Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohdennetut hoitoja on käytetty torjumaan monia kasvaintyypit; Kuitenkin vain harvat ovat tehokkaasti parantaa yleistä eloonjäämistä naisten epiteelin munasarjasyöpä, kerjäämässä ymmärtää paremmin tätä tappavaa tautia ja tunnistaminen olennainen kuljettajia tumorigeneesin jotka voidaan kohdentaa tehokkaasti. Siksi käytimme menettämisestä toiminnon seulontaan auttaa tunnistamaan molekyylitason haavoittuvuuksia, jotka voivat edustaa avainkohtia hoitotoimenpiteitä. Meillä työskentelee puolueeton suurikapasiteettisten letaalisuudelle näytön avulla 24088 siRNA kirjasto kohdistaminen yli 6000 druggable geenejä ja tutkittiin niiden vaikutukset kasvuun ja /tai selviytyminen epiteelin munasarjasyöpä (EOC) solulinjat. Top 300 ”osumia” vaikuttaa elinkelpoisuuden A1847 soluja seulottiin uudelleen poikki ylimääräisiä EOC solulinjoja ja ei-tuumorigeeniset, ihmisen kuolemattomaksi munasarjan epiteelin solulinjoja. Viisikymmentäkolme geeni ehdokasta havaittu olevan vaikutuksia kaikissa tuumorigeenisia testatuissa solulinjoissa. Laaja validoinnissa osumia puhdistetut luettelon neljään laadukkaita ehdokkaita (

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, ja

PTN

). Mekaaniset tutkimukset osoittavat, että hiljentäminen kolmesta geenien johtaa lisääntyneeseen apoptoosin, kun taas

HSPA5

hiljentäminen näyttää muuttavan solujen kasvua G1 solusyklin pysähtymiseen. Lisäksi kaksi riippumatonta geenien ilmentyminen tutkimukset osoittavat, että

NDC80

,

NUF2

ja

PTN

merkittävästi poikkeuksellisesti yliekspressoituvat vakavasta adenokarsinooman. Kaiken kaikkiaan meidän funktionaalinen tuloksia integroitu genomiikka tiedot muodostavat tärkeän puolueetonta avenue kohti tunnistaminen mahdollisten terapeuttisten tavoitteiden lääkekehityksen, joka on kiireellinen ja tyydyttämättömiä kliinisen tarpeen munasarjasyöpä.

Citation: Sethi G, Pathak HB, Zhang H, Zhou Y, Einarson MB, Vathipadiekal V, et ai. (2012) RNA Häiriöt letaalisuus Screen of Human Druggable Genome tunnistaa Molecular heikkoudet epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 7 (10): e47086. doi: 10,1371 /journal.pone.0047086

Editor: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center at San Antonio, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 07 syyskuu 2012; Julkaistu: 09 lokakuu 2012

Copyright: © Sethi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tuettiin osittain ohjelman hanke apurahan Munasarjojen Cancer Research Fund (https://www.ocrf.org) ja apurahan NCI (CA140323) AKG. Tekijät myöntävät tukea Kansasin yliopistosta Cancer Center ja Kansas Bioscience Authority Eminent Scholar Program. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjan epiteelin syöpä on toiseksi yleisin gynekologinen syöpä, ja yksi tappavimmista, naisten, arviolta 22280 uutta tapausta ja 15500 kuolemantapausta 2012. [1] joukossa erilaisia ​​epiteelin munasarjasyöpä, joka sisältää vakavien, mucinous, selkeä solujen ja kohdun limakalvon [2], [3], että suurin osa kuolemista munasarjasyöpä esiintyä potilailla myöhäisvaiheen, laadukkaat vakavasta munasarjasyöpä. [4] Sellaisena on kiireellinen tarve uusille hoitomenetelmiä torjumiseksi tätä tappavaa tautia.

Uusien hoitomuotojen, erityisesti aikakaudella kohdennettujen hoitojen ja henkilökohtaista lääketiedettä, tyypillisesti ohjaa taustatekijöiden ymmärtämiseksi biology, molekyylibiologian ja biokemian kasvainsolujen ja niiden ympäristössä mikroympäristöihin kohdistaminen geneettisiä muutoksia. [5] Tämä on yhteinen teema lääkekehityksen ja voi tarjota spesifisyyttä, mutta ei yleensä tarjota kattavuus kohdistamisessa. Syöpäsolut voivat kehittyä että puuttuu kohdennetut geneettisiä muutoksia tai jotka ovat kestäviä ja voivat aiheuttaa etenevä sairaus. [5] Siksi on välttämätöntä laajentaa aseistus hoitoja, mutta vielä tärkeämpää käsityksemme tärkeä lääke tavoitteita. Evoluution luonne syöpä merkitsee, toisin kuin perinteisen viisauden, että olennaisia ​​piirteitä mitään hoitoa johdonmukaisesti parantamiseen tai valvonta syövän oltava riippumaton siitä nimenomaisesta polkuja kasvainsolun evoluution, ja riippumattomuuteen yksityisistä geneettisiä tai epigeneettiset muutokset. Vaikka geneettiset ja epigeneettiset monimutkaisuus syöpä on lähes rajaton, tuumorisolun evoluutio on rajoitettu. [6], [7] syöpäsolujen johtaa, jos ja vain jos, muutokset aiheuttavat normaalin solun koneiston suorittamaan prosessit leviämisen ja invasiivisuus.

Nykyinen lääkekehityksen pyrkimykset keskittyvät yleisesti muuntunut signaalitransduktioteitä, esimerkiksi sarja kasvutekijän reseptoreita ja loppupään modulaattorit (fosfataasien ja kinaasien), jotka toimivat konsertti edistää kasvua, mutta eivät ole keskeinen koneita. Siksi teimme puolueetonta high-throughput kuolleisuutta näytöt (HTS) pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) tunnistaa geenejä, jotka ovat välttämättömiä munasarjojen kasvainsolujen kasvua ja selviytymistä. Top osumia oli validoitu laajasti ja niiden kliinistä arvoa arvioidaan. Kaiken kaikkiaan löysimme

NDC80

,

NUF2

ja

PTN

tärkeinä molekyyli heikkouksia, jotka muodostavat potentiaalisesti merkittäviä terapeuttisia kohteita munasarjasyöpä.

Tulokset

HTS on Druggable Genome

ensisijainen korkean suoritustehon RNAi seulonta suoritettiin (kuten kuviossa S1A) käyttäen ihmisen Druggable Genome Library (Dharmacon) (taulukko S1), joka koostuu 24088 siRNA: iden kohdistaminen 6022 geenejä käyttäen A1847 soluissa, epiteelin munasarjojen syöpä (EOC) solulinja, joka johdonmukaisesti tuotti toistettavissa transfektion tiedot alla HTS olosuhteissa. Positiivinen ja negatiivinen kontrolli sisäisiä kuopat mukana jokaisen lautaselle, jotta laskennassa transfektiotehokkuutta (katso Täydentäviä tietoja S1 lisätietoja). A1847-solut transfektoitiin käyttäen HTS olosuhteissa, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Normalisoitu elinkelpoisuuden tulokset (määritellään (fluoresenssi-intensiteetti

näyte) /(mediaani fluoresenssin voimakkuuden

viite)) kautta saadut HTS näkyy Gaussin (kuvio S1B). Sen jälkeen tilastollisen datan (katso Täydentäviä tietoja S1), yhteensä 300 geenien edustaa -5% geeneistä kohteena tätä kirjastoa valittiin sisällytettäväksi seuraavalla kierroksella seulonta.

HTS on paneeli EOC solulinjat käyttäen osajoukko Druggable Genome

Seuraavaksi määritellään mitkä 300 geenien tunnistettu osuu ensisijaiselta näytön vastavuoroisesti vaikuttaa solujen kasvuun ja eloonjääminen useiden EOC solulinjoja käyttämällä riippumattoman siRNA kirjasto (taulukko S2). Tämä uusi keskittynyt kirjasto suunniteltiin käyttäen kokonaan uuden altaan neljä siRNA sekvenssien kohdistaminen kunkin geenin minimoimiseksi mahdollisia vääriä positiivisia ensisijaiselta näytön takia off-tavoite vaikutuksia. Tämä strategia käyttää eri joukko siRNA altaat toissijainen näytöissä on se tehty voimassaolon jatkamista askel sinänsä. [8] Transfektio olosuhteissa vielä seitsemän munasarjojen kasvaimia aiheuttavasta solulinjoissa (A2780, CP70, C30, OVCAR5, OVCAR8, SKOV3 ja UPN275) sitten optimoitu HTS (taulukko S3). Nämä seitsemän uutta EOC solulinjat ja A1847-solulinjassa alistettiin sitten HTS käyttäen osajoukon kirjaston kohdistaminen 300 geenejä. Elinkelpoisuuden pisteet johdettiin kaikkiin 300 siRNA altaat kussakin solulinjassa (esitetty graafisesti kuviossa 1A), joka vaihteli +0,09-1,20 poikki solulinjat. ”Hits” kunkin kahdeksan solulinjojen valittiin perustuu sekä tilastollista merkittävyyttä (väärä löytö määrä (FDR) 0,05) ja biologista merkitystä (elinkelpoisuus pisteet 0,85) (katso Täydentäviä tietoja S1 lisätietoja). Lämpöä kartta osumia jokaisen eri EOC käyttämällä luodut solulinjat MultiExperiment Viewer [9], [10] ja leikkauspiste osumien joukossa solulinjoja esitetään kaavamaisesti kuvassa 2A. Kaikkiaan 53 osumaa pidettiin merkittävinä kaikissa kahdeksassa EOC solulinjoissa (kuvio 2A ja taulukossa S4). Keskimääräinen korrelaatiokerroin (r) teknisestä rinnakkaisnäytteiden kaikissa solulinjoissa oli 0,91 ± 0,03 (kuva S2A).

näytöt paneelin EOC ja HIO solulinjoissa. A. Kahdeksan EOC solulinjat kääntää transfektoitu siRNA kohdistamista 300 geenit tunnistaa ensisijaisen seulonta A1847 solulinjan avulla transfektio parametrit optimoida kutakin solulinjaa (katso taulukko S3). Jokainen ympyrä edustaa keskimäärin elinkelpoisuus pisteet teknisestä rinnakkaisnäytteet seuraavista hiljentäminen tietyn geenin. Harmaa pisteviiva katkaista arvo elinkelpoisuuden pistemäärä (0,85) Valitse osumia. B. Kolme HIO solulinjat transfektoitiin parametrien avulla optimoidaan kutakin (katso taulukko S3).

. Lämpöä kartta esitys elinkelpoisuuden tulokset kahdeksan EOC ja kolme HIO solulinjat saavuttaa johdetusta näytöt siRNA kirjaston kohdistamista 300 geenejä. Kaikki elinkelpoisuus arvosanoilla vaihtelevat 0,12 ja 1,53. Sävyjä vihreä edustavat vähentynyttä elinkykyisyyttä ( 0,80), punaisen edustaa lisääntynyt elinkelpoisuuden ( 0,80), ja musta edustaa elinkelpoisuutta pisteet 0,80. Lämpö kartta luotiin käyttäen MultiExperiment Viewer. Kukka kaavioita keltainen ja sininen näyttää osumien poikki joko kahdeksan EOC tai kolme HIO solulinjoissa, vastaavasti, ja risteyksessä osumien kussakin ryhmässä. B. Venn-kaavio näyttää osumien yhteistä välillä HIOS ja EOCs ja määrä osumia ainutlaatuinen jokaiselle ryhmälle.

PANTHER biologinen luokittelujärjestelmän [11] osoitti, että ”aineenvaihduntaa” oli suurin luokka (~43%), johon nämä 53 geenit kuuluivat (kuvio S3A). Erityisesti, kun toiminnallisen kuvauksen näistä geeneistä suoritettiin käyttäen kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto on osoitettu, että 53 osumaa rikastettiin liittyvien geenien proteiinisynteesiä, joissa ribosomaalisen proteiinien ja venymä tekijät (kuvio S3B). Viimeaikaiset selvitykset ovat osoittaneet, että sen lisäksi osallistumista proteiinisynteesiä, ribosomaalisen proteiineja ja venymä tekijät on rooli solukierron säätelyssä ja selviytymistä. [12], [13], [14], [15] Drugs erilaisille molekyylikomponentit mukana proteiinisynteesiä koneet ovat jo kliinisissä kokeissa eri kasvainten muodoissaan, mukaan lukien rinta-, paksusuoli-, ja peräsuolen syöpiä [16], [17], [18], joka tukee translationaalinen potentiaalin osumia. Verkko luonnehdinta käyttäen IPA ohjelmisto osoitti, että geenit verkossa jolla on korkein pistemäärä näytteillä niiden loppupään vaikutukset kautta, ERK1 /2 ja AKT, avain selviytyminen geenejä, jotka ovat sekaantuneet välittäjinä suurten onkogeenisten reittejä munasarjasyövän (kuvio S3C) [19 ], [20], [21], [22].

HTS of Non-tuumorigeenisen HIO Lines

Seuraavaksi määritellään mitkä osumia oli suurin vaikutus EOC solulinjoissa ja vähän tai ei lainkaan vaikutusta ei-tuumorigeenisen ihmisen immortalisoitujen munasarjojen pinnan epiteelisolujen (HIO) solulinjat. Me siis seulottu 53 osumien vaikutuksia elinkelpoisuudesta kolmen HIO solulinjojen (HIO80, HIO120 ja HIO117). Vaikka olimme kiinnostuneita seulonnassa vain 53 osumia, säilyttääkseen saman esitysformaatti ja minimoimiseksi teknisiä eroja siinä, miten siRNA näytöt tehtiin varten HIO solulinjat, me taas käytetään muokatun siRNA kirjasto on suunnattu kaikille 300 geenit. Elinkelpoisuuden pisteet saatiin seuraavat vaiennettu kunkin geenin (kuvio 1 B). Keskimääräinen korrelaatiokerroin välillä teknisten rinnakkaista kolmen HIO solulinjoissa (kuvio S2B, keskimäärin r = 0,90 ± 0,03) oli samanlainen kuin EOC solulinjoissa.

osumia HIO solulinjat valittiin kuvatulla tavalla (normalisoitu elinkelpoisuus pisteet 0,85 ja FDR 5%). Yhteensä 74 osumaa havaittiin yhteinen kaikille kolmelle HIO solulinjoissa (kuvio 2A). Venn kaavio näyttää leikkauspiste osumien välillä EOC ja HIO solulinjoja kuvassa 2B. Neljäkymmentäseitsemän osumia oli yhteistä kahden ryhmän välillä. Kuitenkin oli kuusi osumia ainutlaatuinen EOC solulinjoja (geenejä, jotka vaikuttivat kannattavuuteen kaikki kahdeksan EOC solulinjoissa, mutta ei kaikkia kolmea HIO solulinjojen) jota valittu lisävalidointia. Olemme myös valittu yksi ylimääräinen geeni,

NUF2

, edelleen validointitutkimuksia.

NUF2

, vaikka ei ainutlaatuinen osuma EOC solulinjoihin, näkyy alin elinkykyisyysindeksiä pisteet, määritellään suhde keskimääräiseksi elinkelpoisuutta EOC solulinjojen keskimääräisen normalisoitu elinkelpoisuutta HIO solulinjojen (Taulukko S4). Näiden seitsemän geenit (

BCAR3

,

HSPA5

,

NAMPT

,

NDC80

,

NUF2

,

PTN

, ja

RPS19

) analysoitiin edelleen mahdollisia off-tavoite vaikutuksia.

dekonvoluutio siRNA altaat

sulje pois off-tavoite vaikutukset, me erikseen arvioitiin neljä siRNA päässä siRNA altaat käytetty kakkosnäyttöinä kohdistaminen seitsemän geenejä. 28 yksittäiset siRNA vuonna dekonvoluutio näytössä (taulukko S5) arvioitiin paneelissa EOC solulinjoissa. Jotta hyväksyä seitsemästä geenien olevan, voimassa torjuttaviin vaikutuksia elinkelpoisuudesta EOC solulinjojen, me tarvitaan, että ainakin kaksi neljästä yksittäisten siRNA: t kohdistaminen kunkin geenin johti kannattavuuden pisteet 0,85 tai vähemmän FDR alle 5% kaikkien kahdeksan EOC solulinjoissa. [23], [24] Näiden tiukkojen kriteerien, neljä geenejä,

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, ja

PTN

, olivat pidetään paikan kohde, validoitu osumia (kuvio 3A ja taulukko 1). Seuraavaksi yhdistettiin kaksi tehokkainta siRNA lajeja (korostettu vihreällä, taulukossa S5) kohdistaminen kunkin neljän geenien ja määrällisesti tason väheneminen solujen elinkelpoisuuden kunkin solulinjan. Näitä optimaalisia siRNA altaat aiheutti yli 30% vähennys solujen elinkelpoisuuden poikki enemmistö EOC solulinjojen (kuvio 3B).

. Seitsemän osumia jatkotutkimuksiin valittiin todensi suorittamalla dekonvoluutiolla näyttöjä, joissa yksittäiset siRNA, jotka olivat alun perin osa altaan neljän siRNA: iden toissijaisen näyttöjen arvioitiin niiden vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen. Kunkin osuma on validoitu, keskimääräinen normalisoitu elinkelpoisuuden tulokset (± SD) seuraavasti geenien käyttäen kunkin neljän lajin siRNA: iden arvioitiin kahdeksan EOC solulinjat on esitetty. Osumien katsottiin paikan kohde jos elinkelpoisuus tulokset alle 0,85 havaittiin kaikille kahdeksalle EOC solulinjoissa vähintään kahden itsenäisen siRNA lajia kohdistaminen geeni. Pylväiden edustavat kahdeksaa EOC solulinjat seuraavassa järjestyksessä: A1847, A2780, C30, CP70, OVCAR5, OVCAR8, SKOV3, ja UPN275. B. Kaksi tehokkainta siRNA kohdistaminen kunkin geenin yhdistettiin (12,5 nmol kutakin siRNA lajia) ja vaikutus solujen elinkykyisyys määrällisesti. Palkit edustavat kahdeksaa EOC solulinjojen kuvatulla Panel AC qRT-PCR suoritettiin kaikki kahdeksan EOC solulinjat seuraavanlaista geenin hiljentäminen 72 tuntia käyttäen altaan kaksi tehokkainta siRNA tunnistaa dekonvoluutio tutkimukset paneeli A neljä osumaa, joiden on määritelty olevan aikataulussa. Tähti esittää

PTN

mRNA jotka ovat alle tason havaitseminen seuraavista siRNA hoidon (eli täydellinen knockdovvn mRNA). D. Western blot -analyysi suoritettiin seuraavien geenien joko 72 h (

HSPA5

,

NDC80

, ja

PTN

) tai 120 h (

NUF2

) tason määrittämiseksi naistaintumisprosenttia proteiinitasolla in A1847 soluissa. Immuno blotit kvantitoitiin käyttäen AlphaView ohjelmistoa, versio 3.3 (Cell Biosciences).

Koska ylimääräinen tarkastus kykyyn siRNA: iden oikein kohdistaa mRNA: ita, käytimme optimaalinen altaan kahden tehokkainta siRNA: illa (kuvio 3B) ja suoritettiin kvantitatiivinen RT-PCR tason määrittämiseksi mRNA knockdown transfektion yhdistettyjen siRNA: iden kunkin solulinjan (kuvio 3C). Lähetti-RNA tasot

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, ja

PTN

kaikissa kahdeksassa EOC solulinjojen osoitettiin olevan alennetaan keskimäärin 67%, 87%, 77%, ja 96%, vastaavasti. Western blot-analyysi transfektion jälkeen yhden EOC solulinjan, A1847, oli valmistunut lisäkeinona spesifisyyden osoittamiseksi siRNA altaat arvioimalla solujen tasot vastaavien proteiinien mRNA: iden kohdistetaan. Kaikki neljä siRNA allasta alassäädetty proteiinin tasot niiden mRNA tavoitteensa -50% tai enemmän tässä solulinjassa (kuvio 3D).

Vaikutukset Apoptoosi ja solusyklin etenemisen

päätepiste parametrin solujen elinkelpoisuuden että käytimme tunnistamaan hittejä HTS tutkimuksissa antaa rajoitetusti tietoa mekanismista laski solujen elinkelpoisuuden /kasvun aiheuttama geenien. Olemme siksi tutkineet toiminnalliset vaikutukset kohdistuvat kunkin neljän validoitu osumia apoptoosin ja solusyklin etenemisen kahdella EOC solulinjoja, A1847 ja A2780. Transfektoimme nämä solulinjat jossa uima-allas on kaksi tehokkainta siRNA-sekvenssejä (12,5 nM kutakin siRNA, samalla siRNA-allas, jota käytetään määrällisiä RT-PCR: llä (qRT-PCR) ja Western blot-analyysi) ja kunkin neljän validoitu osumia (

HSPA5, NDC80, NUF2

ja

PTN

) ja mitataan vaikutukset apoptoosiin ja solusyklin etenemisen 72 h transfektion jälkeen 96-kuoppaisille levyille. A2780-soluja, pudotus kaikista neljästä geenistä johti lisääntymiseen apoptoottisten solujen mitattuna positiivinen anneksiini V-värjäys käyttäen guava virtaussytometriä suhteessa soluihin, jotka on transfektoitu

GL2-

-targeting ohjaus siRNA (kuvio 4A). Keskimäärin oli 2,5-kertainen apoptoottisia soluja. Kuitenkin näissä soluissa ei ollut merkittävää vaikutusta solusyklin seuraavat pudotus Näiden neljän osumia (kuvio 4B).

A1847 ja A2780-soluja transfektoitiin

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

,

PTN

tai

GL2-

siRNA. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia transfektion jälkeen, solut kerättiin ja käsiteltiin analyysi apoptoosin tai solusyklin etenemisen. A. C. osa apoptoottiset solut mitattiin anneksiini V värjäyksessä, mitä seurasi luettelointi käyttäen Guava virtaussytometrillä (Millipore). Kansi-muutos apoptoottisten solujen on osoitettu (keskiarvo ± SD, n = 3). B D. osa solujen kunkin vaiheen solusyklin mitattiin propidiumjodidivärjäys seuraa numerointi- käyttämällä guava väline. Kertamuutoksen kunkin solusyklin vaihe on esitetty (keskiarvo ± SD, n = 3).

A1847 soluissa, pudotus on kolme geeniä (

NDC80

,

NUF2

ja

PTN

) johti 1,7-kertaiseen kasvuun apoptoottisten solujen suhteen, jotka on transfektoitu

GL2-

-targeting ohjaus siRNA (kuvio 4C). Knockdovvn

HSPA5

ei johtanut mihinkään merkittävään kasvuun apoptoosin (kuvio 4C). Emme kuitenkaan todeta, että sen Knockdown ei johda 2-kertainen nousu väestön solujen G1 vaiheessa solusyklin ja vastaava 2-kertaisesti alentunut G2 /M vaiheessa (kuvio 4D). Knockdovvn

NDC80

,

NUF2

, ja

PTN

in A1847 soluissa johti lievään kasvuun solujen määrä S vaiheessa (kuvio 4D). Tämä kasvu oli keskimäärin alle 1,5-kertaiseksi ja ei näytä olevan tilastollisesti erittäin merkitsevä. Knockdown näistä neljästä geenit eivät ole mitattavissa olevaa vaikutusta eloonjäämiseen ei-tuumorigeenisiä HIO80 soluissa (kuvio S4).

Arvio validoitu Hits kliinisissä näytteissä

seroosit adenokarsinooma on merkittävä alatyyppi munasarjan epiteelin syövän. Jotta arvioimaan mahdollinen kliininen merkitys neljän validoitu osumia, me tutkituista Cancer Genome Atlas (TCGA) munasarjan vakavasta adenokarsinooma tietokantaan. [25] Geenien ilmentyminen tietoja neljä validoitu hittejä 494 serous adenokarsinooman saatiin TCGA portaali (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp). Expression of

NDC80

,

NUF2

, ja

PTN

on ajan säätelee ≥1.5-kertaiseksi 98%, 99%, ja 37%: n kasvain näytteet, (kuvio 5); kuitenkin vain 1%: n näytteet osoittivat ≥1.5-kertainen yliekspressio on

HSPA5

noin 87% näytteistä osoittaa alennettu ilmentyminen suhteessa normaaliin (kuvio 5). Mitään näistä geeneistä on mutatoitu yli 1% näytteistä (tuloksia ei ole esitetty). Me seuraavaksi analysoitu kopioluvun vaihtelu (CNV) ja DNA: n metylaatio varten

NDC80

,

NUF2

ja

PTN

käyttäen TCGA tietokantaa. CNV analyysi osoitti alhaisen kopioluvun voitot ( 1,2-kertaisesti) 12%, 39% ja 36% näytteistä

NDC80, NUF2 ja PTN,

vastaavasti, ja kopio numero menetys 41% näytteistä

HSPA5

geeni. Oli heikko mutta tilastollisesti merkitsevä korrelaatio geenien ilmentyminen ja kopion numero kolme geeniä yli 494 näytettä (kuva S5a). Lisäksi nämä kolme geeniä huomasimme, että keskimäärin näytteet kopiomäärä voitto osoitti 1,6-kertainen geeniekspression verrattuna näytteiden kopiointisuojaamattomat vahvistuksenkertojan (p-arvo 0,0001, 0,0001, ja 0,05

NDC80

,

NUF2

ja

PTN,

(kuvio S5B). Analysoimme ovatko muutokset DNA: n metylaatio myös liittyy poikkeava ilme. promoottori alueet on

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

ja

PTN

ovat hypometyloidut (β 0,25) in ≥94% tuumorin näytteiden. kuitenkin emme löytäneet tilastollisesti merkittävää korrelaatiota ilmentymisen ja promoottorin metylaation tahansa näiden geenien TCGA datajoukon (tuloksia ei ole esitetty).

TCGA datasarja 494 munasarjan serous adenokarsinooman tiedustellessa määrittämään mRNA ekspressiotasot (log

2 (kasvain /normaali-suhde)) on

NDC80

,

NUF2

,

PTN,

ja

HSPA5

. Nämä tiedot ovat esitetty pylväskaaviot että harmaa katkoviivat osoittavat prosenttiosuuden näytteiden 1,5-kertaiseksi, 3-kertainen, 5-kertainen ja 10-kertainen yliekspressio verrattuna verraton normaaliin näytettä TCGA keräämiseen.

validointi kliinistä merkitystä riippumattomana kohortti

edelleen vahvistaa mahdollisia yhdessä patogeneesin tämän sairauden, selvitimme ilmaus alkuun neljä validoitu osumaa itsenäisessä geeni profilointitiedot joukko primääri munasarjojen kasvainnäytteestä . [26] Geenien ilmentyminen profiileja mikropaloitelluista, myöhäisessä vaiheessa, korkealaatuista munasarjojen vakavien karsinoomat (n = 53) ja microdissected ihmisen munasarjojen pinnan epiteelisolujen (letku) näytteet (n = 10) arvioitiin. Normalisoidut ekspressiotasoja kaikista kasvaimen näytteet on esitetty kuvassa 6A. Olemme havainneet, että 48/53 (90%), tuumorin näytteiden yli-ilmentävät

NDC80

1,5-kertainen tai suurempi. Samoin 53/53 näytettä (100%) ja

NUF2

ja 24/53 näytettä (42%) ja

PTN

havaittiin yli-ilmentää ≥1.5-kertaiseksi. Nämä tiedot korreloivat hyvin TCGA tiedot ilmaisun munasarjakasvain näytteissä.

HSPA5

yliekspressoitiin 8/53 (15%) näytteistä. Kasvu keskimäärin mRNA tasoilla koko kasvain näytteet suhteessa tavanomaiseen HOSE näytteissä oli tilastollisesti merkittävä kaikissa neljässä geenit (p 0,005) (kuvio 6B). Olemme myös arvioi ennusteen arvioinnissa näiden geenien suorittamalla Kaplan-Meier selviytymisen analyysi intensiteetin mittaukset microarray data neljän geenien vastaavaan kliiniset tiedot kunkin potilaan. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi

NUF2

ehdotti, että korkean mRNA-ilmentymisen tasoa liittyi huonoon ennusteeseen näillä potilailla (kuvio S6A). Analyysi muut kolme geeniä ei ollut tilastollisesti merkittävä. (Tuloksia ei ole esitetty). Samanlainen ennusteen arvioinnissa on

NUF2

mRNA löydettiin selviytyminen analyysi TCGA tietojen (kuva S6b).

. Taulukossa esitetään geeni-ilmentymisen tasot 53 vakavien adenokarsinoomat normalisoitu keskimääräinen geenin ekspressiotasot mitattiin normaalissa munasarjakudoksessa (n = 10). B. Kuvassa ovat keskiarvo geeniekspressiotasot poikki serous adenokarsinoomista varten

NDC80

,

NUF2, PTN

ja

HSPA5.

Kaksisuuntaista t-testi osoittaa, että kasvu geenin ilmentymisen kasvainnäytteissä on tilastollisesti merkittävä suhteessa normaaliin kudokseen. *** = P 0,0005; ** = P 0,005; * = P 0,05.

Keskustelu

suuri poistuma hinnat lääkekehitysprojekteihin kohdennettujen hoitomuotojen [27], edellyttää tunnistaminen ja validointi uusien druggable molekyylikohteista, niiden rooli munasarjasyövän selkeästi määritelty minimoimaan epäonnistumiseen lääkkeen kehittämisen aikana putki. Käyttämällä integroitua RNAi seulontaan kohdistaa yli 6000 druggable geenien tunnistimme 53, joita tarvitaan kasvua ja selviytymistä poikki paneelia EOC solulinjojen; Seitsemän näistä olivat pääasiassa aktiivisia tuumorigeenisemmiksi soluissa ja katsottiin ylimääräisiä dekonvoluutiolla ja validointitutkimusten. Neljä ehdokasta seitsemästä (

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, ja

PTN

) lopulta osoittautui voimassa osumia EOC solujen vähäinen vaikutus ei-tuumorigeenisiä HIO soluissa.

menettämisestä funktion seulontaa tutkimuksissa raportoitu tässä asiakirjassa ovat antaneet meille toimiva genomista tilannekuvan uusia molekyylitason haavoittuvuuksia epiteelin munasarjasyövän rajojen ulkopuolella yleisesti kohdennettuja molekyyli signalointireitteihin. Olemme tutkineet neljä validoitu tavoitteet (

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

ja

PTN

), joissa kaikissa on tehtävä kasvua tai eloonjäämistä EOC soluihin, käyttäen

in vitro

soluun perustuvissa määrityksissä. Tulokset osoittavat, että munasarjan tuumorigeenisiä soluja keskimäärin ovat suhteellisesti alttiimpia Ehdokaskohteiden verrattuna ei-tuumorigeenisiä soluissa viittaa mahdolliseen terapeuttinen ikkuna herkistymistä. Kaikki neljä geenejä on aiemmin raportoitu osumia RNA-interferenssi näytöissä. [28], [29], [30] Kaikki neljä tavoitteet koodaa proteiineja vastaanottavaisia ​​hoitointerventio ja on aiemmin raportoitu osallistua solusyklin väyliä tai selviytymisreittejä vuonna muissa elimissä. [31], [32], [33] Genomics dataa TCGA ja Birrer lab tukee edelleen käsitystä, että vähintään kolmen tavoitteista (

NDC80

,

NUF2

,

PTN

) olisi valikoiva alttiutta terapeuttisia kasvainsoluissa suhteessa normaaleihin soluihin antanut merkittäviä ylössäätöä in vakavasta adenokarsinooman. [34] Nykyisin lupaavin inhibiittorit kohdentamalla ehdokkaita ovat INH11 [35], joka on suunnattu NDC80 /NUF2 koulutusjakson, neutraloivan anti-PTN vasta [36], joka toiminnallisesti estävät kasvaimen kasvua edistäviin toimintoihin PTN, ja epigallokatekiinigallaatti joka estää HSPA5. [37] Lisäksi siRNA-pohjainen lääkkeet ovat osoittautuneet toteuttamiskelpoisia vaihtoehtoja

in vivo

terapiassa [38], [39], [40] antaa meille keinoja edetä prekliinisissä tutkimuksissa tehokkuuden mittaamiseksi kohdistaminen neljästä osumaa käyttäen potilaalle tehdä, ksenografti hiiri malleja munasarjasyöpä.

HSPA5

(taulukko 1) on geeni, jonka tuote on keskeinen sääntelijä Endoplasmakalvosto homeostaasiin joka on kriittinen selviytymisen eukaryoottisolut. [41] HSPA5 on jännitys-indusoituva ER chaperone, että on erittäin indusoi monenlaisia ​​kasvaimia kautta tekijät, kuten hypoksia ja asidoosi mikroympäristössä huonosti perfuusio kasvaimia. [41] aikaisemmassa tutkimuksessa, vasta-aineet kohdistuvat solun pinnan HSPA5 indusoi apoptoosia SKOV3- soluissa. [42] Nykyisessä tutkimuksessa, hiljentämisen HSPA5 indusoi merkittävän apoptoosin A2780 soluissa, ja osoitti merkittävää solusyklin pysähtymisen ja A1847 soluja G1 vaiheessa. Geenien ilmentyminen tietoja TCGA viittaavat siihen, että vähentynyt ilmentyminen on yleisempää tämän geenin, joka on vastoin meidän seulonnan tuloksiin. CNV analyysi osoittaa, että

HSPA5

on menetetty 41% näytteistä ja mutaatioanalyysiin TCGA tiedot osoittavat, että

HSPA5

on mutatoitunut alle 1% näytteistä. Koska alennettu ilmentyminen, geenin poisto, ja puute mutaatioita kasvain näytteissä munasarjasyöpä potilaille, lisätutkimuksia tarvitaan, jotta saataisiin parempi käsitys vaikutusmekanismi ja kliinistä merkitystä hitti munasarjasyöpä.

yhdenmukainen meidän seulonta tiedot,

NDC80

ja

NUF2

yliekspressoituvat lähes 100% näytteistä ja

PTN

yli-ilmennetään -40%: n näytteitä kaksi itsenäistä kohortteja potilaan näytteitä. Proteiini tuotteet

NDC80

(

HEC1

,

KNTC2

) ja

NUF2

(

CDCA1

) ovat osa mitoosi monimutkaisia ​​mukana Kinetokori vuorovaikutusta ja karan kokoonpano tarkistuspisteen mitoosissa. [43] Mitosis säätelyhäiriötä on yleinen syy karsinogeneesissä. [44] Aikaisemmassa tutkimuksessa, siRNA välittämä knockdown vastaan ​​

NDC80

ja

NUF2

on osoitettu aiheuttavan epänormaalia mitoottisiin exit ja aiheuttaa apoptoosin peräsuolen syövän ja mahasyövän solulinjoissa. [32] Toisessa tutkimuksessa hiljentäminen

NDC80

käytettäessä EOC solulinjassa, SKOV3.ip1, ehdotti, että apoptoosin lisääntyminen liittyvien solukuolemaa. [45] Sekä

NDC80

ja

NUF2

on osoitettu olevan jopa säännellään aivoissa, maksassa, ja rintasyöpä. [46] Yli-ilmentyminen

NDC80

ja

NUF2

on huonosta kliinisiin ennusteeseen potilailla, joilla on rintasyöpiä ja ei-pienisoluisessa keuhkosyövässä [43], [47]. Häiriöt NDC80 ja NUF2 kompleksin muodostumista käyttämällä pienmolekyylisalpaaja-, INH1, on osoitettu vähentävän proliferaatiota rintasyöpäsoluissa ja vähentää tuumorin kasvua ksenograftin hiirimallissa. [35] Kinetokori komponentteja, erityisesti NDC80 ja NUF2, on ehdotettu mahdollisina kohteina syöpähoitojen. [48] ​​Tutkimuksemme on ensimmäinen raportti NDC80 ja NUF2 mahdollisina huumeiden tavoitteet munasarjasyövän hoitoon.

PTN

(pleiotrophin,

HARP

) on toinen mielenkiintoinen geeni tunnistettiin jonka tuote on kasvutekijä tiedetään tuovan esiin loppupään selviytymisen signalointipolkujen läpi useita reseptorien nimittäin ALK, SDC3, SDC1 ja PTPRb /z. [49] On osoitettu keskeinen rooli kasvainten synnyssä haiman, aivojen ja rinnan kasvain malleja. [50] On mukana solun muuntaminen, kasvua, selviytymistä, muuttoliike ja angiogeneesiä.

PTN

geeni ilmentyy voimakkaasti alkionkehityksen aikana, mutta osoittaa hyvin rajallinen ilmentymistä aikuisen kudoksissa, jossa se rajoittuu aivoihin. [51], [52], [53], [54] Olemme osoittaneet käyttämällä ELISA-määritykset että PTN arvot ovat selvästi kohonneet kunnostetussa tiedotusvälineissä munasarjasyövän solulinjoissa tutkittiin (G. Sethi ja A. K. Godwin, julkaisematon data).