of China (nro 81001064) (www-sivusto: https://www.nsfc.gov.cn). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi aggressiivinen kiinteiden syöpäsairauksia. Joka vuosi 43920 potilaat ovat hiljattain diagnosoitu sairaus, jolloin 37390 kuolemantapausta vuodessa Yhdysvalloissa ja tekemällä haimasyövän neljänneksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman sekä miehillä että naisilla [1]. On ollut vähäistä etukäteen hoidon ja ennusteen pysyy synkkä [2], [3], [4], [5], jossa on 5 vuoden pysyvyys on vain noin 3% ja mediaanielossaolosta alle 6 kuukautta. Potilailla, jotka tehdään mahdollisesti parantava resektio 5 vuoden pysyvyys on vähintään 24%, koska paikallisen uusiutumisen ja etäpesäke [1], [6], [7]. Uusia terapeuttisia strategioita kiireellisesti tarvitaan tämän erittäin pahanlaatuinen sairaus.

Metformiini on lääke, jota käytetään yleisesti hoidettaessa tyypin II diabetesta. Äskettäin epidemiologista tietoa paljasti, että metformiini, mutta ei muita diabeteslääkkeet, vähentää ilmaantuvuus haimasyövän potilailla, joilla on diabetes [8], [9]. Mielenkiintoista on, että ei ole korrelaatiota suojaava vaikutus ja potilaiden veren sokeripitoisuutta [9]. Suojaava vaikutus on havaittu myös lihava hamsteri tumorigeneesin malli haimasyövän käyttäen N-nitrosobis- (2-oksopropyyli) amiini [10]. Useat

in vitro

tutkimukset ovat osoittaneet suoran toiminnan metformiinin monilla syöpäsolujen, mukaan lukien haimasyövän [11], [12]. Metformiini voi siis olla potentiaalinen terapeuttinen aine hoidettaessa haimasyövän, vaikka sen mekanismi anticancer toiminta on epäselvä.

In vitro

kokeet ovat paljastaneet annoksesta riippuvainen metformiinin vaikutusten syöpäsolujen leviämistä. Tyypillisesti pitoisuudet tällaisissa tutkimuksissa ovat 5-30 mM, jotka ovat paljon suuremmat kuin plasmassa ja kudoksissa mitattuna saaneet henkilöt suositellut hoitoannokset, ja vähemmän kuin 1 mmol metformiinia on vähän vaikutusta syöpäsolujen lisääntymistä [13] , [14].

Tässä osoitamme, että pieninä pitoisuuksina metformiinia on vaikutuksia eri alaryhmien haimasyövän soluja niiden ero ilmentymisen pinnan markkereita. CD133

+ ja CD24

+ CD44

+ ESA

+ solujen katsotaan haimasyöpä kantasoluja, ja leviämisen CD133

+ mutta ei CD24

+ CD44

+ ESA

+ soluja selektiivisesti inhiboi pieninä pitoisuuksina metformiinia. Metformiini liittyi vähennykset fosfo-Erk ja fosfo-mTOR riippumaton Akt ja AMPK fosforylaation. Vaikka alhainen pitoisuus metformiini ei ollut vaikutusta proliferatiivista kapasiteettia haiman syöpäsoluja yleensä niiden

in vitro

invasiivisia valmiuksia ja

in vivo

haimasyövän ksenografti- kasvu oli merkittävästi estyy.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

saadaan AsPC-1 ja SW1990 solut American Type Culture Collection. AsPC-1 haiman adenokarsinooma-solut, jotka ovat peräisin askites on 62-vuotias valkoihoinen nainen, potilaan haiman adenokarsinooma; SW1990 haiman adenokarsinooma solut peräisin etäpesäke pernasta 56-vuotiaan valkoihoinen miespotilas haiman adenokarsinooma. Molemmat solutyypit kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA), jota täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, Billings, MT) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (Invitrogen) 37 ° C: ssa 5% CO

2.

Virtaussytometria

pintamarkkerin havaitsemiseksi, solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan Hankin tasapainotettua suolaliuosta ja 1% FBS: ää (Gibco). Eristämiseksi CD133

+ solujen western blot-analyysi, solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan Hankin tasapainotettua suolaliuosta ja 1% FBS: ää. Fc-reseptorin sitoutuminen Inhibitor (eBioscience, Inc., San Diego, CA) lisättiin ja näytettä inkuboitiin 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kahden pesun jälkeen Anti-CD133 fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) (Biorbyt, Cambridge, UK), Anti-CD24 FITC (eBioscience), Anti-CD44 PE-Cy5 (eBioscience) tai anti-ESA PE (eBioscience) lisättiin ja näyte inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kahden pesun jälkeen osuudet Alapopulaation soluja, jotka ilmensivät eri pinnan markkereita määritettiin käyttäen FACSCalibur-järjestelmän (BD Biosciences, San Jose, CA) ja solujen lajittelu CD133

+ soluihin suoritettiin käyttämällä FACSAria järjestelmän (BD Biosciences) . Sivusironnan ja sirontamittari profiileja käytettiin poistamaan soluun dupleteiksi.

apoptoosin analyysiä, soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan ja metformiinin (0,2 mM AsPC-1, 0,1 mM SW1990) tai ilman metformiinia. Ensimmäinen, näytteitä inkuboitiin Fc-reseptoriin sitoutumisen estäjä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, sitten anti-CD133 FITC lisättiin ja näytettä inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kahden pesun jälkeen, anneksiini V APC ja propidiumjodidileimauksella suoritettiin virtaussytometrillä, joka toteutettiin käyttämällä anneksiini V-määrityksellä mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden mukaisesti.

solusyklin analyysi, soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan metformiini (0,2 mM AsPC-1, 0,1 mM SW1990) tai ilman metformiinia. Kiinnityksen jälkeen solujen 70% metanolia, Fc-reseptorin sitoutumisen inhibiittoria lisättiin, ja näytettä inkuboitiin 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Anti-CD133 FITC lisättiin sitten ja näytettä inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kahden pesun jälkeen näyte käsiteltiin RNaasi ja altistettiin propidiumjodidilla ja virtaussytometria.

Soluproliferaatiomääritys

soluproliferaatiomääritykset suoritettiin käyttäen CCK-8 mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut ympättiin 96-kuoppalevylle ja niitä viljeltiin 100 ul: aan DMEM: ää, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kun oli kulunut 24 tuntia, ympättiin soluja käsiteltiin 0,02, 0,05, 0,10, 0,20 tai 0,50 mM metformiinia lisättiin viljelyalustaan, tai ei ole saanut metformiinia. Ilmoitettuina ajankohtina, väliaine vaihdettiin 110 ui DMEM CCK-8-reagenssia, ja soluja inkuboitiin 2 tuntia. Absorbanssi mitattiin kunkin kuopan aallonpituudella 450 nm automaattisella mikrolevynlukijalla.

kasvukäyrä

Ensin soluja viljeltiin seerumittomassa DMEM: ssa 12 h. Sitten solut irrotetaan trypsinoimalla ja maljataan kuusi-kuoppalevyille DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja metformiinin (0,2 mM AsPC-1, 0,1 mM SW1990) tai ilman metformiinia pitoisuutena 1 x 10

3 solua /kuoppa. Solujen määrä arvioitiin Trypsinisoitiin; solujen näytteitä laskettiin hemosytometrillä 24 tunnin välein. Tulokset esitettiin graafisesti kasvukäyrä.

Cell invaasiomääritys

Solu invaasiomääritys suoritettiin 24 syvennyksen TranswellTM kammio (Corning, Inc., Corning, NY). Ensinnäkin, 8 um huokosia polykarbonaattikalvon insertti päällystettiin 100 ul: Matrigel (BD Biosciences). Ennen määritys suoritettiin, soluja käsiteltiin metformiinin (0,2 mM AsPC-1, 0,1 mM SW1990) 48 h tai ei annettu metformiinia. Kammioihin pantiin sitten 24-kuoppaisille levyille; 1 x 10

4 solut DMEM ja 0,2% FBS: ää, maljattiin kuhunkin ylempään kammioon, ja DMEM 10% FBS: ää ja metformiinin (0,2 mM AsPC-1, 0,1 mM SW1990) tai ilman metformiinin lisättiin alakammioissa. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 48 h, solut, jotka olivat tunkeutuneet vastakkaiselle puolelle kalvon pinnan värjättiin kristallivioletilla.

Vieraslajisiirteen kokeen

nainen

nu

/

nu

hiiret saatiin Experimental Animal Center of Union Hospital, Wuhan, Kiina. Kutakin koetta varten, hiiret jaettiin satunnaisesti yhtä suureen ryhmään (neljä hiirtä ryhmää kohti), jotka olivat käsittelemättömiä tai käsitelty metformiinin kanssa. Käsitellyille ryhmille, 800 mg /l metformiinin laimennettiin niiden juomavedessä päivittäin ajaksi kokeen; 72 tuntia myöhemmin, koko väestö haimasyövän soluja injektoitiin oikeaan kylkeen kunkin hiiren. Kasvaimet mitattiin joka 3 päivä alkuperäisen injektion jälkeen ja kasvaimen tilavuus (V) laskettiin V = (pituus x leveys

2) /2. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden unionin sairaala, Huazhong tiede ja teknologia (Luvan numero: 2009-096).

Western blotting

Virtaussytometria lajiteltu solut pestiin PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen RIPA-puskuria, 1 mM PMSF, 1 mM Na-

3Vo

4, ja 1 x proteaasi-inhibiittoriseosta 3 minuutin ajan jäillä. Lysaattia sentrifugoitiin 14000 x g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti käytettiin western blottauksella. Proteiini lysaatit keitettiin latauspuskuria (Beyotime, Jiangsu, Kiina), erotettiin elektroforeesilla 8% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-membraaneille (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Kalvot tutkittiin yön yli 4 ° C: AMPKα, fosfo-AMPKα (Thr172), Akt, fosfo-Akt (Thr308), Erk1 /2, fosfo-Erk (Thr202 /Tyr204), mTOR, ja fosfo-mTOR (Ser2448) ensisijainen vasta-ainetta (Cell Signaling, Danvers, MA), jossa β-aktiini (Cell Signaling) kuin kontrolli. Piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua lgG: tä (Beyotime) käytettiin spesifisten proteiinien. Lopuksi, immunologinen suoritettiin käyttäen kemiluminesenssi substraatteja (Amersham Pharmacia Biotech).

Tilastollinen analyysi

virtaussytometrialla ja solujen invaasiota määritykset, kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Ksenograftikudoksista Koe suoritettiin neljänä rinnakkaisena. Soluproliferaatiomäärityksiä ja kasvukäyrät, Kokeet suoritettiin kuutosta. Tulokset esitettiin keskiarvo ± keskihajonta, analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä ja sitten verrataan ryhmien välillä käyttämällä paritonta Studentin

t

-testi. Merkitsevyystasolla kynnysarvo

P

0,05 käytettiin. Aineisto analysoitiin SPSS V.11 tilasto-ohjelmalla (SPSS, Inc.).

Tulokset

Pieniä pitoisuuksia metformiinin ei estänyt lisääntymistä haimasyöpäsoluissa

tutkimiseksi vaikutusta pieninä pitoisuuksina metformiinin proliferaatioon haimasyövän soluja, teimme CCK-8-määritys käyttäen AsPC-1 ja SW1990-soluissa. Metformiini on osoitettu olevan vähän vaikutusta proliferaatioon haimasyövän soluja pieninä pitoisuuksina. Kuten on esitetty kuviossa. 1, esillä olevassa tutkimuksessa soluja käsiteltiin ,01-+0,2 mM metformiinin 72 tuntia, mutta niiden eloonjääminen ei inhiboinut.

AsPC-1 ja SW1990 soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa metformiinin 72 tuntia ja numerot elävien solujen määritettiin CCK-8-määrityksessä. Tulokset on esitetty osuus elävien solujen suhteessa kontrolliin. Eroa elinkelpoisten solujen välillä havaittiin soluissa, joita käsiteltiin pieninä pitoisuuksina metformiinin (≤0.5 mM) ja valvontaa. Virhe palkit edustavat keskihajonta.

Pieniä pitoisuuksia metformiinin vähentynyt osuus CD133

+ solujen

vaikutuksen tutkimiseksi pieninä pitoisuuksina metformiinin proliferaatioon eri osapopulaatioiden haimasyövän soluja, teimme virtaussytometrian määritys käyttäen AsPC-1 ja SW1990-soluissa. Solut käsiteltiin 0,01-0,2 mM metformiinin 72 h ja niiden ilmentyminen pinnan merkkiaineiden analysoitiin. Kuten on esitetty kuviossa. 2, pieninä pitoisuuksina metformiinin laski CD133

+ solujen annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta ei vaikuttanut CD24

+, CD44

+, ESA

+ tai CD24

+ CD44

+ ESA

+ solujen (CD24

+ CD44

+ ESA

+ solut eivät ole havaittavissa joukossa AsPC-1-soluissa).

AsPC-1 ja SW1990 soluja inkuboitiin eri pitoisuudet metformiinin 72 tuntia ja osuudet ilmentävien solujen eri pinnan markkereita määritettiin virtaussytometrialla. Tulokset on esitetty osuudet eri alaryhmien solujen. Osuudet CD24

+, CD44

+, ESA

+ ja CD24

+ CD44

+ ESA

+ soluja (havaittavissa vain SW1990-soluissa) ei muuttunut käsittelyllä pieninä pitoisuuksina metformiinin (≤0.2 mM). Osuus CD133

+ solut laskettiin annoksesta riippuvaisella tavalla; 0,2 mM metformiini AsPC-1-soluissa ja 0,1 mM metformiini SW1990 solujen vähentynyt osuus CD133

+ solujen puoleen. Virhe palkit edustavat keskihajonta.

*

P

0,05 (verrattuna kontrolli)

Pieniä pitoisuuksia metformiinin estivät leviämisen CD133

+ solujen G1 /S pidätys

vaikutuksen tutkimiseksi pieniä pitoisuuksia metformiinin proliferaatioon CD133

+ haimasyövän soluja, AsPC-1 ja SW1990 soluja käsiteltiin 0,2 mM tai 0,1 mM metformiini, vastaavasti. Solujen lukumäärät laskettiin 24 tunnin välein ja virtaussytometria suoritettiin määrittämään numerot ja osuudet CD133

+ ja CD133

– solut ilmoitettuina ajankohtina. Kuten on esitetty kuviossa. 3, leviämisen CD133

+ soluissa oli valikoivasti estyy. Apoptoosi ja solusyklin analyysi suoritettiin 48 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin metformiinin (0,2 mM AsPC-1, 0,1 mM SW1990) tai ilman metformiinia; Näiden pieninä pitoisuuksina indusoi apoptoosin ole CD133

+ eikä CD133

+ soluja, mutta solusyklin että CD133

+ solujen muuttui hoidon. Alhainen pitoisuus metformiini kasvattanut CD133

+ solut G0 /G1 vaiheeseen ja laski, että solujen S-vaiheessa merkittävästi. CD133

– solukierron ei vaikuttanut (kuvio. 4).

, kasvukäyrät haimasyöpäsoluissa käsiteltiin pieninä pitoisuuksina metformiinia. AsPC-1 ja SW1990 soluja inkuboitiin 0,2 mM tai 0,1 mM metformiini, vastaavasti, ja niiden määrä laskettiin kunakin ajankohtana. Tulokset on esitetty kannen nähden kasvu 0 h. B, vaikutus pieninä pitoisuuksina metformiinin osuudesta CD133

+ soluja. AsPC-1 ja SW1990 soluja inkuboitiin 0,2 mM tai 0,1 mM metformiini, vastaavasti, ja osuus CD133

+ solut määritettiin kunakin ajankohtana. Osuus CD133

+ solut vähenivät asteittain. C, kasvukäyrät CD133

+ ja CD133

– haimasyöpäsoluissa käsiteltiin pieninä pitoisuuksina metformiinia. Kokonaismäärä haimasyöpäsoluissa ja osuudet CD133

+ ja CD133

– soluja määritettiin kunakin ajankohtana. Tulokset on esitetty kannen nähden kasvu 0 h. Leviämisen CD133

+ soluissa oli valikoivasti estyy. Virhe palkit edustavat keskihajonta.

, vaikutus pieninä pitoisuuksina metformiinin apoptoosin haimasyöpä. AsPC-1 ja SW1990 soluja inkuboitiin 0,2 mM tai 0,1 mM metformiini, vastaavasti, 72 tuntia ja osuudet apoptoottisten solujen määritettiin virtaussytometrialla. Merkittäviä eroja ei havaittu käsiteltyjen solujen ja valvontaa. B, vaikutus alhaisten pitoisuuksien metformiinin solusyklin haimasyövän. AsPC-1 ja SW1990 soluja inkuboitiin 0,2 mM tai 0,1 mM metformiini, vastaavasti, 72 tuntia ja osuudet solujen kunkin vaiheen solusyklin määritettiin virtaussytometrialla. Pieneneminen koko S vaiheessa olevien solujen ja lisäystä G0 /G1 vaihe ehdottaa G1 /S pidätys CD133

+ soluja. Virhe palkit edustavat keskihajonta.

*

P

0,05.

Pieniä pitoisuuksia metformiinin esti hyökkäyksen haimasyöpäsoluissa

TranswellTM -koe sen vaikutuksen tutkimiseksi pieninä pitoisuuksina metformiinin haiman syöpäsoluinvaasiota. Metformiinin kanssa (0,2 mM AsPC-1, 0,1 mM SW1990) vähensi solujen tunkeutuneet vastakkaiselle puolelle kalvon Transwell kammion verrattuna soluihin, jotka eivät saaneet metformiinin (Fig. 5B), mikä viittaa siihen, että pieni pitoisuus metformiini estää invasiivisia kapasiteettia haiman syöpäsoluja.

Effect alhaisten pitoisuuksien metformiinin hyökkäyksen haimasyöpä. AsPC-1 ja SW1990 soluja inkuboitiin 0,2 mM tai 0,1 mM metformiini, vastaavasti, 72 tuntia ja solujen invaasiota määritettiin Transwell määrityksellä. Pieninä pitoisuuksina metformiinin vähensi hyökkäyksen haiman syöpäsoluja. Virhe palkit edustavat keskihajonta.

*

P

0,05.

anto suun metformiinin esti haimasyövän ksenograftin kasvua in vivo

vaikutuksen tutkimiseksi pieniannoksisen metformiinin haimasyöpä

in vivo

, vierassiirrekokeissa käyttämällä

nu Twitter /

nu

hiiriä tehtiin. Hiiriä hoidettiin metformiinilla, lääkkeen määrää laimennetaan juomaveteen vastasi ihmisen 20 mg /kg normalisointi pinta-alaan; plasman metformiinin hiirillä oli noin 0,02 mm. Hiiret tapettiin 18 (AsPC-1-solut) tai 24 (SW1990-soluissa) päivän kuluttua ne ruiskutettiin haimasyöpäsoluissa (5 x 10

6 AsPC-1-solut, 1 x 10

7 SW1990-soluissa) . Kasvu haimasyövän -ksenografteissa inhiboi merkittävästi metformiiniin (Fig. 6).

, Vieraslajisiirteen lopetuksen. Kahdeksansataa milligrammaa litrassa metformiinin laimennettiin juomaveteen

nu Twitter /

nu

hiirillä 72 tuntia ennen injektiota haimasyövän soluja. Hiiret tapettiin 18 tai 24 päivää implantaation jälkeen. Ksenograftien hiirille on suun kautta metformiinin olivat paljon pienempiä kuin käsittelemättömästä hiirillä. B, vaikutus suun kautta metformiinin kasvuun ksenograftien. Kahdeksansataa milligrammaa litrassa metformiinin laimennettiin juomaveteen

nu Twitter /

nu

hiirillä 72 tuntia ennen injektiota haimasyövän soluja. Kasvaimet mitattiin joka 3 päivä injektion jälkeen ja kasvaimen tilavuus (V) laskettiin V = (pituus x leveys

2) /2. -ksenografti Kasvu estyi merkittävästi antamalla suun kautta metformiinin. Virhe palkit edustavat keskihajonta.

*

P

0,05.

Pieniä pitoisuuksia metformiinin estivät fosforylaation mTOR riippumaton Akt ja AMPK fosforylaatiota CD133

+ solujen

tunnistaa mahdolliset molekyyli- determinantit vaikutuksia metformiinin CD133

+ soluja, arvioimme aktivointi AMPK, Erk, ja Akt – kolme kinaasit, jotka ovat mahdollisesti mukana näitä vaikutuksia. mTOR, joka fosforyloituu AMPK, Erk, ja Akt, arvioitiin myös. Sen jälkeen kun metformiinin 4 h (0,2 mM AsPC-1, 0,1 mM SW1990), vähennykset fosfo-Erk ja fosfo-mTOR havaittiin CD133

+ soluja, mikä viittaa vaatimus eston Erk ja mTOR by kasvunestotestissä metformiinin. Mitään merkittävää muutosta fosfo-AMPKα havaittiin, kun taas fosfo-Akt lisääntyi jälkeen metformiinin, mikä viittaa siihen, että estävää vaikutusta metformiinin mTOR oli riippumaton AMPK ja Akt-fosforylaation (kuvio. 7).

Haiman syövän soluja käsiteltiin metformiini 4 h (0,2 mM AsPC-1, 0,1 mM SW1990) ja CD133

+ solut lajitellaan virtaussytometrialla. Expression of AMPKα, Akt, Erk1 /2, ja mTOR ja fosforylaation CD133

+ solut arvioitiin western blottauksella ja tulokset kvantifioitiin käyttäen ImageJ V.1.46r (National Institutes of Health). Merkitsevää pienenemistä fosfo-ERK1 /2 ja fosfo-mTOR ilmaisun ja merkittävään kasvuun fosfo-Akt ekspressiotasoja havaittiin metformiinin treated soluja. Virhe palkit edustavat keskihajonta.

*

P

0,05.

Keskustelu

metformiini alentaa maksan glukoosin tuotantoa ja lisää insuliiniherkkyyttä ja glukoosin käyttöä lihakset ja rasvasolut, johtaen vähentynyt insulinemia ja paranemisen insuliiniherkkyyttä diabeetikoilla. Se on yleisimmin määrätty diabeteslääkkeet lääke tyypin II diabetes [15], ja sitä käytetään myös muiden sairauksien, joissa on insuliiniresistenssi, mukaan lukien munasarjojen monirakkulatauti [16], alkoholittomat rasvamaksa [17] ja ennenaikaisen murrosiän [18] . Viime aikoina se on saanut huomiota sen potentiaalisen tehon syöpälääkkeenä. Vuonna uraauurtavaa työtä, Evans et al. Ensimmäinen osoitti vuonna 2005, että metformiinia voi liittyä pienempi riski syövän potilaille, joilla on tyypin II diabetes [19]. Vuonna 2009 tapaus verrokkitutkimuksessa keskitytään vaikutusta diabeteslääkkeiden hoitomuotojen riski haimasyövän julkaisi Li et al. ja osoitti, että metformiini vähensi haimasyövän riskiä, ​​jossa riskisuhde 0,38 [9]. Tehokkuus metformiinin alenevassa ilmaantuvuuden haimasyövän ovat tukeneet muut epidemiologiset ja eläinkokeissa [8], [10].

Vaikka metformiinia n diabeteslääkkeiden vaikutusmekanismi on epävarma, aktivointi AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) on laajalti hyväksytty mahdollinen mekanismi. AMPK on tärkeä entsyymi osallistuu insuliinin signalointiin, aineenvaihduntaa glukoosin ja rasvojen ja glukoosin tuotantoa maksassa soluissa. Monissa solun tutkimukset ovat keskittyneet AMPK ja niihin liittyviä molekyylejä ja ovat paljastaneet syövän vastainen toiminta metformiinin

in vitro

[12], [20], [21]. Tuoreessa tutkimuksessa osoitettiin myös kasvainten vastainen toiminta metformiinin haimasyövän kantasolujen [13]. Huomattavaa on, että useimmat näistä kokeista käytetään pitoisuuksia metformiinin (tyypillisesti 5-30 mM), jotka ovat paljon korkeampia kuin suositeltu terapeuttiset annokset kliiniseen käyttöön. Kun pitoisuudet laskivat samassa järjestyksessä kuin löydetty plasmasta ja kudosten saavilla henkilöillä terapeuttisia annoksia, soluproliferaation inhibointi ei havaittu. Meidän tiedot osoittavat, että lisääntymistä haimasyövän soluja ei inhiboi alle 0,5 mM metformiini.

Useimmat kasvaimet, mukaan lukien haimasyöpä, ovat heterogeenisiä; eli ne sisältävät solut vaihtelevan fenotyyppisten ja biologinen ominaisuudet. Syöpä kantasolujen hypoteesi ehdottaa, että vain pieni solujen alapopulaation, joka määritellään syövän kantasoluja, on kyky aiheuttaa kaikkien solutyyppien löytyy erityisesti syöpä näyte. Syöpä kantasolut avainasemassa on kasvainten synnyssä, kasvu, invaasio, etäpesäke, toistuminen ja kestävyys adjuvanttihoito syövän [22], [23]. Siksi epäilemme, että pieniä pitoisuuksia metformiinin voi vaikuttaa haimasyövän kantasolut ja ei-kantasoluja syöpäsoluja eri tavoin, mikä voisi selittää lääkkeen

in vivo

syövän vastaisia ​​toimia ja epäjohdonmukaisuus

in vitro

ja

in vivo

tuloksia. Koska CD133

+ ja CD24

+ CD44

+ ESA

+ soluja on dokumentoitu olevan haimasyövän kantasolujen [24], [25], [26], me määritti alhainen pitoisuudet metformiinin seuraavilla alapopulaatioiden, mikä osoittaa vähentynyt osuus CD133

+ soluja. Ottaen huomioon pieni vaikutus alhaisten pitoisuuksien metformiinin proliferaatioon haimasyöpäsoluissa yleensä, voidaan päätellä, että leviämisen CD133

+ soluja, mutta ei CD24

+, CD44

+, ESA

+, tai CD24

+ CD44

+ ESA

+ soluja, selektiivisesti estyy. Hermann et ai. osoittivat, että CD133

+ ja CD24

+ CD44

+ ESA

+ soluja päällekkäin mutta eivät identtisiä L3.6pl peräisin olevia soluja COLO 357 haimasyöpäsoluissa [25]. Tuloksemme osoittivat, että CD133

+ solut, mutta ei CD24

+ CD44

+ ESA

+ solut ovat havaittavissa joukossa AsPC-1-soluissa. Kuten SW1990 solujen CD24

+ CD44

+ ESA

+ soluja, joiden osuus 5,46% kaikista soluista, oli herkkä metformiinin, mikä viittaa siihen, että biologisia ominaisuuksia CD133

+ ja CD24

+ CD44

+ ESA

+ solujen eroavat. Olemme edelleen määritelty osuus CD133

+ soluja 24 tunnin välein 5 päivän kuluttua hoidon haimasyövän soluja pieninä pitoisuuksina metformiinin ja tuotetun kasvukäyrät sekä CD133

+ ja CD133

– soluja. Selektiivinen esto CD133

+ soluissa oli selvä. Kertyvät

in vitro

todisteet viittaavat siihen, että suuria pitoisuuksia metformiinin voi käyttää antituumorivaikutusta indusoimalla apoptoosin ja /tai solusyklin pysähtymiseen, mutta on olemassa muutamia julkaistuja tietoja pieninä pitoisuuksina. Siten tutkimme myös vaikutusta alhainen pitoisuus metformiinin apoptoosiin ja solusyklin. Apoptosis, joka on dokumentoitu olevan tärkeä antituumorivaikutuksen metformiinin, aiheutettiin ole CD133

+ eikä CD133

– soluja. G1 /S pidätys aiheutettiin CD133

+ muttei CD133

– soluja. G1 /S pidätys voi siis olla keskeinen rooli estävät selektiivisesti CD133

+ solut.

sitten suoritettu

in vitro

ja

in vivo

kokeissa tarkastaa syövän vastaisen toiminnan alhaisten pitoisuuksien metformiinin haimasyövän. Haimasyöpäsoluissa hoidettiin metformiinilla 72 h käytettiin soluinvaasiota määrityksissä koska hoito vähensi osuutta CD133

+ solujen puoleen. Metformiini laimennettiin juomaveteen

nu Twitter /

nu

hiirillä 72 tuntia ennen ksenograftissa kokeen saavuttaa vakaan tilan plasmassa mukaan metformiinin [27]. Sekä in vitro invaasiomääritys ja in vivo ksenograftissa määrityksessä tukenut syövän vastaisen toiminnan alhainen pitoisuus metformiinia. Erot SW1990 ksenograftin kasvainten eivät olleet tilastollisesti merkitseviä 21. päivänä (

P

= 0,062) tai päivä 24 (

P

= 0,055). Tämä saattaa johtua siitä, että pieni otoskoko. Ottaen huomioon pienet metformiinin vaikutusten leviämisen CD133

– soluja ja avainroolia syövän kantasoluja syövän etenemiseen, invaasio, ja etäpesäkkeiden [28], [29], me alustavasti viittaavat siihen, että selektiivinen esto CD133

+ solujen vaikuttaa merkittävästi in vitro ja in vivo syövänvastainen vaikutus metformiinin.

vieressä arvioitiin ilmentymistä molekyylejä, jotka voivat määrittää syövän vastaisen toiminnan metformiinin CD133

+ haiman syöpäsoluja. Aktivointi mTOR säätelee kasvutekijät ja ravinteita, ja se säätelee solujen kasvua ohjaamalla mRNA käännös, ribosomi biogeneesin, autophagy, ja aineenvaihdunta [30]. Monet kohteet mTOR kinaasin yli-ilmennetään tai mutantit syövän, mikä korreloi syövän etenemiseen, haitalliset ennuste, ja kestävyys kemoterapiaa [31]. Viime vuosina, mTOR havaittiin tärkeitä rooleja säilyttää syövän kantasoluja [32], [33]. Näin ollen, mTOR on pidetty terapeuttisena kohteena syövässä, jotka voidaan kohdistaa metformiinin [34], [35]. Estovaikutusta metformiinin fosforylaation mTOR, jotka on raportoitu syöpäsoluissa, mukaan lukien ne, haimasyövän [36], [37], havaittiin CD133

+ haimasyövän soluja tässä tutkimuksessa. Vaikka metformiini on dokumentoitu indusoivan aktivaatio AMPK haiman syöpäsoluissa, emme havaittu tämän ilmiön, joka voi johtua alhaisesta pitoisuudesta metformiinia käytetään tässä tutkimuksessa [36]. Erk ja Akt kaksi muuta välittäjiä mTOR syöpäsoluissa. Mutaatio K-Ras, vallitseva mutaatio haimasyövän, johtaa poikkeavaan aktivoituminen Erk haiman syöpäsoluja, mikä puolestaan ​​johtaa mTOR aktivointi [38]. Osoitimme yksimielisiksi estoaktiivisuus metformiinin Erk ja mTOR in CD133

+ soluja, mikä johtaa meidät mukaan Erk riippuvainen kumota mTOR aktivointi on tärkeä rooli syövän vastaisen toiminnan metformiinin. Äskettäin samanlainen selektiivinen estävä metformiinin vaikutusten CD133

+ syöpäsolujen aiheutua metformiinin inhiboivan vaikutuksen Akt dokumentoitiin glioblastoma [39]. Sen sijaan, tuloksemme osoittavat, että metformiini aiheuttama aktivoituminen Akt vuonna CD133

+ haiman syöpäsoluja. Olemme alustavasti viittaavat siihen, että kaksi mekanismia voidaan edistää aktivointi Akt on CD133

+ haimasyövän soluja. Ensinnäkin, metformiini indusoi uudelleen ilmentymisen miR-200 haimasyövän [13]. FOG2 tukahduttaa PI3K sitomalla p85α alayksikkö ja miR-200 aktivoi PI3K /Akt-signalointireitin kumoamalla FOG2 [40]. Toiseksi, Erk riippuvainen mTOR saattaa välittää takaisinkytkentäsilmukan, joka lisää Akt fosfory- [41].

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että pieniä pitoisuuksia metformiinin, samaa luokkaa kuin mitattu plasman ja kudosten yksilöitä, jotka ovat saaneet suositeltu terapeuttinen annos metformiinia, estää selektiivisesti proliferaatiota CD133

+ haimasyöpäsoluissa ja on syövän vastainen toiminta sekä

in vitro

ja

in vivo

.