Krooninen sairaus

tiivistelmä

Maailmanlaajuinen geeni säädin Special AT-rikas sekvenssi-sitova proteiini-1 (SATB1) on raportoitu aiheuttavan EMT kaltaisia muutoksia ja olla yhteydessä huonoon kliiniseen tulokseen useassa syöpiä. Tutkimuksen tavoitteena on arvioida SATB1 vaikuttaa biologista käyttäytymistä virtsarakon siirtymäkauden cell carcinoma (BTCC) ja edelleen selventää, jos tämä vaikutus toimii kautta epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) kautta. Ilmentymisen SATB1, E-kadheriinin (epiteelin markkerit), vimentiinistä (mesenkymaaliset markkereita) in BTCC kudoksissa ja viereisten noncancerous kudoksissa, samoin kuin kahden solulinjan virtsarakon syöpään tutkittiin. Onko SATB1 ilmentyminen liittyy kliinis tekijöiden tai ei analysoitiin tilastollisesti. Soluinvaasiota ja muuttoliike, solusyklin, soluproliferaatiota ja apoptoosin arvioitiin SATB1 Knockdown ja ilmentynyt solulinjoissa. Tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen SATB1 oli huomattavan säädelty sekä BTCC kudoksissa ja virtsarakon syövän solulinjoissa korkean potentiaalin etäpesäke. Tulokset liittyy myös EMT markkereita ja huono ennuste BTCC potilaista. Lisäksi SATB1 aiheuttama EMT prosesseja downregulation E-kadheriinin, säätelyä E-kadheriinin repressors (Etana, etana ja vimentiinistä). SATB1 edistetään myös solusyklin etenemisen, soluproliferaatiota, solun invaasiota ja solujen vaeltaminen, mutta ei muuttanut solujen eloonjäämistä. Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että SATB1 keskeinen rooli etenemisessä virtsarakon syövän säätelemällä säätelevien geenien EMT prosesseja. Edelleen, se voi olla uusi terapeuttinen kohde aggressiivinen virtsarakon syöpä.

Citation: Wan F, Cheng C, Wang Z, Xiao X, Zeng H, Xing S, et ai. (2015) SATB1 Yliekspressio Säätelee kehittymistä ja etenemistä in Virtsarakon syövän kautta EMT. PLoS ONE 10 (2): e0117518. doi: 10,1371 /journal.pone.0117518

Academic Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 07 elokuu 2014; Hyväksytty: 26 joulukuu 2014; Julkaistu: 23 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Wan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: kirjoittajat saanut mitään erityistä rahoitusta tähän työhön.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

virtsarakon syöpä (BC) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia, jotka vaikuttavat limakalvon virtsarakon, arviolta 386300 uutta tapausta ja 150200 kuolemantapausta taudista maailmanlaajuisesti vuodessa [1]. Kiinassa se on raportoitu, että BC on yleisin urogenitaalinen maligniteetti, ja esiintyvyys tämän taudin on kasvanut viime vuosikymmeninä [2]. Koska suuri paikallinen kasvaimen uusiutumisen, etenemisen ja etäinen etäpesäkkeitä, huono kliinisistä tuloksista on esitetty BC potilaille huolimatta huomattavia parannuksia kirurgisten tekniikoiden ja adjuvantti hoitojen [3-6]. Samaan aikaan monimutkaisia ​​polkuja aikana onkogeneesiin ja arvaamaton biologista käyttäytymistä syövän tunnetaan edelleen huonosti ja vaikuttavat ympäristö- ja geneettiset tekijät [7]. Siksi tunnistaminen romaani molekyylimarkkereiden jotka voisivat toimia vakiona ennustetekijöiksi tarvitaan varhaista diagnosointia ja kehittämään tehokkaamman hoidon BC potilaille.

On ollut yleisesti tunnettua, että huonon ennusteen pahanlaatuisten kasvainten liittyy kasvain aggressiivisuus. Tämä tapahtuu, kun invasiivisen solut tulevat invasiivisia läpi useita metastaattinen vaiheita, kuten epiteelisolujen menettää napaisuus ja edelleen tunkeutuvat verisuonten ja imusuonten osastot [8]. Epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) on keskeinen prosessi, joka alun perin tapahtuu kriittisten vaiheiden aikana alkion kehityksen, jossa solut menettävät epiteelisolujen ominaisuuksia ja solu-solu kontakteja, ja samanaikaisesti hankkia muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia mesenkyymisolujen [9-11]. Lisäksi vastaavia EMT kaltaisia ​​prosesseja voisi tapahtua syövän etenemisen karsinoomien ja on edistää merkitystä estää apoptoosin ja vanhenemista kasvainsolujen, edistää immunosuppressio [12]. Menetys E-kadheriinin ilmentymisen on tunnusmerkki EMT prosessin [9]. Jälleen viime tutkimuksissa, transkriptiotekijöitä kuten Snail ja Slug on tunnistettu suoraan repressoreina E-kadheriinin ja induktorien EMT, mikä edelleen saa aikaan täydellisen EMTs sekä morfologisia ja käyttäytymisen tasolla, kun yli-ilmennetään epiteelisolujen [13-15] . Lisäksi yhä enemmän todisteita viittaa siihen, että EMT on keskeinen rooli aloittamisen ja kehittämisen etäpesäkkeiden aikana kasvaimen invaasion ja etenemisen virtsarakon syövän

in vivo

ja

in vitro

[16 -18].

Special AT-rikas sitova proteiini 1 (SATB1) on ydin- matriisikiinnitysalueet alue (MAR) DNA-sitovan proteiinin, joka toimii genomin järjestäjä ja geeni säädin kautta moduloimalla avaruudellinen konformaatio chromatin. Se osallistuu myös erilaisia ​​biologisesti tärkeitä prosesseja, kuten proliferaatiota, erilaistumista, apoptoosin ja uudelleenohjelmointi ekspressioprofiileja [19-21]. Viimeaikaisissa tutkimuksissa, ylössäätelyyn SATB1 on todettu korreloivan ja metastaasit monenlaisten malignances, mukaan lukien maha-, rintasyöpä, peräsuolen syövän, maksasyövän, ja eturauhassyöpää. Nämä havainnot viittaavat siihen, että SATB1 on itsenäinen ennustetekijä ja potentiaalinen terapeuttinen kohde ihmisen syövissä [21-26]. Esimerkiksi Han et al havaitsivat, että SATB1 ehtyminen voisi kääntää EMT prosessin kautta alas-säätely E-kadheriinin repressors kuten Snail ja SIPI ja säätelyä E-kadheriinin erittäin aggressiivinen (MDA-MB-231) syöpäsolut [21] . Toinen tutkimus kertoo, että kemoterapeuttisen tukahduttaminen miR-448 lisää mRNA tasot SATB1 ja edistää EMT. Näiden havaintojen perusteella mahdollisia uusia terapeuttisia lähestymistapoja virtsarakon syöpään.

Vaikka transitionaalista rakkosolukarsinoomaa (BTCC) on yksi yleisimmistä alatyyppejä BC, nykyinen tietämys erityinen mekanismi BTCC invaasio ja etäpesäkkeiden on edelleen rajallinen. Eräässä tuoreessa tutkimuksessa, Bin Han et al havaitsivat, että SATB1 yliekspressoitui ihmisen virtsarakon syöpään ja liittyy kasvaimen ja vaihe. Lisäksi he havaitsivat myös, että SATB1 ehtyminen laski solujen lisääntymisen ja lisääntynyt solujen apoptoosin 5637 ja T24-solujen [27]. Kuitenkin miten ilmaus SATB1 vaikuttaa biologiseen käyttäytymiseen BTCC ja onko SATB1 indusoi EMT virtsarakon syöpä on edelleen tutkimaton. Tässä tutkimuksessa arvioimme ilmaus SATB1 vuonna BTCC yksilöiden ja virtsarakon syövän solulinjoissa kuitenkin immunohistokemiallisella värjäyksellä, Real-Time RT-PCR-määrityksissä ja western blotting-analyysi ja totesi, että sen ilmentyminen korreloi kliinisesti patologinen ominaisuudet. Vuonna perustettu ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa, olemme edelleen osoittaneet, että yli-ilmentynyt tai vaiennettu SATB1 säädellään solun muuttoliike, invaasiota ja leviämisen sekä solusyklin.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Ensisijainen virtsarakkosyöpänäytteiden ja sovitettu ei-syöpäkudokset saatiin 126 potilasta (keski-ikä 65,2 vuotta, vaihteluväli 45-78) diagnosoitiin virtsarakon syöpä, joille tehtiin kirurginen resektio immunohistokemiallista määrityksiä Union Hospital Department of Urology (Wuhan , Kiina) huhtikuusta 2007 lokakuussa 2012. osia kudosnäytteet kiinnitettiin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Kaikki potilaat eivät saaneet ennen leikkausta hoitoa, kuten kemoterapiaa tai sädehoitoa. Kaikki osallistujat, jos niiden kirjallinen suostumus osallistua tähän tutkimukseen, ja hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong tiede ja teknologia (HUST). Kliiniset ja patologinen tiedot on saatu retrospektiivinen katsaus hyvin dokumentoituja potilastietoja. Kasvaimet luokiteltiin histologisesti ei-lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC) (vaihe PTA) tai lihakseen invasiivisia virtsarakon syöpä (MIBC) (vaihe pT3) mukaan kasvaimeen solmut-etäpesäkkeitä (TNM) luokitus vaiheessa [28]. Grade määrättiin mukaan Maailman terveysjärjestön luokittelu kasvaimia virtsateiden ja mies sukuelinten (2004) [28]. Kaikki kuolemat johtuivat virtsarakon syöpään. Potilaiden ominaisuudet esitetään taulukossa 1. Ihmisen virtsarakon syövän solulinjat BIU-87 ja T24 pidettiin laboratoriossamme (Central laboratorio Union Hospital, Tongji Medical College, HUST, Wuhan, Kiina). BIU-87-soluja, jotka ovat peräisin II-luokan, ei-lihas-invasiivisen (pT1) ihmisen BTCC virtsarakon. T24 soluja, jotka ovat huonosti eriytetty ja niillä on suurempi potentiaali etäpesäkkeiden ja näyttää tyypillisen fibroblastisia morfologia mikroskoopilla olivat peräisin luokan III rakkosyöpä- [29]. Soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja 100 ug /ml penisilliiniä-streptomysiiniä (Gibco, Carlsbad, CA, USA), ja niitä inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

immunohistokemiallinen värjäys analyysi

proteiinin ilmentyminen määritettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä SATB1, E-caderin ja vimentiinin kanssa streptavidiini biotiini-peroksidaasi-kompleksin menetelmä, jossa käytetään SABC sarjat (Boster Ltd Wuhan, Kiina) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, kudosnäytteet kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin, kuivattu ja upotettiin parafiiniin. Sitten osat poistettiin parafiini ja nesteytyksestä. Vetyperoksidia käytettiin endogeenisen peroksi- din blokkaamiseksi aktiivisuus 10 min. Sen jälkeen, kun antigeeni haku käyttämällä mikroaaltouuni, leikkeet käsiteltiin 10% normaalia vuohen seerumia 10 minuuttia huoneenlämpötilassa vähentää ei-spesifisen sitoutumisen kapasiteettia. Sitten leikkeitä inkuboitiin kanin polyklonaalisen vasta-aineen SATB1, E-caderin ja vimentiinin (Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) laimennus 1:70. Nämä jätettiin kosteutetussa kammiossa yön yli 4 ° C: ssa. Kun oli pesty kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), 5 min jokaisen kerran, leikkeitä inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen kanssa 40 minuutin ajan ja sitten streptavidiini biotiini-peroksidaasi-kompleksin 40 minuuttia 37 ° C: ssa. Huuhtelun jälkeen, diaminobentsidiiniä (DAB; Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) käytettiin kromogeenina ja leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Näytteet inkuboitiin PBS: llä sijasta primaarisen vasta-aineen toimi negatiivisena kontrollina. SATB1staining ydin- määriteltiin havaittavan immunoreaktioita ja E-caderin ja vimentiinista värjäytymistä plasmalemma tai sytoplasmassa määriteltiin havaittavan immunoreaktioita. Positiivinen värjäytyminen pisteytettiin perustuu intensiteetti ja prosenttiosuus solujen SATB1 tumavärjäystä. Mukaan hallitseva intensiteettiä, värjäyksen voimakkuus oli merkitty jakautuu seuraavasti: pisteet 0, negatiivinen tumavärjäystä kaikkien kasvainsolujen; pisteet 1, heikko tumavärjäystä; pisteet 2, kohtalainen tumavärjäystä; Pisteet: 3, vahva tumavärjäystä. Mukaan prosenttiosuus positiivisesti värjättyä solua, pisteet värjäytymisen tiheys annettiin seuraavasti: 0, alle 5%; 1, 5-25%; 2, 25-50%; 3, enemmän kuin 50%. Lopullinen pistemäärä laskettiin lisäämällä kahden edellä tulokset. Kymmeniä 0-2 määriteltiin alhainen ilmaisun tulokset, ja 3-6 määriteltiin huipputuloksia.

RNA ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-määrityksissä

Kokonais-RNA eristettiin ja puhdistettiin kunkin kudoksen näyte, ja solulinjoja käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen käänteistranskriptio (Takara Biotechnology Dalian, Kiina) ja seuraavat edellytykset: käänteistranskriptio 37 ° C: ssa 25 min, mitä seurasi inkubointi 85 ° C: ssa 5 sekuntia 20 ul: ssa reaktion tilavuudesta. Sitten cDNA valmistettiin ja sitä käytettiin templaattina kvantitatiivista reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PT-PCR) suoritettiin ABI StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) käyttämällä SYBR Green Real- PCR Master Mix (Takara Clontech, Kioto, Japani). Tämä tehtiin seuraavissa olosuhteissa: denaturaatio 95 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, minkä jälkeen 40 monistussykliä (95 ° C 5 sekunnin ajan, 60 ° C 30 sekunnin ajan). Alukkeet suunniteltiin käyttäen NCBI Primer-BLAST seuraavasti: SATB1 (eteenpäin, 5′-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 ’; taaksepäin, 5′-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3′), E-kadheriinin (eteenpäin, 5’-CTG GACGCTCGGCCTGAAGT-3 ’; käänteinen , 5’-GGGTCAGTATCAGCCGCTTT-3 ’), vimentiinin (eteenpäin, 5′-ACAGGCTTTAG CGAGTTATT-3′; taaksepäin, 5’-GGGCTCCTAGCGGTTTAG-3 ’), Twist (eteenpäin, 5’CAGCGCACCCAGTCGCTGAA-3’; taaksepäin, 5 ’ -CCAGGCCCCCTCCATCCTCC-3 ’), Snail (eteenpäin, 5′-ATCCGAAGCCACACGCTGCC-3′; taaksepäin, 5’-CACGGCTGCAGTGGGGACAG-3 ’), Slug (eteenpäin, 5′-CGCTCCTTCCTGGTCAAGA-3′; taaksepäin, 5’-TTGCGTCACTCAGTGTGC-3 ’), ZEB1: (eteenpäin, 5′-TGCTCCCTGTGCAGTTACACCTT-3′; taaksepäin, 5’-CCAGACTGCGTCACATGTCTTTGA-3 ’), ZEB2: (eteenpäin, 5′-ATACCGCGGTGCCATCCTTGTACAGTGGTT-3′; taaksepäin, 5’-GCGCTGCAGAGTAATTGGAAAAAAACAAA-3 ’) GAPDH (eteenpäin, 5’-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ’; taaksepäin, 5′-TGCCATGGGTGGAATCATATTGGA-3’). Alukkeet suunniteltiin olevan introni-ulottuu. Sykli kynnys (CT) arvoja standardoitu CT arvoja GAPDH. Suhteelliset tasot yksittäisten mRNA kunkin näytteen transkriptio verrattuna kontrolliin GAPDH laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä.

Western blotting -analyysi

Yhteensä proteiini uutettiin kustakin kudosnäytteestä ja solulinjasta käyttäen RIPA-puskuria (Sigma, St. Louis, MO, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Proteiinikonsentraatiot määritettiin BCA Protein Assay Kit (Boster Ltd, Wuhan, Kiina). Yhtä suuret määrät on korjattu proteiinin näytteet erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) ja sen jälkeen esto TBST puskurissa, joka koostuu 50 mM Tris (pH 7,6), 150 mM NaCl ja 0,05% Tween täydennetty 5% rasvatonta maitoa 4 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Blotatun kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kaniinin polyklonaalisen vasta-aineen SATB1, E-kadheriinin, vimentiinistä (Abcam Inc., Cambridge, CA, USA) (1: 800), ZEB1, ZEB2, Snail ja Slug (Santa Cruz Biotechnology Inc ., Santa Cruz, CA, USA) (1: 500). Käytimme GAPDH (Boster Ltd Wuhan, Kiina) latauskontrollina. Vasta-aineen sitoutuminen havaittiin käyttämällä peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Boster Ltd, Wuhan, Kiina) vielä 2 tuntia huoneen lämpötilassa mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Immunoreaktiivisia vyöhykkeet visualisoitiin tehostetulla Western-blottauksella tunnistusjärjestelmä ECL (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) ja intensiteetti havaittua juovaa analysoitiin käyttämällä Image J ohjelman.

SATB1-knockdown-soluja

Yksi aiemmin validoitu shRNA käytettiin [21]. Sekvenssi shRNA oli seuraava: 5′-GGATTTGGAAGAGAGTGTC-3 ’. ShRNA syntetisoitiin ja kloonattiin pGenesil2 vektoriin (GenePharma Co., Ltd Shanghai, Kiina) ja transfektoidaan sitten 50% -confluent T24 solulinja yhdessä pGenesil2 ohjaus vektorin käyttäen Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden . Yhdistettiin populaatioiden pudotus solut saatiin kahden viikon kuluttua lääkkeen valinta 400 pg /ml G418: aa, inkuboinnin jälkeen 24 tuntia. Sitten stabiileja RNA-interferenssin-välitteisen SATB1-pudotus solulinjat nimettiin pGenesil2-SATB1-shRNA ja viljeltiin edelleen, että seuraavissa kokeissa. T24-soluja käsiteltiin pGenesil2-salatun-shRNA (5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ’), joka ei ole kohdistettu mitään erityisiä geeniä käytettiin kontrolliryhmiin.

SATB1 yli-ilmentäviä soluja

Ihmisen täyspitkä SATB1 cDNA kloonattiin pcDNA3.1 ekspressiovektoriin ostettu GenePharma Co., Ltd (Shanghai, Kiina). Sen jälkeen, kun varmistettiin DNA-sekvensoinnilla, pcDNA3.1-SATB1 ekspressiovektoriin ja pcDNA3.1 ohjaus vektori transfektoitiin 50% -confluent BIU-87-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 vastaavasti (Invitrogen). Transfektion jälkeen stabiilien solulinjojen valittiin inkubaation jälkeen 600 pg /ml G418: RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia kahden viikon ajan. Nämä viljeltiin sitten myöhemmin kokeita. SATB1 yli-ilmentäviä BIU solut perustettiin ja SATB1 ekspressiotasot esitetty näiden solujen vahvistettiin käyttäen Real-Time RT-PCR-analyysillä. Transfektoimattomista BIU-87-soluja käytettiin kontrolliryhmiin.

Immunofluoresenssianalyysi

määrittää proteiinin solun lokalisointi SATB1 ja E-kadheriinin, immunofluoresenssilla tehtiin käyttäen A1Si laser-skannaus konfokaalimikroskoopilla. Lyhyesti, BIU-87 ja T24-solujen transfektoitiin pcDNA3.1-SATB1 ja pGenesil2-SATB1-shRNA ekspressiovektorit ympättiin lasipeitinlevyille ja laitettiin 24-kuoppaisille levyille. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 min ajan 37 ° C: ssa inkuboinnin jälkeen 3 päivää, ja sitten ne pestiin kahdesti PBS: llä 10 minuutin ajan kutakin. Kiinnitetyt solut läpäiseviksi 0,3% Triton X-100: ssa 15 min, estetty 10% vuohen seerumissa 1 tunti, ja pestiin sitten kahdesti PBS: llä 10 minuutin ajan kutakin. Sitten soluja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen seuraavasti: kanin polyklonaalinen vasta-aine SATB1, ja E-kadheriinin (Abcam Inc., Cambridge, CA, USA) (1:50) 4 ° C: ssa yön, jota seuraa havaitseminen Cy5-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineet ja FITC-leimatun phalloidin (5 ug /ml) (sigma) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. DAPI käytettiin sen jälkeen tahraa ytimiä. Kuvat kerättiin käyttämällä Nikon A1Si laser-skannaus -konfokaalimikroskoopilla (Nikon, Japani).

Solun hyökkäyksen ja muuttoliike määrityksissä in vitro

BIU ja T24cells transfektoitu pcDNA3.1-SATB1 plasmidit, pGenesil2 vektori, joka sisältää SATB1 erityisiä shRNA sekä negatiivisena kontrollina vektori lisättiin ylempään osastoon transwell levyjen 6,5 mm poly-karbonaatti suodattimet ja 8.0μm huokoskoko (Corning Costar, MD, USA). Tämä tehtiin 100 pl seerumittomassa elatusaineessa ja 500 ui RPMI-1640, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solujen invaasio määrityksissä, Transvvell- suodattimen insertit päällystettiin 50 pl: lla Matrigelillä (BD Biosciences, NJ, USA). Kun oli inkuboitu 12 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä, kasvaimen solut, jotka tunkeutui insertin pohjaan kalvon kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin Crystal Violet (Boster Ltd, Wuhan, Kiina) mukaan valmistajan protokollaa. Sitten invasiivisia värjätään solut laskettiin valomikroskoopilla 10 satunnaisesti valittua kentät 200-kertaisella suurennuksella. Solun kulkua määrityksiä, transfektoidut solut ympättiin ylähuoneissa ilman päällystetyn Matrigel. Kun oli inkuboitu 12 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä, siirrettyjä soluja alapuoli suodatintoimiset kiinnitettiin ja värjättiin Crystal Violet, ja sitten laskettiin ja analysoitiin kuten edellä on kuvattu. Kolme rinnakkaista kuopat testattiin määritystä kohti, ja jokainen koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Spektrofotometriä käytettiin mitataan optinen tiheys 560 nm: ssä, ja kyky soluinvaasion laskettiin prosentteina soluja, jotka tunkeutuivat Matrigel-päällystetyt suodattimet.

Solukierron ja leviämisen analysointi

validoimiseksi vaikutuksia SATB1 on solusyklin, virtaussytometrialla käytettiin analyysiin solujen prosenttiosuus kussakin solusyklin vaiheessa sen jälkeen, kun solujen propidiumjodidilla (PI) (Keygentec, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, BIU ja T24 solut suspensoitiin uudelleen jääkylmään PBS: llä ja kiinnitettiin 70% etanolilla jäissä. Sitten kiinteä kuopat värjättiin PI liuosta 30 minuutin ajan, ja analysoitiin virtaussytometrialla.

CCK-8-solujen lisääntymisen määrityksessä (CCK-8 kit; Boster Ltd, Wuhan, Kiina) käytettiin havaitsemaan solun kasvuvauhdin mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, vakiintuneen SATB1-pudotus T24-soluissa ja SATB1 yli-ilmentäviä BIU-87-solujen 4 x 10

3 kuoppaa kohti ympättiin tasapohjaisille 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä. Kvantitoimiseksi solujen elinkelpoisuuden, soluja inkuboitiin CCK-8-liuosta (10 ui /kuoppa) 1,5 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sitten absorbanssiarvot kasvainsolujen mitattiin 450 nm: ssä ilmoitettu ajankohtina käyttäen mikrolevylukijaa (Bio-Rad, Tokio, Japani). Kolme rinnakkaista kuopat testattiin määritystä kohti, ja jokainen koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

apoptoosimäärityksessä

havaita vaikutuksia SATB1 solujen apoptoosiin, virtaussytometrialla suoritettiin analysoida apoptotics nopeudella käyttäen anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Keygentec, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, BIU ja T24-solujen transfektoitiin pcDNA3.1-SATB1 plasmidit ja pGenesil2 vektorilla, joka sisältää SATB1 erityisiä shRNA sekä negatiivisena kontrollina vektori maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä viljeltiin 24 tunnin ajan. Sitten solut (1×10

6) värjättiin anneksiini-V: n ja PI: n ja apoptoottisten solujen määritettiin anneksiini V-FITC apoptoosin havaitseminen pakki ja arvioidaan FACSCalibur väline.

Tilastollinen analyysi

tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Kolme rinnakkaista kuopat testattiin määritystä kohti, ja jokainen koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tilastolliset vertailut ryhmien välillä määritettiin opiskelijan

t

-testi. Cross-pöydän analyysi suoritettiin käyttäen Pearsonin khiin neliö (χ

2) testi tai Fisherin testiä analysoida merkitystä korrelaatioita SATB1 ilmaisun ja kliinis-virtsarakon syöpään. Kaplan-Meier tontteja käytettiin arvioitaessa ennustetekijöiden merkitystä SATB1 on univariate analyysiin. Monimuuttuja-analyysi suoritettiin käyttäen COX suhteellisten riskien testi. Kaikki tiedot analysoitiin SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kaikki tilastolliset testit kaksisuuntaisia ​​ja tilastollinen merkitsevyys oletettiin p 0.05.

Tulokset

SATB1 on säädelty ihmisen BTCC kudoksissa ja virtsarakon syövän solulinja korkea metastaattinen potentiaali

Sen tutkimiseksi, epänormaali ilmentyminen SATB1 liittyy virtsarakon syövän kehittymisen ja etenemisen ja mukana säätelyssä EMT ihmisen virtsarakon syövän, immunohistokemia, reaaliaikainen RT-PCR: llä ja western-blottauksella analyysejä suoritetaan alun perin tunnistaa ilmentymisen SATB1. Lisäksi niitä käytettiin analysoimaan E-kadheriinin ja vimentiinin 126 kudosnäytteistä ihmisen virtsarakon syöpä, joka vastaa vierekkäisten normaaleissa kudoksissa ja virtsarakon syövän solulinjat vastaavasti. Ilmaisu tasot SATB1 ja vimentiinista todettiin olevan merkittävästi säädelty mRNA ja proteiini tasoilla NMIBC ja MIBC kudoksiin verrattuna vastaaviin viereisen hyvänlaatuinen yksilöitä (Fig. 1A ja C; * P 0,05; ** P * P 0,05). Ilmentymistasojen SATB1 RNA: n ja proteiinin olivat merkittävästi korkeammat etäpesäkekasvainten solulinja (T24) kuin ei-metastaattinen kasvaimen solulinja (BIU-87) (Fig. 1A ja C; ** P 0,001), mikä viittaa siihen, SATB1 ilmentyminen liittyi aggressiivisen kasvain fenotyyppejä. Lisäksi ilmaus vimentiinista on silmiinpistävän voimistunut on RNA: n ja proteiinin tasot T24 solulinjassa verrattuna in BIU-87-solulinjojen (Fig. 1A ja C; * P 0,05). Sitä vastoin E-kadheriinin ilmentyminen oli selvästi heikko tai menetetty mRNA ja proteiini tasoilla NMIBC kudoksissa, MIBC kudokset ja korkea etäpesäkekasvainten solulinjassa T24 mutta huomattavan suuri vastaaviin viereisen ei-neoplastisia yksilöitä ja BIU-87cell linjan (Fig. 1A ja C; * P 0,05, ** P 0,001). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin immunohistokemiallisesti värjäämällä -analyysi SATB1, E-kadheriinin ja vimentiinin, joka osoitti, että SATB1 on pääasiassa paikallisia ytimet virtsarakon syövän kudosta, joilla on alhainen immunoreaktiivisuus normaalissa virtsarakon kudoksissa (Fig. 1 B). Kuitenkin vimentiinistä havaittiin olevan pääasiallisesti värjättiin plasmalemma virtsarakon syövän kudosten menetys tai alhainen E-kadheriinin värjäytymistä (Fig. 1 B). Joukossa ensisijainen virtsarakon syöpäpotilailla positiivisia SATB1 ilme näkyy kadonneet tai alhainen E-kadheriinin ilmentymisen mutta korkea vimentiinista ilme. Sen sijaan SATB1-negatiivisten potilaiden osoitti vahvaa E-kadheriinin värjäystä mutta kevyt värjäytymisen vimentiinista (Fig. 1 D), mikä viittaa vahvasti positiivinen korrelaatio SATB1 ja EMT merkkiaineiden BTCC.

Expressions mRNA tasojen SATB1, E-kadheriinin ja vimentiinin ihmisen virtsarakon karsinooma kudosten ja kaksi virtsarakon sinoomasolulinjoja kvantitatiivisen RT-PCR: llä (A * P 0,05, ** P 0,001). IHC värjäys ihmisen rakkosyöpä- kudosten ja vastaavien viereisten ei-syöpä kudoksia SATB1, E-kadheriinin ja vimentiinista suoritettiin. SATB1 värjäytyminen havaittiin ytimet virtsarakon syövän solujen, vimentiinistä havaittiin olevan pääasiallisesti värjättiin plasmalemma virtsarakon syövän solujen, mutta E-kadheriinin värjäytyminen havaittiin pääasiassa plasmalemma ei-syöpä rakon soluissa (B); Virtsarakon syöpä näytteiden SATB1-positiivisten värjättiin vimentiinista mutta ei E-kadheriinin. Kuitenkin tuumorin näytteiden SATB1-negatiivisia värjättiin E-kadheriinin, mutta ei vimentiinista (D). Alkuperäinen suurennus oli × 400x (B ja D). Proteiini tasot SATB1, E-kadheriinin ja vimentiinin tutkittiin Western blot (C). Virhe palkit osoittavat s.e.m., n = 3 kokeita.

yli-ilmentyminen SATB1 liittyy kliinis parametrien ja korreloi huonon ennusteen

väliset suhteet SATB1mRNA ilmaisun ja kliinis tekijöitä tutkittiin. Kuten taulukosta 1, korkea ilmentyminen SATB1 oli merkitsevästi yhteydessä ikään (≥55 vs. 55, p = 0,034), primäärikasvain syvyys invaasion (T1 + T2 vs. T3 + T4, P 0,001), TNM vaihe (vaiheet I + II vs. vaiheet III + IV, P = 0,015), läsnäolo imusolmuke etäpesäke (P = 0,013) ja läsnäolo etäpesäkkeiden (P = 0,012). Ei kuitenkaan ole merkittäviä eroja havaittu välillä korkea SATB1 ilmaisun ja sukupuolesta (mies vs. nainen, P = 0,143) tai kasvaimen erilaistumiseen (G1 vs. G2 + G3, P = 0,111). Kaplan-Meier-analyysi suoritettiin määrittämään prognostisen merkitys SATB1. Kuten on esitetty kuviossa. 2, analyysi paljasti korrelaatio suurempi SATB1expression tasoilla ja lyhyempi elinaika kertaa (P 0,001). Lisäksi monimuuttuja Coxin analyysi vahvisti, että SATB1 ilmaisu on merkittävä ja riippumaton ennustetekijä ihmisen virtsarakon siirtymäkauden cell carcinoma oikaisun jälkeen muita tekijöitä, kuten on esitetty taulukossa 2 (P = 0,005).

5 vuotta yleinen eloonjäämisaste potilailla, joilla on korkea SATB1 ilme oli huomattavasti huonompi kuin ne, joilla on alhainen SATB1 ilme (P 0,001; log-rank-testi).

ektooppinen ilmentyminen SABT1 indusoi EMT on vakiintunut ihmisen syövän solulinja, lisätä niiden invasiivisia kyky

Aiemmat tutkimukset ovat sidoksissa SATB1expression epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [21,24]. Voit testata, onko ektooppinen ilmentyminen SATB1 voisi aiheuttaa EMT ei-metastasoitunut kasvainsoluja, ihmisen virtsarakon syövän solulinja (BIU-87) on hyvin alhainen SATB1 ilme transfektoitiin pcDNA3.1-SATB1 ekspressioplasmideja luoda vakaa SATB1-yliekspressoivassa solulinja kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Tulokset reaaliaikaisen RT-PCR ja Western blotting osoitti, että SATB1 mRNA ja proteiini tasoilla transfektoitujen ryhmässä huomattavasti verrattuna transfektoimattomista ryhmän ja kontrolli vektori-transfektoiduissa ryhmä (Fig. 3A; ** P 0,001). Kuitenkin, ei ollut merkittäviä muutoksia ilmaus SATB1 kontrolliryhmän vektori-transfektoidut ryhmä ja transfektoimattomista ryhmä (P 0,05). Samanlaisia ​​tuloksia voidaan saavuttaa immunofluoresenssianalyysillä havaitsemiseksi SATB1 (Fig. 3C). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että transfektointi BIU-87 solujen aiheutti merkittävää lisäystä Etana ja Slug (mRNA ja proteiini) sekä samanaikainen induktio vimentiinista (mRNA ja proteiini). MRNA-tasot E-kadheriinin ilmentyminen väheni sen jälkeen, kun transfektio pcDNA3.1-SATB1 ekspressioplasmidien (Fig. 4A; P 0,05). Kuitenkin, ei ollut merkittäviä muutoksia ilmentymisen E-kadheriinin proteiinin välillä kontrollivektorilla ja pcDNA3.1SATB1 ryhmän (Fig. 4B; P 0,05). Oli vain trendi vähentäminen E-kadheriinin proteiinin ilmentymistä, ja esti vaikutusta ei ole yhtä jyrkkä, koska esto voisi olla translaation jälkeisiä.

SATB1 ilmentyminen BIU-87-solut ja T24-solujen transfektoitu pcDNA3.1-SATB1 ja pGenesil2-SATB1-shRNA tutkittiin qRT-PCR ja western blot (A ja B; ** P 0,001). Ei-transfektoiduissa BIU-87-soluja käytettiin kontrolliryhmän. T24-soluja käsiteltiin pGenesil2 kontrollivektorilla, joka ei ole kohdistettu mitään erityisiä geeniä käytettiin kontrolliryhmiin. Immunofluoresenssianalyysi suoritettiin havaitsemiseksi SATB1staining kussakin solussa ryhmissä. Immunofluoresenssikoe kuvia 200 x suurennus (C ja D). Virhepalkit osoittavat sem, n = 3 kokeissa.

ilmentyminen Snail ja Slug, kaksi inhibiittorit E-kadheriinin ja mesenkymaaliset markkeri vimentiinista ilmentyivät jälkeen SATB1 ekspressio oli lisääntynyt (A; ** P 0,001). MRNA-tasot E-kadheriinin ilmentyminen väheni sen jälkeen, kun transfektio pcDNA3.1-SATB1 ekspressioplasmidien (A; P 0,05). Oli suuntaus vähentäminen E-kadheriinin proteiinin ilmentymistä BIU-87 solujen parannettu SATB1 ilme (B; P 0,05). Sen jälkeen SATB1 ilmentyminen hiljennettiin kanssa SATB1 shRNA in T24-soluissa, ilmaus Snail, Slug ja mesenkymaalisten markkereita vimentiinista säädeltiin vähentävästi. Ilmentymisen epiteelin marker, E-kadheriinin, säädeltiin voimakkaammaksi kuin transfektoimattomista soluihin ja kontrollivektori-transfektoiduissa soluissa (C ja D, * P 0,05; ** P 0,001). Ei tapahtunut merkittäviä muutoksia ilmauksia ZEB1, ZEB2 ja Twist, muut tunnetut inhibiittorit E-kadheriinin, in BIU-87 tiiviimmän SATB1 ilme ja T24-solujen pienentää SATB1 ilme, vastaavasti.

kuitenkin, ei ollut merkittäviä muutoksia ilmentymisen ZEB1, ZEB2 ja Twist, joka tunnetaan muiden estäjien E-kadheriinin, kolmen solun ryhmän (P 0,05).