Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

homeodomain-vuorovaikutuksessa proteiinikinaasin 2 (HIPK2) on monitoiminen proteiini, joka hyödyntää sen kinaasiaktiivisuuden moduloimiseksi keskeisten molekyylien reittejä syövän hillitsemään kasvaimen kasvua ja aiheuttaa vastaus hoitoja. Esimerkiksi HIPK2 knockdown indusoi ylössäätely onkogeenisten hypoksian indusoituva tekijä-1 (HIF-1) toiminta johtaa konstitutiivista hypoksinen ja angiogeeninen fenotyyppi lisääntynyt kasvaimen kasvu

in vivo

. HIPK2 esto, siis vapauttaa johtavia reittejä tuotannon proinflammatoristen molekyylien, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) tai prostaglandiini E2 (PGE

2). Kasvain tuotettu tulehduksen välittäjäaineiden muu kuin edistää kasvaimen kasvua ja verisuonten kehitys voi sallia kiertämistä kasvaimen vastaisen immuunivasteen. Näin ollen, dendriittisolut (DC) toimintahäiriö aiheuttama kasvain tuotetaan molekyylejä, voi sallia tuumorisolut paeta immuunitutkimusohjelmasta. Täällä arvioimme molekyylimekanismin PGE

2 tuotannon jälkeen HIPK2 ehtyminen ja kuinka moduloida sitä.

Menetelmät /tärkeimmät havainnot

Osoitamme, että HIPK2 Knockdown paksusuolen syöpäsoluissa johti cyclooxygenase -2 (COX-2) ilmentymisen lisääntyminen ja COX-2-johdetun PGE

2 sukupolven. Molekyylitasolla, COX-2 säätelyä riippui HIF-1-aktiivisuutta. Raportoimme aikaisemmin, että sinkin estää HIF-1 aktiivisuutta. Täällä sinkkilisän jotta HIPK2 köyhdytettyä soluihin esti HIF-1-indusoidun COX-2 ilmaisun ja PGE

2 /VEGF tuotantoa. Tällä translaation tasolla, kun taas elatusainetta sekä siRNA ohjaus ja HIPK2 köyhdytettyä solujen estyy DC kypsymisen väliaine vain sinkki-käsiteltyjen HIPK2 köyhdytettyä soluja tehokkaasti palauttaa DC kypsymisen nähdään ilmaus kostimuloivien molekyylien CD80 ja CD86, sytokiinien IL 10 julkaisu, ja STST3 fosforylaatio.

Päätelmä /merkitys

Nämä havainnot osoittavat, että: 1) HIPK2 knockdown indusoi COX-2 voimistumista, lähinnä riippuen HIF-1 toimintaa; 2) sinkin vaimentua HIF-1-indusoidun COX-2 ja esti PGE

2 /VEGF tuotantoa; ja 3) sinkin ja HIPK2 köyhdytettyä solujen palauttaa DC kypsymistä.

Citation: Garufi A, Pistritto G, Ceci C, Di Renzo L, Santarelli R, Faggioni A, et al. (2012) Targeting COX-2 /PGE

2 Pathway in HIPK2 Knockdown Syöpäsolut: Vaikutus dendriittisolujen kypsyminen. PLoS ONE 7 (11): e48342. doi: 10,1371 /journal.pone.0048342

Editor: Kjetil Tasken, University of Oslo, Norja

vastaanotettu: 15 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 24 syyskuu 2012; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Garufi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Avustukset Italian Association for Cancer Research (AIRC) ja GDO (no. 11377) ja AF (n. 10265). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

homeodomain vuorovaikutuksessa proteiinikinaasin 2 (HIPK2) on monitoiminen kinaasi, jonka toiminnan hillitsee syövän etenemiseen. HIPK2 fosforyloi ja aktivoi oncosuppressor p53 apoptoottisen funktion vasteena huumeiden [1], [2]. HIPK2 myös tukahduttaa signalointireiteissä osallisena syövän etenemiseen, kuten Wnt /β-kateniinin, avulla sen katalyyttisen aktiivisuuden ja transkription tukahduttamisen toiminta [3], [4]. Viime aikoina havaitsimme, että HIPK2 estää hypoksia-indusoituva tekijä 1α (HIF-1α) alayksikön transkription tasolla. HIF-1 on heterodimeerinen transkriptiotekijä, joka indusoi transkriptiota yli 60 osallistuvien geenien angiogeneesiin, glukoosiaineenvaihduntaan ja invaasiota [5]. HIF-1 koostuu HIF-1β alayksikkö, konstitutiivisesti soluissa, ja happea herkkä HIF-1α alayksikköä. Lisääntynyt HIF-1α esiintyvät usein monissa ihmisen syövissä ja stimuloidaan alhainen hapen lisäksi myös geneettisiä muutoksia. Tässä suhteessa, HIPK2 pudotus aiheuttaa HIF-1α säätelyä lisääntynyt HIF-1 toiminta johtaa endoteelikasvutekijä (VEGF) tuotantoa, kasvaimen angiogeneesiä ja chemoresistance [6], [7]. Yrittäessään kohdistaa HIF-1 aktiivisuutta, olemme aikaisemmin osoittaneet, että sinkki-ionit sallivat HIF-1α proteiinien hajoaminen syöpäsoluissa johtaa tukahduttaminen HIF-1-reitin

in vitro

ja

in vivo

[8] kanssa palauttamiseen kemosensitiivisyys [9].

Muut kuin asiakkuutta VEGF ilme, HIPK2 knockdown johtaa lisääntyneeseen prostaglandiini E2 (PGE

2) biosynteesin, joka korreloi kasvaimen kasvu

in vivo

[10]. PGE

2 on runsain prostaglandiini löytyy peräsuolen syövän ja suosii kasvaimen kasvua stimuloimalla leviäminen, angiogeneesi, ja invasiivisuus, ja estämällä apoptoosin [11]. PGE

2 aktivoi komponentit onkogeenisten Wnt merkinantojärjestelmä johtaa vakauttamiseen ja aktivointi β-kateniinin, kuten transkriptiotekijän indusoivan useiden geenien ekspression, mukaan lukien COX-2 (COX-2), c-myc, sykliini D1, ja PPARS, jotka ovat mukana kasvaimen etenemistä [12].

prostaglandiinien kautta COX-2 on tärkeä reitti patogeneesissä paksusuolen syövän vaan myös muihin syöpiin [13]. COX-2, indusoituva muoto syklo-oksigenaasin, katalysoi arakidonihapon (AA) ja endoperoxide välituotteita, jotka ovat viime kädessä muunnetaan prostaglandiinien (PGE2, PGD2, PGF2, PGI2 ja TxA2). COX-2 on erittäin indusoituu vasteena tulehduksen välittäjäaineita, kasvutekijät, onkogeenin aktivaation ja kasvaimen promoottorit [14]. Näin ollen, kohonneet COX-2 on havaittu monissa syöpätyypeissä [15] – [17]. Transkriptionaalisen säätelyn COX-2-geenin riippuu mole- koneiden kanssa vuorovaikutuksessa COX-2-promoottori, joka näyttää ohjata toiminnan eri signalointireittien [18]. Niistä onkogeenisiä reittejä kuten Wnt /β-kateniinin signalointi [19] tai HIF-1 [20] voi parantaa COX-2-geenin transkription. On havaittu, että HIF-1-aktivoitu COX-2 /PGE

2 akselin indusoi VEGF ja edistää angiogeneesiä [21], joka puolestaan ​​voimistaa HIF-1 transkriptionaalisen aktiivisuuden [22]. Tällaiset ylikuulumisen joukossa signaalinvälitysreittien johtaa itsesäätelydomeenin silmukka, joka on hyödyllinen syövän etenemiseen. Siksi kohdistaminen HIF-1 on toiminnallinen strategia poistaa reittejä mukana syövän etenemiseen, kuten COX-2 /PGE

2 /VEGF.

tuumorisoluja tuottavat usein tulehduksellinen molekyylejä, jotka mikroympäristössä, muut kuin edistää kasvaimen kasvua ja verisuonten kehityksen, mahdollistaa kiertäminen kasvaimen vastaisen immuunivasteen [23]. PGE

2, kuten kasvaimeen vapautetaan tekijät, on osoitettu tukahduttaa immuunivastetta ja mahdollistavat tuumorisolut paeta immuunitutkimusohjelmasta indusoimalla esimerkiksi paikallisia ja systeemisiä dendriittisolut (DC: t) toimintahäiriö [24], [25]. DC: t ovat tehokkaita antigeeniä esitteleviä soluja (APC: t) ja siten se on ratkaiseva rooli aloittamaan immuunivasteen-vasteen. DC ovat erittäin erikoistuneet antigeenin talteenotto, käsittely ja esitys ja kypsymisen jälkeen ne ilmaisevat co-stimuloivien molekyylien (toisin sanoen CD80 ja CD86), joka aktiivinen T-lymfosyyttien [26]. Niiden rooli herättämisessä kasvain vasteita ja myöhemmät kasvainregressio on laajasti osoitettu, kautta

in vivo

rokotteen stimulaatio tai

ex vivo

DC immunoterapia [26]. Alentuminen DC kypsymisen voi riippua siitä, että kasvain-julkaissut tekijät aiheuttaen siten immunosuppressiota. Siten vika DC järjestelmä on yksi tärkeimmistä tekijöistä kasvaimen paeta [27], [28].

Sen perusteella edellä mainittuihin seikkoihin Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida ensin roolia COX-2 in PGE

2 sukupolven seuraava HIPK2 ehtyminen. Olemme havainneet, että HIPK2 pudotus johti HIF-1-indusoidun COX-2 ilmentymisen lisääntyminen ja COX-2-johdetun PGE

2: n tuotantoa. Mielenkiintoista, sinkin vaimentua COX-2 ilmaisun ja esti PGE

2 sukupolvi ja sen signalointireiteissä sekä HIF-1 aiheuttama VEGF. Sitten, toiminnallisella tasolla, kun taas elatusainetta sekä siRNA ohjaus ja HIPK2 köyhdytettyä solujen estyy DC kypsymisen, vain väliaine sinkki-käsiteltyjen HIPK2 köyhdytettyä soluja, mikä osoitti vahvaa PGE

2 ja VEGF downregulation, tehokkaasti palauttaa DC kypsymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksynyt eettinen komitea Policlinico Umberto I, Sapienza yliopisto, Rooma, Italia.

Solut, Culture kunto, Hoidot ja elatusaineesta

Ihmisen RKO (paksusuolen syöpä) ja vakaasti HIPK2-häirinnyt RKO-siHIPK2 [29] soluja ylläpidettiin rutiinisti RPMI-1640 (Life Technology-Invitrogen) väliaineessa, kun taas HCT116 (paksusuolen syöpä), 293 (ihmisen alkion munuaisen solut) ja Doxyclyclin (Dox) indusoitavissa MCF7 (rintasyöpä) (MCF7indsi /HIPK2) soluja, jotka ilmentävät HIPK2-häiriö [30], oli rutiininomaisesti yllä DMEM (Life-tekniikka- Invitrogen) väliaineessa, jotka kaikki sisältävät 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä ja glutamiinia, 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Sinkkilisän, subkonfluenteista soluja käsiteltiin 100 uM ZnCl

2 24 tuntia. Indusoituvan HIPK2 pudotus, Dox (1 ug /ml) lisättiin MCF7indsi /HIPK2 solujen joka 3 päivä, kunnes HIPK2 pudotus onnistui saavutettu (tavallisesti noin 5 päivää). Sen jälkeen kun HIPK2 pudotus oli saavutettu, soluja viljeltiin ilman Dox vielä 5 päivää palautumisen HIPK2 ehtyminen.

saamiseksi väliaine (CM), RKO siRNA-ohjaus ja siHIPK2 köyhdytettyä solut ympättiin 6 x 10

5/60 mm2 petrimaljaan ja viljellään, kunnes 60% konfluenssiin. Sen jälkeen elatusaine korvattiin ja supernatantit (eli elatusaine) kerättiin 48 tuntia myöhemmin. ZnCl

2 (100 mM) lisättiin 24 h.

RNA ja Reverse Transcription (RT) -PCR Analysis

Solut kerättiin vuonna TRIzol Reagent (Invitrogen) ja kokonais-RNA eristettiin noudattamalla valmistajan ohjeita. cDNA syntesized 2 ug kokonais-RNA: ta MuLV käänteistranskriptaasia Kit (Applied Biosystems). Semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttäen Hot-Master Taq-polymeraasia (Eppendorf) ja 2 ui cDNA-reaktio ja geenien spesifisiä oligonukleotideja olosuhteissa lineaarisen vahvistuksen. PCR suoritettiin kahtena kappaleena kahta erilaista cDNA. PCR-tuotteet ajettiin 2% agaroosigeelissä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä, käyttämällä UV-valoa. Housekeeping β-aktiini tai 28S-geenejä käytettiin sisäisenä standardina. Densitometri-analyysi sovellettiin määrällisesti erityisten mRNA-tasot verrattuna sisäiseen standardiin. Data esitetään edustavat vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Western immunoblottaus

Yhteensä solu-uutteet valmistettiin inkuboimalla 4 ° C: ssa 30 minuuttia lyysipuskurissa (50 mmol /L Tris-HCI , pH 7,5, 150 mmol /l NaCI: a, 150 mmol /l KCI: a, 1 mmol /l ditiotreitolia, 5 mmol /l EDTA: a, pH 8,0, 1% Nonidet P-40) sekä yhdistelmä proteaasi-inhibiittoreita (Sigma Chemical Company) ja fosfataasi-inhibiittorit, ja SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Millipore). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssä ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla, jotka tunnistavat COX-2 (Cayman Chemical), β-kateniinin (Santa Cruz Biotechnology), sykliini D1 (M-20, Santa Cruz, ystävällisesti Marco Crescenzi ISS, Rooma, Italia), hiiren monoklonaalinen anti-HIF-1α (Novus Biologicals, UCS Diagnostic, Italia), p-STAT3 (Y705), yhteensä STAT3 (molemmat Cell Signaling Technology), ja β-aktiini (Calbiochem). Sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuren peroxidise (Bio-Rad) käytettiin 1:5000. Immunoreaktiivisuus havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla kitillä (ECL kit, Amersham Corporation).

Transfektio ja Plasmidit

293-solut transfektoitiin käyttäen N, N-bis- (2-hydroksietyyli) -2amino -ethanesulphonic happo-puskuroitu salinr (BBS) versio kalsiumfosfaatti menettelyä [31], kun taas RKO ja HCT116 transfektoitiin käyttämällä kationista polymeeriä LipofectAMINEPLUS menetelmä (Invitrogen), mukaan valmistajan ohjeen. Määrä plasmidi-DNA tasataan kukin näyte täydentämällä tyhjällä vektorilla, ja transfektion tehokkuutta visualisoitiin käyttämällä kotransfektoitiin GFP-ekspressiovektoriin. Ekspressioplasmidit käytettiin: hallitseva negatiivinen muoto HIF-1α ilman DNA: ta sitovan domeenin ja transaktivaatiodomeenin (pCEP4-HIF-1α-DN) [32] (ystävällisesti BH Jiang Nanjing Medical University, Kiina), HIF-1α ekspressiovektori (ystävällisesti A. Farsetti, National Research Council, Rooma, Italia) ja HA-VHL ekspressiovektoriin (ystävällisesti WK Rathmell, University of North Caroline at Chapel Hill, USA).

RNA-interferenssi

Solut maljattiin semiconfluence 35 mm annoksia päivää ennen transfektiota. Ohjaus-siRNA ja erityinen siHIF-1α (Dharmacon), tai pSUPER-HIPK2 ja ohjaus pSuper vektorit [29] transfektoitiin yön yli käyttäen LipofectAMINEPLUS reagenssia (Invitrogen). 36 h myöhemmin soluja käsiteltiin 100 uM ZnCl

2: ssa 24 tuntia. Transfektiotehokkuuden visualisoitiin käyttämällä kotransfektoitiin GFP ekspressiovektoriin fluoresenssimikroskoopilla. Tehokkuutta pudotus varmistettiin RT-PCR-analyysillä.

ELISA-määritys

Soluja kasvatettiin alakonfluenssista 60 mm petrimaljoille viljeltiin 24 h 0,5% FBS: ää, ennen kuin lisättiin tuoretta elatusainetta, jossa oli 10 % helmikuu tai ilman COX-2 selektiivinen NS-398 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) 50 nM: ssa 24 h tai 100 uM ZnCl

2 24 h. PGE

2 ja VEGF havaitseminen solun väliaine määritettiin kolmena kappaleena entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) käyttäen, vastaavasti, prostaglandiini E2 EIA Kit (Cayman Chemical) ja Quantikine ihmisen VEGF immunomääritys Kit (R D Systems, Minneapolis, MN), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. PGE

2 ja VEGF tasot normalisoituivat solujen määrä ja ilmaistiin pg /10

6 solua /ml.

IL-10 tuotantoa DC, väliaine päässä siRNA ohjaus ja siHIPK2 köyhdytettyä solujen käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 100 uM ZnCl

2: ssa 24 tuntia, lisättiin DC kulttuurin 96-kuoppaisilla levyillä, 1/1 (tilavuus /tilavuus) kanssa väliaineessa, joka sisälsi IL-4 ja GM-CSF: n, 24 h. Afterword, TNF-α lisättiin 48 h DC kypsymistä. IL-10: n tuotantoa, jonka DC määritettiin sen jälkeen ELISA: lla käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevia reagensseja ja standardit (RayBiotech, Inc.). Supernatantit lisättiin kahtena sopiviin ennalta päällystetyille levyille. Sen jälkeen, kun levyt pestiin, piparjuuriperoksidaasi-konjugoitu toteamisvasta-ainetta lisättiin. Käytetty substraatti värin kehitys oli tetrametyylibentsidiini (TMB). Optinen tiheys mitattiin 450 nm mikrolevylukijalla (Multiskan Ex, Thermo Labsystem). Pienin havaitseminen annoksen IL-10 on tyypillisesti alle 1 pg /ml.

Generation of monosyyttien dendriittisoluja (DC) ja DC Kypsytys

tuottaa monosyyteistä johdettujen DC, ihmisen perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC), joka on saatu terveiltä luovuttajilta (alle tietoinen suostumus) eristettiin Fycoll-Paque-gradienttisentrifugoinnilla (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) buffy coats. CD14 + monosyyttejä valittiin positiivisesti käyttäen anti-CD14 MAb-konjugoitua magneettinen mikrohelmien (Miltenyi Biotec, Auburn, Kalifornia, USA). Puhdistettu monosyyttejä viljeltiin tiheydellä 10

6 solua /3 ml 12-kuoppaisilla levyillä 6 päivän ajan RPMI 1640: ssä (Euroclone), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliini G, 100 mg /ml streptomysiiniä ja rekombinantin ihmisen granulosyytti-makrofagi-pesäkkeitä stimuloivan tekijän (GM-CSF, 50 ng /ml) ja interleukiini-4 (IL-4, 20 ng /ml) (Miltenyi Biotec) tuottaa epäkypsät DC: (IDC). Sytokiinit täydennetään joka toinen päivä yhdessä 20% tuoretta alustaa. IDC aktivointi, ihmisen rekombinantti-TNF-α (20 ng /ml; Miltenyi Biotec) lisättiin päivänä 6 48 h indusoimaan DC kypsymisen.

analyysi DC fenotyypin virtaussytometrialla

puhdistettu monosyyttejä viljeltiin 6 päivän ajan GM-CSF: n ja IL-4, kanssa tai ilman 20% (tilavuus /tilavuus) vakioidun alustan (CM) syöpäsolujen käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 100 uM sinkkiä 24 h tai monoklonaalisia anti- VEGF-vasta-aine (R 0,05) tai 1% (p 0,01).

(A) HIPK2 ja COX-2-geenin ilmentymisen profiili ensisijainen kasvaimia.

rasiakuvaajien

edustavat HIPK2 (

vasen paneeli

) ja COX-2 (

oikea paneeli

) mRNA-tasot yksilöillä 1) paksusuolen, 2) peräsuoleen ja 3 ) paksusuolen adenokarsinooma ensisijainen kasvaimia. * P 0,001. (B) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit HIPK2 ja COX-2-geenin ilmentymisen RKO soluissa stabiilisti häirinnyt varten HIPK2 toiminto (siHIPK2) tai ei-kohde-RNA-interferenssi (siRNA). 28S käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) edustaja RT-PCR-analyysi HCT116-soluja, jotka on transfektoitu pSuper-HIPK2 (siHIPK2) tai pSuper ohjaus (siRNA) vektori 48 tuntia. 28S käytettiin sisäisenä kontrollina. (D, vasen paneeli) edustaja RT-PCR-analyysit MCF7-indsi /HIPK2 soluja käsiteltiin Dox (DOX +) 5 päivää (for HIPK2 Knockdown) ja sitten kasvatettiin ilman Dox (DOX-) vielä 5 päivää (for HIPK2 talteenotto) . (D, oikea paneeli) densitometrinen analyysi HIPK2 ja COX-2 tasot (kuten vasen paneeli) suoritettiin ja normalisoitu arvoja 28S mRNA piirrettiin. * P = 0,001. (E) Yhteensä solu otteita RKOsiHIPK2 ja ohjaus siRNA-solut analysoitiin Western immunoblottaus arvioida COX-2-proteiinin tasot. β-aktiini käytettiin proteiini latauskontrollina.

Tulokset ja keskustelu

käänteinen korrelaatio Matala HIPK2 ja High COX-2 eksressoitumistasojen syöpäsoluissa

saada tietoa

in vivo

suhde COX-2 ja HIPK2 teimme

in-silico

koekspressoimalla analyysi verrataan erilaisia ​​microarray tutkimuksia eri normaalin ja kasvaimen paksusuolen kudokset Oncomine integroidun syöpä tietokanta tutkimus työkalu (https://www.oncomine.org). Analyysit tietokokonaisuuksien saatu yksilöitä normaaleista kudoksista ja ensisijainen paksusuolen adenokarsinoomien paljasti käänteinen korrelaatio HIPK2 ja COX-2: n ilmentymisen. Siten HIPK2 ilme oli korkea normaaleissa kudoksissa ja vähensi paksusuolen adenokarsinooman, kun taas COX-2: n ilmentymisen oli alhainen normaaleissa kudoksissa ja merkittävästi lisääntynyt paksusuolen adenokarsinooman (Fig. 1A). Seuraavaksi me yritettiin tutkia HIPK2 ollut merkitystä COX-2 sääntelyä. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, lisääntynyt COX-2: n ilmentymisen tasoja havaittiin RKO koolonkarsinoomasoluissa stabiilisti puuttua varten HIPK2 toiminto (siHIPK2) [29], verrattuna kontrolliin siRNA soluihin. Samanlaisia ​​käänteinen korrelaatio alhainen HIPK2 ja korkea COX-2 tasot löydettiin HCT116 koolonkarsinoomasoluissa käynnissä ohimenevä HIPK2 loppuminen siRNA (Fig. 1 C), mikä rooli HIPK2 COX-2 mRNA: n ekspressio syöpäsoluissa. Edelleen vahvistaa tämän havainnon, otimme etuna Dox-indusoituvan MCF7 rintasyövän soluja (MCF7indsi /HIPK2), jossa Dox hoito indusoi HIPK2 downregulation [30], saaminen olennaisesti samanlaisia ​​tuloksia. Siten Dox hoito (Dox +) alennetaan HIPK2 mRNA ilmaisu, joka korreloi merkitsevästi COX-2 säätelyä, kuten myös osoituksena densitometrinen analyysi (Fig. 1 D). Sen jälkeen, palautuminen HIPK2 ehtyminen mukaan Dox poisto (Dox -), palautti COX-2-geenin ilmentymisen tasoa samoin lähtöaineena COX-2 tasot ohjaus solujen, kuten myös käy ilmi densitometrisellä analyysejä (Fig. 1 D). Seuraavaksi Western immunoblottaus osoittivat lisääntynyttä COX-2-proteiinin tasot RKO HIPK2 vaje solujen verrattuna ohjata siRNA soluihin (Fig. 1 E). Nämä tulokset osoittavat, että ensimmäistä kertaa, käänteinen korrelaatio HIPK2 ja COX-2: n ilmentymisen paksusuolen syövän soluissa, jotka oli kiehtovan vahvistettiin koettamalla Oncomine aineisto normaalin ja terveisiin kudoksiin, mikä osoittaa, että tämä saattaa olla tyypillinen syöpä allekirjoitus. Lisäksi vaikutus COX-2 säätelyyn ylöspäin rintasyövän soluissa HIPK2 esto voidaan myös ottaa huomioon.

(A) edustaja RT-PCR-analyysit ohjaus RKO-siRNA ja RKO-siHIPK2 jotka oli transfektoitu HIF -1α hallitseva negatiivinen (HIF-1αDN) 36 tuntia. COX-2: n ja VEGF-mRNA-tasot on esitetty. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (B) RT-PCR-analyysit RKO-siHIPK2 solut transfektoitiin erityisiä siRNA ja HIF-1α pudotus tai kontrolli-siRNA. Transfektion jälkeen uutettiin kokonais-RNA ja RT-PCR suoritettiin arvioimaan HIF-1α, COX-2: n ja VEGF ekspressiotasot. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Yksi edustava koe kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. (C, vasen paneeli) RT-PCR-analyysit RKO-siHIPK2 transfektoitujen solujen VHL ekspressiovektorilla (+) tai tyhjällä vektorilla (-). Transfektion jälkeen uutettiin kokonais-RNA ja RT-PCR suoritettiin arvioimaan COX-2: n ja VEGF ekspressiotasot. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (C, oikea paneeli) densitometrinen analyysi COX-2 ja VEGF tasot (kuten vasen paneeli) suoritettiin ja normalisoidut arvot ß-aktiini mRNA piirrettiin. * P = 0,001. (D) 293-solut transfektoitiin HIF-1α-ekspressiovektoriin (+) tai tyhjällä vektorilla (-). Transfektion jälkeen uutettiin kokonais-RNA ja RT-PCR suoritettiin arvioimaan HIF-1α, COX-2: n ja VEGF ekspressiotasot. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Yksi edustava koe kolmen erillisen kokeen näytettiin.

Enhancement COX-2 Expression in HIPK2 Knockdown Cells kautta HIF-1α

Yksi mekanismeista, jotka parantavat COX-2-transkription on kautta HIF-1 toimintaa [20]. HIPK2 Knockdown indusoi HIF-1 aktiivisuutta, nähdään lisääntynyt VEGF-geenin transkription ja angiogeneesiä, jota derepressoivissa HIF-1α promoottori transkription [6]. Jotta voidaan tutkia, jos HIF-1α on mukana COX-2: n ilmentymisen, useita geneettisiä lähestymistapoja tehtiin. RKO stabiilisti puuttui varten HIPK2 toiminto (siHIPK2) olivat pääasiassa käytetty ja transfektion tehokkuutta seurattiin käyttämällä ko-transfektoitiin GFP-vektorilla koko kokeissa. Tutkia vaikutuksen HIF-1α on COX-2-geenin transkription, ensin suorittaa menettämisestä toiminnon kokeita vallitsevaa negatiivista HIF-1α (HIF-1αDN) rakentamiseksi ilman DNA: ta sitovan ja transaktivaatiodomeenin joka estää HIF-1 aktiivisuus [32]. RT-PCR-analyysi osoitti, että HIF-1αDN ilmentymisen merkittävästi vähensivät COX-2 in RKO-siHIPK2 solut (Fig. 2A), mikä viittaa siihen, HIF-1 transkriptiosta riippuvan COX-2-asetus. Tämä vaikutus yhteydessä järjestettiin yksi havaittu HIF-1 kohdegeenin VEGF (Fig. 2A). Sitten, HIF-1α ehtyminen RKO-siHIPK2 solujen erityisten siRNA häiriö osoitti, että HIF-1α downregulation voimakkaasti esti sekä COX-2: n ja VEGF-geenin ilmentymisen (Fig. 2B). Ylimääräisenä lähestymistapa inhiboida HIF-1: n aktiivisuuden, me yli-ilmentää von Hippel-Lindaun (VHL) proteiinia, joka on osoitettu estävän HIF-1: n aktiivisuuden kohdistamalla HIF-1α varten proteasomaalisten hajoamiseen [33]. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, VHL yli-ilmentyminen in RKO-siHIPK2 solujen aiheuttama tehokas COX-2 sekä VEGF downregulation, mistä on osoituksena densitometrisellä analyysejä. Lopuksi, edelleen vahvistaa vaikutuksen HIF-1: COX-2-asetus, transfektoimme HIF-1α ekspressiovektori 293-soluissa noudattaen, että oli merkittävä parannus sekä COX-2: n ja VEGF-mRNA: n ilmentymisen, verrattuna kontrollisoluihin (kuvio . 2D). Yhdessä nämä tulokset antavat vahvaa näyttöä siitä, että COX-2 ylösajon jälkeen HIPK2-knockdovvn, riippui, al ainakin osittain, HIF-1 aktiivisuutta vahvisti vaikutusta havaittu HIF-1- kohdegeenin VEGF.

(A) 293-solut transfektoitiin HIF-1α-ekspressiovektoriin (+) tai tyhjällä vektorilla (-). HIF-1α-transfektoituja soluja käsiteltiin ZnCl

2 (100 uM). 24 h käsittelyn jälkeen, solut kerättiin jaettu kahteen sekä RNA: n ja proteiinin analyysit. RT-PCR suoritettiin arvioimaan COX-2: n ja VEGF ekspressiotasot (ylempi paneeli). 28S käytettiin sisäisenä kontrollina. Yhteensä solu uutteet analysoitiin immunoblottauksella (I.B.) arvioimaan HIF-1α-proteiinin tasot. L.C. (Lastaus kontrolli). (B) RKO-siHIPK2 soluja käsiteltiin ZnCl

2 (100 uM) 24 tuntia. Transfektion jälkeen uutettiin kokonais-RNA ja RT-PCR suoritettiin arvioimaan COX-2: n ja VEGF ekspressiotasot. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Yksi edustava koe kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. (C) kokonaismäärä solu-uutteista peräisin RKOsiHIPK2 käsittelemättömän tai käsitelty ZnCI

2 (100 uM) 24 tunnin ajan, analysoitiin Western immunoblottaus arvioida COX-2-proteiinin tasot. β-aktiini käytettiin proteiini latauskontrollina.

Sinkki Downregulates COX-2 ekspressiotasot HIPK2 Depleted Solut

aiemmin osoittaneet, että sinkki-ionit lisäravinteen konstitutiivisesti hypoksisiin eturauhasen syöpäsolujen tai angiogeenisissä glioblastoomasoluissa downregulates HIF-1α ilmaisua siten estämällä HIF-1 toimintaa [8]. Tämä havainto oli seuraava oikeaksi genomin laajuinen analyysejä, joissa sinkki todellakin ehkäisee geeniekspressioprofiilien aiheuttama hypoksia-aktivoitu HIF-1 [34]. Täällä ensimmäinen yli-ilmentynyt HIF-1α 293-soluissa ja analysoitiin-mRNA-tasojen semikvantitatiivinen RT-PCR ennen ja jälkeen sinkin. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, HIF-1-indusoidun COX-2: n ja VEGF-geenin ilmentyminen oli tehokkaasti estää sinkin. HIF-1α yli-ilmentymisen ja sen downregulation kun sinkki hoitoja, kuten aiemmin on raportoitu [8], osoitettiin Western immunoblottaus (I.B.) (Fig. 3A, alempi paneeli). Sitten, sinkin ja RKO-siHIPK2 solut osoittivat merkittävästi vähentää sekä COX-2: n ja VEGF-mRNA: n geeni-ilmentymisen RT-PCR-analyysillä (Fig. 3B). Niinpä Western immunoblottaus vahvisti COX-2 downregulation in HIPK2 tyhjentynyt soluissa jälkeen sinkin (Fig. 3C). Huomattavaa on, että meidän käsissämme sinkin (100 uM 24 h) ei vaikuttanut solujen elävyyden (tuloksia ei esitetty). Koska COX-2 on usein yliaktiivista kasvaimia johtaa kasvaimen aggressiivisuus ja huono ennuste [14], kohdistaminen COX-2 voi olla tärkeä saavutus syövän hoidossa. Siten COX-2-estäjät ovat osoittaneet voimakkaita antituumorivaikutukset useissa eri eläinmalleissa paksusuolisyövän; yhteisymmärryksessä, poistetaan COX-2-geenin johtaa huomattavaan vähenemiseen adenooma taakka sekä pieniä ja paksusuolen

APC

Δ716

mutanttihiiriltä ja

APC

min

hiirissä [35]. Kuitenkin selektiiviset COX-2-estäjät ovat osoittautuneet erittäin tehokkaasti ehkäistä polyyppi toistuminen, siihen liittyviä haitallisia kardiovaskulaarisia sivuvaikutuksia nämä lääkkeet voivat vaikuttaa sopiva satunnaistetussa kliinisessä tutkimuksessa [36], [37]. Siksi on pakko kehittää uusia lähestymistapoja kohdistaa COX-2-toiminto. Tässä suhteessa, käyttö sinkki vähen- tämisessä HIF-1-indusoidun COX-2: n ilmentymisen voi edustaa mielenkiintoinen lähtökohta voittamiseksi haittavaikutuksia ainakin tiettyjä COX-2-estäjät; Lisäksi toimimalla HIF-1 aktiivisuutta sinkki voi vaikuttaa useisiin toisiinsa signalointireitteihin. Lopuksi, onko sinkki saattaa estää COX-2 on myös itsenäisesti HIF-1 on edelleen selvittämättä.

(A) PGE

2 tuotanto tutkittiin ELISA: lla RKO-siRNA säätökennoja jätetään hoitamatta ja HIPK2 köyhdytettyä solut (siHIPK2) ennen ja jälkeen ZnCl

2 hoitoa (100 uM 24 tuntia) ja sen jälkeen käsittelemällä COX-2-spesifinen estäjä NS-398 (50 nM) 24 tuntia. PGE

2 tuotanto piirrettiin pg /10

6 solua. Pylväät, keskiarvo kaksi erillistä koetta suoritettiin kaksinkertaisina, ± S.D. * P 0,001. (B) Yhteensä solu otteita RKO-siRNA säätökennoja hoitamattomana ja HIPK2 köyhdytettyä soluja (siHIPK2) ennen ja jälkeen ZnCl

2 hoitoa (100 uM 24 h) analysoitiin Western immunoblottauksella arvioida COX-2, β- kateniinin, ja sykliini D1-proteiinin tasoja. β-aktiini käytettiin proteiini latauskontrollina. (C) VEGF tuotanto määritettiin ELISA: lla RKO-siRNA ohjaus soluissa ja HIPK2 köyhdytettyä soluissa (siHIPK2) ennen ja jälkeen ZnCl

2 hoitoa (100 uM 24 tuntia). VEGF tuotantoa piirrettiin pg /10

6 solua. Pylväät, keskiarvo kaksi erillistä koetta suoritettiin kaksinkertaisina, ± S.D. * P 0,001.

Sinkki Estää PGE

2 signaalireaktioteissä HIPK2-köyhdytettyä Cells

Todettuaan, että sinkki voi downregulate COX-2 tasot HIPK2 tyhjentynyt soluissa, me seuraava pyrittiin arvioimaan PGE

2 modulaatio. ELISA-määrityksessä osoitti, että kyseessä oleva osa PGE

2 tuottama HIPK2 depletoiduista verrattuna hallita soluihin, kuten aiemmin on raportoitu [10], oli merkitsevästi inhiboi sinkkilisän (Fig. 4A). Mielenkiintoista on, että sinkki-indusoitua PGE

2 inhibitio oli yhtä tehokas kuin erityiset COX-2-estäjän NS-398 (Fig. 4A). Yhteisymmärryksessä, Länsi immunoblottaus osoitti vahvaa väheneminen COX-2-proteiinin tasot jälkeen sinkin (Fig. 4B), kuten on raportoitu edellä. Lisäksi parantaakseen β-kateniinin ja sen kohde-sykliini D1 HIPK2 köyhdytettyä soluissa, kuten aiemmin on raportoitu [3], [4], jotka inhiboivat merkittävästi sinkin (Fig. 4B), joka samansuuntainen edellä PGE

2-estoon. Tämä on mielenkiintoinen korrelaatio, koska PGE

2 on osoitettu aktivoivan β-kateniinin, kuten transkriptiotekijän indusoivan useiden geenien ekspression, mukaan lukien COX-2 ja sykliini D1, muodostetaan positiivinen itsesäätelydomeenin silmukan, joka suosii kasvaimen etenemistä [12 ], [38].

(A) valomikroskoopilla osoittaa ohjaus eriytetty DC (Mock, paneeli 1) ja eston eriytetty DC morfologian läsnäollessa CM siRNA ohjaus (paneeli 2) tai HIPK2 köyhdytettyä soluja ( siHIPK2) (paneeli 3); Tämä esto ei tapahdu ainoastaan ​​silloin DC jossa viljeltiin CM sinkki-käsiteltyjen siHIPK2-CM (paneeli 5) verrattuna CM sinkki-käsiteltyjen siRNA säätökennoja (paneeli 4). Yksi edustava koe kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. Mikrovalokuva suurennus, 10 ×. (B) analyysi pinnan DC kypsymisen markkereita, CD80 ja CD86, käyttämällä virtaussytometria. DC Mock: ohjata kypsillä DC; DC + siRNA-CM: DC kypsymisen, kun läsnä on CM siRNA kontrollisolujen; Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.