Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epigenetiikka ajatellaan olevan tärkeä rooli syövän synnyn useita satunnaista peräsuolen syöpiä (CRC). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, yhtäpitävät DNA hypermetylaation välillä kasvaimen paria. Kuitenkin vain harvat metylaation markkereita on analysoitu. Tässä tutkimuksessa pyrittiin kuvaavat epigeneettiset allekirjoitus useita CRC käyttäen genomin mittakaavan DNA: n metylaatio profilointia. Analysoimme 12 potilaalla on synkronoitu CRC ja 29 ikä- ja sukupuolihormoneja, ja kasvaimen sijainti-pariksi potilailla, joilla on yksinäinen kasvainten EPICOLON II kohortissa. DNA: n metylaatio profilointi suoritettiin käyttäen Illumina Infinium HM27 DNA: n metylaatio määrityksessä. Merkittävimmät tulokset todensi MethyLightTM. Kasvaimet näytteet analysoitiin myös, että CpG Island Methylator Fenotyyppikuvaus (CIMP);

KRAS

ja

BRAF

mutaatioita ja yhteensopimattomuus korjauksen puute tila. Toiminnallinen merkintä klustereiden suoritettiin. Havaitsimme 102 CpG sivustoja, jotka osoittivat merkittävää DNA hypermetylaation useita kasvaimia suhteessa yksinäinen kollegansa (ero β arvo ≥0.1). MethyLight määritykset validoitu tulokset 4 valittujen geenien (p = 0,0002). Kahdeksan 12 (66,6%) useita kasvaimia luokiteltiin CIMP-korkea, verrattuna 5 out of 29 (17,2%) yksinäinen kasvaimet (p = 0,004). Mielenkiintoista, 76 pois 102 (74,5%) hypermetyloitunut CpG sivustoja löytyy useita kasvaimia havaittiin myös CIMP-korkea kasvaimet. Toiminnallinen analyysi hypermetyloitunut geenien löydetty useita kasvaimia osoitti rikastumista liittyvien geenien eri kasvaimia synnyttäviä toimintoja. Lopuksi useita CRC liittyy selvä metylaation fenotyyppi, jossa on tiiviin kasvainten lukumäärää ja CIMP korkea. Tuloksemme voi olla tärkeää selvittää taustalla olevan mekanismin kasvainten lukumäärää.

Citation: Gonzalo V, Lozano JJ, Alonso-Espinaco V, Moreira L, Muñoz J, Pellisé M, et al. (2014) Multiple satunnaisissa paksusuolisyövissä Näyttää Unique Metylointi fenotyyppiin. PLoS ONE 9 (3): e91033. doi: 10,1371 /journal.pone.0091033

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu 11 joulukuuta 2013 mennessä; Hyväksytty: 06 helmikuu 2014; Julkaistu 18 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Gonzalo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia klinikka Barcelona (Josep Font avustus), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2007-64873 ja SAF2010-19273), Fundación Científica de la Asociación Española contra el Cancer, ja Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). ”Cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (EAKR). Unión Europea. Una manera de hacer Europa ”. CIBEREHD rahoittaa Instituto de Salud Carlos III. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

jopa 10% kaikista peräsuolen syöpä (CRC) potilaille kehittyy enemmän kuin yksi kasvain colorectum joko synkronisesti (diagnosoitu samanaikaisesti) tai metachronously (diagnosoitu seurannan aikana) [1], [ ,,,0],2], [3]. Kasvainten lukumäärää ajatellaan aiheutua yhteisen etiologic tekijä (geneettinen tai ympäristö-) ja antaa hyvän mallin tutkia yhteisiä molekyylitason muutoksia ja tarkemmin, potentiaalinen kenttä vaikutus [4], [5], [6], [7 ]. Genetics selittävät vain osan spektristä useita CRC, etenkin esiintyvät yhteydessä Lynch oireyhtymä (johtuu mutaatioista yhteensopimattomuuden korjaavien geenien) [8], [9], [10], familiaalinen liittyvät polypoosin (FAP) [ ,,,0],11],

MUTYH

liittyy polypoosin (MAP) [11] ja muiden paksusuolen polypoosin [12]. Toisaalta, käsite näkökenttäpuutoksesta on ehdotettu selittämään kasvainten lukumäärää kautta yleisen matkapuhelinverkon tai molekyylin häiriö koko peräsuolen limakalvon, mikä aiheuttaa oletetun kentän vaikutus (niin kutsuttu ”field cancerization”) [6], [7] , kuten sahalaitaiset polypoosin oireyhtymä [13], [14], [15]. Kuitenkin lopullinen taustalla patogeenisen mekanismin kasvainten lukumäärää edelleen heikko.

Ei-perinnöllinen skenaario, aiemmat tutkimukset ovat löytäneet yhteisiä molekyylitason muutos kuvioita välillä CRC parien ja normaalissa paksusuolen limakalvo potilaalla on kerrannaisia ​​Kolorektaalituumorien, tukemalla oletetun näkökenttäpuutoksesta [4], [10], [14], [16]. Toisin kuin geneettisiin muutoksiin, joita ei yleisesti todettu normaalissa limakalvon syöpäpotilaista, epigenetiikan ajatellaan olevan tärkeä rooli syövän synnyn niiden henkilöiden, jotka kehittävät useita kasvaimia [4], [5], [14], [17 ], [18], [19], [20], [21]. Tässä mielessä se on ehdotettu, että synkroninen CRC liitetään useimmin kanssa CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) [4],

BRAF

mutaation ja microsatellite epävakautta [10]. Todellakin, ryhmämme verrattuna joukon 41 pareittain useita ja yksinäinen CRC ja tunnistettu hypermetylaatiota

MGMT2

lokuksen ja

RASSF1A

geeni muuttujina itsenäisesti liittyy kasvainten lukumäärää. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet yhdenmukaisia ​​metylaatiovyöhykkeiden kasvaimen pareittain [4], [14], [17], [18]. Toisaalta, maailmanlaajuisen DNA hypometylaatio on liitetty genomin epästabiilisuuden ja syövän syntymistä [22], [23] ja viime aikoina korkeampia hypometylaatio LINE-1 (surrogaattimarkkerina globaalin DNA: n metylaation) normaalissa paksusuolen limakalvo on todettu olla Tunnusomaista potilaalla on synkroninen CRC [14]. Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että yhteisiä ympäristö- ja /tai geneettinen tausta voi aiheuttaa yhtäpitävät malleja DNA: n metylaation potilailla, joilla on useita kasvaimia. Kuitenkin vain harvat metylaation markkereita on analysoitu ja suurikapasiteettisten tekniikoiden kanssa genomin laaja kyky tarvitaan löytää ja ymmärtää paremmin taustalla epigeneettiset allekirjoitus useiden satunnaista CRC.

Tässä tutkimuksessa, jonka tavoitteena on kuvaava taustalla epigeneettiset allekirjoitus, joka erottaa useita päässä yksinäinen CRC kasvaimia käyttämällä genomin laajuinen lähestymistapa. Tätä varten analysoimme 12 synkroninen ja 29 ohjaus yksinäinen CRC johdettu väestöpohjainen EPICOLON-II kohortti, ja arvioidaan genomin mittakaavan metylaatio profiilin käyttäen Illumina Infinium HM27 DNA metylaatiomääritystä, lähestymistapa, jota ei ole aiemmin yritetty.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat ja näytteet

Kaksitoista potilasta synkronoitu CRC ja 29 ikä- ja sukupuolihormoneja, ja kasvaimen sijainti-pariksi potilailla, joilla on yksinäinen kasvaimia rekrytoitiin EPICOLON II kohortti, monikeskustutkimus väestöpohjainen tutkimus suoritettiin Espanjassa vuosien 2006 ja 2007 [24]. Synkroninen kasvaimia selvästi erottaa normaalit paksusuolen limakalvolla molemmat olivat invasiivisia (ainakin pT1). Potilaita seurattiin, kunnes kuolema tai maaliskuuta 2012, kumpi tuli ensin. Väestörakenteen, kliininen ja kasvaimeen liittyvät piirteet potilaiden mukana tutkimuksessa on koottu taulukkoon 1. Poissulkemisperusteet tähän tutkimukseen oli peräsuolen polypoosia oireyhtymiä, Lynch oireyhtymä, ja henkilökohtainen historia tulehduksellinen suolistosairaus. Institutionaalinen eettinen komitea kunkin osallistuvan sairaalan (ks Kiitokset) hyväksyi tutkimuksen ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Frozen kasvain peräsuolen kudoksista saatiin leikkauksen kaikista potilaista, ja heti tallennettu -80 ° käyttöön saakka. Jos potilaalla on useita leesioita, kudosnäyte saatiin yksi kasvaimia (pisimmällä tai suurin yksi, kun useita kasvaimia oli sama kasvain vaihe).

DNA: n eristämistä ja bisulfiittikonversion

jäädytetyt näytteet sulatettiin ja genominen DNA eristettiin käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vetysulfiittikäsittelyä suoritettiin genominen DNA käyttäen EZ DNA Metylointi-Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA) valmistajan protokollan.

Infinium array

Me tehdään DNA: n metylaatio profilointi alkaen 12 synkroninen ja 29 yksinäinen CRC käyttäen Infinium metylaatiomääritystä kanssa HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, San Diego, CA), joka pystyy samanaikaisesti analysoida metylaatiostatuksen 27578 yksittäisten CpG aluetta ja 14495 proteiinia koodaavan geenien ja 110 miRNA [25], [ ,,,0],26], [27]. Koko genomin vahvistus, merkintöjä, hybridisaatio ja skannaus suoritettiin mukaan valmistajan ohjeiden at ydin laitokseen (Centre de Regulació Genòmica, Barcelona, ​​Katalonia, Espanja). Metylaatiostatuksen mitattiin suhde signaalin metyloidut koetin suhteessa sekä metyloidut ja metyloitumaton anturi signaaleja. Metylointi suhdelukuja eristettiin käyttäen metylaation-moduuli Illumina Bead Studio seuraavat keskimääräiset normalisointi. Kvantitatiivinen β-arvo vaihtelee välillä 0 (0% metylaatio) 1 (100% metylaatio). P-arvo katkaista Havaitut koettimia (eroaa taustamittaukset) asetettiin 0,05. Me ulkopuolelle koettimia, jotka olivat aiemmin julkaistut epäluotettavina (jotka sisältävät yhden nukleotidin polymorfismien (SNP: t) ja ne toistuvat sekvenssit joka peitti kohdennetut CpG) ja ne, jotka oli suunniteltu sekvenssit joko X tai Y-kromosomi. Yhdessä me naamioitu datapisteet 7549 antureista [27]. Täydellinen microarray aineisto on saatavilla GEO (Gene Expression Omnibus; hakunumero GSE52573).

Määritelmä CIMP korkea kasvaimia perustuu Infinium määrityksen

luokiteltu kasvaimissa CIMP-korkea (CIMP- H), CIMP-low (CIMP-L) ja CIMP-0, joka perustuu 2-vaihe paneelit markkereita äskettäin kuvanneet Hinoue

et ai

perustuu Illumina Infinium HM27 DNA metylaatiomääritystä [27]. Ensimmäinen paneeli (

B3GAT2

,

FOXL2

,

KCNK13

,

RAB31

, ja

SLIT1

) on määritellyt näytteen CIMP (High and Low) versus CIMP-0 jos β-arvo on ≥0.1 kolmen tai useamman markkereita. Toinen merkki paneeli (

FAM78A

,

FSTL1

,

KCNC1

,

MYODCD

ja

SLC6A4

) erottaa CIMP-H versus CIMP-L kasvaimia jos β-arvo on ≥0.1 kolmen tai useamman markkereita (taulukko 2). Nämä merkit ovat osoittaneet näyttämään 100% herkkyys ja 100% tarkkuus tunnistaa CIMP-H kasvaimia [27].

tekninen validointi Infinium määrityksen avulla MethyLightTM

MethyLightTM tekniikka määrällinen analyysi metylaation käytettiin tekniseen validointiin tulosten havaittiin Illumina Infinium määritys [28]. Seuraavat tiukat kriteerit käytettiin valittu kandidaattigeenit validointi: 1) yksinäinen kasvain oli β arvo 0,2; ja 2) useita kasvaimia oli joko β arvon 0,3 ja ero β arvon ≥0.2; ja 3) säädettiin p-arvo 0,05; ja 4) aikaisemmat kasvaimen ehkäisevästä ominaisuuksia perustuvat julkaistuun kirjallisuuteen. Näiden kriteerien, valitsimme 4 geenit tekniseen validointiin (

MAP1B, HTRA1, ALOX15, TIMP-3

). Locus PCR alukkeiden ja koettimien on listattu taulukossa S1 ja oli erityisesti suunniteltu bisulfited muunnetaan DNA-sekvenssit ja jotka sijaitsevat kussakin geenin promoottorialue. MethyLight suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu, käyttäen ALUC4 sisäisenä kontrollina [17], [28].

Arviointi Kasvaimen yhteensopimattomuuden korjauksen puutos

Kasvaimen yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmä puutos arvioitiin sekä microsatellite epävakaus ( MSI) testaus ja immunovärjäys arvioida myös MSH2, MLH1, MSH6 ja PMS2 kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. MSI tila arvioitiin käyttämällä BAT26 ja NR24 quasimonomorphic markkereita, kuten aikaisemmin on kuvattu [30]. Kasvaimet luokiteltiin MSI kun jompikumpi kahdesta markkereita oli epävakaa.

arviointi

BRAF

ja

KRAS

mutaatiostatus

BRAF

mutaatiot kodonissa 600 eksonissa 15, ja

KRAS

mutaatio kodoneissa 12 ja 13 eksonissa 2 analysoitiin MethyLightTM ja suoralla sekvensoinnilla, vastaavasti, kuten aiemmin julkaistu [31].

toiminnallinen merkinnästä klusterointi erilaisesti metyloitua geenien välillä useita ja yksinäinen kolorektaalisyövissä

käytimme Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID) [32] tunnistaa polkuja merkitystä syövän synnyn perustuu geeneihin, jotka osoittivat merkittävästi erilaiseen metylaatio välillä useita ja yksinäinen useita kasvaimia (ero β arvon ≥0.1 ja p 0,05) (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov).

tilastollinen

Logistic regressio oikaistu iän, sukupuolen ja kasvaimen sijainti käytettiin arvioimaan eron DNA metylaatio β-arvot kullekin koetin kahden itsenäisen ryhmää. Illumina Infinium DNA: n metylaatio β-arvot graafisesti käyttäen lämpökarttana, syntyy R /Bioconductor paketteja. Kliinis-verrattiin käyttäen Chi-square (laadullinen muuttujat) ja t-testit (määrälliset muuttujat). MethyLight kvantitatiivinen data (prosentteina metylaatio suhde, PMR) analysoitiin käyttämällä U-testi. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Tilastollinen analyysi ja tietojen visualisointia tehtiin käyttämällä R /Bioconductor ohjelmisto ja SPSS ohjelmistoa (V.15).

Tulokset

Differential metylaatio välillä useita ja yksinäinen kasvaimia

kaksitoista potilasta, joilla on useita CRC ja 29 ikä- ja sukupuolihormoneja, ja kasvaimen sijainti-pariksi potilailla, joilla on yksinäinen kasvaimia muodosti tämän tutkimuksen perusteella. Demografiset ja kasvaimen ominaisuuksiltaan potilaista tässä tutkimuksessa on lueteltu taulukossa 1. Me käytetään Illumina Infinium HM27 DNA metylaatiomääritystä, joka arvioi DNA metylaatiostatuksen 27578 CpG sivustoja sijaitsee promoottorialueet yli 14000 proteiinia koodaavan geenejä. Havaitsimme 102 CpG sivustoja, jotka osoittivat merkittävää DNA hypermetylaation useita kasvaimia suhteen yksinäinen niitä (ero β arvon ≥0.1 ja p 0,05). Käyttämällä tiukempia kriteerejä (ero β arvo ≥0,2; p 0,05), tunnistimme 36 CpG sivustoja merkittävästi hypermetyloitunut (katso yksityiskohtainen luettelo geenien taulukossa S2). Lämpökarttana osoittaa merkittävimmin hypermetyloitunut CpG sivustoja, jotka erottavat useita ja yksinäinen kasvaimia on esitetty kuviossa 1. Nämä tulokset osoittavat, että useita kasvaimia liittyy selvä metylaation fenotyyppi, iästä, sukupuolesta ja kasvaimen sijainnista.

DNA metylaatio β-arvot esitetään käyttäen väri mittakaavassa punaisesta (korkea DNA metylaatio) vihreäksi (matala DNA metylaatio). Rivit edustavat antureista ja pylväät edustavat kasvaimen näytteitä. Kliiniset ja molekyylitason ominaisuuksia (ryhmä, sukupuoli, kasvaimen sijainti, CIMP-H ja

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta) ovat edustettuina yläpuolelle heatmap vaakasuora baareissa.

Tekninen validointi microarray tulosten

jotta teknisesti tulosten validointiin Infinium määrityksen käytimme tiukat ehdot valitaan antureista, joita on huomattavasti hypermetyloitunut useita kasvaimia verrattuna yksinäinen vaurioita (β arvo yksinäinen kasvaimissa 0,2; β arvo 0,3 useina kasvaimet; ero β arvon välillä useita ja yksinäinen kasvaimia ≥0.2, ja oikaistu p-arvo 0,05). Jotta valita biologisesti relevantteja CpG sivustoja, me etusijalle geenejä aiempien näyttöä tuumorisuppressorin ominaisuuksia. Näiden kriteerien, valitsimme

MAP1B

,

HTRA1

,

ALOX15

, ja

TIMP-3

validoitavaksi viidessä pariksi useita ja yksinäinen kasvaimia. Tulokset on esitetty kuviossa 2. Yleisesti, löysimme merkittävästi korkeampi metylaatiotasoilla useita kasvaimia verrattuna yksinäinen niitä (yleisesti PMR, 14% vs. 2,7%, vastaavasti; p = 0,0002). Kuten kuviossa 2 on esitetty, kaikki neljä merkkiä osoitti korkeampaa metylaation useita kasvaimia suhteessa yksinäinen niitä, mikä vahvistaa yhdenmukaisuuden meidän tuloksia.

neljä geeneistä (

MAP1B, HTRA1, ALOX15, TIMP-3

) valittiin perustuu tiukkoihin kriteereihin (β arvo yksinäinen kasvaimissa 0,2; β arvo 0,3 lukuisia kasvaimia; eroa β arvon välillä useita vs. yksinäinen ≥0.2, ja oikaistu p-arvo 0,05). Box-tonttien näyttää Prosenttiosuus Metylointi Ratio (PMR) määräytyy MethyLightTM. Linjat sisällä laatikot merkitsevät mediaani, ja laatikot merkitse väli 25. ja 75. prosenttipisteet. Mustat viivat tarkoittavat suurimman ja pienimmän PMR arvo. P-arvot, kun verrataan useita (punainen) ja yksinäinen (sininen) kasvaimet (Mann-Whitney koe) on esitetty.

CIMP-korkea liittyy kasvainten lukumäärää

Seuraava analysoi CIMP asema useiden ja yksinäinen kasvaimia perustuu äskettäin kehitetty geenin markkeripaneelit määritelty Hinoue

et al

[27]. Tämä paneeli on viime aikoina osoittanut parempaan MethyLightT-pohjainen viiden markkeripaneelin kuvannut WEISENBERGER [33]. Kymmenen ulos 12 (83%) useita kasvaimia ja 25 ulos 29 (86,2%) yksinäinen CRC osoitti hypermetylaatiota kolme tai enemmän markkereita ensimmäisestä paneelista (eli

B3GAT2

,

FOXL2

,

KCNK13

,

RAB31

, ja

SLIT1

), joten ne luokiteltiin CIMP kasvaimia. Perustuen toinen paneeli (eli

FAM78A

,

FSTL1

,

KCNC1

,

MYOCD

, ja

SLC6A4

), 8 ulos 12 (66,6%) useita kasvaimia lopulta luokiteltu CIMP-H, verrattuna 5 ulos 29 (17,2%) yksinäinen kasvaimet (p = 0,004) (taulukko 2). CIMP-H kasvaimia havaitaan tarjoavan merkittäviä hypermetylaation (ero β arvon ≥0.1; p-arvo 0,05) 301 CpG sivustoja (109 ero β arvon ≥0.2; p-arvo 0,05). Lämpökarttana osoittaa merkittävin CpG sivustoja, jotka erottavat CIMP-H ja CIMP-L /0 kasvaimia on esitetty kuviossa 3. Yksityiskohtainen luettelo CIMP-H hypermetyloitunut CpG sivustoja on esitetty taulukossa S3. Mielenkiintoista, 76 pois 102 hypermetyloitunut CpG sivustoja useita kasvaimia myös nähtävä hypermetyloitunut CIMP-H kasvaimet (kuva 4). Ei ollut

BRAF

mutaatioiden tahansa kasvain. Tuloksemme osoittavat tiiviin kasvainten lukumäärää ja CIMP, iästä, sukupuolesta ja kasvaimen sijainnista. Tämä havainto on yhtäpitävä aiemman suuremman tutkimuksessa, jossa kasvaimet luokiteltiin käyttäen MethyLightTM-pohjainen merkkiaineita [4], mikä vahvistaa kentällä vika teoriassa.

DNA: n metylaatio β-arvot esitetään käyttäen väri asteikolla punainen (korkea DNA metylaatio) vihreäksi (matala DNA metylaatio). Rivit edustavat antureista ja pylväät edustavat kasvaimen näytteitä. Kliiniset ja molekyylitason ominaisuuksia (ryhmä, sukupuoli, kasvaimen sijainti, CIMP-H ja

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta) ovat edustettuina yläpuolelle heatmap vaakasuora baareissa.

Sininen rengas näyttää 102 hypermetyloitunut CpG sivustoja löytyy useita versus yksinäinen kasvaimia ja keltainen ympyrä esittää 301 hypermetyloitunut CpG sivustoja CIMP-H versus CIMP-L /0 kasvaimia. Merkillistä, 76 pois 102 hypermetyloitunut geenien useita kasvaimia myös nähtävä hypermetyloitunut CIMP-H kasvaimia, ja ne edustettuina risteystä.

Association between

KRAS

mutaatioita ja hypermetylaation

KRAS

mutaatioita on assosioitunut metylaation fenotyypin nimeltään CIMP-alhainen, jossa hypermetylaatiota pienempi määrä CIMP-määrittelyssä loci esiintyä [27]. Olemme pyrkineet tutkimaan metylaatio profiilin liittyy

KRAS

mutantti kasvaimia ja sen yhdessä kasvainten lukumäärää. Olemme havainneet, että

KRAS

mutantti kasvaimia edustettuina sekä useita ja yksinäinen kasvaimia (33,3% vs. 43,4%, vastaavasti; p = 0,7) (kuvio 1). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että

KRAS

mutantti kasvaimia osoitti selvästi metylaatio profiilia kuin

KRAS

villityypin kasvaimia. Havaitsimme 189 CpG sivustoja, jotka osoittivat merkittävää DNA hypermetylaation in

KRAS

mutantti CRC suhteen

KRAS

villityypin kasvaimia (ero β arvon ≥0.1 ja p 0,05). Käyttämällä tiukempia kriteerejä (ero β arvo ≥0,2; p 0,05), tunnistimme 92 CpG sivustoja merkittävästi hypermetyloitunut. Yksityiskohtainen luettelo

KRAS

-associated hypermetyloitunut CpG sivustoja on esitetty taulukossa S4 ja kuvio S1. Prosenttiosuus CIMP-H ei ollut eroa

KRAS

mutantti ja villityypin kasvaimia (23% vs. 35%, vastaavasti; p = 0,7). Vastaavasti osuus CIMP-low ei ollut eroa

KRAS

mutantti ja villityypin kasvaimia (69,2% vs. 55%, vastaavasti; p = 0,485). Kaiken kaikkiaan vaikka huomasimme, että

KRAS

mutatoitunut kasvaimia näyttää selvä metylaation profiileja, oli yhdessä ei kasvainten lukumäärää eikä CIMP tila.

toiminnallinen analyysi ero metylaation havaittu useita peräsuolen syöpä

Teimme rikastamiseen analyysi 102 hypermetyloitunut antureista havaita useita kasvaimia (β arvo 0,1; p 0,05) käyttäen Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery väline, jotta löydettäisiin toimiva korrelaatio mitään karsinogeenisia polku mukana syövän synnyn. Tämä toiminnallinen analyysi osoitti, että läsnä ja rikastamiseen liittyvien geenien eri tuumorigeenisia toiminnot: cell liike (12 geenit), solumigraation (7 geenejä), väyliä syövän (8 geenit), soluliikkuvuus (7 geenit), solujen jakautumisen ( 11-geenit), transkriptiotekijä aktiivisuus (14-geenien), ja transkription säätelyyn, (17-geenien) (taulukko 3). Täysi lista toiminnallisen annotation klusterointi erilaisesti metyloitua geenien on esitetty taulukossa S5.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin ensimmäistä kertaa genomin mittakaavassa DNA metylaatio profiilia kasvain kudoksia potilailta, joilla on useita ja yksinäinen CRC rekrytoidaan väestöpohjaisen kohortti. Huomasimme, että kasvainten lukumäärää liittyy selvä metylaation profiilia, iästä, sukupuolesta tai kasvaimen sijainnista. Verrattuna yksinäinen kasvaimia, useita CRC osoittivat merkittäviä hypermetylaation spesifisissä CpG sivustoja ja mielenkiintoisesti, oli vahva yhdessä CIMP-H on kuvattu CRC. Toiminnallinen analyysi erilaisesti metyloitua CpG sivustoja useita kasvaimia osoitti rikastumista liittyvien geenien eri kasvaimia synnyttäviä toimintoja. Tulokset Metylointia profiloinnin kelpoistettiin onnistuneesti kvantitatiivinen PCR-määrityksissä. Kaiken tietomme antaa uutta tietoa alan cancerization vaikutus ja peräsuolen syövän syntymistä ei-perinnöllinen tapauksissa. Tämä tutkimus osoittaa, että somaattisia hypermetylaation tärkeä rooli kasvainten lukumäärää ja voi muodostaa mielenkiintoisen biomarkkeri CRC riskinarviointia.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet tiiviin poikkeava DNA: n metylaation ja kasvainten lukumäärää [4], [14 ], [16], [17], [18]. Nosho ja työtovereiden [4] analysoitiin 47 potilaalla on synkronoitu CRC ja 2021 yksinäinen kasvaimet useita metylaation markkereita, mukaan lukien 8 CIMP erityisiä CpG saari (eli

CACNA1G

,

CDKN2A

,

CRABP1

,

IGF2

,

MLH1

,

NEUROG1

,

RUNX3

, ja

SOCS1

) ja löysi merkittävää yhteyttä välillä kasvainten lukumäärää ja läsnäolo CIMP-korkea (35% synkronisessa kasvaimissa versus 8% yksinäinen kasvaimissa; p = 0,036). Vielä tärkeämpää on, havaitsivat yhtäpitävän metylaation kasvain paria. Samoin Konishin ja työtovereiden [18] analysoidaan metylaatiostatuksen rajoitettu määrä päättäjien 57 useita kasvaimia ja 69 yksinäinen CRC, ja totesi, että metylaatiostatuksen

p14

ja

MGMT

oli merkitsevästi suurempi useita kasvaimia, jotka osoittavat yhtäpitävät metylointi jostain merkkiaineiden kasvaimiin paria saman paksusuolen sivustolla. Mukaisesti näiden havaintojen, olemme aikaisemmin osoittaneet, että hypermetylaatiota

MGMT

ja

RASSF1A

on itsenäisesti liittyy kasvainten lukumäärää [17]. Toisessa tutkimuksessa Kamiyama ja työtovereiden [14] analysoidaan metylaatiostatuksen pitkien välissä nukleotidin elementti-1 (LINE-1) in Hyväksytty syöpäkudoksessa ja ei-syöpä paksusuolen limakalvolla potilaista yhden ja usean oikeanpuoleista CRC. Tekijät havaitsivat suurempi hypometylaatio LINE-1 sekä kasvain ja normaali limakalvo potilaista, joilla on useita kasvaimia verrattuna potilaisiin, joiden yksinäinen kasvaimia, ja mikä tärkeintä, LINE-1 hypometylaatio oli itsenäinen ennustaja metachronous kasvaimet (p = 0,003). Kirjoittajat ehdottivat, että LINE-1 hypometylaatio normaalissa limakalvon voitaisiin käyttää epigeneettisestä ennakoivaa biomarkkereiden useita CRC riskin. On tärkeää huomata, että LINE-1 hypometylaatio on aiemmin todettu korreloivan käänteisesti kanssa CIMP fenotyypin, joka voi olla ristiriidassa meidän ja aiempien tutkimusten. Kuitenkin korrelaatio LINE-1 hypometylaatio ja CIMP useita kasvaimia ei ole tutkittu perusteellisesti, ja erot potilaiden valinnassa ja menetelmät voivat selittää näitä odottamattomia tuloksia. Myös muut tutkimukset ovat arveltu, että geneettisen ja epigeneettiset maiseman tietyn kasvaimen määräytyy sijainti paksusuolessa, ja että vastaavia molekyyliprofiilien Synkronointisäädön kasvaimia vaikuttavat läheisyys [34], [35]. Valitettavasti emme voineet subanalyze tätä kysymystä johtuu puuttumisesta toisen kasvaimen. Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että kertyminen poikkeava DNA: n metylaation tapahtuu pääasiassa henkilöillä, joilla on taipumus kehittyä useita kasvaimia. Tulokset Tämän tutkimuksen paitsi kannattavat tätä olettamusta, mutta myös uusia todisteita siitä epigeneettiset maisema potilaalla on useita kasvaimia. Taustalla mekanismi yhdistyksen välillä poikkeava metylaatio ja moninaisuus on vielä tuntematon. Jotkut kirjoittajat ovat ehdottaneet perinnöllinen alttius joissakin tapauksissa [14], kanssa kertyminen metylaation virheiden ikääntymisen aikana on geneettisesti alttiita alaryhmä yksilöitä. Kuitenkin tämä hypoteesi ei ole osoitettu ja tulevia tutkimuksia tarvitaan.

Tässä tutkimuksessa onnistuneesti vahvistanut MethyLightTM metylaatiostatuksen 4 erilaisesti metyloitua CpG sivustoja havaittu tietojenkeruuvaiheessa tutkimuksen. Tarkemmin, havaitsimme, että

MAPB1B

,

HTRA1

,

ALOX15

, ja

TIMP-3

merkittävästi hypermetyloitunut useita kasvaimia.

MAP1B

(Microtubule liittyvä proteiini 1 B) on aiemmin osoitettu olevan hypermetyloitunut CIMP-korkea kasvaimet ilman MSI, jotka pääasiassa vastaavat ryhmän kasvainten analysoitu tutkimuksessamme [36].

HTRA1

kuuluu htrA (korkean lämpötilan Vaatimus tekijä A) seriiniproteaasien ja sillä on suojaava rooli oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, koska sen kasvain tukahduttava ominaisuuksia [37], [38], [39] .

HTRA1

on osoittautunut vaiennetaan kautta promoottori hypermetylaation [38], ja ehdotti mahdollisena uusi biomarkkereiden diagnoosin ja ennusteen useissa syövissä.

ALOX15

(15-lipoksigenaasin tai 15-LOX) on indusoituva ja erittäin säännelty entsyymi normaaleissa ihmisen soluissa, jotka on avainasemassa tuotannossa lipidien signalointi välittäjäaineiden.

ALOX15

on viime aikoina osoitettu olevan säädellä vähentävästi CRC ja toimii tuumorisuppressorina edistämällä eri antituumorigeenistä tapahtumia, kuten solujen erilaistumista ja apoptoosia ja estää krooninen tulehdus, angiogeneesi ja metastaasi [40]. Lopuksi, Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-3 (

TIMP-3

) on todettu vaiennettu vuonna useiden syöpätyyppien mukaan promoottorigeenin hypermetylaation, mukaan lukien CRC [41], [42]. Kaiken kaikkiaan tuloksemme osoittavat, että useita kasvaimia liittyy hypermetylaatiota vakiintunut tuumorisuppressorigeeneille.

Riippumatta oleva mekanismi takaa vahvan yhteyden poikkeava metylaatio ja kasvainten lukumäärää, tulokset viittaavat siihen, että metylaatiostatuksen markkereita voidaan käyttää osittaa riski kasvainten lukumäärää. Kamiyama ja kollegat osoittivat äskettäin, että LINE-1 metylaatiostatuksen normaalissa paksusuolen limakalvon voisi ennustaa kehitystä metachronous CRC suurella herkkyydellä [14], mikä edustaa kliinisesti merkittävä ennustetekijöitä biomarkkereiden tunnistamiseen ”korkean riskin” potilaille. Samoin analyysi metylaatiostatuksen markkereita tunnistettu tutkimuksessamme voidaan käyttää kliinisessä tilanteessa tunnistamaan korkean riskin potilailla ja räätälöidä valvonnan strategia. Tulevien tutkimusten nimenomaan analysoida tätä hypoteesia on kuitenkin perusteltua.

Tärkein vahvuus tässä tutkimuksessa on, että käytimme väestöpohjaisen kohortti hyvin kuvattu CRC tapauksissa minimoiden siten valinta bias. Lisäksi käytimme ensimmäistä kertaa genominlaajuisia metylaatio profiloinnin Illumina Infinium määritys tässä asetelmassa. Olemme kuitenkin tietoisia joitakin rajoituksia. Ensinnäkin, emme analysoi DNA: n metylaation korrelaation kasvaimen pareittain vuoksi suunnittelun EPICOLON II hanke, jossa vain yksi kasvain kerättiin. Toiseksi CIMP määritelmä ei perustunut aiemmin kuvattu metylaatio merkkiaineita [33]. Kuitenkin, tällä hetkellä ei ole yksimielisyyttä määritelmää CIMP kasvaimet ja Hinoue ja kollegat [27] osoittivat äskettäin, että uusi paneeli, joka perustuu Illumina Infinium DNA: n metylaation alustan ylitti MethyLightT-pohjainen viiden markkerin paneeli (eli

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

ja

SOCS1

). Taajuus CIMP korkean taajuuden yksinäinen CRC havaittu tutkimuksessamme (17%) vastaa edellisten kuvioiden, joka vahvistaa tarkkuutta uuden paneelin ehdottamaa Hinoue

et al.

Kolmanneksi tutkimuksessamme , ei ollut

BRAF

mutantti kasvaimia, ja sen mukaisesti, yhdistys kasvainten lukumäärää, jolla on erityistä metylaation fenotyyppi viittaa ainoastaan ​​CIMP korkea /

BRAF

villityypin kasvaimia, jotka voivat olla jopa 40% of CIMP-korkea kasvaimet. Lopuksi tuloksemme tulee virallisesti huomioon ei tilastollisesti merkitsevä haettaessa useita testaus korjauksia, lisätutkimuksia muissa ikäluokat ovat tarpeen tulosten varmistamiseksi. Emme kuitenkaan pystyneet vahvistamaan joitakin merkittävimpiä hypermetyloitunut CpG sivustoja MethyLightTM, mikä vahvistaa pätevyyden tuloksemme.

Yhteenvetona tuloksemme ovat sopusoinnussa hypoteesin, että kasvainten lukumäärää liittyy selvä kuvio poikkeava metylaatio. Verrattuna yksinäinen kasvaimia, useita CRC näyttää useammin CIMP-H ja hypermetylaation muissa paikka-. Tuloksemme voi olla tärkeää selvittää taustalla olevan mekanismin kasvainten lukumäärää ei-perinnöllinen skenaario, ja tarjota uusia mahdollisia biomarkkereita tunnistaa korkean riskin potilailla ja räätälöintiä valvontastrategiat.

tukeminen Information

Kuva S1.

Heatmap esittää 172 merkittävimmin hypermetyloitunut CpG-sivustoja, jotka erottavat KRAS mutantti (n = 13) verrattuna KRAS villityypin kasvaimia (n = 28), joka perustuu Infinium DNA: n metylaation tietoja.