Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useat kopiomäärä-muuttunut alueilla (CNAs) on havaittu genomissa kohdunkaulan syövän, erityisesti, monistumiset of 3q ja 5p. Kuitenkin osuus kopioluvun muutoksia kohdunkaulan syövän synnyn on ratkaisematta, koska genominlaajuisten olemassa välisen korrelaation puuttuminen kopioluvun muutoksia ja geenin ilmentymisen. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko CNAs solulinjoissa calo, CaSki-, HeLa-, ja SiHa liittyi muutoksia geenien ilmentyminen. Keskimäärin 19,2% solun line genomien oli CNAs. Kuitenkin vain 2,4%, joka koostuu vähän toistuvien alueiden (MRRs) yhteinen kaikille solulinjat. Kun taas 3q oli rajoitettu yhteinen voittoja (13%), 5p oli täysin kahdennettu toistuvasti. Genome-leveä, vain 15,6% geenien sijaitsee CNAs geenimuutos ilmentymisen; Sen sijaan korko MRRs oli jopa 3 kertaa tähän. Chr 5p varmistettiin täysin monistettiin FISH; kuitenkin enintään 33,5%: n tutkitaan geenien 5p vapautui. 3Q, tämä osuus oli 13,4%. Jopa 3q26, joka oli 5 MRRs ja 38,7% toistuvasti saanut SNP, määrä oli vain 15,1%. Mielenkiintoista, jopa 19%: vapautettiin geenien 5p ja 73% vuonna 3q26 oli vaimentua, mikä viittaa lisätekijöitä olivat mukana geenin tukahduttaminen. Vapautuneet geenejä 3Q ja 5p tapahtui klustereita, mikä viittaa paikalliseen chromatin tekijät voivat myös vaikuttaa geenien ilmentyminen. Alueilla monistettu epäjatkuvasti, vaimentua geenejä kasvoi tasaisesti, kun monistettujen SNP lisääntynyt (p 0,01, Spearmanin korrelaatio). Siksi osittainen geenimonistuksen voivat toimia äänenvaimennusjärjestelmissä geeniekspression. Muita geenejä 1Q, 3Q ja 5p voisivat osallistua kohdunkaulan syövän synnyn, erityisesti apoptoosin. Näitä ovat

PARP1

1Q,

TNFSF10

ja

ECT2

3Q

ja CLPTM1L

,

AHRR

,

PDCD6

, ja

DAP

in 5p. Kaiken geenien ilmentyminen ja copy-numero profiilit paljastavat muita tekijöitä kuin geeni annostus, kuten epigeneettiset tai kromatiinin verkkotunnuksia, voivat vaikuttaa geenin ilmentymisen sisällä täysin monistettu genomista segmenttiä.

Citation: Vazquez-Mena O, Medina-Martinez I , Juárez-Torres E, Barron V, Espinosa A Villegas-Sepulveda N, et al. (2012) Amplified geenit voidaan yliekspressoituina muutoksia tai vaimentua kohdunkaulan syövän Cell Lines. PLoS ONE 7 (3): e32667. doi: 10,1371 /journal.pone.0032667

Editor: Alessandro Marcello, kansainvälinen keskus geeni- ja biotekniikan, Italia

vastaanotettu: 05 syyskuu 2011; Hyväksytty: 30 tammikuu 2012; Julkaistu: 07 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Vazquez-Mena et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Council of Science and Technology (CONACYT), myöntävät numerot 8135 /A1, 24341 (JB) ja 80680 (SK), ja National University of Mexico (UNAM), myöntää numero SDI.PTID.05.2 ( JB). OVM, AE, IMM, ja VB olivat vastaanottajien stipendiaattina CONACYT. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä (CC) on toiseksi yleisin syöpä naisilla maailmanlaajuisesti, vaikuttavat 500000 yksilöitä vuosittain ja se on tärkein kuolinsyy naisten syöpä kehitysmaissa [1]. Viruksen onkoproteiineja E6 ja E7 korkean riskin ihmisen papilloomavirusten (HPV) on tärkeä rooli syövän synnyssä. Ne estävät solujen eri tavoitteita, mukaan lukien kasvaimeen vaimennin proteiinien p53 ja pRB, häiritä avain cellular prosessien, kuten apoptoosin ja solusyklin kontrolli, ja johtaa genomin epästabiilisuuden ja neoplastisia kehittämiseen [2]. Huolimatta aiheuttamat vahingot oncoviral proteiinit, CC on harvinainen komplikaatio virusinfektio, koska useimmat infektiot ovat ohimeneviä eivätkä kehittyä neoplastisia vaurioita. Keskimäärin se kestäisi 12-15 vuotta ennen pysyviä HPV-infektio voi kautta esipahanlaatuinen vaiheissa kohdunkaulan epiteelinsisäisen uudisvaurioiden (CIN), johtaa CC [3]. Nämä havainnot viittaavat siihen, HPV-infektio ei yksinään aiheuta tautia ja muita tekijöitä, kuten epänormaali isäntägeenejä, voisi liittyä kehittämiseen kohdunkaulan syöpä. Useat genomialuetta on havaittu muutoksia määrän DNA kopioiden (kopiomäärä-muuttunut alueita, CNAs) CC analysoimalla kasvaimen genomin käyttämällä menetelmiä, kuten vertaileva genominen hybridisaatio (CGH), fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH ), ja mikrosiruja of SNP. Voitot 1Q, 3Q, 5p, 8q, ja 20q ja deleetioita 2q, 3p, 4p, 4q, 5q, 6Q, 8p, 11q, 13q, 18q, ja Xq on usein raportoitu sekä CC [4] – [10 ] ja CC-solulinjat [9], [11] – [16]. Genomista epätasapaino voi edistää sääntelemättömään ilmentymiseen onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille syöpäsoluissa, ja kokoamisen muuttaa geenien on osoitettu korreloivan kasvaimen etenemiseen [17]. Kuitenkin osuus näistä muutoksista kohdunkaulan syövän synnyn on vielä Kiistanalaista. Voitot 3q [5] – [9], [18], [19] ja 5p [5], [13], [20] – [22] ovat yleisimpiä kromosomi muutoksen kohdunkaulan karsinoomat, ja ne ovat myös olleet kuvattu muita kiinteitä kasvaimia [23] – [25]. Pienin konsensus alue 3q vahvistus CC karttoja kromosomaaliseen cytobands 3q26-27 [6] – [9], [14], [18], mikä viittaa siihen, jotkut geenit näillä alueilla sijaitsevien voisi osallistua kohdunkaulan syövän synnyn. Jotkut niistä, kuten

kiksi tert

[26], [27] ja

PIK3CA

[28], katsotaan ehdokas onkogeenit CC. Suuret alueet 3Q, kuten loci jossa

kiksi tert

ja

PIK3CA

sijaitsevat, ovat vahvistaneet monistettiin kalastaa interphase tumassa kohdunkaulan kasvaimia ja metafaasissa Chr solulinjoissa [14], [29]. Kuitenkin yksityiskohtainen luonnehdinta näiden monistettujen geenien ei ole tehty, ja vain voitto

PIK3CA

on validoitu kvantitatiivinen PCR [28]. Ei ole osoitettu, että

kiksi tert

ylössäädellään Tuumorinäytteissä tai solulinjoja, jossa se vahvistetaan, ja korrelaatio vahvistusta ja säätelyä

PIK3CA

geeni on edelleen kiistanalainen. Monistaminen

PIK3CA

ei liity lisääntynyt geeniekspression Tuumorinäytteissä [30], [31]. Kuitenkin, se on liittynyt lisääntynyt määrä proteiinin Western blot solulinjoissa [28], ja nousi proteiinin aktiivisuus kasvaimissa [32] ja solulinjat [28]. Se, missä määrin nämä toistuvat kromosomaalisen muutokset ovat merkityksellisiä kasvainten kehittymiseen ei vielä juurikaan tunneta. Toisaalta, täyttä vahvistusta 5p on hyvin dokumentoitu FISH Tuumorinäytteissä ja solulinjoissa [13], [16], [29]. Jotkut monistettujen geenien tunsivat tämän alueen ja ehdotti olla mukana CC, kuten

SKP2

,

TERT

,

TRIO

,

RNASEN

, ja

PRKAA1

, on havaittu voimistuvan tuumorinäytteissä [22] ja solulinjat [13], [16]. Kuitenkin genomin laajuinen, ei korrelaatio on havaittu kopiomäärä ja geenien ilmentyminen, jopa kromosomi käsivarret täysin monistettiin kuten 5p tai 3Q. Solulinjoissa ottaa 5p monistettu, vain 22% tutkittujen geenien voimistunut. Vastaavasti invasiivisia kasvaimia tai solulinjoja joilla monistetaan 3q havaittiin vielä pienempi osuus voimistunut geenien [16]. Puute korrelaatio kopioluvun (CN) ja geenin ilmentymisen [16], [31] viittaavat siihen, että jotkut muuttaa määritellyt alueet SNP tai mCGH paneelit voivat olla CN-muutettu epäjatkuvasti eivätkä kaikki geenit alueiden sisällä vaikuttaa. Kuitenkin rooli kopioluvun geenien vapauttaminen ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti genominlaajuisten ja ainoastaan ​​tietyillä alueilla on tutkittu [16], [31], [33]. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko CN muutoksia solulinjoissa, genomin laajuisesti geeni-by-geenin tasolla liittyi muutoksia geenien ilmentyminen. Tätä varten CN korjauksilla koko genomin ja ekspressiotaso on yli 20000 geenejä tutkitaan 4 solulinjoissa käyttämällä 100 K SNP ja Human Gene 1,0 ST mikrosiruja päässä Affymetrix.

Tulokset

tunnistaminen geenien mahdollisesti muuttunut kopiomäärä

Jokaisessa solulinjassa oli keskimäärin 49167 kopioluku-muuttunut SNP (CN-AS; 42,6% kaikista SNP arvioitu), enimmäkseen voitot (45,5%) ja single deleetiot (48,5%). Amplifikaatiot (5,5%) ja varsinkin, kaksinkertainen poistot (0,5%) olivat harvinaisia ​​tapahtumia. Kaikkiaan 1065 eri CNAs tunnistettiin 4 solulinjoissa tutkittu, 599 voitot ja 466 poistot. Keskimäärin solulinjoissa oli 273 ± 32 (vaihteluväli 240-317) CNAs ja yleinen CN-muuttunut genomi oli noin 19,2%. Kun CNAs on 4 solulinjoja linjassa (kuva S1), 108 minimaalinen toistuvia alueita (MRRs) tunnistettiin (taulukko S1). Heillä oli keskikoko on 787 kb (alue, 3.4-16,755 kb) ja määrä DNA sisältyy koko joukko MRRs vastasi 2,4% genomin. Toistuvat SNP että muodostivat MRRs edusti vain 5,8% kaikista arvioitu SNP. Vain 10 kromosomi käsivarret oli suurempi ja tilastollisesti merkitsevä määrä (merkitty tähdellä kuvassa 1). Kolme heistä oli saanut vain SNP (1Q, 3Q, ja 5p), 6 oli vain poistettu SNP (4p, 13q, 18q, 20p, 21P, ja Xq), ja 1 (11 q) oli sekä saadut ja poistaa SNP. On huomattava, että 94%: n 2045 arvioitiin SNP 5p monistettiin, mikä viittaa siihen, että koko 5p toistettiin (kuvio 2A). Prosenttiosuus muuttuneen SNP muissa aseita oli paljon pienempi kuin 5p, paitsi 21P, joka oli 100% muuttunut SNP. Oli kuitenkin vain 5 arvioitiin SNP tällä varren (kuvio 1). Toisaalta, 45 pois 297 cytobands oli merkittävä korkeampi toistuvia muuttuneen SNP kuin koko genomista, useimmat niistä sijaitsevat kromosomien tunnistettu edellä (taulukko S2). Cytobands kanssa korkeampi mukana 9 vahvistetaan (1q31, 5p12, 5p13, 5p14, 5p15, 3q24, 3q26, 7p11, 7q32) ja 6 poistetaan (4p16, 11q23, 11q25, 13q12, 13q14 ja 18q11).

vasemmalla puolella, määrä SNP sijaitsevat jokaisessa kromosomi varsi on merkitty, jotka selvittävät 100 K mikrosirulla. Oikealla puolella on numero geenien sijaitsevat kussakin varressa on merkitty, joka tutkittiin muutoksia geenien ilmentyminen, jonka ST1.0 ilmaisun microarray. Kukin pylväs prosenttiosuutta toistuvien muuttuneen SNP (vasemmalla) tai vapautettu geenejä (oikealla) yhteinen 4 solulinjoja. Kromosomaalinen varret on merkitty keskellä sarakkeeseen. Arms merkitty tähdellä oli keskimääräinen määrä CN-muuttunut SNP suuremmat ja tilastollisesti merkitsevä (p 0,05, chi-neliö testi) verrattuna koko genomin tarkoittaa. Arms tilastollisesti merkitsevästi vapautuneilla geenin rikastaminen leimattiin ”a” (tunnistettu sekä chi-neliö testi ja PAGE), ”b” (tunnistettu vain chi-neliö testi, p 0,05) tai ”c” (tunnistettu vain PAGE).

paneeli A esittää kopiomäärä log

2 suhde SNP tutkittu Chr 5 100 K SNP microarray HeLa, CaSki, SiHa ja calo. Paneelit B-D esittävät kertainen muutos geenin geenien ilmentymistä arvioi ST1.0 ilmaisun microarray sijaitsee MRR 5-1 (n = 64), MRR 5-4 (n = 44), ja MRR 5-5 (n = 37) klo 5p. Palkit edustavat voimistunut geenejä, vaimentua geenit ja geenit ilman muutosta geenien ilmentyminen. Geenit tilataan mukaan sijoitukseen genomissa. SAM menetelmää käytettiin analysointiin, käyttäen cut-off-arvot kertainen muutos ≥1.5 tai ≤0.66 ylös- tai vaimentua geenejä ja taita löytö määrä (FDR) on 0%. Geenit aiemmin raportoitu liittyvän kohdunkaulasyövän leimataan tähdillä (IPA-järjestelmä) tai ympyrät (PubMed).

Olettaen, että CNAs ja MRRs oli jatkuvasti muuttunut alueita, geenien tunnistamiseen CN muutoksia, ne rinnastettiin kokonaismäärään ihmisen geenit mukaan asemaansa genomin (kuva S1). Lukumäärä muuttunut geenejä kohti solulinjaa vaihteli 6864 vuonna Calo on 17829 SiHa- (keskimäärin 11669 geenit, taulukko 1). Mielenkiintoista on, että 14 MRRs puuttui geenejä ja geenien lukumäärän jäljellä MRRs (n = 94) oli välillä 1 103 yhteensä 1264 geenien sijaitsi MRRs, 619 poistetaan, 626 sai, ja 19 poistetaan joissakin soluissa ja saadut muut (taulukko S3).

geeniekspressioanalyysiä 20741 geenien CC solulinjoissa

mRNA: n määrä on transkriptoitu 20741 geeneistä verrattiin yksittäisten solulinjojen tai kaikki 4 solulinjoja yhteen ja 10 normaali kohdunkaulan epiteelin valvontaa. Raakadata oli vakioitu vankka mikrosiru keskiarvo (RMA) algoritmi FlexArray ohjelmiston, ja geenit on erilainen ilme taso tunnistettiin kanssa ”merkitys analyysi mikrosirujen” (SAM), jossa käytetään raja-arvot kertainen muutos ≥ 1.5 ja kansi löytö määrä (FDR) 0% (katso materiaalit ja menetelmät). Keskimääräinen määrä geenejä ilmaistuna differentiaalisesti välillä syöpäsolujen ja kontrolliryhmässä oli 3127 ja vaihteli välillä 2069 (10%) SiHa- ja 5295 (25,5%) HeLa (katso taulukko 1). Kun kokeet 4 solulinjoja yhdessä ryhmänä, 3122 geenejä (15,1%) oli ilmaistu toisella verrattiin kontrolliryhmän, 1434 upregulated ja 1688 vaimentua (taulukko S4).

taajuus on vapautettu geenien laskettiin kunkin kromosomi käsivarteen ja cytoband. Vain 7 kromosomi käsivarret (4q, 5p, 15q, 16p, 16q, 18q ja 19p) osoitti suurempaa ja tilastollisesti merkitsevä (p 0,05, chi-neliö) prosenttiosuus vapautettu geenien verrattiin kokonaisuus (15,1%; Kuva 1). Arm 5p oli suurin prosenttiosuus (33,5%) on vapautettu geenien seuraa 16q (22,1%), 16p (21,3%), 18q (21%), 15q (20,8%), 19p (20,4%) ja 4q (18,9%) . Vuonna 5p, 16p, 16q ja 19p ilmen- tymisen lisääntymisen geenit vallalla, kun taas 4q 15q ja 18q vaimentua geenit vallitsi (kuvio 1). Vain 10 ulos 297 cytobands oli myös suurempi ja tilastollisesti merkitsevä nopeus, useimmat niistä sijaitsevat näissä kromosomeissa (taulukko S2). Cytobands kanssa korkeampi olivat 19p12 (61,8%), 15q11 (52,5%) ja 5p15 (45,1%). Useimmat näistä Chr ja cytobands vahvistettiin kanssa PAGE-analyysi (kuvio 1 ja taulukko S2), jotka pitävät laskelmissa lisäksi määrä vapautettu geenejä, keskiarvo kertainen muutos (FC, katso materiaali ja menetelmät). Kuitenkin 8 Chr ja 29 cytobands, ei paljastunut kanssa chi neliön testi, havaittiin myös rikastettua on vapautettu geenien tällä menetelmällä (leimattu yläindeksi ”c” kuviossa 1, taulukko S2), mikä osoittaa, että toisin kuin prosenttiosuus, keskimääräinen arvot FC olivat merkittävästi erilaiset verrattuna maapallolla keskimäärin.

korkea tilastollisesti merkitsevä positiivinen korrelaatio (p 0,01) välillä havaittiin arvojen qRT-PCR ja mikroriveissä kaikissa 23 geenit arvioitiin sekä menetelmien . Korrelaatiokertoimet vaihteli 0,61-1,0 ja keskiarvo oli 0,82. Kuvio 3 esittää sitä intensiteetti mRNA 9 sijaitsevat geenit 1q (PARP1), 3q (MCM2, ECT2,

NAALDL2

,

NLGN1

, TNFSF10 ja

RFC4

) ja 5p (

TRIO, CLPTM1L

), joka arvioitiin qRT-PCR ja mikrosiruja. Nämä kokeet ehdotti, että koko data joukon HG1.0ST mikrosiruja oli luotettava.

Paneeli A esittää kokeissa mikrosiruja ja paneeli B qRT-PCR kokeita. Paneelit esittävät keskiarvoa ± keskivirhettä ilmaisun intensiteetin 9 CN-muuttunut sijaitsevat geenit 1q (

PARP1

), 3Q (

MCM2

,

ECT2

,

NAALADL2

,

NLGN1

,

TNSF10

ja

RFC4

) ja 5p (

TRIO ja CLPTM1L

). Molemmissa menetelmissä voimakkuudet ilmaistaan ​​suhteellisen yksiköissä (katso materiaalit ja menetelmät).

Korrelaatio kopioluvun muutoksia geenien ilmentyminen

Analyysi geenin ilmentymisen koko joukko CNAs ja MRRs.

Only 63% CN-muuttaa geenejä voitaisiin arvioida muutoksia geenien ilmentymisen kanssa mikrosiru HG1.0ST. Toisaalta, alkaen 20741 geeneistä tutkitaan muutoksia ilmaisua, keskimäärin 35,4% heistä tunnistettiin mahdollisten muutoksia kopioluku solulinjoissa (taulukko 1). Osuus vapautettu geenien oli hieman korkeampi ryhmässä geenien CN muutoksia kuin ryhmässä geenien ilman CN muutoksia (15,6% vs. 14,8%; p 0,05, chi-neliö). Suurempi ero löytyi ryhmässä toistuvien muuttunut geenien (18,8% vs. 14,9%; p = 0,0035, chi-neliö). Nämä pienet erot voivat ehdottaa joko että useimmat geenit tunnistettu mahdollisten muutoksia kopiomäärä ei todellisuudessa poisteta tai saadut tai että ne ovat muuttuneet kopioluvun ilman muutoksia geenien ilmentyminen. Ensimmäisessä tapauksessa CNAs olisi ollut CN-muuttunut jaksoittain. Kun toiseksi CNAs olivat oletettavasti CN-muuttaa jatkuvasti, mutta geenien ilmentyminen on saattanut moduloitu muut tekijät. Mielenkiintoista keskimäärin 69,1% mahdollisesti CN-muuttunut geenejä kussakin solulinjassa ei ole muuttunut SNP; Pikemminkin ne välissä 2 muuttunut SNP sisällä CNAs (kuva S1). Loput (30,9%) oli 1-282 muuttuneen SNP (keskiarvo, 6 ± 10). Kuitenkin se oli odotettavissa, että geenit sijaitsee täysin muuttunut alue olisi vapautettu samalla, riippumatta määrä SNP.

Yksi epäsuora tapa testata tätä hypoteesia maailmanlaajuisesti oli tutkia, onko prosenttiosuuden vapautettu geenien nousee kuin määrä SNP /geeni tai alue kasvaa. Koko joukko CNAs, määrä vapautettu geenit eivät kasvaa määrää SNP kohti CNA lisääntynyt, vaan se pysyy yhtenäisenä noin 15,6% (kuvio 4A). Sen sijaan, että MRRs, trendi kasvoi 14,5% geeneissä sijaitsee MRRs 1-100 SNP 36,1% geeneissä sijaitsee MRRs yli 500 SNP (p 0,001, Mantel-Haenszel lineaarinen-by-lineaarinen yhdistys chi-neliö testi, kuvio 4A). Numerot myös kasvanut tiheyteen muuttunut SNP, 16,5% vuonna geenit sijaitsevat MRRs yli 20 kb /SNP 23,2% geeneissä sijaitsee MRRs alle 20 kb /SNP (p = 0,03, Pearson chi-square ; tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot viittaavat siihen, että MRRs kanssa suurempi määrä SNP: t ovat todennäköisesti täysin CN muuttunut. Kuitenkin, se, että osuus vapautettu geenien kasvaa lineaarisesti, kun määrä muuttuneen SNP: per-geenin lisääntynyt (p 0,01, Mantel-Haenszel lineaarinen-by-lineaarisen khiin neliö testi; kuvio 4B), viittaa siihen, että monet näiden alueiden oli CN-muuttunut jaksoittain.

kuvassa prosentuaalinen suuntauksia vapautettu geenien määrä CN-muuttunut SNP alueittain (paneeli A) tai geeni (paneeli B) lisääntyi. MRR sisältää geenit kanna jonka minimaalinen toistuvat alueet yhteisiä 4 solulinjoja. Lineaarinen muuttujien välinen kaikissa paitsi yhdessä juoni (CNAs, paneeli A) oli tilastollisesti merkitsevä, p 0,01, Mantel-Haenszel lineaarinen-by-lineaarinen yhdistys khiin neliö testi.

kerrostunut analyysi suoritettiin selventämään tarkka suhde näistä muuttujista. Pooliin CNAs prosenttiosuus suuntaus vapautettu geenien lisääntynyt määrä SNP: iden /geeni, joko ne sijaitsevat CNAs, joissa on vähemmän tai enemmän kuin 500-SNP: itä tai alhainen tai korkea tiheys SNP: (tietoja ei ole esitetty). Nämä tiedot viittaavat siihen useimmat CNAs eivät CN-muuttunut jatkuvasti. Kun joukko toistuvia muuttunut geenejä, trendi vapautettu geenien erilainen, jos ne sijaitsevat MRRs vähemmän tai enemmän kuin 500 SNP. Edellisessä ryhmässä, suuntaus oli samanlainen kuin koko joukko CNAs (p 0,001, Mantel-Haenszel lineaarinen-by-lineaarinen yhdistys khiin neliö testi; kuvio 5A), ikään kuin he olivat myös CN-muuttunut jaksoittain. On huomattava, että epäjatkuvassa CNAs (tietoja ei esitetty) tai MRRs, nouseva suuntaus johtuu vaimentua geenejä, joko ne on poistettu (MRRs, p = 0,01, Spearmanin korrelaatiota; kuvio 5B) tai monistettu (for MRRs , p 0,01, Spearmanin korrelaatio, kuvio 5C). Siinä tapauksessa, että 2 monistetun MRRs joissa on enemmän kuin 500 SNP vaikka suuntaus de-geenien laski hieman 40,8%: sta 28,6%: n määrä SNP: iden /geenin (kuviot 5A), se ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,333, Mantel-Haenszel lineaarinen-by-lineaarinen yhdistys khiin neliö testi). On huomattava, että tämä osajoukko MRRs osoitti suurimman prosenttiosuuden de geenien (36,1%, 39 pois 108, kuvio 5D), jossa on yli 89,7% voimistunut (35 ulos 39, kuvio 5D). Nämä tiedot viittaavat siihen, nämä MRRs ovat todennäköisesti täysin CN muuttunut. Mielenkiintoista, nämä 2 MRRs sijaitsevat 5p, käsivarren jo osoittaneet täysin täydennetty. Yksi (MRR 5-1) sijaitsee cytoband 5p15 ja toinen (MRR 5-4) sijaitsee cytoband 5p14 (taulukko S1).

paneelissa A prosenttiosuus suuntaus vapautettu geenien verrataan keskuudessa geenit sijaitsevat MRRs ottaa 1-100, 101-500, ja 500 SNP. Suuntaukset ylä- ja vaimentua geenit esitetään paneeleissa B (47 poistetaan MRRs, 500 SNP), C (51 monistettu MRRs, 500 SNP), ja D (2 monistettu MRRs, 500 SNP). Kokonaismäärä geenejä tutkitaan ilmaisun ja mukaan analyysiin paneelit B, C, ja D oli 390, 267, ja 108, vastaavasti. Yläpuolella olevat numerot palkit osoittavat määrä vapautettu geenejä.

Geenien ilmentyminen analyysin yksittäisten MRR.

Toinen tapa tutkia todellisia copy-number tila MRRs on vertaamalla prosenttiosuus vapautettiin geenien jokaisessa MRR kanssa koko joukko jäsenrekisterimuutoksia. Periaatteessa on odotettavissa, että jos MRR on todella poistettu tai saatu, useimmat geenit sijaitsevat että MRR pitäisi muuttaa ilmentymistä samalla tavalla kuin CN muutos. Vain 61,9% (783 1264) geenien sijaitsee 85 MRRs tutkittiin muutoksia ilmaisun. Prosenttiosuus koko vapautettu geenien oli 18,8% (147 783) ja vain 32 MRRs oli suurempi kuin tämä prosenttiosuus. Kuitenkin vain 4 niistä, 2 saadut (MRR 3-13 ja 5-1, taulukko S1) ja 2 poistettu (MRR 4-4 ja 13-2, taulukko S1), ero vastaan ​​koko setti (18,8%) oli tilastollisesti merkitsevä. Erityisen huomattava on MRR 5-1, koska 43,8% tutkituista geeneistä (28 out of 64) on vapautettu, ja p-arvo oli hyvin alhainen (4,5 x 10

-6, chi-neliö). Näiden 27 geenit ilmentyivät ja vain 1 (

FBXL7

) säädeltiin vähentävästi (kuvio 2B). Kuten odotettua, prosenttiosuus yli-ilmentynyt geenien oli samanlainen alaryhmissä geenien kanssa (50%) tai ilman sitä (38,9%) muuttaa SNP: t (p 0,05, chi-square; tuloksia ei ole esitetty). Korkea prosenttiosuus yliaktiivista geenien molemmissa alaryhmissä geenien viittaa vahvasti siihen, että tämä MRR on täysin kahdennettu. Toinen 3 alueet (jäsenrekisterimuutoksia 3-13, 4-4 ja 13-2) oli suurempi osuus vapautettu geenien (57,1%, 75% ja 46,2, vastaavasti), mutta ne vain rajoittanut geenit arvioitu ilmaisun ja p-arvot olivat hieman alle 0,05 (taulukko S1). On tärkeää huomata, että jos kaikki geenit sijaitsevat MRRs tutkittiin ja vapautettiin geenien havaittiin samassa suhteessa, ero näiden 3 MRRs keskiarvosta olisi vahvempi, ja 2 ylimääräistä MRRs voitiin tunnistaa (MRRs 1-4 ja 19-2; Taulukko S1). Mielenkiintoista, MRR 3-13 sijaitsee 3q26, joka on cytoband usein monistettu CC. Toinen mahdollisesti saanut MRR sisältävät yli 500 SNP (MRR 5-4), yksilöity analyysi osoitti edellä, ei ollut prosenttiosuus vapautuneilla geenien paljon suurempi kuin keskimääräinen olevan tilastollisesti merkitsevä (p 0,05, chi-neliö testi ), koska vain 25% (n = 11) 44 geenien tutkittu ilmaisun vapautui.

geenien ilmentyminen analyysi kromosomin aseita ja cytobands.

korrelaatio CN ja geenin ilmentyminen analysoidaan kromosomaalisen aseiden ja cytobands oli erittäin huono. Vain 5p osoittivat selvää korrelaatiota CN ja geenien ilmentyminen (kuvio 1), koska suuri osa toistuvien sai SNP (94%) verrattuna osuus on suuri ilmen- tymisen lisääntymisen geenien (27,7%). Korrelaatio oli erityisen korkeampi 5p15 ja 5p12 jos tuen määrä voimistunut geenien kasvoi jopa 45,1% (taulukko S2). Vähemmässä määrin, korkeammat prosenttiosuudet poistetaan SNP korreloivat rikastamista vaimentua geenien 4p, 13q ja 18q (kuvio 1). Toinen 6 varret ja 37 43 jäljellä cytobands, tunnistetaan suuri osuus CN-AS, ei ilmennyt mitään geeniä rikastamiseen verrattuna koko genomin, kuten 3Q (13,4%) ja 3q26 (15,1%), joka oli yksinomaan sai SNP mutta vaimentua geenit vallitsevia (7,8% 3Q, kuvio 1, ja 11% 3q26, taulukko S2). Kun 3q analysoitiin erikseen kussakin solulinjassa, suuri osa sai SNP havaittiin Calo (93,5%) ja HeLa (87,2%; kuvio 6). Kuitenkin osuus vapautettu geenien kasvoi vain noin 2-kertaisesti HeLa (23,4%), mutta ei Calo (12,7%) verrattuna, että CaSki- (13,9%) ja SiHa (9,4%). Toisaalta, 4q, 5q, 6Q, 14 q, 15q, 16q, 16p, 17Q, 19p ja 20q, joka osoitti myös rikastuminen vapautettu geenien, ei ollut yhtään tai hyvin pieni osa CN-AS (kuva 1). Tämä pätee myös varten 31 39 cytobands joka osoitti merkittävää rikastumista vapautettu geenejä. Se on erityisen tunnettu vuonna 15q11 ja 19p12, jotka eivät ole toistuvia muuttunut SNP, mutta osoitti vaimentua yli 50% tutkitaan geenien (taulukko S2).

Paneeli A esittää kopiomäärä log

2 suhde SNP tutkittu Chr 3, jonka 100 K SNP microarray HeLa, CaSki, SiHa ja calo. Paneelit B-D esittävät kertainen muutos geenin geenien ilmentymistä arvioi ST1.0 ilmaisun microarray sijaitsee 3q26 (n = 73), 3q27 (n = 63), ja 3q28-29 (n = 66). Geenit tilataan aseman mukaan genomissa. Katso legenda Kuva 2 lisätietoja.

Analyysi 5p, 3Q ja 1q.

Vaikka koko 5p varsi näytti monistettavan (kuvio 2A), se kannattaa toteaa, että noin 2/3 geenien sijaitsee tässä käsi ei vapautettu, ja niiltä de geenien, 9 havaittiin vaimentua (kuvio 2B-D). Lisäksi osuus vapautettu geenien ei ole jakautunut tasaisesti pitkin 5p, koska se oli paljon suurempi MRR 5-1 (5p15, 43,8%; kuvio 2B) kuin MRR 5-4 (5p14.3-5p13.2; 25% Kuvio 2C) ja MRR 5-5 (5p13.1-5p12, 24,3%, kuvio 2D). Vaimentua geenit olivat lähes poissa MRR 5-1 mutta kasvoi MRRs 5-4 ja 5-5. On huomattava, että 48,8% ja vapautettiin geenien 5p, erityisesti MRR 5-1, jaettiin klustereita 2 tai useampia peräkkäisiä vapautettu geenien (kuvio 2B). Tämä jakelu oli tilastollisesti merkitsevä satunnaisesti jakauma (p 1 x 10

-8, chi neliö testi), mikä viittaa siihen, että lisäksi segmentin vahvistus, sijainti geenien saman alueen sisällä kromatiinin, kenties silmukan tasolla, voivat vaikuttaa geenin ilmentymisen. Useita geenejä aiemmin raportoitu ja tarkoitus olla mukana kohdunkaulan syövän synnyn, kuten

BRD9

,

POLS

,

SDHA

, ja

TRIO

, havaittiin myös ilmen- tymisen lisääntymisen ja sijaitsee MRR 5-1 (kuvio 2B).

kuvassa 6 intensiteetti (log

2 suhde) SNP tutkittu Chr 3 (kuvio 6A) ja ilmaisu kertainen muutos geenien arvioida at 3q26-29 (kuva 6B-D), jossa on geenejä usein tunnistettu tai liittyy CC. Vain 3q26 oli MRRs (MRRs 3-11, 3-12, 3-13, ja 3-14, kuvio 6B). Hyvin pieni osuus vapautettu geenien kohti cytoband näkyy (~13%), etenkin 3q28 /3q29. Kuitenkin 31,9% on vapautettu geenejä, samoin kuin tutkittu 5p, sijaitsivat yhdessä ryhmissä 2 tai useamman geenin, intercalated useita geenejä, joilla ei ole muutoksia geenien ilmentyminen. Kun kyseessä on 3q26 (kuvio 6B), on yksi klusteri, linjassa MRRs 3-13 ja 3-14, joista 3 vaimentua (

TNFSF10

,

NLGN1

, ja

NAALADL2

) ja 2 voimistunut geenit (

AADACL1

ja

ECT2

). Toisaalta, on 1 MRR (3-12), joka oli geenit, joilla ei ole muutoksia geenien ilmentyminen. Vuonna 3q27, on klusterin 5 yli-ilmentynyt geenien (

ALG3

,

ECE2

,

CAMK2N2

,

PSMD2

, ja

EIF4G1

). On huomionarvoista, että geenit kuten

kiksi tert

,

PIK3CA

(3q26), ja

LAMP3

(3q27) on kumpikaan CN muutettiin toistuvasti eikä voimistunut (kuvio 6B ja C).

Kuvio 7 esittää signaalin voimakkuutta (log

2-suhde) SNP: iden tutkittu Chr 1 (kuvio 7A) ja MRR 1-15 (kuvio 7F), ilmaus kertainen muutos geenien arvioitiin 4 MRRs (1-8, 1-9, 1-14 ja 1-15, kuvio 7B-E) ja kopiomäärän PARP1 geenin arvioidaan qPCR (7G). Samoin kuin 3Q prosenttiosuus vapautettu geenien kohti cytoband 1Q oli hyvin alhainen (keskiarvo = 13%) ja vain 1q21 oli korkeampi kuin koko genomin (22,2%, taulukko S2). Jopa MRRs vain keskimäärin 17% geeneistä oli de säädelty (laskettu taulukko S1), ja pieni ero (2,5%), verrattuna koko 1q (14,5%; kuvio 1), ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Kuvissa 7B-E osoittaneet MRRs (1-8, 1-9, 1-14 ja 1-15), jotka oli suurempi määrä geenejä tutkitaan muutosten ilmentymisen (taulukko S1). In MRR 1-9 (kuvio 7C), se on tunnettu, että yksikään 27 geenit tutkitaan oli voimistunut, sen sijaan kaksi heistä vaimentua (MNDA ja DARC). Sitä vastoin MRR 1-15 (kuvio 7E), 7 ulos 33 (21,2%) tutkittu geeniä voimistunut, mukaan lukien PARP1. Samoin 5p ja 3Q, vapailla geenit olivat usein (37,9%), joka sijaitsee yhdessä ryhmissä 2 tai useamman geenin limittäin useita geenejä, joilla ei ole muutoksia geenien ilmentyminen. Tämä näkyy selvästi MRRs 1-8 (kuvio 7B), 1-14 (kuvio 7D) ja 1-15 (kuvio 7E). Monistamiseen PARP1 geeni validoitu neljässä solulinjoissa qPCR kanssa TaqMan-määritys (kuviot 7G). Mielenkiintoista, kopiomäärä korreloi keskimääräisen voimakkuuden (log2 suhde) 110 SNP sijaitsee MRR 1-15 tutkittava yhdessä 100 K mikrosiru (kuvio 7F). Katsovat calo, CaSki- ja HeLa oli noin 4 kopiota PARP1 geenistä ja log2 suhde noin 0,2, SiHa oli 10 kappaletta ja log2 suhde 0,4.

Paneeli A esittää kopiomäärä log2 suhde SNP tutkittu Chr 1 100 K SNP microarray HeLa, CaSki, SiHa ja calo. Paneelit B-D esittävät kertainen muutos geenin geenien ilmentymistä arvioi ST1.0 ilmaisun microarray sijaitsee MRRs 1-8, 1-9, 1-14 ja 1-15. Geenit tilataan mukaan sijoitukseen genomissa. Paneelin F, keskimääräinen ± S.D. että log2 suhde signaalin 110 SNP sijaitsee MRR-15 piirrettiin. Paneelissa G esitetään kopioluvun PARP1 geenin laskettu qPCR kolmena kappaleena kokeissa. Katso legenda Kuva 2 lisätietoja.

Fluoresoiva in situ hybridisaatio (FISH) B

kopioluku 5p15 alueella, jossa MRR 5-1 sijaitsee, tutkittiin a. b. c. d. a. b. c. d. a. b. a. b.