Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yksi tärkeimmistä tekijöistä valittaessa hoitostrategiaa syövän on luonnehdinta biomarkkereita syöpäsoluissa. Erityisesti viimeaikaisen kehityksen Monoclonal Antibodies (MAB) ensisijaisena-tiettyjä huumeita kohdistaminen kasvain reseptoreja osoittaa, että niiden tehoa voimakkaasti riippuvainen luonnehdinta kasvaimen biomarkkereita. Arvio niiden asemasta yksittäisillä potilailla helpottaisi valintaa optimaalisen hoidon strategia, ja jatkuva valvonta näiden biomarkkereiden ja niiden sitoutumista prosessi hoito tarjoaisi keinon varhainen tehokkuuden arviointi terapeuttisen intervention. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa elävien eläinten, että fluoresenssin elinikä voidaan käyttää sitoutumisen havaitsemiseksi kohdistetun optisen koettimien solunulkoiseen reseptoreihin tuumorisolujen

in vivo

. Ajatuksena oli, että fluoresenssin elinikä tietyn koetin on herkkä paikalliseen ympäristöön ja /tai affiniteetti muihin molekyyleihin. Kiinnitimme lähi-infrapuna (NIR) fluoresoivat koettimet Human kasvutekijän 2 (HER2 /neu) erityisiä Affibody molekyylejä ja käyttäneet aikaa ratkaista optinen järjestelmä verrata fluoresenssin elinikä optisen antureista, jotka oli sidottu ja sitoutumattoman kasvainsoluihin elävillä hiirillä. Tuloksemme osoittavat, että fluoresenssin elinikä muuttuu mallissamme järjestelmässä rajata HER2-reseptoriin sitoutuneen sitoutumattomasta koetin

in vivo

. Näin ollen, tämä menetelmä on käyttökelpoinen spesifinen merkki reseptorin sitovan prosessi, joka voi avata uuden paradigman ”kuva ja käsitellä” käsite, erityisesti varhaisessa vaiheessa arviointi hoidon tehokkuus.

Johdanto-osan: Ardeshirpour Y, Chernomordik V, Zielinski R, Capala J, Griffiths G, Vasalatiy O, et ai. (2012)

In vivo

Fluoresenssi Lifetime Imaging Näytöt sitominen spesifisiä koettimia Cancer Biomarkers. PLoS ONE 7 (2): e31881. doi: 10,1371 /journal.pone.0031881

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 19 tammikuu 2012; Julkaistu: 23 helmikuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Intramural tutkimusohjelma on Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development ja National Cancer Institute , Imaging Probe Development Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health. Kuten YA, RF, VC, JC, GG, OV, AS, JK, IL, AG ja MH ovat työntekijöitä National Institutes of Health; Tämä rahoittajan ollut merkitystä tutkimusasetelma, tietojen keruun ja analysoinnin, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen. Toinen rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yksi tärkeimmistä tekijöistä valittaessa asianmukaista hoitoa strategia syöpä on luonnehdinta biomarkkereita syöpäsoluissa, ja tämä voi olla melko haastavaa. Erityisesti viimeaikainen edistys monoklonaalisia vasta-aineita (MAB), kuten ala-spesifisten lääkkeiden, tuumorien reseptoreihin, osoittavat, että niiden tehoa riippuu voimakkaasti yli-ilmentyminen spesifisiin reseptoreihin.

Lisäksi, yksi tärkeimmistä tekijöistä, jotka usein puuttuu syövän hoidossa (lähinnä käyttämällä MAB) on jatkuva seuranta vaste kasvaimen reseptorit hoidon, erityisesti alkuvaiheessa, määrällisesti sitova prosessi, joka on kriittinen arviointi lääkkeen tehoon.

Nykyinen standardi

ex vivo

menetelmiä, esimerkiksi, immunohistokemia (IHC), geenien monistuminen osoitti Fluorescent

In situ

hybridisaatio (FISH), ja entsyymi-immunologinen määritys (ELISA), ovat invasiivisia ja vaativat koepalat potilaille. Luonnostaan, koepaloja on riski puuttuu pahanlaatuisten leesioiden, ja aikana terapeuttinen jakso, kuinka monta kertaa, että biopsia voidaan ottaa on rajoitettu [1]. Vaihtoehtoiset menetelmät harkitaan parhaillaan perustuvat farmakokinetiikkaan radionuklidin koettimien PET injektion jälkeen verenkiertoon [2].

In vivo

fluoresenssikuvantamisella on vaihtoehtoinen ei-invasiiviset tekniikka, jota voidaan käyttää erikseen tai adjunction muiden yksityiskohtaiset ajoissa seuranta biomarkkereiden aikana hoidon. Tämä menetelmä on yksinkertainen ja kannettava.

Viimeaikaiset edistysaskeleet loisteputki antureista, kohdistaminen tietyn sairauden biomarkkerit, on avannut uuden aikakauden

in vivo

fluoresenssikuvantamisella. Niiden avulla on lupaava työkalu lääketieteellisen diagnostiikan [3] – [8]. Erityisesti kehittäminen lähi-infrapuna (NIR) fluoresoiva koettimet on merkittävästi parantunut kyky

in vivo

fluoresenssikuvantamisella, alhaisen autofluorisaatiota tausta ja syvä tunkeutuminen NIR valon kudoksessa [9].

fluoresenssikuvantamisella voidaan toteuttaa muodossa mittaamalla fluoresenssin intensiteetti jakaumia ja /tai fluoresenssin eliniän [10] – [18]. Fluoresenssi käyttöikä kuvantaminen perustuu arviointiin keskimääräinen aika, sähköisesti innoissaan fluorofori pysyy viritetyn tilan ennen sen siirtymistä perustilan, mukana fotoniemissio. Fluoresenssi käyttöikä voidaan mitata aikatasossa tai taajuusalueen tekniikoita [19] – [22]. Tässä tutkimuksessa käytimme tarkempi Edellinen menetelmä ja mitataan eksponentiaalinen ohimenevä rappeutuminen fluoresenssin voimakkuutta ajan ottaen huomioon vaikutus impulssivasteen järjestelmän. On osoitettu, että fluoresenssin elinikä on riippumaton pitoisuus fluoroforien ja intensiteetti eksitaatiovalon. Fluoresenssin käyttöikä voi pysyä vakiona jopa viisinkertaiseksi vaihtelu intensiteetin virittävän valon [23]. Toisaalta, se voi olla herkkä paikallisille biokemiallisia ympäristöön, esim., Lämpötilan ja pH: n tai molekyylivuorovaikutusten [24], [25]. Tämä ominaisuus tekee fluoresenssin elinikä kuvantaminen lupaava ehdokas havaitsemisessa ja valvonnassa erityinen syöpään reseptoreihin diagnosoinnissa ja hoidossa. Toinen tärkeä sovellus tämä tekniikka on tutkia tehokkuutta varhaisen vaiheen hoitovaste seuraamalla sitovat lääkemolekyylejä kasvainsoluihin.

Tässä tutkimuksessa olemme suunnattu ihmisen epidermaalisen kasvutekijän 2 (HER2 /neu) reseptori, joka on yksi tärkeä biomarkkereita monissa syövissä, mukaan lukien rinta- ja munasarjasyöpä [26]. Yliekspressio tämän reseptorin korreloi huonon ennusteen ja kestävyys tiettyjä kemoterapian [27]. Optimoida hoitotoimenpide, on tärkeää arvioida ilmaus HER2-reseptorin diagnostisen prosessiin ja seurata sitä

in vivo

aikana hoidon. Arvioimaan tilan tämän reseptorin, käytimme HER2-erityinen Affibody konjugoitu lähi (NIR) fluoresoiva väri.

Vaikka useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet parantuneet signaali /kohina-suhde

in vivo

fluoresenssikuvantamiseen jonka panemista fluorofori väriaineita käyttäen Polymersomes [28], nanoputket [29] tai käyttämällä nanohiukkasia [30] vaihtoehtona yksi molekyyli fluoroforit, Affibody-DyLight750 konjugaatin, tutkittiin käsikirjoituksen, näyttää olevan paremmin koetin tavoitteemme, eli luonnehdinta HER2-reseptoreiden yli-ilmentymisen kasvaimet

Invivo.

Affibody molekyylit [31] – [34] ovat hyvin stabiileja proteiineja. Ne ovat suhteellisen pieniä (8,3 kDa), noin 20 kertaa pienempi kuin vasta-aineita. Kuten kaikki muut pienet molekyylit, ne voivat kerääntyä kasvain kautta vuotava kasvain vasculatures. Niiden suuri diagnostinen etu on, että ne voidaan tehdä erittäin spesifisiä erityisesti syöpäsolun reseptoreihin, esimerkiksi HER2. Sitoutumisen jälkeen näihin reseptoreihin, irrallinen koettimet huuhdo ja pääosin sidottu fluoresoivia ligandien osaltaan signaalin kasvaimen alueella myöhemmin aikoina. Tämä parantaa merkittävästi kontrastia kasvain, verrattuna taustalla.

Edellisessä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että dynaamisia muutoksia fluoresenssin voimakkuuden tasoja HER2-spesifisten Affibody proteiineja, konjugoituna fluoresoivaa väriainetta, voidaan voidaan käyttää määrällisesti HER2 ilmentymistä tuumorisoluissa [35] – [37]. Suhteellisen nopea farmakokinetiikkaa Affibody-DyLight750 konjugaatti nopeuttaa tietojen keräämistä ja yksinkertaistaa niiden analysointi. Menetelmä, joka on esitetty nykyisessä käsikirjoituksen, vaikkakin vähemmän kvantitatiivinen nykyvaiheessa verrattaessa farmakokinetiikkaa analyysin mahdollistaa yhden arvioida HER2 tilan kasvaimen vain aikaerotteisiin mittaus. Se ei vaadi toistuvia mittauksia fluoresenssin kasvain jälkeen anturin injektiota tarkoita paljon kauemmin aikoina havainto. Ehdotettu lähestymistapa voidaan käyttää alustavan arvioinnin HER2 ilmaisun kasvain. Se on käytettävissä määrällisiä luonnehdinta HER2-reseptoreihin, joka perustuu farmakokinetiikkaan.

Toisaalta, se on esitetty aikaisemmassa tutkimuksessa [35], että HER2 Affibody sitoutuu eri epitooppiin HER2-reseptoriin kuin epitooppitoisintoja kohdistettu tällainen laajasti käytetty monoklonaalisia vasta-aineita trastutsumabi tai pertuzumab. Tämä mahdollistaa seurannan HER2 ilmaisun aikana hoidon häiritsemättä mitä vaikutuksia näiden lääkkeiden [35].

Tässä tutkimuksessa tutkimme elävien eläinten onko sitomalla Affibody-konjugoitu fluoresoiva koetin HER2-reseptoriin voi vaikutus fluoresenssin elinikä anturin. Tätä tarkoitusta varten fluoresenssi elinikä tutkittiin kolmessa eri tilanteessa: HER2-erityisiä Affibody (His6-Z

HER2: GS-Cys) fluoresoiva koetin ihmisen kasvainten malleissa korkea HER2 ilme, HER2-specific Affibody fluoresoiva koetin on ihmisen kasvainmuoto ilman HER2 ilme, ja HER2-epäspesifinen Affibody (His

6-Z

Taq: GS-Cys) fluoresoiva koetin ihmisen kasvainten malleissa korkea HER2 ilme, kaikki hiirimallissa

vuonna vivo

. Tulokset osoittavat merkittäviä eroja fluoresenssin eliniät välillä kasvaimen alueen ja takkaispuolelle, kun ja vain silloin, kun sitoutuminen optinen anturi kasvaimen reseptoreihin voi tapahtua. Päinvastoin, ei muutosta fluoresenssin eliniän havaittiin tapauksissa, joissa optinen koettimet ole affiniteettia HER2 reseptoreihin.

Materiaalit ja menetelmät

varjoainetta

näiden kokeiden kahdessa eri Affibody® molekyylejä (Affibody, Tukholma, Ruotsi) käytettiin: HER2-spesifinen Affibody (His6-Z

HER2: GS-Cys) ja HER2-epäspesifinen Affibody (His

6-Z

Taq: GS-Cys), molemmat konjugoidaan Dylight750 fluoresoiva koetin (Thermo-Fisher-Scientific, Waltham, Massachusetts). Dylight750 on riittävän kirkas käyttää

in vivo

tutkimukset ilman mitään muutoksia, ja voidaan helposti konjugoida HER2 erityisiä /ei-spesifisen Affibodies. Konjugaatio suhde Dylight750 on affibody proteiini on 01:01.

mitataan eliniän Affibody koettimen kemiallisia puskurit (koostumuksen kanssa sitruunahappo, boorihappo, ja mono-natriumfosfaattia vaihtelevat pH: ssa 4.5 9. Ei merkittävää muutosta fluoresenssin eliniän havaittiin koko pH-alueella (Fig. 1A). Steriloitu suolaliuosta käytettiin 3 kertaa laimentamisesta Affibody koetin ennen injektiota.

Olemme myös mitattiin fluoresenssin elinikä Affibody koetin kemiallisissa puskurissa pH 6,86 lisäämällä sen BSA pitoisuus 0%: sta 5% (naudan seerumialbumiinia, fraktio V, Vähintään 96%, Sigma Co.). elinikä Affibody koetin osoittautunut olevan herkkä läsnä BSA proteiinien (Fig. 1 B). Emme ole havaittu väheneminen fluoresenssissa eliniän suhteen Affibody koetin, jota käytetään injektioon.

Soluviljely

eläinten tutkimuksissa kolme ihmisen tuumorin ksenograftimalleissa eri tasoilla ekspressoivien HER2 käytettiin tässä tutkimuksessa. BT-474 ja NCI-N87 ovat ihmisen tuumorisolulinjoja kanssa korkeatasoisen HER2 (HER2 /neu) lauseke: 243 ± 24 ng /mg ja 395 ± 41 ng /mg proteiinia, vastaavasti, kun taas MDA-MB-468 on ihmisen tuumorisolulinja ilman HER2 ilme. Kaikki kolme solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). In vitro -tutkimus, olemme käyttäneet joko SK-BR-3 solulinja korkea HER2 ilmentymisen tai HER2-negatiivinen MDA-MB-468 ihmisen syövän solulinja. SK-BR-3 on valittu joukosta HER2 positiivisia solulinjoja, koska sen paremmin kiinnityksen levyyn. Soluja kasvatettiin RPMI (BT-474, NCI-N87), DMEM-F12 (SK-BR-3, MDA-MB-468) viljelyväliaineeseen, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja Pen /Strep (10000 U penisilliiniä, 10 mg streptomysiiniä) 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa. Ratkaisu on 0,05% trypsiiniä ja 0,02% EDTA käytettiin solujen irtoaminen.

In vitro

tutkimuksessa

HER2-positiivisen SK-BR-3 ja HER2 negatiivinen MDA-MB -468 solut sijoitettiin 8-chambered konfokaali dioja ja inkuboitiin yön yli. 24 tunnin kuluttua inkubaation Affibody-DyLight488-konjugaattia lisättiin soluihin media 0,5 ug /ml pitoisuutena. Kun on kulunut vielä 30 minuutin inkuboinnin 37 ° C: ssa, 2 ug /ml Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA) lisättiin soluihin ja inkuboitiin vielä 1 tunti ytimien värjäystä. Sitten solut pestiin kolme kertaa ja kuvattiin PBS Zeiss LSM 510 -konfokaalimikroskoopilla (lisätietoja kokeilun esitellään muualla [valmisteilla]). Olemme käyttäneet merkki samankaltainen Affibody-DyLight750-konjugaattia (Affibody-DyLight488), koska Zeiss LSM 510 -konfokaalimikroskoopilla ei toimi tällä lähi-infrapuna aallonpituuksilla.

Lisäksi vahvistaa yhdenmukaisuutta saatujen tulosten kanssa Affibody- DyLight750-konjugaattia ja arvioida elinikä Affibody koetin

in vitro

, FLIM microcopy soluviljelmien suoritettiin erityisesti sovitettu Olympus FV1000 käänteinen laser-skannaus kahden fotonin mikroskooppi [38] kuvantamiseen kautta ei- descanned havaitseminen väylän yhden fotonin tilassa. Vaikka nämä muutokset vähensi mikroskoopin syvyys resoluutio merkittävästi verrattuna konfokaalimikroskopialla, se saa osoittaa selvästi sitoutumisen HER2-Affibody-DyLight750-konjugaatin ulkokalvon HER2 positiivisia SK-BR-3-soluissa.

lyhyesti, kuvantamisen, Olympus-Fluoview 1000 galvo-peili laser skannaus mikroskooppi varustettu laajakaistaisen viritettävät ”Mai Tai DeepSee” Ti-Sapphire laser (by Newport Spectra-Physics) käytettiin. Laser asetettiin yhden fotonin eksitaatioaallonpituudella 717 nm (minimoida sirontaa by puoliläpäisevän peilin). Merkittävät laser vaimennus yhdistelmällä ortogonaalisen kalsiitti polarisaattorin ja metallisen harmaasuodin käytettiin välttää ilmaisimen kyllästymisen ja näyte fotobleknande. Näyte oli asennettu ylösalaisin vaiheessa 8-kuoppalevylle ja valaistu pitkän syötön 740-830 nm puoliläpäisevä peili (FF741-DI01 by Semrock) avulla vesi-upotus 0,8 NA LUMPlanFl N 40 × tavoite Olympuksen. Kaksi päällekkäin Newport Oriel 51350 väri lasi 780 nm longpass suodattimia käytettiin edessä punainen herkkä Peltier-jäähdytetään nopeasti nousu PMT moduuli (Becker Hickl malli PMC-100-20) poistamiseksi hajonta, toinen harmoninen sukupolven ja solujen autofluoresenssia . Koska ilmaisin asennettiin ei-descanned puolen portista ilman erityistä suodatusta, tehokkaasti Z-resoluutio laski merkittävästi hyväksi keräysteho. Nopeasti vastaus pii valodiodi (Becker Hickl malli PHD-400-N-12) käytettiin laser synkronointiin. Fotonilaskenta tapahtumia syrjitty, on rekisteröity ja määritetty pikselipaikkoihin Beckerin Hickl SPC-830 PCI aluksella. Data-analyysi suoritettiin SPCImage ver. 3.2 ohjelmisto Becker Hickl. Tyypilliset fotoni kertyminen vaihtelivat 60-300 s työllistää nopea kaksisuuntainen pyyhkäisytila ​​vähentämiseksi edelleen fotobleknande. Keskimääräinen laskentavilkkauden pidettiin hyvin alle 2 MHz välttämiseksi pulssien pileuppia.

Instrumentti reagoinnin, syntyy murskatuista ureakiteitä öljyssä, havaittiin niin toinen harmoninen sukupolven (laser viritetty 820 nm) läpi asianmukaisen setti dikroisilla /emissiosuodattimia ja mitataan FWHM ~190 ps (tässä tapauksessa määritettiin PMT siirtoaika leviämisen).

eläinten valmistelu

eläinkokeissa viljellyt syöpäsolut istutettiin oikeaan eturaaja on ksenograftin naisten nude-hiirissä. Viisi miljoonaa solua injektoitiin 0,1 ml: aan 50% Matrigel oikeaan eturaajan. Tutkimuksen hyväksyi National Institutes of Health Animal Care ja Käytä komitea (hyväksyntä ID: ROB117). Sen jälkeen, kun kasvaimet kasvoivat koko 0,5-1 cm, hiiret siirrettiin myös kuvantamisen tilat. Ennen kuvantaminen, hiiri nukutettiin isofluraani hengitettynä. Hiiri pantiin lämpötilaa valvotaan vaiheessa ja kaksi kuvien kasvaimen alueella ja takkaispuolelle vangittiin ennen injektiota. Sitten, 10 ug Affibody konjugoitu fluoresoiva koetin injektoitiin häntälaskimon kautta. Kuvat otettiin yhtäjaksoisesti 30 minuutin välein ensimmäisen 5 tuntia. Kasvainkudoksen uutettiin eläimistä 24 tunnin kuluttua HER2-Affibody-DyLight750 injektio, kiinnitettiin 10% neutraaliin burred formaliinilla (NBF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Kasvaimia värjättiin HER2 ilmaisun (Herceptest, Daco) ja Affibody jakaumakuvio.

On huomattava, että Affibody-DyLight yhdisteet eivät indusoi myrkyllisiä vaikutuksia rintasyövän soluissa, kuten osoitettiin

in vitro

kokeita soluviljelmissä (kokeellinen tiedot esitetään muualla [valmisteilla]). Edelleen vahvistaa alhaisesta toksisuudesta koetin

in vivo

, pidimme useita hiiriä injektoidaan annoksina jopa 0,5 mg /kg hengissä enintään 1 kuukauden kuluttua injektion Affibody-DyLight750 yhdiste noudattamatta mitään myrkyllisyyttä vaikutuksia hiirellä.

in vivo

Lifetime Imaging System

in vivo

elinaikanaan kuvantamisjärjestelmä koostui viritettävän pulssin laserin kanssa pulssin leveys 100 fs ja toistotaajuus 80 MHz. Laserin viritetty eksitaatioaallonpituudella 750 nm. Valopulssien skannattu kohde (kasvain tai takkaispuolelle) on eläimen rasterikuviota läpi lukupää, jossa lähde ja ilmaisin kuitujen 2 mm etäisyydellä. Eläin asetettiin pimeään kammioon on lämpötilaohjattu skannaus vaiheessa. Heijastunut fluoresenssi signaali suodatetaan 780 nm pitkän pass emissiosuotimen. Havaitut fotonit olivat vangiksi valomonistinputkella (PMT) ja fotonien laskettiin jonka aikakorreloitua Yhden fotonin counter (TCSPC). Alustus, skannaus, ja hankinta olivat ohjataan Labview ohjelmisto. Yksityiskohdat kuvantamisjärjestelmä löytyvät [15]. Fluoresenssi elinikä arvioitiin käyränsovitusmenetelmä datan yhdelle eksponentiaalista toimintoa optimoida iteratiivinen reconvolution yhden hajoavien eksponentiaalinen kanssa impulssivastefunktio järjestelmän. Me katkaistu pyrstö aikaerotteisen intensiteetin datan ansiosta enemmän alttius fotoni liikenteen suhteen vaihteluita. Meidän prekliinisissä tutkimuksissa, koska kasvain sijaitsee hiiren eturaajoja ihon alle, syvyys kasvain ei ole merkittävää vaikutusta eliniän kuitenkin sovelluksiin käsitellään syvällä kasvaimia, vaikutus fotoni diffuusio on havaittu aikaerotteisessa fluoresenssivoimakkuudet olisi otettava huomioon.

tulokset

In vivo

Study

tutkimiseksi sitovia HER2-specific Affibody fluoresoiva koetin HER2-reseptoria positiivinen kasvain fluoresenssin eliniän, kolme erilaista tapausta pidettiin. Ensimmäisessä tapauksessa HER2-erityinen Affibody (His6-Z

HER2: GS-Cys) optinen anturi ruiskutettiin hiiriin korkean HER2-ilmentävät ihmisen kasvain karsinoomia. Toisessa tapauksessa HER2-epäspesifinen Affibody (His

6-Z

Taq: GS-Cys) fluoresoiva koetin ruiskutettiin hiiriin samalla HER2-ilmentävät ihmisen kasvaimen karsinoomia kuin ensimmäisessä tapauksessa, ja kolmannessa tapauksessa, HER2 erityinen Affibody (His6-Z

HER2: GS-Cys) fluoresoiva koetin ruiskutettiin hiiriin ilman HER2-ilmentävä kasvain.

ensimmäisessä kokeessa, HER2-specific Affibody oli ruiskutetaan neljä hiirtä korkeatasoinen (+3) HER2-ilmentävät ihmisen kasvainten syöpä, BT-474. Kuva. Kuvio 2 esittää tulokset

in vivo

mittaukset fluoresenssi-intensiteetin ja elinikä tuumorin alueella ja takkaispuolelle. Kuva. 2C esittää ero fluoresenssin intensiteetti kasvain (Fig. 2A) ja kontralateraalisen sivustoja (Fig. 2B) 1 tunnin ajan injektion jälkeen, kartoitetaan kasvaimen alueella. Kuva. 2D esittää dynamiikka suurimman fluoresenssi-intensiteetin kasvaimen alueella ja takkaispuolelle 6 tuntia injektion jälkeen. Pikselin maksimi-intensiteetillä käytettiin luonnehtimaan kasvain. Fluoresenssi kartoitus on takkaispuolelle oli keskiarvona 16 pikseliä, koska ei ollut erityinen kohta kohdistaa tällä takkaispuolelle. Keskiarvon yli 16 pikseliä on käytetty melun vähentämiseen. Osoittaakseen vaihteluita eliniän ja fluoresenssin intensiteetti koko skannatun alueen esitimme karttoja fluoresenssin intensiteetti ja elinikä contralateral ja kasvaimen alueilla. Data esitetään kuviossa. 2D ja kuvio. 2H ovat keskiarvoja mittausten yli 4 hiirtä (Merkit tarkoittavat keskimääräistä ja palkit osoittavat keskihajonta). Kuva. 2G osoittaa ero fluoresenssin elinikä kasvain (Fig. 2E) ja kontralateraalisen sivustoja (Fig. 2F) 1 tunnin ajan injektion jälkeen, kartoitetaan kasvaimen alueelle. Fluoresenssin elinaika kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle yli 6 tunnin kuluttua injektion esitetään kuviossa. 2H. Kuvioissa. 2H, data, joka vastaa pikselin maksimi-intensiteetillä, käytettiin eliniän laskelmissa, koska se oli korkein signaali-kohina-suhde.

(A) Fluoresenssin intensiteetti kartan kasvaimen alueella. (B) Fluoresenssin intensiteetti kartan contralateral sivustolla (C) Ero Fluoresenssin intensiteetin kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle, kartoitetaan kasvaimen alueelle. (D) farmakokinetiikkaa fluoresenssin intensiteetin kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle injektion jälkeen ajan myötä. Fluoresoiva voimakkuus oli keskimäärin yli 16 pikselien takkaispuolelle. Tiedot kuvioissa. (D) ja (H) ovat keskimääräisiä tiedot neljä hiirtä. Merkkiaineet kuvaavat keskimääräisiä ja palkit esittävät keskihajonnan. (E) Fluoresenssi käyttöikä kartan kasvaimen alueelle. (F) Fluoresenssi käyttöikä kartan contralateral sivustolla. (G) Ero fluoresenssin elinikä kasvain ja takkaispuolelle kartoitettu kasvaimen alueelle. (E) Farmakokinetiikka fluoresoivan elinikä kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle injektion jälkeen ajan myötä. Kaikki käyttöikä ja fluoresenssin voimakkuutta karttoja numeroin 2,4-7 ovat mittauksista 1 tunnin kuluttua injektion Affibody koetin. Kaikissa mittauksissa fotonit laskettiin yli kahden sekunnin integrointiaika,

t

0

. Jos haluat sulkea pois kyllästyminen vaikutus 16 bitin ovin kirkkain pikseliä, kun vastaava raja 65536 laskee saavutettiin ennen aika

t

0

olemme renormalized datan kertomalla fotoneja laskee, mitataan alempi integrointiaika

t

, kertoimella

t

0 /t.

kaikissa kokeissa data vangittiin kasvain ja kontralateraalista sivustot samalla alueella kuin ensimmäisessä kokeessa. Fluoresenssin intensiteetti ja käyttöikää karttoja, päätimme mittaustietojen 1 tunti injektion jälkeen, joka vastaa tapausta, kun huomattava määrä fluoresoivia väriaineita oli saatavilla sekä kontralateraaliseen ja tuumorikohdissa.

esimerkkinä käyrien saatu SPCImage ohjelmisto, (ver. 3.2, Becker Hickl GmbH) on esitetty kuviossa. 3 mittauksiin sekä kasvaimen (Fig. 3A) ja kontralateraalisen (Fig. 3B) sivustoja. Nämä tiedot ovat mittaukset, suoritettiin 1 tunnin kuluttua injektion HER2-erityisiä Affibody, konjugoituna DyLight750, hiiren ihmisen kasvaimen -ksenograftia (BT-474). Tämä solulinja on tunnetusti korkea ilmentymisen HER2. Sininen ja vihreä kuvaajat esittävät mittaustiedot ja impulssivastefunktio järjestelmän, vastaavasti. Valaisin perustui yhteen eksponentiaalista mallia. Parametri a1 osoittaa sukulainen signaalin amplitudi käytetään yhtenä eksponentiaalista mallia ja t1 on elinikäinen (in picoseconds). Pieni kaavio alareunassa on sopiva virhe ja punainen viiva esittää sovitetun käyrän.

X-akseli on amplitudi ja y-akseli on mittauksen aika (ns). Sininen ja vihreä kuvaajat osoittavat, mittaustiedot ja impulssivastefunktio järjestelmän, vastaavasti. Valaisin perustui yhteen eksponentiaalista mallia. Parametri a1 osoittaa sukulainen amplitudi yhden eksponentiaalista mallia ja t1 on elinikäinen (in picoseconds). Pieni kaavio alareunassa on sopiva virhe ja punainen viiva osoittaa sovitetun käyrän.

Toisessa kokeessa, olemme käyttäneet kolme hiiriä samalla HER2 karsinooman (BT-474). Toisin kuin edellisessä kokeessa, joka on HER2-epäspesifinen Affibody (His

6-Z

Taq: GS-Cys) optinen anturi käytettiin varjoaineena. Tulokset on esitetty kuviossa. 4. Koska ei ole erityistä tukea Z

Taq affibody HER2 reseptoreihin, ei anturi sitovaa /kertymistä HER2 kasvaimissa havaittiin tässä kokeessa.

(A) Fluoresenssin intensiteetti kartan kasvaimen alueelle. (B) Fluoresenssin intensiteetti kartan contralateral sivustolla (C) Ero Fluoresenssin intensiteetin kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle, kartoitetaan kasvaimen alueelle. (D) farmakokinetiikkaa fluoresenssin intensiteetin kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle injektion jälkeen ajan myötä. Tiedot kuvioissa. (D) ja (H) ovat keskimääräisiä tietoja kolmesta hiirestä. Merkkiaineet kuvaavat keskimääräisiä ja palkit esittävät keskihajonnan. (Erpar; Fluoresenssin elinikä kartan kasvaimen alueelle. (F) Fluoresenssi käyttöikä kartan contralateral sivustolla. (G) Ero fluoresoivan elinikä kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle kartoitetaan kasvaimen alueelle. (E) Farmakokinetiikka ja fluoresoiva elinikä kasvaimen alueella ja takkaispuolelle injektion jälkeen ajan mittaan.

kolmannessa kokeessa kolme hiiret HER2-negatiivisten malli (MDA-MB-468) käytettiin tutkimuksessa. Jälleen HER2-spesifinen Affibody (His6-Z

HER2: GS-Cys) optinen anturi käytettiin fluoresoivaa varjoainetta. tässä nimenomaisessa ihmisen tuumorin malli, koska ei ole HER2 reseptoreihin tuumorin alueella, HER2 Affibody ei sitoudu kasvainsoluihin. intensiteetti sekä kasvaimen ja takkaispuolelle väheni merkittävästi 2-3 tuntia injektion jälkeen (kuvio. 5D). fluoresenssi käyttöikä havaittiin myös olevan sama sekä kasvaimen ja kontralateraalisen sivustoja (Fig. 5H).

(A) Fluoresenssin intensiteetti kartan kasvaimen alueelle. (B) Fluoresenssin intensiteetti kartan contralateral sivustolla. (C) Ero Fluoresenssin intensiteetin kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle, kartoitetaan kasvaimen alueelle. (D) farmakokinetiikkaa fluoresenssin intensiteetin kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle injektion jälkeen ajan myötä. Tiedot kuvioissa. (D) ja (H) ovat keskimääräisiä tietoja kolmesta hiirestä. Merkkiaineet kuvaavat keskimääräisiä ja palkit esittävät keskihajonnan. (E) Fluoresenssi käyttöikä kartan kasvaimen alueelle. (F) Fluoresenssi käyttöikä kartan contralateral sivustolla. (G) Ero fluoresoivan elinikä kasvain ja takkaispuolelle kartoitettu kasvaimen alueelle. (E) Farmakokinetiikka fluoresoivan elinikä kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle injektion jälkeen ajan myötä.

Samat kokeet toistettiin NCI-N87 kasvain malli. NCI-N87 solut ovat myös tiedetään olevan korkea HER2 ilmaisun [26]. Fluoresenssin intensiteetin ja elinikäinen mitattiin

in vivo

injektion jälkeen fluoresoiva koetin, joka perustuu joko HER2-specific Affibody (His6-Z

HER2: GS-Cys) tai HER2-epäspesifinen Affibody (His6-Z

Taq: GS-Cys). Tulokset on esitetty kuviossa. 6 ja kuvio. 7, vastaavasti.

(A) Fluoresenssin intensiteetti kartan kasvaimen alueelle. (B) Fluoresenssin intensiteetti kartan contralateral sivustolla. (C) Ero Fluoresenssin intensiteetin kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle, kartoitetaan kasvaimen alueelle. (D) farmakokinetiikkaa fluoresenssin intensiteetin kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle injektion jälkeen ajan myötä. Tiedot kuvioissa. (D) ja (H) ovat keskimääräisiä tietoja kolmesta hiirestä. Merkkiaineet kuvaavat keskimääräisiä ja palkit esittävät keskihajonnan. (E) Fluoresenssi käyttöikä kartan kasvaimen alueelle. (F) Fluoresenssi käyttöikä kartan contralateral sivustolla. (G) Ero fluoresoivan elinikä kasvain ja takkaispuolelle kartoitettu kasvaimen alueelle. (E) Farmakokinetiikka fluoresoivan elinikä kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle injektion jälkeen ajan myötä.

(A) Fluoresenssin intensiteetti kartan kasvaimen alueelle. (B) Fluoresenssin intensiteetti kartan contralateral sivustolla (C) Ero Fluoresenssin intensiteetin kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle, kartoitetaan kasvaimen alueelle. (D) farmakokinetiikkaa fluoresenssin intensiteetin kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle injektion jälkeen ajan myötä. Tiedot kuvioissa. (D) ja (H) ovat keskimääräisiä tietoja kolmesta hiirestä. Merkkiaineet kuvaavat keskimääräisiä ja palkit esittävät keskihajonnan. (E) Fluoresenssi käyttöikä kartan kasvaimen alueelle. (F) Fluoresenssi käyttöikä kartan contralateral sivustolla. (G) Ero fluoresoivan elinikä kasvain ja takkaispuolelle kartoitettu kasvaimen alueelle. (E) Farmakokinetiikka fluoresoivan elinikä kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle pistoksen jälkeen ajan myötä.

Ennen pistämistä fluoresenssin elinikä Dylight750, konjugoituna HER2-erityisiä Affibody (His6-Z

HER2: GS-Cys), mitattiin 0,71 ns. Kuitenkin elinikä Dylight750 konjugoituna HER2-epäspesifinen Affibody (His6-Z

Taq: GS-Cys) mitattiin 0,62 ns. Tämä eliniän ero HER2-erityisiä ja epäspesifinen olivat yhdenmukaisuus meidän in vivo mittauksia takkaispuolelle.

arvioimiseksi potentiaalinen panos autofluoresenssia osaksi mitatun fluoresenssivoimakkuudet, olemme mitanneet signaalia ennen anturin injektiota sekä kasvaimen ja kontralateraalista sivustoja. Kuviot. 8A-8B esittävät intensiteetti kartta 16 pikseliä kasvaimen alueelle ja takkaispuolelle ennen injektiota Affibody koetin.