Krooninen sairaus

tiivistelmä

yli-ilmentyminen on kationit lävistävät kanava TRPM8 eturauhassyövissä saattaa edustaa uutta mahdollisuutta niiden hoitoon. Inhibiittorit TRPM8 vähentää kasvua eturauhasen syöpäsoluja. Olemme käyttäneet kahta äskettäin kuvattu ja erittäin spesifinen esto, AMTB ja JNJ41876666 ja RNAi määrittää merkitystä TRPM8 ilmentymisen lisääntymistä ei-kasvain ja kasvainsoluissa. Esto ilmentymistä tai toimintaa kanavan vähentää leviämisen hinnat ja proliferatiivinen osa kaikissa tuumorisoluissa testattu, mutta ei ei-kasvain eturauhasen soluissa. Havaitsimme ole johdonmukaista kasvun nopeutuminen stimulaation jälkeen kanavan mentoli tai icilin, mikä osoittaa, että pohjapinta TRPM8 ilmaisu on riitä ylläpitämään kasvua eturauhasen syöpäsoluja.

Citation: Valero ML, Mello de Queiroz F, Stühmer W , Viana F, Pardo LA (2012) TRPM8 Ion Channels Differentially moduloida leviämisen ja Cell Cycle jakelu Normaali ja Eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 7 (12): e51825. doi: 10,1371 /journal.pone.0051825

Editor: Alexander A. Mongin, Albany Medical College, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 06 marraskuu 2012; Julkaistu: 14 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Valero et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoittama Max-Planck -instituutissa ja myöntää SAF2010-14990 ja PROMETEO2010-046 FV. MV oli sen vastaanottajalle predoctoral apurahan Espanjan hallituksen (F.P.I). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

TRPM8 on kalsiumia läpäisevä, ei-selektiivinen kationi kanavan ohimenevä reseptorin potentiaalisten superperheen [1], tarvitaan transduktion kohtalainen kylmässä [2], [3]. Läsnäolo TRPM8 kylmän reagoiva pieni halkaisijaltaan neuronien Dorsaalijuurigangliassa ja kolmoishermo ja fenotyyppi havaittu TRPM8 – /- hiirten tukee roolia TRPM8 vuonna thermosensation ja nosiseptioon [4] – [6]. TRPM8 kanavat on kloonattu lajeista eri sukuihin, mistä sammakkoeläimet ihmiseen [7]. Ihmisen TRPM8 tunnistettiin aluksi aikana näytön jopa geenien eturauhassyövässä (ja siksi kutsutaan trp-P8 [8], mutta myöhemmin havaitaan muissa elimissä [9], [10]. Niistä normaaleja kudoksia ilmaus kanava on hyvin rajoitettu alapopulaatio ensisijaisen aistihermoilla [2], [3], mutta se on myös läsnä miehen sukuelimiin huomattavia määriä [2], [3], [8], [9], [11], [12].

aktivointi endogeenisen (eli hermosolujen) tai yhdistelmä TRPM8 kanavia aiheuttaa allekirjoituksen nykyinen ominaista uloimmassa oikaista ja jännitteestä riippuva gating [13] – [15]. TRPM8 kanavat voidaan aktivoida erityiset ja selektiivisiä agonisteja, joko luonnollisia (kuten eukalyptolia ja mentolia) tai synteettisiä yhdisteitä, kuten Super jäähdytysaineen icilin, joka on tähän mennessä tehokkain agonisti TRPM8 [2], [3], [16] – [19] . Muut agonistit (linalooli, geranioli, muun muassa) tunnistettiin seulomalla mentolia johdannaisia ​​tai hajusteen yhdisteitä. erityisesti geraniolin voi olla fysiologinen aktivaattori TRPM8, koska se on välituote aikana kolesterolin synteesiä, ja se indusoi eturauhasen epiteelissä. Kaikki tunnetut TRPM8 agonistit indusoivat viilentävä vaikutus, vahvistaa käsite rooli TRPM8 kylmässä käsitys [20].

TRPM8 mRNA on havaittu pahanlaatuisten solujen, ja tämä on tutkittu laajalti eturauhassyövän. TRPM8 mRNA erittäin yli-ilmennetään hyvin erilaistunut aikaisin eturauhasen kasvaimia. Tyypillisessä malli androgeeniriippuvaisissa eturauhassyövän (LNCaP; epiteelisolujen apikaalisella solujen erittävä fenotyyppi) ilmentyminen havaitaan molemmissa solukalvon ja Endoplasmakalvosto, jossa se voisi toimia Ca

2+ release kanava [ ,,,0],18], [19], [21] – [23]. Solukalvon TRPM8 saattaa suojaava vaikutus, koska aktivointi TRPM8 PSA (eturauhasen spesifisen antigeenin) vähensi soluliikkuvuus PC3-soluissa [24].

TRPM8 saattaisi olla käyttökelpoinen markkeri eturauhassyövän lopputulokseen, koska menetys TRPM8 ilmaisu näyttää liittyvän siirtymistä androgeeniriippumattomuuteen ja huonon ennusteen [19], [21], [25]. Tämä saattaa heijastaa vaikutus androgeenien on TRPM8 ilmaisua, koska geeni näyttää kymmenen oletetun androgeeniresponsiivinen elementit [18]. Epätavallisen korkeat TRPM8 mRNA voi myös olla merkki etäpesäkkeitä [26].

Canonical TRPM8 kanava toiminto voidaan estää urean yhdisteitä (katso jäljempänä), joka tunnetaan myös estävän TRPV1 [17], [25 ], [27]. Tämä rajoittaa tällaisten salpaajien tutkimuksessa roolin TRPM8 eturauhassyövässä koska solut ilmentävät myös TRPV1 [28]. Tällä hetkellä ainoa mahdollinen tapa erityisesti leikellä rooli kanavan eturauhasen syöpä on käyttää siRNA. RNA-interferenssi voi tuottaa tehokkaasti ja erityisiä kaataa tietyn geenin

in vivo

ja

in vitro

[29], [30].

Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin vaikutuksia, joita TRPM8 hiljentäminen on solun eloonjäämistä ja solujen lisääntymistä kolmen ihmisen eturauhasen solulinjojen, LNCaP, PC3 ja DU145. LNCaP on vahvasti androgeeniriippuvaisissa [19], kun DU145 on androgeenista riippumaton [31] ja PC3 muodostaisi välituotestatuksen [32]. Tutkimme myös käyttäytymistä tässä suhteessa ei-kasvaimen (SV40 kuolemattomaksi) eturauhasen solulinja, PNT1A [33]. Esto ilmentymistä tai toimintaa kanavan alennettua leviämisen hinnat ja proliferatiivinen jae kaikissa tuumorisoluissa testattu, mutta ei ei-kasvain eturauhasen soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Prostate solulinjat PNT1A (ECACC 95012614), LNCaP (DSMZ ACC 256), PC3 (DSMZ ACC 465) ja DU145 (DSMZ ACC 261) saatiin DSMZ (Braunschweig, Saksa) tai ECACC (Salisbury, Iso-Britannia) . Kukin rivi kasvatettiin ja ylläpidetään ohjeiden mukaan vastaavan palveluntarjoajan. Identity kasvainsolulinjoissa varmistettiin spesifisten merkkiaineiden (PC3 AR, ERa +, ER +, PSA-, DD3-, DU145 AR, ERα-, ER +, PSA-, DD3-; LNCaP AR +, ERα- , ER +, PSA +, DD3 +; Paul Thelen, Department of Urology, yliopistollisen sairaalan Göttingen).

siRNA transfektoinneilla

transfektio siRNA (25 nM) suoritettiin käyttäen joko Lipofectamine 2000 tai Lipofectamine RNAiMAX reagenssit OptiMEMiin väliaineessa (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Saksa) 24 tunnin kuluttua pinnoitus. Neljä eri siRNA: t suunniteltiin kohdistamaan hTRPM8 kanavaan HiPerformance siRNA suunnittelu Algorithm (Qiagen). Seuraavat hTRPM8 (NM_024080) sekvenssejä käytettiin: TRPM8.1, tcgaatgttctcacctattaa; TRPM8.2, aaggttagattccaataaata; TRPM8.3, cagaatgttatcatactacat ja TRPM8.4, ccgggacgagatggacataga.

Kaikki siRNA: ita syntetisoitiin Qiagen (Hilden, Saksa), paitsi kaupallinen Negative Control # 1 ja ihmisen GAPDH siRNA (Ambion, Darmstadt, Saksa), jota käytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina vastaavasti. Soluja inkuboitiin siRNA ja transfektioreagenssi 6 h ja kerättiin kokeita varten vain päättymisen jälkeen transfektion. Lisäksi solut, joita käsiteltiin vain OptiMEM ja vastaavat transfektioreagenssin otettiin mukaan kontrolleina.

qPCR

Kokonais-RNA saatiin viljelmistä käyttäen RNeasy mini (Qiagen, Hilden, Saksa) käänteiskopioitiin ( SuperScript, Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) ja oligo-dT ja geenin spesifisiä alukkeita hTRPM8 (5′-cttgggcaaaacacacaatg-3 ’). Reaaliaikainen PCR suoritettiin malli käyttäen TaqMan järjestelmää käytettäessä AbiPrism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA) tai LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Saksa). Seuraavat fragmentit monistettiin: nt 2910-3058 sekvenssistä NM_024080.4 havaittiin kanssa hTRPM8 koetin (5’-FAM-tcgccatgtttggctacacggtgggcacc-TAMRA-3 ’) ja nt 1632-1732 sekvenssistä NM_003234 havaittiin kanssa hTFR koetin (5 ”-JOE-tgaatggctagagggatacctttcgtccc- (6-TAMRA) -3 ’). Ihmisen transferriini-reseptori on käytetty kontrollina templaattina RNA eheyden ja PCR suorituskykyä. Suhteellinen kvantitointi suoritettiin käyttäen REST ohjelmistoa (suhteellinen Expression Software Tool; [34], [35]).

virtaussytometria

siRNA: hoidon jälkeen siRNA, solut maljattiin 6- kuoppalevyille ja inkuboitiin 24-120 tuntia ennen mittausta. Solut trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa PBS: llä ja sen jälkeen pidettiin jäillä. Solusyklin mittauksia, soluja inkuboitiin 50 ug /ml propidiumjodidia (PI), 0,3% saponiinia ja 100 U /ml RNaasi. Elinkelpoisuuden mittausta, ei-elinkelpoisia soluja havaittiin värjäämällä 10 ug /ml PI: n PBS: ssä. Näytteet analysoitiin BD FACSAria virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Heidelberg, Saksa). Propidiumjodidia viritettiin 488 nm, ja fluoresenssi kerättiin käyttämällä 595 nm: n puoliläpäisevä peili ja 610/20 nm: kaistanpäästösuodattimen (solusyklin) tai 655 nm puoliläpäisevä peili ja 695/40 nm: kaistanpäästösuodattimen (elinkelpoisuutta) . Gates elävät solut perustettu tulevaisuuteen ja sivusironta ja solusyklivaiheista määritettiin käyttämällä FlowJo ohjelmistoa (Puu Star Inc., Ashland, USA). Vaihtoehtoisesti elinkelpoisten solujen prosentuaalinen oli suoraan määritettiin PI syrjäytyminen.

kokeita läsnä mentolia ja icilin, solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 24-168 h 125-300 uM mentoli tai 10 uM icilin ennen mittauksia. Solut trypsinoitiin, ja pestiin kahdesti PBS: llä. Näytteitä käsiteltiin ja analysoitiin solusyklin ja elinkelpoisuuden mittaukset edellä kuvatulla tavalla.

Kalsium Imaging

Kalsium kuvantaminen Kokeet suoritettiin fluoresoivalla ilmaisin Fura-2. Ennen kutakin koetta solut inkuboitiin 5 uM acetoxymethylester muodossa Fura-2 (Fura-2AM, Invitrogen) 45 min 37 ° C: ssa. Tämän jälkeen 250 uM sulfinpyratsonin lisättiin vielä 20 minuutin ajan, jotta estää anionisen että huonontaa lastausta Fura-2AM syöpäsoluissa linjat. Fluoresenssimittaukset tehtiin Leica (Nussloch, Saksa) DM IRE2 -käänteismikroskoopissa varustettu 12-bittinen jäähdytetty CCD-kamera (Imago QE Sensicam; TILL Photonics, Graefelfing Saksa). Fura2 viritettiin 340 ja 380 nm Polychrome IV monokromaattoria (TILL Photonics), ja vapautuu fluoresenssi suodatettiin läpi 510 nm pitkä ylipäästösuodatin. Kalibroitu suhteet olivat esillä verkossa 0,5 Hz käyttämällä TILL Vision ohjelmistoversio 4.01 (TILL Photonics). Kalsium kuvantaminen kokeet tehtiin samanaikaisesti lämpötilarekisteröinneissä. Kylpy ratkaisu, kutsutaan ”valvonnan ratkaisu”, sisälsi (mM): NaCl 140, KCI 3, CaCl

2 2,4, MgCI

2 1,3, Hepes 10 ja glukoosi 10, ja pH säädettiin 7,4 NaOH: lla.

lisääntymismääritykset

Lisääntyminen arvioidaan perustuen kykyyn metabolisesti aktiivisten solujen vähentää tetratsoliumsuolojen värillinen formatsaanin (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2 , 5-difenyylitetratsoliumbromidi, MTT, Sigma-Aldrich). Solut trypsinoitiin ja maljattiin tasapohjaisille 96-kuoppalevyille tiheyksinä vaihtelee 2000-5000 solua /kuoppa riippuen solulinjan tutkittiin. Määrittää metabolista aktiivisuutta, 10 ui MTT-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tuntia. Absorbanssi tuotetun formatsaanisakka määritettiin Victor2 levyn lukijaa (Wallac) käyttäen 570 nm: n ja 630 nm: n virityksellä suodattimia. Sillä kokeiluja mentoli, väliaine uusittiin joka 48 h sekä testi- ja kontrolli kuoppiin.

haavan paraneminen Pitoisuus

Soluja ensimmäistä viljeltiin konfluenssiin ( 90%) vuonna 6- hyvin ruokia. Pieni alue sitten häirinnyt raaputtamalla yksikerroksista kanssa 1000 ul muovinen pipetin kärki. Sen jälkeen soluja viljeltiin 12, 24 tai 48 tuntia erilaisissa koeolosuhteissa: alhainen seerumin tai joko vehikkeliä tai lääkettä sisältävää väliainetta. Solut tarkastettiin mikroskooppisesti ajan. Jäljellä oleva haava-alueen laskettiin CorelDrawta ohjelmiston ja migraation etäisyys solujen arvioitiin perustuen, että laskentaan.

Drugs

4- (3-kloori-pyridin-2-yyli) – piperatsiini-1-karboksyylihapon (4-tert-butyyli-fenyyli) amidi (BCTC) oli antelias lahja Grünenthal AG (Aachen, Saksa). [L-arginyyli] – [N- [2,4-dikloorifenetyyli] glysyyli] -N- (2,4-dikloorifenetyyli) glysiiniamidi (DD01050, (H-Arg-15-15 C [36]), oli lahja Dr. A. Ferrer-Montiel (Universidad Miguel Hernandez, Espanja). AMTB (N- (3-aminopropyyli) -2 – [(3-metyylifenyyli) metoksi] -N- (2-tienyylimetyyli) bentsamidi-hydrokloridi (1: 1) hyklaatti) uusi, erittäin selektiivinen TRPM8 antagonisti oli antelias lahja tri Stuart Bevan (Kings College, Lontoo). JNJ41876666 (yhdiste 5 viite [37]; 3-[7-Trifluoromethyl-5-(2-trifluoromethyl-phenyl)-1

H-

benzimidazol-2-yl]-1-oxa-2-aza-spiro[4.5]dec-2-ene Hydrokloridi,), joka on voimakas TRPM8 antagonisti, oli antelias lahja Janssen Research Development, LLC (Spring House, PA). Fig. 1 esittää kemialliset rakenteet käytetyistä lääkkeistä.

Statistical analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM on saatu ainakin kolmen erillisen kokeen. tilastollinen merkitsevyys arvioitiin Studentin t-testillä. P-arvot on merkitty kuvioissa tähdellä lähelle vastaavan sarakkeen tai symboli. * p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,005.

tulokset

Detection of TRPM8 Expression eturauhasen ja eturauhasen solulinjoissa

TRPM8 ilme on yleisin hermokudoksessa ja miehen sukuelimiin. Aikaisemmissa tutkimuksissa on kuvattu yli-ilmentyminen TRPM8 eturauhastuumoreissa ja johdetut solulinjat eturauhassyöpä, erityisesti LNCaP [8]. Muut solulinjat kielteisen näistä selvityksistä. viime aikoina PC3-solut raportoitu heikosti positiivinen western blot [21]. Asetamme määrittää ilmentymisen tasojen TRPM8 eturauhasen syöpäsolujen LNCaP, PC3 ja DU145 ja ei-kasvaimen solulinja PNT1A eri lähestymistapoja laajentaa ja täydentää tulokset raportoidaan ennen [38].

Ensinnäkin, TRPM8 mRNA-pitoisuus määritettiin käänteisfaasi-transkription reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) käyttäen TaqMan-koettimia normaaleissa ihmisen aivoissa, eturauhasen, ja solulinjat LNCaP, PC3, DU145 (johdettu kasvaimet) ja PNT1A (ikuisti ei-transformoitu eturauhasen solulinja). RNA eheys ja käänteistranskriptio kontrolloitiin käyttämällä ihmisen transferriinireseptorin referenssinä normalisointia. mRNA TRPM8 havaittiin aivoissa ja eturauhasessa ja enimmäismäärät terveen eturauhasen (ei esitetty). Viesti havaittiin myös kaikissa ihmisen solulinjoissa testattu, LNCaP, PC3, DU145 ja PNT1A. Kuten raportoitu aiemmin, tasot kuin kasvaimen line PNTA1 olivat merkittävästi alhaisemmat kuin syöpäsolun linjat. Suhteellinen määrä TRPM8 viesti oli DU145≈LNCaP PC3 PNT1A (Fig. 2A).

. mRNA runsaus määritettiin reaaliaikaista PCR: cDNA RNA: sta johdetut peräisin ilmoitetusta lähteestä. Ihmisen transferriinireseptoriproteii- käytettiin viitteenä taloudenhoito geeni. RNA runsaus ilmaistaan ​​normalisoidut arvot yli PNT1A. Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitsevä suhteessa PNT1A. B-C. DU145 solut reagoivat kylmään ja mentoli. B. lähetetään (vasemmalla) ja pseudovärin ratiometrinen [Ca

2 +]

i kuvia esittää esimerkin vastetta DU145 solujen kylmään (18 ° C) ja mentoli 500 uM. C. [Ca

2 +]

i vasteet kylmä- ja mentoli-herkkiä soluja (C1) verrattuna kylmän tunteeton, mentoli erottelua DU145 solun (C2). D-F. Vastauksena kylmä on pienentynyt TRPM8 Knockdown sisään DU145 soluissa. Pseudovärin ratiometrinen [Ca

2 +]

i kuvia transfektoiduissa soluissa ohjaus siRNA (D) tai TRPM8.4 siRNA (E) 37 ° C: ssa (ylempi paneeli) tai 18 ° C (alempi paneeli). Yksittäiset [Ca

2 +]

i vastaukset ovat edustettuina oikealla vastaavissa kuvissa. Amplitudi ja osa soluista, jotka reagoivat kylmä ärsykkeitä on selvästi vähentynyt TRPM8 siRNA-käsitellyissä viljelmissä. Tämä vaikutus on määrällisesti kuvattu F.

Näistä tuloksista päättelemme, että TRPM8 ilmentyy kaikissa eturauhasen testatuissa solulinjoissa. Lisäksi proteiini näyttää muodostamiseksi toiminnallisia kanavia. Meidän käsissämme, DU145 (Fig. 2B, C), LNCaP ja PC3 (tietoja ei esitetty) solut näyttävät solunsisäisen Ca

2+ tasot stimulaation vaikutuksesta mentolia (500 uM) ja kohtalainen kylmää (lasku lämpötilassa 36 ° C 18 ° C), sopusoinnussa funktionaalisen ekspression TRPM8. Kylmä-herätti vasteita DU145 solut voimakkaasti vähennetty vastaan ​​suunnattu siRNA TRPM8 (Fig. 2D-F).

vaikutus TRPM8 salpaajat proliferaatioon Eturauhassyöpäsolulinjat

kuvatut kokeet toistaiseksi tukevat käsitystä, että TRPM8 ilmaisu tapahtuu sekä normaalissa eturauhasessa ja syöpäsoluja. Kysymys jää kuitenkin, onko estyminen TRPM8 on samanlaisia ​​vaikutuksia kaikissa solutyypeissä. Tärkein tavoite oli testata, onko TRPM8 toiminta on yleinen vaatimus, että useat erilaiset eturauhassyövän solulinjoissa. Tämän testaamiseksi käytimme farmakologinen TRPM8 salpaajat [39] ja siRNA teknologia.

salpaajat käyttää (Fig. 1) olivat clotrimazole (EY

50 200 nM) [40]; BCTC, estävään agentti TRPV1 kanavien [41] ja hiiren, rotan ja ihmisen TRPM8 kanavat (EC

50 noin 0,6-1 pM) [13], [17], [27], [42]; tio-BCTC, vähemmän aktiivinen (EY

50 3,5 uM) analogi BCTC; ja DD01050, uusi TRPV1 salpaaja, joka estää myös TRPM8 neuronien ja HEK293-soluissa (EY

50 noin 1 uM) [38]. Proliferaatio määritettiin käyttäen MTT-määrityksiä (Fig. 3), ja vaikutus näiden lääkkeiden ja valikoivampi TRPM8 antagonisti (katso alla) on solusyklin jakautumisen ja solujen elinkelpoisuus määritettiin virtaussytometrialla (Fig. 4).

kasvu ilmoitettu solulinjojen läsnä ollessa TRPM8 estäjiä. MTT hydrolyysi ilmaistuna kertainen lisäys, on normalisoitu tasolle hetkellä 0. Clotrimazole (umpinaiset neliöt), BCTC (täytetyt ympyrät), tio-BCTC (avoimet neliöt) ja DD01050 (kolmiot) 5 päivän kokeilu. Tietopisteet edustavat keskimäärin 4 kokeita ± SEM. *:

p

0,05; **:

p

0,01; ***:

p

0,005. Salpaajia käytettiin lopulliseen pitoisuuteen 10 uM.

histogrammit osoittavat muutoksia proliferatiivisen osa läsnä ollessa salpaajien määritettynä virtaussytometrialla solusyklin analyysi. Kaikki lääkkeet käytettiin pitoisuutena 10 uM. Proliferatiivinen jae kontrolloiduissa olosuhteissa (ajoneuvon käsiteltyjä soluja) on katsottu 100% leviämisen.

Klotrimatsoli on vakiintunut estäjä syöpäsolujen lisääntymistä luultavasti läpi useita tavoitteita, mukaan lukien keskisuuri johtavuus kalsium-aktivoitujen K

+ -kanavien [43]. Käytetyn pitoisuuden (10 pM), klotrimatsoli inhiboivat kaikki kasvaimen solulinjojen 60-80% viiden päivän kuluttua, mutta ei vaikuta kasvua PNT1A solujen (Fig. 3). BCTC 10 uM oli samanlainen käyttäytyminen clotrimazole, koska se vähensi voimakkaasti leviämisen kaikissa solulinjoissa (50-70%), mutta PNT1A. Vaikutukset BCTC näyttävät esiintyvän, ainakin osittain (katso jäljempänä), kautta toimia TRPM8, koska tio-BCTC oli selvästi tehottomampi kaikissa linjat testattu. Hieman yllättäen DD01050 (10 uM) indusoi merkittävän eston ainoastaan ​​PC3-soluissa tasolle verrattavissa muihin estäjiä, mutta se ei osoittanut mitään merkittävää inhibitiota missä tahansa muussa solulinjassa (Fig. 3).

proliferaation esto korreloi hyvin proliferatiivinen fraktio, joka mitattiin prosentteina solujen S /G2 /M-vaiheisiin solusyklin. Kuten on esitetty kuviossa. 4 suhteellinen teho kunkin esto heijastuu myös vähenemisen proliferatiivisen murto aiheuttama. Mikään testattujen lääkkeiden muuttunut proliferatiivinen osa PNT1A soluja. Toisaalta, sekä klotrimatsoli ja BCTC (molemmat 10 uM), vähensi solujen S /G2 /M-vaiheisiin kaikissa tuumorisolulinjoja, kun taas 10 pM tio-BCTC oli vähemmän voimakas ja DD01050 oli tehokkain on PC3-soluissa. Testasimme myös vaikutusta AMTB ja JNJ41876666, uusia ja erittäin spesifiset TRPM8 estäjät [37], [44], on kaikissa solulinjoissa. 10 uM, sekä lääkkeiden vähentää proliferatiivisen osa syöpäsolulinjojen jättäen PNT1A solut ennallaan. Emme havainneet mitään sytotoksisia vaikutuksia huumeiden käytetyillä pitoisuuksilla (ei esitetty). Yhdessä tulokset, jotka saatiin eri salpaajia ovat yhdenmukaisia, että esto TRPM8 tulosten pelkistettynä leviämisen eturauhasen syöpäsoluja.

Knock Down of TRPM8 Message Vähentää Eturauhassyöpä Cell Proliferation

jotta saataisiin enemmän suoraa korrelaatiota TRPM8 ilmaisun ja kasvainsoluproliferaation, käytimme siRNA vastaan ​​TRPM8 ja mitata sen vaikutuksia proliferaatioon ja solusyklin jakelun kolmessa kasvain eturauhasen solulinjojen ja ei-kasvainten yksi. Positiivisena kontrollina käytettiin vastaan ​​suunnattu siRNA hGAPDH. Koska GAPDH on keskeinen entsyymi glykolyysin, vähentäminen proteiinin heijastuu metabolista aktiivisuutta transfektoiduissa soluissa. Tämä on osoitettu neljä solulinjojen MTT: n määritykset (ei esitetty) ja virtaussytometria (Fig. 5A).

vaikutus GAPDH pudotus on proliferatiivinen osa kunkin solulinjan määritettiin. Kuten odotettua, GAPDH knockdown estää proliferaatiota kaikissa solutyypeissä. B. aikakäyrä vähentäminen TRPM8 RNA sisällön ilmoitettu TRPM8 siRNA hoitoon. TRPM8 viesti määritettiin osoitettuina aikoina transfektion jälkeen. Suhteellinen runsaus on tarkoitettu mRNA: n määrä hetkellä 0 ja joka on korjattu ilmentymistä transferriinin reseptorin kontrollina. C. TRPM8 proteiini pudotus mukaan TRPM8.3 ja TRPM8.4 siRNA 48 h transfektion jälkeen. Aktiini käytettiin latauskontrollina ja densitometrinen määrällinen vertailuryhmään nähden siRNA on esitetty oikealla pylväskaaviona.

käyttö Useiden toiminnallisten siRNA: iden on suositeltavaa varmistaa spesifisyyden fenotyyppivaikutukset havaittu koska sekvenssit kohdistaminen eri osat sanoman pitäisi olla kvalitatiivisesti samat vaikutukset. Määrällisesti, eri siRNA: t kohdistuvat saman geenin eivät usein ole yhtä tehokkaita, koska termodynaamiset ominaisuudet, vakaus, ja asemointi joko siRNA: iden itse tai kohde-geenin alue. Siksi testattiin neljällä eri siRNA: t on suunnattu TRPM8, jotka on nimetty TRPM8.1-4. Nämä siRNA tunnistavat erillisiä kohdesekvensseistä TRPM8 ja eroavat hiljentäminen teho eri solulinjoissa. Voit vähentää mahdollisuutta off-tavoite vaikutuksia, käytimme vähäisiä määriä siRNA (25 nM) ja optimoitu transfektion ajan. Tätä varten me inkuboitiin kunkin solutyypin tasapainotettu siRNA-transfektioreagenssia sekoitus 4, 6, 8, 12, ja 24 h, ja seurataan 24 ja 48 tuntia sen jälkeen suhteellinen väheneminen TRPM8 aikaansaama TRPM8.3 ja TRPM8.4 käyttäen reaaliaikainen PCR; TRPM8.3 ja TRPM8.4 olivat tehokkaita RNA-tasolla kaikissa neljässä testattu solulinjoissa (mukaan lukien PNT1A) inkuboinnin jälkeen 6 tuntia siRNA. Olemme myös optimoitu inkuboinnin ajan kuluttua siRNA transfektion jälkeen, runsaasti TRPM8 mRNA: ta 12, 24, 72 ja 120 tuntia. Sillä PNT1A, LNCaP ja PC3 enimmäisvähennyksen TRPM8 viestin TRPM8.4 siRNA havaittiin 72 tuntia, kun taas DU145 osoitti suurimman vaikutuksen jo 48 tuntia (kuvio. 5B). Hiljentäminen TRPM8 aiheutti laskun proliferaatiossa mitattuna MTT määrityksissä PC3-solulinjassa. MTT hydrolyysi PNT1A, DU145 ja LNCaP-soluissa ei ilmeisesti vaikuta siRNA (ei esitetty). Tämä johtuu luultavasti siitä, että eri mahdollisina aikoina RNA Knockdown, koska pitäisi odottaa siirsivät useita tunteja välillä väheneminen TRPM8 viesti ja vaikutuksista proliferaatioon, joka riippuu kaksinkertaistaa aika ja tarvittava aika proteiinin pudotus molemmat jotka ovat erilaiset kullekin solutyypille. Vähentäminen mRNA korreloi selvästi vähentäminen proteiinin noin 50% kaikissa solulinjoissa 48 tuntia (kuvio 5C), mutta epätäydellinen pudotus voisi selittää puuttumisen vaikutusten MTT: n hydrolyysiä.

Tästä syystä teimme mittauksia proliferatiivisen fraktion, joka osoittautui herkempiä. Olemme havainneet lasku osa solujen S /G2 /M-vaiheisiin solusyklin kaikissa kasvainsolulinjoissa, mutta havaittu mitään vaikutusta ei-kasvain PNT1A soluihin. Eräs esimerkki solusyklin jakautuminen mittaukset DU145-soluissa on esitetty kuviossa. 6A. Väheneminen S ja G2 /M-soluissa on selvästi näkyvissä sen jälkeen siRNA hoidon. Tuloksista kaksi tehokasta siRNA: t oli erilainen riippuen solulinjoissa; PC3 ja LNCaP vastasi vain yhden kahden sekvenssin (TRPM8.4, Fig. 6B), kun taas DU145 molemmissa sekvensseissä olivat tehokkaita.

. Edustavia solusyklin histogrammin DU145 transfektoitujen solujen ohjaus (top) tai hTRPM8 siRNA (alhaalla). Proliferatiivinen fraktio (S /G2 /M) on selvästi vähentää, kun TRPM8 knockdown. B. Proliferatiivisia jae (%) transfektoitujen solujen valvontaa tai anti TRPM8 siRNA (sekvenssit 3 ja 4). Palkit edustavat keskiarvoa 3-5 kokeiluja. C. BCTC pitäytyy estovaikutusta jälkeen hiljentäminen of TRPM8. Normalisoitu kasvua DU145-solujen läsnä ollessa 10 uM BCTC, transfektion jälkeen solut ohjaus (valkoinen pylväs) tai TRPM8.4 siRNA (musta pylväs). Kasvu ilman BCTC edustaa 100%.

Havaitut vaikutukset alle siRNA oli mahdollista testata, onko proliferaation esto indusoi farmakologiset aineet välittävät yksinomaan niiden vaikutukset TRPM8. Tämän testaamiseksi me arvioinut BCTC pystyi vähentämään kasvua DU145 solujen jälkeen siRNA hoidon. Jos kaikki vaikutukset BCTC oli välittyvä TRPM8, lääkkeen käyttö on vähemmän vaikutusta proliferaatioon jälkeen TRPM8 knockdown siRNA. Kuitenkin BCTC (10 uM) esti kasvua tämän solulinjan samassa määrin, kun TRPM8 pudotus, mikä osoittaa, että vaikutus BCTC eturauhassyövän soluproliferaatiota ei ole pelkästään seurausta TRPM8 inhibition (Fig. 6C).

Aikaisemmat raportit osoittivat, että elinkelpoisuus LNCaP-solujen pienenee inhibitio TRPM8 [19]. Voisimme Tämän havainnon varmistamiseksi, mutta LNCaP oli ainoa solulinja, joka osoitti tämän ongelman. Elinkelpoisuus varten PNT1A1 väheni myös, kun siRNA transfektion, mutta tämä vaikutus ei riipu TRPM8, koska se tapahtui tässä solulinjassa myös ohjaus siRNA (tuloksia ei ole esitetty).

Mentoli ja Icilin Effects in leviämisen ja elinkelpoisuus eturauhasen solujen

tulokset vahvistavat käsitystä, että TRPM8 inhibitio vähentää solujen lisääntymistä eturauhasen syöpäsoluja. Näin ollen, päätimme testata, onko aktivointi TRPM8 mentoli tuottanut päinvastainen vaikutus, eli proliferaation lisääntymisen. Mentoli (120 tai 300 uM) tai icilin (10 uM) lisättiin kasvualustaan. Hieman paradoksaalisesti, mentoli on kuvattu vähentää elinkelpoisuuden LNCaP-solujen [19]. Alkuperäinen tulkinta tämän ilmiön oli, että aktivointi TRPM8 johtaa jatkuva Ca

2 + tulva, joka indusoi apoptoosin, mutta mentoli saattaa olla off-tavoite vaikutukset näissä soluissa sekä [22], [45]. Emme havainneet järjestelmällistä väheneminen LNCaP solujen elinkelpoisuuden läsnäollessa mentoli, vaikka jonkin verran lisääntynyt kuolleisuus joissakin kokeissa. Mentoli ei muuttanut elinkelpoisuutta muita solulinjoja (ei kuvassa). MTT: n ja virtaussytometria kokeita neljän solulinjoissa edellyttäen kiehtova results.We ei havaittu mitään merkittävää kasvua aiheuttama mentolia tai icilin tavanomaisissa seerumissa (Fig. 7A). Kuitenkin, kun läsnä on vähentää seerumin vain DU145-solut osoittivat vaatimaton mutta merkittävää kasvua leviämisen aiheuttama mentolia (Fig. 7B).

vaikutus mentoli (kaksi eri pitoisuuksina) ja icilin (10 uM) on proliferatiivinen osa kunkin solulinjan määritettiin. Mitään vaikutusta ei havaittu. Tiedot esitetään normalisoitu proliferatiivisen osa puuttuessa TRPM8 aktivaattoreita. B. seerumi-puutteellisissa soluissa, kohtalainen pitoisuudet mentoli esiin kasvua metabolista aktiivisuutta DU145-solujen MTT-määrityksellä mitattuna. Vaikutus oli heikompi suuremmilla pitoisuuksilla.

vaikutus TRPM8 Block haavojen paranemiseen

Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että TRPM8 toiminta on merkityksellinen tekijä ohjaamalla maahanmuuttoa eturauhassyöpäsolujen [24], [46]. Tämän vuoksi päätimme käyttää haavan paranemista määritys, klassinen menetelmä uudelleensijoittamista yhdistetyn vaikutuksista proliferaatio ja migraatio [47], tutkia toimia TRPM8 salpaajien on häirinnyt muodostetuilla LNCaP, PC3, DU145 ja PNT1A soluja. Kun läsnä on normaali seerumissa kaikki solulinjat tehokkaasti vähentää haava-alueelle; kasvaimen solulinjojen tarvitaan lyhyemmät sulkea haavan verrattuna ei-kasvaimen linjat (Fig. 8A vasemmalla, C). Haavan paranemisen inhiboitui merkittävästi erityiseen TRPM8 salpaajien AMTB ja JNJ41876666, PC3, LNCaP ja DU145-soluissa, mutta ei PNT1A (kuvio 8A, C). Vaikutusten minimoimiseksi leviämisen, suoritimme sama analyysi kaikissa solulinjoissa 12 h; JNJ41876666 kevennetty haavan paranemista kaikilla tuumorisolulinjoja, mutta ei PNT1A soluissa (Fig. 8B).

Haavan paranemista määritykset suoritettiin PNT1A, LNCaP, PC3 ja DU145-solujen puuttuessa tai läsnä ollessa TRPM8 inhibiittorit AMTB ja JNJ41876666 (10 uM). A. Edustavia kuvia suoritetuissa kokeissa on normaali seerumissa. Koska esto, kaikki solulinjat tehokkaasti palauttaa yksikerroksista 24 (LNCaP ja DU145) tai 48 h (PNT1A; 24 h, ei takaisin,). Läsnäolo salpaajien heikentää paranemista LNCaP, PC3 ja DU145, mutta ei PNT1A soluissa. B. Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin kaikissa solulinjoissa jo 12 tunnin kuluttua alusta. C. kvantitointi palauttaa pinnan kolme kuvaa kaltaisia ​​A 24 tunnin kaikissa solulinjoissa, paitsi PNT1A (48 h), kun läsnä on JNJ41876666 (musta) ja AMTB (punainen). D. Samanlaisia ​​kokeita alhainen pitoisuus seerumissa paljasti, että PNT1A ei vähentänyt tyhjästä pintaa, kun taas syöpäsolujen LNCaP ja PC3 (3% FCS) ja DU145 (1% FCS) teki. Healing jälleen inhiboitui JNJ41876666 (10 uM). E. Mentoli aiheuttama lievä kiihtyminen paranemista vain DU145 soluissa, kun taas icilin osoittanut mitään vaikutusta mihinkään linjojen testattu.

alhainen pitoisuus seerumissa, PNT1A solut eivät sulkea haava 48 tuntia kun taas kaikki kolme syöpäsolulinjoilla vähensi merkittävästi haavan pintaan 24 h; tällaisissa olosuhteissa, JNJ41876666 merkittävästi hidastunutta haavojen paranemista kaikissa syöpäsolulinjoissa, vaikka ei PNT1A (kuvio 8D); AMTB tuotettu olennaisesti samat vaikutukset (tuloksia ei ole esitetty).