Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä (PCA) luustometastaaseja ovat pitkään uskotaan olevan osteoblastic koska luun remodeling johtaa uuden luun muodostumista. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet kasvanut osteolyytti- toiminnan alkuvaiheissa PCa luustometastaaseja, mikä viittaa siihen, että kohteena sekä osteolyyttinen ja osteoblastic välittäjiä todennäköisesti estää luun ja PCa luun etäpesäke. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että PCa solut voisivat stimuloida erilaistumista osteoklastien ja osteoblastien välityksellä säätely ylöspäin RANKL, RUNX2 ja osteopontiinin, edistämällä luun. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että muotoiltu isoflavone ja 3,3′-di-indolyylimetaani (BR-DIM) kykenivät estämään erilaistumista osteoklastien ja osteoblastien kautta estämällä solun signaalitransduktion RANKL, osteoblastic, ja PCa solusignalointia. Lisäksi olemme havainneet, että isoflavone ja BR-DIM alassäädetty ilmentymistä miR-92a, jonka tiedetään liittyvän RANKL signalointi, EMT ja syövän etenemistä. By polku ja verkon analyysissa havaittiin myös sääntelyn vaikutukset isoflavone ja BR-DIM useita signalointireittien kuten AR /PSA, NKX3-1 /Akt /P27, MITF jne Siksi isoflavone ja BR-DIM niiden multi -targeted vaikutukset voivat olla käyttökelpoisia ehkäistäessä Eturauhassyövän eteneminen, erityisesti lieventävien luumetastaasipotilailla mekanismeja.

Citation: Li Y, Kong D, Ahmad A, Bao B, Sarkar FH (2012) kohdistaminen Bone Remodeling by Isoflavone ja 3,3′-di-indolyylimetaani yhteydessä Eturauhassyöpä luumetastaasi. PLoS ONE 7 (3): e33011. doi: 10,1371 /journal.pone.0033011

Editor: Muzaffer Cicek, Mayo Clinic College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 joulukuu 2011; Hyväksytty: 2. helmikuuta 2012 Julkaistu: 07 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avustusta National Cancer Institute, National Institutes of Health (5R01CA083695, 5R01CA108535, 5R01CA132794 ja 5R01CA131151 myönnetty FHS). Kirjoittajat kiittää Puschelberg ja Guido perustan niiden antelias rahoitusosuudesta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijä Fazlul Sarkar ja toinen kirjoittaja Aamir Ahmad ovat PLoS ONE toimitusneuvosto jäsenet. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuolemia miehillä Yhdysvalloissa oli arviolta 241740 uutta tapausta ja 28170 kuolemantapausta odotetaan vuonna 2012 [1]. Korkea kuolleisuus Eturauhassyövän johtuu pääasiassa kehittämiseen etäpesäke. Eturauhassyövän yleisesti osoittaa sen asteittaista ominaisuuksia kautta päällekkäisiä androgeenireseptorin riippuvuus kastroida vastuksen lopulta etäpesäkkeitä. Vaikka PCa voidaan katsoa lokalisoitu eturauhasen, on vielä 15%: sta 20% ilmaantuvuus myöhemmin etäpesäkkeiden [2]. On raportoitu, että 35%: lla potilaista, joilla PCa kehittää hematogeneous etäpesäkkeitä ja että luun etäpesäke PCa on yleisin (~90%) kesken hematogeneous etäpesäkkeiden [3]. Eturauhassyövän luustometastaaseja, ovat pitkään uskotaan olevan osteoblastic koska uuden luun muodostumista. Näin ollen, kohdistaminen osteoblastisia molekyylit, kuten endoteliini-1, BMP, ja Wnt signalointi on pidetty strategioita estämään PCa luumetastaasipotilailla [2]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset osoittivat lisääntynyt osteolyytti- toiminnan alkuvaiheissa PCa luuetäpesäkkeistä [4], [5]. Useat kasvutekijät todettiin vapautumaan luuta hajotessaan kun PCa solut metastasized luuhun. Lisäksi syöpäsolut voivat levitä luun ja hyödyntää paikallisen sytokiinin koneiston edistää osteoklastigeneesin, jolloin luun resorptio ja syöpäsolujen kasvua [6]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että luun kuten osteolyyttinen ja osteoblastic prosesseja tapahtuu PCa luumetastaasipotilailla puolestaan ​​suosii kasvua Eturauhassyövän soluja vastaperustetun luu. Näin ollen molekyyli kohdentaminen sekä osteolyyttisiä ja osteoblastien välittäjiä todennäköisesti estää luun, joka voisi tulla uudempi terapeuttisen strategian eston PCa luumetastaasi.

estävät osteolyyttisiä prosessi, useita strategioita on kehitetty mukaan lukien käyttö bisfosfonaattien ja kohdistaminen biologisen sääntelyviranomaisten osteoklastogeneesin, kuten osteoprotegeriini (OPG), reseptorin aktivaattori Nukleaaritekijä-KB (RANK) ja reseptorin aktivaattori Nukleaaritekijä-KB ligandi (RANKL). Tärkein sytokiini kone, joka on mukana luun ja PCa luun etäpesäke, on OPG /RANK /RANKL signalointi [7], [8]. RANKL ilmaistaan ​​osteoblastien, ja se on tarpeen ja riittävä osteoklastigeneesin [9]. RANKL sitoutuu sen reseptoriin RANK, joka on läsnä pinnalla osteoklastien esiasteiden, joka indusoi osteoklastien muodostumista ja aktivaatiota [9], [10]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että RAW264.7-solut, yksi osteoklastien esiaste makrofagit, voisi erilaistuvat osteoklasteiksi, kun viljellään, kun läsnä on RANKL [10]. Tärkeimmät ominaisuudet osteoklastien sisältävät kykyjä imeä luuta, ilmaista tartraatti-resistentti hapan fosfataasi (TRAP), ja ilmaista proteaasien kuten metalloproteinaasien (MMP), jotka suosivat syövän eteneminen ja metastaasit [10], [11]. Tärkeää on, että RANKL: in ilmentyminen on myös todettu joissakin syöpäsoluissa sekä aktivoitujen T-solujen [6], [11], [12]. Näin ollen, RANKL signalointi on uskotaan olevan terapeuttinen kohde inhibition luun ja luun etäpesäkkeiden [13].

Lisäksi useat molekyylit mukaan lukien endoteliini-1, BMP, ja Wnt on uskottu, koska tärkeä säätimet osteoblastien erilaistumista ja luun muodostumista [2], [14] – [16]. Histologinen tutkimukset ovat osoittaneet, että osteoblastisia leesioita PCa luumetastaasin on ominaista laskeuman uusien luiden, jotka on tuotettu osteoblastien, järjestäytymätön ja lomitettu välillä pesäkkeitä syöpäsoluja. Osteoblastien, endoteliini-1, BMP, ja molekyylit Wnt signalointi ilmentyy voimakkaasti. Lisäksi kohonnut seerumin luuspesifinen alkalinen fosfataasi, merkkiaine osteoblastien erilaistumista ja proliferaatiota, ovat usein havaitaan syöpäpotilaan luumetastaasipotilailla [17], mikä viittaa tärkeyttä näiden molekyylien PCA luun etäpesäke. Siksi kohdentamalla osteoblastisissa molekyylit voivat estää luun ja PCa luun etäpesäke.

Äskettäin, luonnolliset aineet ovat saaneet paljon huomiota alalla syöpätutkimukseen. Isoflavone genisteiiniä esiintyy pääasiassa soija on osoittanut sen kyky estää syöpäsolujen kasvua

in vitro

ja

in vivo

ilman myrkyllisyyttä. Olemme aiemmin havainneet, että isoflavonin genisteiini voi estää NF-KB: n ja Akt aktivoitumisen syöpäsoluissa [18]. Lisäksi olemme raportoitu, että ruokavalion genisteiini- voi estää PCA kokeellisen luumetastaasipotilailla on SCID-ihmis- malli [19] ja että genistein voisivat voimistaa apoptoosin indusoiva vaikutus kemoterapia-aineiden kautta alas-säätely NF-KB [20]. 3,3′-di-indolyylimetaani (DIM) on toinen luonnollinen aine ja pääasiallisesti löytyy perheenjäsenet Cruciferae kuten parsakaali. Me ja muut ovat havainneet, että DIM ja sen formuloidun tuotteen (BR-DIM valmistaa BioResponse, LLC. Parannetun hyötyosuus) voisi alas-säädellä ilmentymistä AR, Akt: n ja NF-KB: n, joka johtaa inhibition PCa kasvu ja induktio apoptoosin

in vitro

ja

in vivo

[21], [22]. DIM havaittiin myös voimistavan terapeuttista tehoa kemoterapeuttisten [23]. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko isoflavone seosta G2535, joka sisälsi 70,5% genisteiiniä, ja BR-DIM voi estää erilaistumista osteoklastien ja osteoblastien välittyvät sääntelyn solusignalointi polkuja, jotka ovat mukana luun ja PCa luun etäpesäke.

tulokset

eriyttäminen osteoklastien ja osteoblastien yhteistyössä kulttuuri järjestelmä PCA solujen

roolin tutkimiseksi luuhun liittyvien solujen signalointi luun aikana PCa luun etäpesäke, ensin kehittäneet yhteistyössä -Kulttuuri järjestelmä mahdollistaa PCa soluihin ja osteoklastien tai osteoblastien kasvatettiin samoissa viljelyalustan kunnossa. Olemme havainneet, että PC-3 eturauhasen syöpäsolujen voi kasvaa hyvin ennalta osteoklastien (RAW264.7-solut) (kuvio 1A), ja että sekä C4-2B solut ja pre-osteoblastien (hFOB1.19 solut) voivat kasvaa yhdessä (kuvio 1 B) . Sitten, käsittelimme yhdessä viljelemisen PC-3 ja RAW264.7 solujen RANKL: n tai TGF-β aiheuttaa osteoklastien erilaistumista. Inkuboimme co-kulttuuri C4-2B ja hFOB1.19 soluja 39 ° C: ssa aiheuttaa osteoblastien erilaistumista. TRAP-värjäys suoritettiin havaitsemiseksi osteoklastien kun AFOS värjäys suoritettiin havaitsemiseksi osteoblastien erilaistumista. Havaitsimme muodostumista monitumaisten solujen ja tummanruskea rakeet eriytetty osteoklastien ympäröi PC-3-solut (kuvio 2A), mikä viittaa siihen, että eriyttäminen osteoklastien voisi indusoida RANKL tai TGF-β PCA kasvuympäristön. Havaitsimme myös tummansininen rakeet hTOB1.19 soluissa ympäröi C4-2B soluja (kuvio 2B), mikä viittaa siihen, että osteoblastien voitaisiin eriyttää kun kasvanut yhteen PCA soluihin.

. PC-3-solut (merkitty musta kolmio) oli viljeltiin yhdessä RAW264.7-solut (merkitty musta nuoli), solutiheys on pieni (a, b) ja korkea solutiheys (c, d). B. C4-2B-solut (merkitty valkoinen kolmio) oli viljeltiin yhdessä hFOB1.19 solut (merkitty valkoinen nuoli) solutiheys on pieni (e, f) ja korkea solutiheys (g, h). × 100.

. RAW264.7-soluja viljeltiin yhdessä PC-3-solut (merkitty musta nuoli) ja käsiteltiin 100 ng /ml RANKL (a, b) tai 10 ng /ml TGF-β (c, d) ja 8 päivää. TRAP värjäys osoitti tummanruskea rakeet (merkitty valkoisella nuolella) in eriytetty osteoklastien ympäröi PC-3-solut. B. hFOB1.19 soluja viljeltiin yksinään (e, f) tai co-viljeltiin (g, h), jossa C4-2B solut (merkitty musta kolmio) 39 ° C: ssa 5 päivää. AFOS värjäys osoitti tummansininen rakeita (merkitty valkoinen kolmio) in eriytetty osteoblastien. × 200.

TGF-β indusoiman osteoklastien välityksellä RANKL

Koska havaitsimme erilaistumista osteoklastien TGF-β, testasimme vaikutus TGF-β ilmentymistä koskevat RANKL . Olemme havainneet, että ilmentymisen taso RANKL lisäsi merkitsevästi TGF-β hoitoa C4-2B ja PC-3-soluja (kuvio 3A), mikä viittaa siihen, että induktio osteoklastien TGF-β on välittyy ylös-säätely RANKL ja että PCa solut voisivat tuottaa RANKL aiheuttaa osteoklastien. Havaitsimme myös, että ilmentymistaso CXCR-4, yksi kriittisistä geenien etäpesäke, oli merkittävästi lisääntynyt TGF-β hoitoon. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tehostetun TGF-β kasvain tai stroomasoluissa voisi edistää luun ja PCa metatstasis kautta RANKL ja CXCR-4-signalointia.

V: C4-2B ja PC-3-soluja käsiteltiin 100 ng /ml OPG tai 10 ng /ml TGF-β: ssa 24 tuntia. Ilmaus RANKL ja CXCR-4-proteiinin mitattiin Western Blot-analyysi. B ja C: RAW246.7 (B) ja hFOB1.19 (C) solut alempi kammiot olivat viljeltiin yhdessä C4-2B (C4), PC-3 (PC), ARCaP

M (M) ja ARCaP

E (E) eturauhassyövän solut ylähuoneissa 48 tuntia. Western Blot-analyysi tehtiin mitata ilmaisua osteoklastien tai osteoblastien merkkiaineiden RAW264.7 tai hFOB1.19 soluja.

Co-kulttuuri eturauhasen syöpäsolujen lisäsi erilaistumista osteoklastien ja osteoblastien

Sen tutkimiseksi, PCa soluja voisi edistää erilaistumista osteoklastien ja osteoblastien, me viljellä RAW264.7 tai hFOB solujen alempaan kammioon viljelyjärjestelmästä ja viljellään eri PCa soluja kuten C4-2B, PC-3, ARCaP

M ja ARCaP

E solut ylemmässä kammiossa niin, että eritettyjen proteiinien syöpäsoluista voisi tulla alemman kammion ylempään kammioon kalvon läpi, 1 pm huokoskoko. Western blot analyysi suoritettiin mittaamaan osteoklastien ja osteoblastien erilaistumista markkereita. Olemme havainneet, että co-viljelmä RAW264.7 solujen PCa-solujen lisääntynyt ilmentyminen TRACP, yksi suurimmista osteoklastien merkkiaineiden RAW264.7-soluissa (kuvio 3B). Ilmentyminen fibronektiiniä lisääntyi myös silloin, kun viljeltiin yhdessä C4-2B ja PC-3-soluja (kuvio 3B). Havaitsimme myös lisääntyneen ilmentymisen RUNX2 yksi osteoblastien merkkiaineita, in hFOB1.19 soluja (kuvio 3C). Ilmentymisen osteopontiinin, yksi tärkeä geenien luun, indusoitui myös silloin, kun samanaikaisesti viljeltiin PCa soluja (kuvio 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PCa solut voivat tuottaa joitakin molekyylejä, jotka edistävät erilaistumisen induktioon osteoklastien ja osteoblastien, aiheuttaen luun.

Isoflavone ja BR-DIM esti erilaistumista osteoklastien ja osteoblastien

vaikutusten tutkimiseksi, isoflavonin ja BR-DIM on differntiation osteoklastien ja osteoblastien, käsittelimme RAW264.7 tai hFOB1.19 soluja 10-25 uM G2535 tai BR-DIM prosessien aikana osteoklastien ja osteoblastien erilaistumista. Teimme TRAP tai AFOS värjäys havaita erilaistumista osteoklastien tai osteoblastien. Havaitsimme, että TGF-β indusoi muodostumista monitumaisten osteoklastien ja että isoflavoneja ja BR-DIM hoitoja vähensi tummanruskea rakeet RAW264.7-soluissa (kuvio 4A) ja tummansininen rakeet hFOB1.19 soluissa viljeltynä yksinään (kuvio 4B ) tai co-viljelty C4-2B (kuvio 4C). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että isoflavone ja BR-DIM voi estää erilaistumista osteoklastien ja osteoblastien, joka voisi lieventää luun aikana PCa etäpesäke ja olisi erittäin toivottavaa, että eston PCa luun etäpesäke.

V: RAW246. 7-soluja käsiteltiin 10 ng /ml TGF-β yksin tai yhdessä 10 uM G2535 ja 8 päivää. TRAP-värjäys suoritettiin. Tummanruskea rakeet osoitti erilaistumista osteoklastien. × 100. B ja C: hFOB1.19 soluja viljeltiin yksinään (B) tai viljeltiin yhdessä C4-2B-solut (C) 39 ° C: ssa. Solut käsiteltiin myös 20 uM G2535 tai 10 uM BR-DIM ja 5 päivää. AFOS värjäys osoitti tummansininen rakeita eriytetty osteoblastien. × 200.

Isoflavone ja BR-DIM säänneltyä RANKL ja eturauhassyövän signalointia, joka voisi estää osteoklastogeneesiä ja eturauhassyövän kasvua

Koska huomasimme, että isoflavone ja BR-DIM esti eriyttäminen osteoklastien, me tutki tarkemmin molekyylitason mekanismi isoflavone ja BR-DIM toimia osteoclastgenesis. Teimme mikrosiruanalyysi geeniekspression profiilin C4-2B käsiteltyjen solujen G2535 tai BR-DIM. Käyttämällä kekseliäisyyttä Pathway Analysis, huomasimme, että isoflavone ja BR-DIM esti solun signaalitransduktion RANKL signalointireitillä (kuvio 5A ja taulukko 1) ja PCa signalointi (kuvio 5B ja taulukko 1). BR-DIM ja isoflavone estivät merkitsevästi ilmaus MITF, yksi tärkeä transcrption tekijöitä säätelyssä osteoklastien geenin ilmentymistä (kuvio 5A ja taulukko 1). BR-DIM ja isoflavone esti myös signaali transductions PCA signalointia ylössäätöä p27 ja alas-säätely PSA ja sykliini D (kuvio 5B ja taulukko 1). Lisäksi isoflavoni ja BR-DIM säännelty molekyylien signaalitransduktion verkkoihin down-regulation Akt, NKX3-1, STK-4, CDK13 ja MITF (kuvio 5C, 5D ja taulukko 1), mikä johtaa estyminen osteoklastigeneesin ja Eturauhassyövän kasvun. Lisäksi teimme reaaliaikainen RT-PCR: llä ja Western blot-analyysi vahvistaa tulokset microarray ja Ingenity Pathway analyysi. Havaitsimme, että BR-DIM ja isoflavone alassäädetty ilmaisua MITF, Akt, NKX3-1, sykliini D ja PSA, ja sääteli ilmentymistä p27, p38 ja CREB mRNA (kuva 6 A ja 6B) ja proteiini (kuvio 6C ja 6D) tasolla. Nämä tulokset ovat oli yhdenmukainen microarray data viittaa siihen, että BR-DIM ja isoflavone voisi estää osteoklastogeneesiä ja PCa kasvua.

BR automaattinen säännelty molekyylien RANKL signalointi (A), eturauhassyöpä signalointi (B), ja signaali transduktio verkot (C, D) analysoitiin microarray ja kekseliäisyyttä Pathway analyysi C4-2B soluissa. Punainen osoittaa sääteli molekyylit taas vihreä täsmennetään alassäädetty molekyylejä. Luvut automaattisesti luotu Ingenuity Pathway Analyysiohjelmisto.

BR-DIM ja isoflavone säännelty ilmentymistä MITF, p38, Akt, NKX3-1, P27, sykliini D, CREB ja PSA mRNA ja proteiinin tasot testataan real-time PCR (A, B) ja Western blot -analyysi (C, D). C4-2B (A, C) ja PC-3 (B, D) soluja käsiteltiin 25 uM G2535 tai 25 uM BR-DIM 24 tuntia (RNA) tai 48 tuntia (proteiinin uutto). (BD: BR-DIM).

RANKL sääteli ilmentymistä miR-92a taas isoflavone ja BR-DIM abragated ylös-säätely miR-92a stimuloidaan RANKL

atk ennustaminen kohde miRNA, huomasimme, että RANKL voi säädellä useita miRNA kuten miR-92a ja miR-155, mikä lisää osteoklastigeneesin. Vahvistamaan, onko miR-92a on oikeutettu tavoite RANKL tai ei, me käsitelty C4-2B soluja 100 ng /ml RANKL 24 tuntia. Havaitsimme, että RANKL indusoi miR-92a ilmentymistä PCA soluissa (kuvio 7A). Tärkeää on, olemme huomanneet, että solujen käsittely isoflaone tai BR-DIM vähentynyt ilmentyminen miR-92a ja heikennetty induktio miR-92a ilmentymistä stimuloidaan RANKL PCA-soluissa (kuvio 7A), mikä viittaa siihen, mekanistinen yhteys RANKL, asennuspalveli- 92a ja biologinen aktiivisuus isoflavonien tai BR-DIM.

: C4-2B soluja käsiteltiin 100 ng /ml RANKL, 25 uM G2535, 25 uM BR-DIM, tai yhdistelmä RANKL ja G2535 tai BR-DIM 24 tuntia. Kokonais-RNA uutettiin ja ilmentymistä miR-92a havaittiin käsiteltiin C4-2B soluissa. B: C4-2B soluja viljeltiin alemmassa kammiossa yhteistyön kulttuurin järjestelmä. RAW246.7 ja hFOB1.19 Soluja viljeltiin ylemmässä kammiossa. Soluja käsiteltiin 25 uM G2535 tai 25 uM BR-DIM: ssa 48 tuntia. Ilmaisua E-kadheriinin ja vimentiinin mitattiin Western Blot-analyysi. C: hFOB1.19-soluja käsiteltiin 25 uM G2535 tai 25 uM BR-DIM: ssa 48 tuntia. Ilmentyminen periostin havaittiin Western Blot -analyysillä.

Isoflavone ja BR-DIM säädellä epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) markkerit, E-kadheriinin ja vimentiinin

Koska olemme Havaittu että isoflavoni ja BR-DIM voi estää ilmentymisen miR-92a, joka voisi edistää etäpesäke ja säädellä EMT kohdistamalla alassäätöä ilmaus E-kadheriinin [24], me tutki tarkemmin vaikutuksia isoflavone ja BR-DIM ilmaus E-kadheriinin ja vimentiinista, kaksi tärkeintä ja hyvin vastaan ​​EMT markkereita, jotka liittyvät suoraan EMT fenotyyppiin. Me viljellä C4-2B soluja alempaan kammioon rinnakkaisviljelmätilanteessa järjestelmä jossa viljelty RAW264.7 ja hFOB1.19 solut ylemmässä kammiossa matkia kasvain microenvironment Eturauhassyövän soluja ja osteoklastien /osteoblastien vuorovaikutusta. Sen jälkeen, käsittelimme solut 25 uM G2535 tai 25 uM BR-DIM: ssa 48 tuntia. Olemme havainneet, että isoflavoneja tai BR-DIM käsittely lisäsi ekspressiota E-kadheriinin ja vähentynyt ilmentyminen vimentiinista (kuvio 7B), mikä viittaa siihen, että isoflavoneja ja BR-DIM voisi estää induktion EMT, jonka ekspressiota sääteleviä miR-92a, E -cadherin ja vimentiinista.

Isoflavone ja BR-DIM esti ilmentymistä osteoblastic geenin

Koska havaitsimme, että isoflavone ja BR-DIM voisi estää osteoblastien erilaistuminen me tutki tarkemmin molekyylitasolla isoflavoni ja BR-DIM toimintaohjelma osteoblastien erilaistumista. Käsittelimme hFOB1.19 solujen 25pM G2535 tai 25pM BR-DIM 48 tuntia. Olemme havainneet, että isoflavoneja tai BR-DIM hoito esti ilmentymisen periostin (kuvio 7C), joka on yksi tärkeä geenien osteoblastien erilaistumista. Nämä tulokset viittaavat siihen, että inhibitio periostin voisi olla yksi molekyyli mekanismeja, joilla isoflavoneja ja BR-DIM inhiboi osteoblastien erilaistuminen.

Keskustelu

On hyvin tunnettua, että PCa solut usein etäispesäkkeitä luun. Luun, metastasized PCa solut voitaisiin hyödyntää ravinteita verestä luuytimessä, vuorovaikutuksessa ennalta osteoklastien ja pre-osteoblastien, ja stimuloida luunmuodostusyksikköjä [25], [26]. Vuorovaikutus PCa solujen ja pre-osteoklastien /pre-osteoblastien on kriittinen vaihe luun aikana PCa luumetastaasipotilailla [26]. Siksi kehittäminen rinnakkaisviljelmätilanteessa järjestelmä PCA solujen ja pre-osteoklastien /pre-osteoblastien on tärkeää tutkimisesta molekyylitason interaktioiden signalointipolkujen aikana PCa luumetastaasipotilailla luun. Tuloksemme osoittivat, että androgeenireseptorin erottelua PCa soluihin, kuten PC-3 ja C4-2B solut voivat kasvaa hienosti valmiiksi osteoklastien tai ennalta osteoblastien samassa kulttuurissa astian määritellyssä alustassa, joka matkii

in vivo

ympäristössä suoraa vuorovaikutusta Eturauhassyövän soluja ja paikallisten luun soluja. Meidän yhdessä viljelemisen järjestelmä, PCa-solut, esi-osteoklastien, ja pre-osteoblastien voi kasvaa myös yksittäisten kammioiden, jotka erotettiin kalvo mahdollistaa proteiinit (liukoiset tekijät) jakautuminen kahden kammion erottaen eri solujen yksittäisissä kammioissa . Tällä tavoin vaikutus erittyvien proteiinien (liukoiset tekijät) PCA-solujen luusoluihin tai vaikutuksia erittyvien proteiinien luun solujen PCa soluja voitaisiin tutkia. Käyttämällä co-kulttuuri, testasimme molekyylitason muutoksia osteoklastien tai osteoblastien kannustanut PCa soluja. Viimeaikaiset tutkimukset Muut tutkijat osoittivat, että yhdessä viljelemisen osteoklastien ja osteoblastien voisi olla hyödyllistä tutkia luun aineenvaihduntaa ja osteoklastigeneesin [27], [28]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että yhteistyö kulttuurin järjestelmä on erittäin hyödyllinen tutkittaessa molekyylitason muutoksia, kun PCa solut itseohjautuva luuhun, mikä mahdollistaa arvioitaessa muutoksia signaalin transductions välillä PCa solujen ja paikallisten luu- soluihin PCa luumetastaasipotilailla luun remodeling dokumentoimat tuloksemme.

erilaistuminen osteoklastien tai osteoblastien on tärkeä askel aikana syövän etäpesäke luuhun ja luun. Käyttämällä meidän co-kulttuuri järjestelmä, huomasimme, että ennalta osteoklastien voi erilaistua kypsä osteoklastien kun samanaikaisesti viljeltiin yhdessä PCa soluihin. Lisäksi pre-osteoblastien voisi myös erilaistua kypsyä osteoblastien kun samanaikaisesti viljellyt PCA soluihin. Lisäksi olemme havainneet, että yhdessä viljelemisen osteoklastien ja osteoblastien PCA solujen voisi lisätä erilaistumista osteoklastien ja osteoblastien. Nämä havainnot viittaavat siihen, että molekyylit tuottamat PCa solut voivat aiheuttaa erilaistumista osteoklastien ja osteoblastien. Mikä tärkeintä, huomasimme, että isoflavone ja BR-DIM voi estää erilaistumista osteoklastien ja osteoblastien kun viljeltiin yhdessä PCa soluihin, mikä viittaa siihen, että isoflavone ja BR-DIM olisivat käyttökelpoisia eston PCa luumetastaasipotilailla luunmuodostusyksikköjä (kuva 8) . On tunnettua, että PCa solut luumetastaasipotilailla stimuloivat luun taas luun helpottaa PCa luumetastaasipotilailla invaasio luun [29] – [31], joka tunnetaan noidankehä luun ja luun etäpesäke. Tuloksemme osoittivat, että isoflavone ja BR-DIM esti luun solujen erilaistumista, mikä viittaa siihen, että isoflavone ja BR-DIM voi estää PCa luumetastaasipotilailla läpi häiritsevät luun.

On raportoitu, että eriyttäminen osteoklastien tapahtuu ensin aikana luun kun PCa soluja etäispesäkkeitä luuhun [4], [5]. Siksi esto osteoklastien on tärkeää keskeyttämiseksi PCa luumetastaasipotilailla itseohjautuva. On tunnettua, että RANK /RANKL /OPG signalointi on keskeinen säädin osteoklastien [32]. Tuloksemme osoittivat, että RANKL hoito voisi merkittävästi erilaistumisen indusoimiseksi osteoklastien, joka on yhdenmukainen julkaistun raportin [33]. Vielä tärkeämpää on, olemme havainneet, että TGF-β voi ajan säätelemään RANKL, joka johtaa osteoklastien erilaistumisen. Nämä tulokset ovat myös yhdenmukaisia ​​raportit muilta tutkija [31], mikä viittaa siihen, että TGF-β, joka on yleisesti nähtävissä kehittynyt PCA saattaa stimuloida erilaistumista osteoklastien, mikä johtaa luun resorptiota ja luun. Lisäksi on hyvin tunnettua, että TGF-β voi myös aiheuttaa EMT [34], mikä helpottaa PCa etenemistä, mukaan lukien invaasion ja luumetastaasi. Tärkeää on, että tietomme osoittavat, että isoflavonin voisi lieventää TGF-β indusoiman osteoklastien, ja että isoflavoneja ja BR-DIM voi säätelemään EMT markkereita (kuvio 8), mikä viittaa siihen, että nämä luonnolliset aineet voivat olla käyttökelpoisia ehkäistäessä Eturauhassyövän etenemisen ja luun etäpesäke.

Kehittyvät näyttöä mukaan MikroRNA (miRNA) säätelevät monet fysiologisia ja patologisia prosesseja [35]. Tuloksemme osoittivat, että lisäksi säännellä osteoklastien RANKL voi myös ajan säätelemään miR-92a. MIR-92a on havaittu alas-säätelemään kasvaimen vastaisen geenejä, mikä johtaa syöpäsolujen proliferaation [36]. Viimeaikaiset raportti osoitti, että E-kadheriinin on välittömänä kohteena miR-92a ja että ilmentyminen miR-92a edistänyt imusolmuke etäpesäke ihmisen ruokatorven okasolusyöpä kautta alas-säätely E-kadheriinin [24]. Siksi RANKL voi edistää myös PCa progressiota säätely ylöspäin miR-92a ja siten alas- säätely E-kadheriinin. Mielenkiintoista, isoflavoni ja BR-DIM pystyivät vaimentamaan säätely ylöspäin miR-92a stimuloidaan RANKL hoito, mikä viittaa, että on tärkeää näiden luonnollisten aineiden (isoflavone ja BR-DIM) inhibitioon Eturauhassyövän eteneminen ja luun etäpesäkkeiden (kuva 8 ).

sen lisäksi, että estävät vaikutukset osteoklastien isoflavone ja BR-DIM myös inhibted erilaistumista osteoblastien down-regulation periostin, yksi tärkeä geenien osteoblastien erilaistumista. Siksi kohdentamalla sekä osteoklastien ja osteoblastien erilaistumista, isoflavone ja BR-DIM voi tehokkaasti keskeyttää luun, joka tarjoaa epäsuotuisa micoenvironment varten itseohjautuva Eturauhassyövän soluja luuhun. Vaikka sekä isoflavoni ja BR-DIM osoittivat estovaikutusta luusolun erilaistumista, mukana olevien molekyylien ja muuttuneen tasoilla Isoflavonin tai BR-DIM hoito eivät olleet samat, mikä viittaa siihen, että monimutkaisten sääntelymekanismeja ovat mukana. By polku ja verkko analyysi, huomasimme, että isoflavone ja BR-DIM voi vaikuttaa useita signalointireittien kuten AR /PSA, NKX3-1 /Akt /P27, LEF1 /sykliini D1, MITF /NR3C1 jne BR-DIM käsitelty C4 2B soluja, löysimme voimakkaampi alas-säätely PSA jonka on havaittu moduloivan geenien luun ja osteoblastien erilaistumista [37]. Nämä tulokset viittaavat siihen, usean kohdistamista vaikutuksista isoflavone ja BR-DIM, joka tekee isoflavone ja BR-DIM tehokas aineita estämiseen PCa kasvua luun mikroympäristössä.

Yhteenvetona isoflavone ja BR-DIM pystyivät kohdistaa sekä osteoklastien ja osteoblastien erilaistumista ja myös voitaisiin kohdistaa useita molekyylejä PCa soluissa; Siksi nämä aineet voivat estää luun ja PCa kasvua, mikä viittaa siihen, että isoflavone ja BR-DIM voisi olla erittäin hyödyllinen ehkäisyyn Eturauhassyövän eteneminen, erityisesti luun etäpesäke. Biologista aktiivisuutta isoflavone ja BR-DIM välittyy alaspäin säätely useita signalointireittien kuten RANKL, AR /PSA, ja Akt signalointia, mikä tekee niistä erittäin lupaavia den ehkäisemiseksi ja /tai hoitoon PCa ja sen luun etäpesäke yhdessä tavanomaisten kemoterapia.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, reagenssit, ja vasta-aineet

PC-3 (ATCC, Manassas, VA), C4-2B, ARCaP

E ja ARCaP

M (Novicure, Birmingham, AL) syöpäsolujen ja pre-osteoklastien RAW264.7 (ATCC) soluja pidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia , 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa. Pre-osteoblastien hFOB1.19 (ATCC) soluja ylläpidettiin DMEM /F12 ilman fenolipunaista (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä 5% CO

2 ilmakehässä 34 ° C: ssa. Isoflavone seos G2535 (70,5% genisteiiniä, 26,3% daidzein ja 0,31% glycetein valmistamia Orgaaniset Technologies ja saatu NIH) liuotettiin DMSO tehdä kantaliuos, joka sisältää 50 mM genisteiiniä. Pitoisuudet isoflavone me tässä artikkelissa kuvatut viittaavat kaikki pitoisuus genisteiiniä isoflavone seoksessa. BR-DIM (BioResponse, LLC., Boulder, CO, muotoiltu-DIM korkeammat hyötyosuus

in vivo

[38]) oli jalomielinen lahjoitus tohtori Michael Zeligs ja liuotettiin DMSO tehdä 50 mM varasto- ratkaisu. CXCR-4 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA), anti-fibronektiini (Santa Cruz), anti-RUNX2 (Santa Cruz), anti-osteopontiinissa (Santa Cruz), anti-periostin (Santa Cruz), anti-E -cadherin (Santa Cruz), anti-vimentiinistä (Dako), anti-RANKL (R & D, Danvers, MA), anti-TRACP (Sigma, St. Louis, MO), anti-MITF (Santa Cruz), anti- p27 (Santa Cruz), anti-PSA (Santa Cruz), anti-sykliini D (Santa Cruz), anti-p38 (Santa Cruz), anti-β-aktiini (Sigma) ja anti-GAPDH (Sigma) ensisijainen vasta-aineita käytettiin Western Blot-analyysi.

Co-kulttuuri Eturauhassyövän soluja osteoklastien ja osteoblastien

jäljitellä PCa solu kasvatettu osteoklastien ympäristössä, PC-3-solujen ja RAW264.7 soluja viljeltiin yh- klo 1:01 suhde RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä 5% CO 2-ilmakehässä 37 ° C: ssa. Soluja käsiteltiin 100 ng /ml RANKL tai 10 ng /ml TGF-β varten 8päivä stimuloimaan RAW264.7 solujen erilaistumisen. Samoin jäljittelemään PCa solun kasvanut osteoblastic ympäristössä, C4-2B ja hFOB1.19 soluja yhdessä viljeltiin 1:02 suhde RPMI 1640 /F12 (01:01), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä 5% CO 2-ilmakehässä 39 ° C: ssa 5 päivää stimuloimaan osteoblastien erilaistumista hFOB1.19 soluja.