Krooninen sairaus

tiivistelmä

MDA-7 /IL-24 oli mukana erityinen syöpään apoptoosin kautta tukahduttaminen Bcl-2: n ilmentymisen, joka on keskeinen apoptoosin säätelyproteiini mitokondriaalisen syöttämällä reitin. Kuitenkin mekanismit tämän sääntelyn ovat epäselviä. Me raportoimme tässä, että kasvain-selektiivinen monistautumiskykyisten adenovirus ZD55-IL-24 johtaa Bcl-2 S-denitrosylation ja samanaikainen ubikitinaatiosta jotka osallistuvat 26S-proteasomin hajoamista. IL-24-siRNA estää täysin Bcl-2 ubikitinaation kautta reversion Bcl-2: S-denitrosylation ja suojaa sitä proteasomaalisten heikkeneminen, joka vahvistettiin merkittävä rooli MDA-7 /IL-24 säätelyssä posttranslational muutos Bcl-2 syöpäsoluissa . Typpioksidi (NO) on keskeinen säätelijä-proteiinin S-nitrosylation ja denitrosylation. NO-luovuttaja, natrium (SNP), alas-säätelee Bcl-2 S-denitrosylation, vaimentaa Bcl-2 ubikinaation ja myöhemmin ehkäisee MDA-7 /IL-24 indusoi syöpäsolujen apoptoosin, kun taas NO estäjä 2- (4-karboksifenyyli) -4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oksi-3-oksidi (PTIO) esittää päinvastainen vaikutus. Samaan aikaan, nämä NO modulaattorit eivät vaikuta Bcl-2 fosforylaation, mikä viittaa siihen, että NO säätelee Bcl-2 vakaus fosforylaatiosta riippumattomalla tavalla. Lisäksi Bcl-2 S-nitrosylation vähennys aiheuttama ZD55-IL-24 johtui sekä iNOS lasku ja TrxR1 lisäys. iNOS-siRNA helpottaa Bcl-2 S-denitrosylation ja ubikitiinistä hajoamista, kun taas TrxR1 estäjä auranofin estää Bcl-2: n denitrosylation ja ubikitinaatio, mikä hillitsee kaspaasin signaalireitin aktivoinnin ja myöhemmän syöpäsolun apoptoosin. Yhdessä meidän tutkimukset paljastavat, että MDA-7 /IL-24 indusoi Bcl-2 S-denitrosylation säätelemällä iNOS ja TrxR1. Lisäksi denitrosylation Bcl-2 tulokset sen ubikinaation ja sen jälkeen kaspaasi proteaasi perheen aktivaation seurauksena, apoptoosin alttius. Nämä havainnot tarjoavat uuden käsityksen MDA-7 /IL-24 indusoi kasvun esto ja syövän apoptoosin.

Citation: Tian H, Wang J, Zhang B, Di J, Chen F, Li H, et al. (2012) MDA-7 /IL-24 indusoi Bcl-2 Denitrosylation ja Ubiquitin-Hajoaminen Mukana Cancer Cell Apoptosis. PLoS ONE 7 (5): e37200. doi: 10,1371 /journal.pone.0037200

Editor: Demetrios Vavvas, Massachusetts Eye Korva sairaala-Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 joulukuu 2011; Hyväksytty: 16 huhtikuu 2012; Julkaistu: 21 toukokuu 2012

Copyright: © 2012 Tian et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat National Natural Science Foundation of China (nro. 81071854) ja Science and Technology Department of Jiangsun maakunnassa (BK2010177, BK2010179). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Interleukiini 24 (IL-24), jota kutsutaan myös melanooma erilaistumiseen liittyvän geeni-7 (MDA-7), on ainutlaatuinen jäsen IL-10-geenin perhe, joka näyttää selektiivinen induktio syövän erityisiä apoptoosin vahingollisia vaikutuksia normaaleissa soluissa [1] – [3]. MDA-7 /IL-24 indusoi kasvun hidastuminen ja apoptoosin laajan kirjon ihmisen syöpäsoluja, kuten melanooman, pahanlaatuinen gliooma, ja rinta- [4] – [8]. Osallistumista MDA-7 /IL-24: n indusoiman apoptoosin kasvainsoluissa kudoksissa liittyy solulimakalvostoon (ER) stressi ja mitokondrioiden ja reaktiivisen hapen (ROS) tuotanto [7], [9], [10]. Lisäksi MDA-7 /IL-24 aiheuttama voimakas ”sivullinen antituumorivaikutuksen” toimintaa, kykyä estää kasvaimen angiogeneesiä, synergiaa säteily, kemoterapiaa, monoklonaalinen vasta-aine hoitojen ja immuunijärjestelmän modulatorisen toimintaa [11], [12], jotka tekevät siitä ihanteellisen työkalu syövän geeniterapiaa.

Vaikka kanavat, joita MDA-7 /IL-24 lisää apoptoosin kasvainsoluissa ei täysin tunneta, todisteita useista tutkimuksista viittaa siihen, että MDA-7 /IL-24 välittää monien proteiinien tärkeää puhkeamista kasvun inhibition ja osallistuminen mitokondrioiden apoptoottisen solukuoleman reaktiotien [7]. B-solulymfooma-geenin 2 (Bcl-2), joka on yksi anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäseniä, on lokalisoitu ulomman mitokondriokalvon. Jotkut antiapoptoottisten mekanismeja Bcl-2 sisältävät sääntely kalsiumtasapainoa ja neutralointi proapoptoottiset proteiinin Bax muodostamalla heterodimeerejä. Lisäksi Bcl-2 edisti saarto sytokromi c release ja yhdessä mitokondriaalisen apoptoosin tekijä Apaf1 lopulta esti kaspaasi proteaasin perheen ja säilynyt mitokondrioiden eheys [13], [14]. MDA-7 /IL-24 tukahduttaa Bcl-2-proteiinin ekspressio, joka näin lisäsi suhde tietyn pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit kallistamalla tasapainon säilymisen kuolemaan karsinoomasoluja. Sen sijaan, yliekspressio Bcl-2 suojattu syöpäsolujen MDA-7 /IL-24-välitteisen apoptoosin, mikä viittaa siihen, Bcl-2: lla on tärkeä rooli syöpäsolujen apoptoosin vasteena MDA-7 /IL-24 [8]. Kuitenkin tarkka mekanismi, jolla MDA-7 /IL-24 säänneltyä Bcl-2 helpottaa mitokondrioiden ei ole tunnistettu. Esillä olevassa tutkimuksessa käytettiin kasvaimeen selektiivinen replikoituva adenovirusta, joka ekspressoi IL-24 (ZD55-IL-24), joka poistetaan olennainen viruksen E1B 55 kDa: n geenin ja aiheuttivat vahvan sytopaattinen vaikutus ja merkittävä apoptoosia tuumorisoluissa, ilman normaaleissa soluissa [15] tutkimaan edelleen mekanismi MDA-7 /IL-24 asiakkuutta Bcl-2 säätely alaspäin ja myöhemmät karsinooma apoptoosia.

(A) aika tietenkin analyysi IL-24-proteiinin ilmentymistä Hela, A375 ja 7860 soluja käsiteltiin ZD55-IL-24 (20 MOI). (B) Aika tietenkin analyysi E1A proteiinin ilmentymistä Hela, A375 ja 7860 solut käsitellään ZD55-IL-24 (20 MOI). (C) Aika tietenkin analyysi Bcl-2-proteiinin ekspressio HeLa, A375 ja 7860 soluissa, joita käsiteltiin ZD55-IL-24 (20 MOI). β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (D) ZD55-EGFP (5 MOI), jossa raportti geeniä käytettiin EGFP: tä havaitsemaan infektion tehokkuuden replikoituvan adenoviruksen eri ajankohtina (suurennus x 200). (E) Hela, A375 ja 7860-solujen elinkelpoisuutta käsiteltiin ZD55-IL-24 (20 MOI) on eri ajankohtina määritettiin MTT: llä. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskihajonta (S.D.) kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3); *

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmään.

(A) vaikutukset eri tiitterit ZD55-IL-24 (0,1 MOI, 1 MOI, 5 MOI, 10 MOI , 20 MOI) on Bcl-2: n ilmentymisen indusoima Western blottauksella 48 h infektion jälkeen ZD22-IL24. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) ZD55-EGFP on eri tiitterit käytettiin havaitsemaan infektion tehokkuuden replikatiivisen adenovirus (suurennus x 200). (C) HeLa-solujen elinkelpoisuus on käsitelty eri tiitterit ZD55-IL-24 määritettiin MTT-määrityksellä. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskihajonta (S.D.) kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3); *

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmään.

(A) Hela, A375 ja 7860 solujen vastauksena ZD55-IL-24 (20 MOI) valmistettiin immunosaostuksella käyttämällä anti-Bcl-2-vasta-aine. Saatu immuunivaste kompleksit analysoitiin anti-S-nitrosocysteine ​​Western-blottauksella ja seisoi Bcl-2 S-nitrosylation tasolla eri ajankohtina 12 h, 24 h, 36 h ja 48 h, vastaavasti. (B) ajan kuluessa Bcl-2 ubikitinaation HeLa-soluissa havaittiin immunosaostuksella käyttämällä anti-Bcl-2-vasta-aineen ja sitten seuraa immunoblottauksella anti-ubikitiini-vasta-ainetta. (C) vaikutus IL-24-siRNA (100 nM), kun IL-24: n, Bcl-2: n ilmentymisen, Bcl-2 S-nitrosylation ja ubikitinaatio HeLa-soluissa havaittiin Western-blottauksella ja samanaikainen immunosaostus. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Vastaavat juovat skannataan, ja optinen tiheys (O.D.) määritettiin kertainen muutos verrattuna kontrolliryhmään. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskihajonta (S.D.) kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3); *

p

0,05 vs. kontrolliryhmä;

#

p

0,05 versus salattu siRNA ryhmä.

(A) aika tietenkin analyysi kaspaasi-9, kaspaasi-3 ja PARP HeLa-soluissa käsitelty ZD55 -IL-24 (20 MOI). Vastaavat juovat skannataan, ja optinen tiheys (O.D.) määritettiin kertainen muutos verrattuna kontrolliryhmään. (B) Varhainen apoptoosin ja myöhäinen apoptoosin HeLa-soluissa havaittiin värjäämällä solut anneksiini V-FITC (vihreä väri) ja propidiumjodidia (punainen väri) on eri ajankohtina. (C) HeLa-soluissa, käsiteltiin ZD55-IL-24 eri aikaan värjättiin anneksiini V-FITC /propidiumjodidia (PI) ja välittömästi analysoitiin virtaussytometrialla. Data esitetään prosentteina anneksiini V-positiivisten solujen kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmään.

(A) Hela, A375 ja 7860-soluja esikäsiteltiin ZD55-IL-24 (20 MOI) 24 tunnin ajan ja sitten käsitelty NO luovuttaja SNP (2 mM), NO estäjä PTIO (300 uM) ja SNP samanaikainen antaminen pelkistimen DTT (10 mmol) 6 tuntia vastaavasti. Bcl-2: S-nitrosylation havaittiin immunosaostuksella käyttämällä anti-Bcl-2-vasta-aineen ja sitten seuraa immunoblottauksella anti-S-nitrosocysteine ​​vasta-aine. (B) vaikutus NO modulaattorit on Bcl-2 ubikinaa- HeLa-soluissa havaittiin immunosaostuksella käyttämällä anti-Bcl-2-vasta-aineen ja sitten seuraa immunoblottauksella anti-ubikitiinipromoottori vasta-aine. (C) vaikutus NO modulaattoreiden on Bcl-2: n ilmentymisen in Hela, A375 ja 7860-solujen havaittiin Western-blottauksella käyttämällä anti-Bcl-2-vasta-aine. (D) Hela, A375 ja 7860-soluja esikäsiteltiin ZD55-IL24: ssa 24 tuntia ja sitten käsiteltiin proteasomaalisten inhibiittorin MG132 (10 uM) 6 tuntia. Bcl-2: n ilmentyminen analysoitiin Western-blottauksella käyttäen anti-Bcl-2-vasta-aine. (E) Bcl-2: n fosforylaatiota Hela-soluissa havaittiin Western-blottauksella anti-p-Bcl-2 (Ser87) vasta-aine. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Vastaavat nauhat skannattiin ja voimakkuudet määritettiin optinen tiheys (OD) mittaukset. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskihajonta (S.D.) kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3).

#

p

0,05 versus ZD55-EGFP; *

p

0,05 versus ZD55-IL-24-ryhmä;

@

p

0,05 versus DMSO ryhmä.

(A) Hela-soluja esikäsiteltiin ZD55-IL24 (20 MOI) 24 tunnin ajan ja sitten lisätään NO luovuttajan SNP (2 mM), NO estäjä PTIO (300 uM), SNP samanaikainen antaminen pelkistimen DTT (10 mM) ja proteasomaalisten estäjä MG132 (10 uM) 6 tuntia vastaavasti. Prokaspaasi-9, pilkottiin kaspaasi-9, prokaspaasi-3, pilkotaan kaspaasi-3 havaittiin Western-blottauksella. (B) vaikutus NO modulaattorit SNP, PTIO, SNP + DTT ja proteasomin estäjä MG132 varhaisen apoptoosin ja myöhäinen apoptoosin HeLa-soluissa käsitelty ZD55-IL-24 havaittiin värjäämällä anneksiini V-FITC (vihreä väri) ja propidiumjodidia (punainen väri) vastaavasti. (C) HeLa-solut värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidia ja välittömästi analysoitiin virtaussytometrialla. (D) Vaikutukset NO modulaattorit ja MG132 päälle Hela solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT: llä. Vastaavat juovat skannataan, ja optinen tiheys (O.D.) määritettiin kertainen muutos verrattuna kontrolliryhmään. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskihajonta (S.D.) kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3).

#

p

0,05 versus ZD55-EGFP ryhmä; *

p

0,05 versus ZD55-IL-24-ryhmä;

@

p

0,05 versus DMSO ryhmä.

(A) aika tietenkin analyysi iNOS ilmaisun Hela, A375 ja 7860 solut käsitellään ZD55-IL-24 (20 MOI). (B) Hela, A375 ja 7860-solut transfektoitiin iNOS-siRNA (100 nM) 12 tuntia, sitten käsiteltiin ZD55-IL-24: ssa 12 h. Vaikutus iNOS-siRNA on iNOS-ilmentyminen analysoitiin Western-blottauksella. (C) vaikutus iNOS-siRNA on Bcl-2-proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western-blottauksella. (D) vaikutus iNOS-siRNA on Bcl-2 S-nitrosylation havaittiin immunosaostuksella käyttämällä anti-Bcl-2-vasta-aineen ja sitten seuraa immunoblotat- anti-S-nitrosocysteine ​​vasta-aine. (E) vaikutus iNOS-siRNA on ubikitiinistä Bcl-2 havaittiin immunosaostuksella käyttämällä anti-Bcl-2-vasta-aineen ja sitten seuraa immunoblottauksella anti-ubikitiinipromoottori vasta-aine. (F) vaikutus iNOS-siRNA on kaspaasi-9, kaspaasi-3 ja PARP HeLa-soluissa havaittiin Western-blottauksella. Vastaavat juovat skannataan, ja optinen tiheys (O.D.) määritettiin kertainen muutos verrattuna kontrolliryhmään. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskihajonta (S.D.) kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3). *

p

0,05 vs. kontrolliryhmä;

#

p

0,05 versus salattu siRNA ryhmä.

(A) aika tietenkin analyysi TrxR1 ilmaisun Hela, A375 ja 7860 solut käsitellään ZD55-IL- 24 (20 MOI). (B) Hela, A375 ja 7860-soluja käsiteltiin ZD55-IL-24: ssa 24 tuntia ja sitten lisättiin TrxR1 inhibiittorin auranofiini (5 uM) 6 tuntia. Vaikutus TrxR1 estäjä auranofin on TrxR1-proteiinin ekspressio havaittiin Western-blottauksella. (C) vaikutus TrxR1 estäjä auranofin on Bcl-2-proteiinin ekspressio HeLa, A375 ja 7860-solujen havaittiin Western blot-määrityksellä. (D) vaikutus TrxR1 estäjä auranofin on Bcl-2 S-nitrosylation havaittiin immunosaostuksella käyttämällä anti-Bcl-2-vasta-aineen ja sitten seuraa immunoblottauksella anti-S-nitrosocysteine ​​vasta-aine. (E) vaikutus TrxR1 estäjä auranofin on Bcl-2 ubikinaa- HeLa-soluissa havaittiin immunosaostuksella käyttämällä anti-Bcl-2-vasta-aineen ja sitten seuraa immunoblottauksella anti-ubikitiinipromoottori vasta-aine. (F) vaikutus TrxR1 estäjä auranofin on kaspaasi-9, 3 ja PARP havaittiin Western-blottauksella. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Vastaavat juovat skannataan, ja optinen tiheys (O.D.) määritettiin kertainen muutos verrattuna kontrolliryhmään. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskihajonta (S.D.) kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3). *

p

0,05 versus ZD55-EGFP;

#

p

0,05 versus DMSO ryhmä.

(I) IL-24 inhiboi iNOS ilmaisun johtaa vähentämiseen NO liikevaihdon ja vaimennus Bcl-2 S- nitrosylation. (II) Trx denitrosylates S-nitrosyloidut Bcl-2: sta sen ditiol ryhmä, jolloin muodostuu alennettu Bcl-2 ja hapetettu Trx; hapettunut Trx vähenee (ja siten uudelleen), jonka selenosyanogeeni flavoproteiini Trx reduktaasin (TrxR) ja NADPH, mikä viittaa siihen, että TrxR vähentämällä hapettunut Trx voi helpottaa Bcl-2 denitrosylation. (III) alle pohjapinta kunnossa, Bcl-2 S-nitrosylation stabiloi proteiinin rakenne ja kestää sen ubikitiinipromoottori-proteasomin hajoamista. Muodostaminen heterodimeerejä proapoptoottiset proteiini, kuten Bax, sytokromi c release ja kaspaasin proteaasin perheen aktivaation, ja sääntely mitokondrion transmembraanisen mahdollisia ovat joitakin mekanismeja, joilla Bcl-2 kykenee sen anti-apoptoottinen vaikutus. (IV) Vastauksena IL-24: n, Bcl-2 S-denitrosylation kautta sekä iNOS vähennys (a) ja TrxR1 lisäys (b) helpottaa Bcl-2 ubikitinaation, jotka lopulta hajottavat 26S-proteasomin. Bax laukaisee vapautumisen sytokromi c: n ja kaspaasi-proteaasin perhe, jonka välittämää solunsisäistä proteolyysiä, joka on ominaista solujen apoptoosia.

Vaikka ilmaus Bcl-2 säätelevät useat mekanismit, kuten transkription , posttranslationaalinen muutos, dimerointi ja hajoaminen [16], [17], yhä enemmän todisteita osoittaa, että posttranslational muutos on kriittinen rooli mahdollisessa Bcl-2 liikevaihdon stressiä kunnossa [18], [19], [20]. Jotkut tutkimukset osoittavat, proteiini S-nitrosylation on sääntelyprosessia signaalitransduktioreitteihin joka säätää toiminta Bcl-2 kovalenttisesti typpioksidin (NO) ryhmä on kysteiini tioli sivuketju. On osoitettu, että nämä kaksi kysteiinitähdettä Bcl-2, Cys

158 ja Cys

229 ovat vastuussa S-nitrosylation Bcl-2, ja mutaatio näiden kahden tähteen täysin inhiboida Bcl-2 S-nitrosylation [16]. S-nitrosylation on säännelty NO-syntaasin (Noss) lukien neuronaalinen NOS (nNOS), endoteelin NOS (eNOS) ja indusoituva NOS (iNOS) [21], [22]. Niistä kolme NO-syntaasin, iNOS, Ca

2 +: sta riippumatonta entsyymin, määritellään ”high-lähtö” NOS, tuottaa suuria määriä NO. Jotkut edellinen paperit osoittavat myös iNOS havaittiin lisääntynyt pitkälle edennyt melanooma ja ilmentymisen MDA-7 /IL-24 säätelee negatiivisesti iNOS ilmaisun pahanlaatuisen melanooman solulinjoissa [23], [24], [25], mikä viittaa siihen, että iNOS voisi osaltaan edistää syövän etenemiseen. Kuitenkin tarkka rooli iNOS tuumorigeneesiin on epäselvä. Olipa ZD55-IL-24 aiheuttama iNOS lasku olisi edelleen vaikuttaa Bcl-2 S-nitrosylation taso on ensimmäinen tavoite nykyisen tutkimuksen. Koska proteiini S-nitrosylation tason riippuu paitsi NO välittämän S-nitrosylation kautta NOS mutta myös denitrosylating entsyymiä kuten tioredoksiini (Trx /TrxR) järjestelmät [26], myös tutkia, Bcl-2 S-nitrosylation vähentämistä vastauksena ZD55-IL-24 on määritelty sekä iNOS ja Trx /TrxR järjestelmiä.

Jotkin esillä raportit osoittavat, että sisplatiini-indusoitua reaktiivisten hapen lajien aiheuttaa Bcl-2 S-nitrosylation joka inhiboi 26S-proteasomin hajoamista, mikä osoittaa, että S-nitrosylation voinut käyttää biologista funktiota muuttamalla proteiinin vakautta. Samoin NO-välitteinen S-nitrosylation Bcl-2 liittyy sen ubikitiinipromoottori hajoaminen voi olla tärkeä apoptoosin resistenssin ja kehittäminen keuhkosyövän aiheuttama Cr (VI) ja muut syöpää aiheuttavia [16], [27]. Näin ollen on kasvava kiinnostus ymmärtää solumekanismin onko Bcl-2 S-nitrosylation muutosta lisäämällä ZD55-IL-24 on sekaantunut sen ubikinaation ja proteasomaalisten hajoamista.

Koska mekanismeja, joilla MDA-7 /IL-24 estää Bcl-2: n ilmentymisen ja helpottaa syöpäsolujen apoptoosin ei ole selvitetty. Nykyinen tutkimus määritti merkittävä rooli Bcl-2 denitrosylation sen ubikitiinipromoottori proteasomin hajoamista, joka lopulta välittää kaspaasin signaalireitin aktivointi ja syöpäsolun apoptoosin vasteena ZD55-IL-24. Lisäksi Bcl-2 S-nitrosylation diminishment vastauksena ZD55-IL-24 sisältää sekä iNOS välittämää S-nitrosylation ja Trx /TrxR1 mukana denitrosylation, joka myöhemmin helpottaa ubikitiinistä välittämän proteasomin hajoamista. Tällainen tiivis suhde Bcl-2 denitrosylation ja ubikitinaatio tuo uutta valoa IL-24 aiheuttama Bcl-2 hajoamista ja erityisiä kasvaimen apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja reagenssit

ihmisen Henrietta Lacks (Hela) solulinjassa, ihmisen pahanlaatuinen melanooma syöpäsolu linja (A375) ja ihmisen munuaisen masolulinjassa (7860) saatiin Shanghai Cell Collection (Shanghai, Kiina). Hela ja A375-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM) (GIBCO BRL, Grand Island, NY), joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia (FBS, GIBCO-BRL), 2 mM L-glutamiinia, ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä ja 5% CO2-ympäristössä 37 ° C: ssa. Munuaisten syöpä 7860-soluja viljeltiin RPMI1640, joka oli täydennetty 5% FBS: ää ja antibiootteja. Natriumnitroprussidi (SNP), 2- (4-karboksifenyyli) -4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oksi-3-oksidi (PTIO), ditiotreitoli (DTT), dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja Z-Leu Leu-Leu-al (MG132) ostettiin Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO), vasta-aineet Bcl-2, fosfo-Bcl-2 (Ser87), NOS2 (iNOS), proteiini A-agaroosi, ja IL -24-siRNA, iNOS-siRNA ja salatun ohjaus-siRNA ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Vasta-aineita ubikitiini ja S-nitrosocysteine ​​olivat Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO). Vasta-aineita varten β-aktiini, prokaspaasi-3, pilkotaan kaspaasi-3, prokaspaasi-9, halkaistut kaspaasi-9-vasta-aineita, anti-poly ADP-riboosi-polymeraasi (PARP) ja lohkaistaan ​​PARP ostettiin Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA).

Virus rakentaminen ja tuotanto

pZD55, E1B 55 kDa-deleted onkolyyttinen adenoviruksen rakentamisen plasmidista; pCA13, E1-deleted adenovirus shuttle plasmidiin; ja ZD55-tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (EGFP), jossa reportterigeeni EGFP ystävällisesti professori Liu (Xin-Yuan Liu, Institute Biokemian ja solubiologian, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Kiinan tiedeakatemia, Shanghai, Kiina). IL-24 on ensimmäinen kloonattiin pCA13 muodostamiseksi pCA13-IL-24. Sitten IL-24, leikattiin irti pCA13 subkloonattiin pZD55 rakentaa pZD55-IL-24. Onkolyyttinen adenovirus, ZD55-IL-24 on tuotettu HEK293-soluissa (Shanghai Cell Collection, Shanghai, Kiina) välisellä homologisella rekombinaatiolla pZD55-IL-24 ja adenovirus pakkaus plasmidi pBHGE3 (Microbix Biosystems), vastaavasti. Suuren mittakaavan puhdistus kaikkien adenoviruspartikkelien suoritettiin ultrasentrifugoimalla keesiumkloridilla standarditekniikoiden mukaisesti. Tiitterit määritettiin käyttäen plakkitestillä HEK293-soluissa.

Sirna määrityksessä

kokeista, joissa IL-24 erityisen siRNA: t, soluja (3 x 10

5 per kuoppa) maljattiin 6-kuoppaisille levyille. 24 h inkubaation jälkeen, Hela-solut pestiin, täydennetään tuoreella väliaineella ja käsiteltiin ZD55-IL-24 (20 MOI) 12 tuntia, solut pestiin sen jälkeen ja sijoitettiin tuoreeseen elatusaineeseen ja lisättiin IL-24 erityisen siRNA ( 100 nM) käyttäen siRNA transfektioreagenssia. 24 tunnin kuluttua siRNA transfektion, solulysaatit valmistettiin ja alistettiin western blot-analyysi, kuten on kuvattu alla.

kokeista, joissa iNOS-siRNA: t, solut transfektoitiin 100 nM iNOS-spesifisten siRNA: ssa 12 h, solut pestiin sen jälkeen ja sijoitettiin tuoreeseen elatusaineeseen ja käsiteltiin sitten ZD-55-IL-24 (20 MOI) 12 tuntia. 24 tunnin kuluttua siRNA transfektion, solulysaatit valmistettiin ja alistettiin western blot-analyysi, kuten on kuvattu alla.

Western-blottaus

jälkeen erityisiä hoitoja, soluja inkuboitiin lyysipuskuriin, joka sisälsi 20 mmol /L Tris-HCI (pH 7,5), 1% Triton X-100, 150 mmol /l NaCI: a, 10% glyserolia, 1 mmol /l Na

3Vo

4, 50 mmol /L NaF, 100 mmol /L fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, ja kaupallinen proteaasi-inhibiittorin seosta (Roche Molecular Biochemicals) 20 minuuttia jäillä. Sen jälkeen, kun liukenemattoman roskan pelletoitiin sentrifugoimalla 14000 g 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, supernatantit kerättiin ja määritettiin proteiinipitoisuus käyttäen Bradford-menetelmällä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Proteiinit (80 ug) erotettiin denaturoivissa olosuhteissa SDS-PAGE (10%) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Blokkauksen jälkeen 2 tuntia fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen, jossa oli 0,1% Tween 20: tä (PBST), ja 3% naudan seerumin albumiinia (BSA), membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa sopivan primaarisen vasta-aineen PBST, joka sisälsi 3% BSA: ta. Sitten membraanit pestiin ja inkuboitiin alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä tai anti-hiiri-IgG: tä (Sigma, 1:10 000) PBST: ssa 2 tuntia ja kehitettiin käyttäen NBT /BCIP värisubstraattia (Promega, Madison, USA).

immunosaostus

immunosaostus, solulimafraktiot (joista kukin sisälsi 400 ug proteiineja) laimennettiin nelinkertaisesti HEPES-puskurissa, joka sisälsi 50 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 10% glyseroli, 1% Triton X-100, ja 1 mM kutakin EGTA, EDTA, PMSF ja Na

3Vo

4. Näytteet esi-inkuboidaan sitten 1 tunnin ajan 20 ul proteiini-A-agaroosin ja sentrifugoitiin poistaa epäspesifisesti kiinni proteiinien proteiini A-agaroosi. Sitten supernatantti inkuboitiin 2 ug: lla spesifisten vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa. Lisäyksen jälkeen proteiini A-agaroosi, seosta inkuboitiin 4 ° C: ssa vielä 2 tuntia. Näytteet kolminkertainen pestiin HEPES-puskuria ja eluoitiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) latauspuskuria keitettiin sitten 100 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Immuuni- komplekseja erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja analysoitiin Western blottauksella, kuten yllä on kuvattu.

mittaus apoptoosin anneksiini V-analyysi

anneksiini V-sitoutumismääritys mukaisesti käytettävä valmistajan ohjeet. Lyhyesti, soluja (3 x 10

5 per kuoppa) 6-kuoppaisilla levyillä käsiteltiin ZD55-IL24 (20 MOI) eri 12 h, 24 h, 36 h, 48 h ja 72 h. Solut kerättiin ja anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI) dual-värjäys määritys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti ((Nanjing Keygen Biotech, Kiina). Kerätyt solut lyhyesti pestiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS ) kahdesti ja suspendoitiin uudelleen 200 ui 1 x sitovaa puskuria, joka sisälsi 5 ui anneksiini V-FITC: llä 15 minuuttia ja sitten 300 ui 1 x sitovaa puskuria, joka sisälsi 5 ui propidiumjodidilla (PI) 5 minuutin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Kun oli inkuboitu solut analysoitiin käyttäen FACStar virtaussytometria.

solunelinkykyisyysmääritys

karsinoomasolut (1,0 x 10

4 per kuoppa) inkuboitiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaiselle levylle ja käsiteltiin ZD55-IL-24: n ja NO modulaattorit. Cell eloonjäämisaste arvioitiin standardin 3- (4, 5-dimethylthazol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (Sigma, St. Louis , MO) läsnä ollessa tai poissa ollessa ilmoitettu koenäytteiden lopullisessa tilavuudessa 0,2 ml eripituisia aikoja 37 ° C: ssa. sen jälkeen, 20 ui MTT-liuosta (5 mg /ml PBS: ssa) lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan . 4 tunnin kuluttua inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, 150 ui DMSO: ta lisättiin. Lopuksi levyt ravisteltiin ja optinen tiheys aallonpituudella 570 nm mitattiin ELX-800 spektrometrillä lukija (Bio-Tek Instruments Inc., USA). Neljä rinnakkaista kuopat testattiin määritystä kohti, ja kukin koe toistettiin kolme kertaa. Prosentuaalinen solujen elinkykyisyys laskettiin suhteena koenäytteiden ohjaus- näytteiden x 100.

Tilastollinen analyysi

Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Tilastollinen analyysi Tulosten suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä tai yksisuuntaisen varianssin (ANOVA), jota seurasi Duncanin uudessa useita erilaisia ​​menetelmän tai Newman-Keuls testi.

P

-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

vaikutus ZD55-IL-24 on Bcl-2: n ilmentymisen ja syöpäsolujen elinkelpoisuuden

proteiini ilmauksia IL-24 ja E1A mukana adenovirus ZD55-IL-24 replikointi ja käännös Hela, A375 ja 7860 soluja havaittiin Western-blottauksella tällä eri ajankohtina. Meidän tiedot osoittivat selvä lisääntyminen IL-24 24 h 72 h verrattuna kontrolleihin, kuten on esitetty kuviossa. 1A. Samaan aikaan, E1A-proteiinia seisomaan replikaation kyky ZD55-IL-24 osoitti selvää parannuksen 12 h 72 h kuviossa. 1B, joka on samanlainen kuin ajan myötä tehostetun vihreän fluoresoiva proteiini (EGFP) ilmentyminen käsiteltiin ZD55-EGFP on esitetty. 1D. Lisäksi, Bcl-2: n ilmentymisen on käänteinen lasku 24 h 72 h (Fig. 1 C). Lisäksi, Bcl-2-lasku vastauksena ZD55-IL-24 on osoitettu annoksesta riippuvalla tavalla. Tehokas tiitterit ZD55-IL-24 inhiboimaan Bcl-2: n ilmentymisen on 10 ja 20 MOI, kuten on esitetty kuviossa. 2A. Tutkia tarkemmin, ovatko ZD55-IL24 vaikuttaa kolme karsinoomasoluja selviytymisen, solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT: llä (Fig. 1 E). Tuloksemme osoittivat, että ZD55-IL-24 alentaa tehokkaasti solujen eloonjäämistä ja tämä inhibitio osoitettiin myös annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1E ja 2C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat ZD55-IL24 voisi välittää korkean tason ja vakaa IL-24 ilmentyminen 24 h 72 h ja vähentää Bcl-2-proteiinin tason ajasta ja annoksesta riippuvaisesti.

Effect of ZD55-IL-24 on Bcl-2 S-nitrosylation ja ubikitinaatio

sen tutkimiseksi, ZD55-IL-24 auttaisivat muuttuminen Bcl-2 S-nitrosylation ja ubikitinaatio, havaitsimme Bcl-2 S -nitrosylation ja ubikitinaatio tasolla Hela, A375 ja 7860 solua. Tulokset osoittivat, että ZD55-IL-24 HeLa-soluissa vähentynyt Bcl-2-S-nitrosylation 79% 24 h 38% 48 h verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 3A). Sen sijaan, Bcl-2 ubikitinaation kasvoi 1,4-kertaiseksi 24 tuntia, jolloin 2,3-kertaisesti 48 h, kuten on esitetty kuviossa. 3B. Tulokset A375 ja 7860 solut olivat yhdenmukaisia ​​edellä trendi. Varmistamiseksi edelleen mahdollista roolia IL-24 säätelyssä Bcl-2 S-nitrosylation ja ubikitinaatio erityisiä IL-24-siRNA käytettiin pudotus IL-24 ilmentyminen. Tuloksemme osoitti IL-24-siRNA ilmeisesti kunnostettu Bcl-2 S-nitrosylation ja täten vaimentaa Bcl-2 ubikinaa- verrattuna salattu ohjaus siRNA (Fig. 3C). Niinpä ZD55-IL-24 indusoi laski Bcl-2 S-nitrosylation ja lisäsi Bcl-2 ubikinaation.

vaikutus ZD55-IL-24: n vapautumisen ja syöpäsolujen apoptoosin

Edelleen onko Bcl-2 poikkeavan pienentäminen vastauksena ZD55-IL-24 johtaisi kaspaasi signaalireitin HeLa-soluissa, kaspaasi-9, kaspaasi-3 ja PARP detektoitiin eri ajankohtina 12 h, 24 h , 36 h ja 48 h vastaavasti, kuten on esitetty kuviossa. 4A. Tulokset osoittivat, että prokaspaasi-9 laski asteittain 76%: iin 24 h 36% 48 h. Sen sijaan lohkaistiin kaspaasi-9 vastaavasti kasvoi 1,5- 24 h 2,5-kertainen 48 h verrattuna kontrolliryhmään. Kaspaasi-3 ja PARP suoritetaan samanlainen muutos kuin kaspaasi-9. Tuloksemme osoittavat, että ZD55-IL-24 indusoi pilkkominen kaspaasi-9, kaspaasi-3 ja PARP aktivoimiseksi kaspaasi signaalireitin. Lisäksi, HeLa-soluissa, apoptoosin havaittiin anneksiini V /PI ja sitten analysoitiin käyttämällä virtaussytometrillä (Fig. 4B ja C). Tulokset osoittivat, että ZD55-IL-24 paranee dramaattisesti apoptoosin HeLa-soluja 2.3- 24 h 7,4-kertaiseksi 72 tuntia verrattuna kontrolliryhmään. Yhdessä ZD55-IL-24 aloitti kaspaasin signaalireitin aktivointi ja syöpäsolun apoptoosin.

Effect of Bcl-2 S-nitrosylation muutos sääntelystä sen ubikinaa- vastauksena ZD55-IL-24

sen tutkimiseksi, ZD55-IL-24 voi säädellä Bcl-2 S-nitrosylation kautta NO, mikä lopulta vaikuttaa sen ubikitinaatiosta käsittelimme Hela, A375 ja 7860-solujen NO luovuttaja SNP, NO estäjä PTIO ja SNP samanaikainen pelkistävän aineen DTT antamisen jälkeen ZD55-IL24, vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, eksogeeninen NO luovuttaja SNP tehokkaasti lisäsi Bcl-2 S-nitrosylation tämä pelastus vaikutus neutralisoituisivat samanaikaisen DTT. Samaan aikaan, ei inhibiittoria PTIO merkittävästi vähentää Bcl-2 S-nitrosylation. Toisaalta, NO luovuttajan SNP esti ubikitinaation Bcl-2, mutta DTT co-hoidon torjua vaikutuksia SNP. Lisäksi NO estäjä PTIO helpottanut ubikinaa- Bcl-2 kuvassa. 5B. Kuva. 5C esittää ZD55-IL-24 hoito 24 h aiheutti merkittävän laskun Bcl-2: n ilmentymisen, joka väheni edelleen lisättäessä NO inhibiittorin PTIO. Sitä vastoin hoito NO luovuttaja SNP huomattavasti vastustanut ZD55-IL-24 aiheuttama Bcl-2 säätely alaspäin. Kuva.