Krooninen sairaus

tiivistelmä

synkkä kuolleisuutta keuhkosyöpään johtuu myöhään diagnoosin ja luontainen terapeuttinen vastus. Sisällyttäminen kohdistettuja hoitomuotoja on vaatimattomasti parantunut kliinisiä tuloksia, mutta ennen kaikkea yksilöimään uudet tavoitteet voitaisiin edelleen parantaa hoitotuloksia ohjaamalla kerrostuneisuus köyhien riskin alkuvaiheessa potilaat ja individualizing terapeuttisia valintoja. Oletimme, että peräkkäinen yhdistettynä mikrosiru lähestymistapa olisi arvokasta tunnistaa ja vahvistaa uusia tavoitteita keuhkosyöpä. Olemme profiloitu geenien ilmentyminen allekirjoitusten aikana keuhkojen epiteelisolujen kuolemattomaksi ja transformaatio, ja osoitti, että geenien mitoosin oli asteittain parannettu karsinogeneesissä. 28 geenit validoitu immunoblottauksella ja 4 geenit arvioitiin edelleen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kudossiruina. Vaikka CDK1 oli hyvin ilmaistu tuumorikudoksissa, sen menetys sytoplasmasta yllättäen ennustettu huono selviytyminen ja resistenssin kemoterapia useita solulinjoissa, erityisesti mikrotubulia suunnattu aineita. Analyysi ilmaus CDK1 ja CDK1 liittyvien geenien NCI60 solulinjassa tietokanta vahvisti laaja yhdistys näiden geenien kanssa kemoterapeuttisten reagointikykyä. Nämä tulokset vaikuttavat muokkaamiseen keuhkosyövän hoidossa ja painottaa näiden yhdistettyjen lähestymistapoja biomarkkereiden löytö.

Citation: Zhang C, Elkahloun AG, Robertson M, kidukset JJ, Tsurutani J, Shih JH, et al. (2011) menetys Sytoplasmiset CDK1 ennustaa Huono Survival in Human Lung Cancer ja antaa Kemoterapia Resistance. PLoS ONE 6 (8): e23849. doi: 10,1371 /journal.pone.0023849

Editor: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italia

vastaanotettu: toukokuu 10, 2011; Hyväksytty: 26 heinäkuu 2011; Julkaistu: 24 elokuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Intramural tutkimusohjelma NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolema kaikkialla maailmassa, mikä aiheuttaa noin 1,2 miljoonaa kuolemaa vuodessa ja arviolta 157300 kuolemantapausta vuonna 2010 [1]. NSCLC yleisimmin esiintyy tupakoitsijoilla [2]. Yhdysvalloissa noin 90% kuolemista keuhkosyövän miehillä ja 79% naisilla liittyy tupakointi [3]. Useimmat keuhkosyöpätapauksista epiteelisolujen alkuperää. Siksi kehittäminen keuhkosyövän heijastaa kumulatiivinen vaikutus tupakoinnin aiheuttamien molekyylitason muutoksia hengitysteiden epiteelisolujen. Koska noin 90 miljoonaa nykyisiä tai entisiä tupakoitsijoita Yhdysvalloissa on pysyvästi lisääntynyt suhteellinen riski sairastua keuhkosyöpään, tunnistaminen varhaisen molekyylitason tapahtumia ominaisia ​​keuhkojen kasvaimien syntyyn voisi tarjota perustan, joiden tavoitteena on estää fenotyyppinen etenemistä suojattavan syövän synty.

Molecular muutokset keuhkosyöpä ovat monimutkaisia ​​ja sisältävät geneettiset, epigeneettiset, ja biokemialliset muutokset. Ensimmäinen molekyyli tapahtumia voidaan tunnistaa olivat geneettiset ja mukana inaktivoitumisen tuumorisuppressorigeeneille kuten p53 [4], ja aktivointi onkogeenien, kuten K-Ras [5]. Epigeneettisiä tapahtumia ovat hiljentäminen CDK-estäjä, p16, kasvainsuppressorigeenit RASSF1, ja muiden geenien avulla metylaatio [6], [7]. Äskettäin, biokemialliset tapahtumat, kuten konstitutiivisen aktivaation signaalitransduktioreaktioteiden, jotka edistävät solujen eloonjäämistä ja hoito vastus on myös raportoitu [8], [9], [10]. Viime kädessä nämä molekyylimuutokset täytyy ajaa fenotyyppiset etenemistä epiteelisolujen tarkoitettu muutos. Kokeellinen muutos normaalien epiteelisolujen tuumorigeenisia soluihin vaatii kaksi erillistä vaihetta. Ensimmäinen on solu kuolemattomaksi, joka vaaditaan, jotta solujen alttiita Toisessa vaiheessa muutosta. Ihmisen solut on kiertää kaksi esteitä saavuttaa kuolemattomaksi, monistus vanhenemista ja solujen kriisi. Nämä esteet kuolemattomaksi säännellään telomeerien lyhentäminen ja retinoblastoomaproteiinin (Rb) ja p53 kasvaimeen vaimennin reittejä [11]. Muita muutoksia ei tarvita täyttä muutosta. Vaikka yhä useammat molekyylitason muutoksia on havaittu fenotyyppisten etenemistä epiteelisolujen transformaatio, muut tapahtumat ovat todennäköisesti tärkeitä.

tunnistamiseksi laajan molekyylimuutoksista ominaisia ​​prosesseja kuolemattomaksi ja transformaatio hengitysteiden epiteelisolujen, käytimme mallin käyttöön otetun järjestelmän Reddel

et al.

, joka loi immortalized, ei-tuumorigeenisiä keuhkoputken epiteelisolujen (BEAS-2B) infektoimalla normaaleja ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (NHBE) ja adenovirus-12 SV40 hybridi virus [12]. Häiriöt p53 ja Rb väylät SV40 T-antigeeni yhdessä lisääntynyt telomeraasi ilme, ikuisti BEAS-2B-soluja. BEAS-2B-soluja tehtiin sitten täysin tuumorigeenisiä altistamalla BEAS-2B-soluja in vivo tupakan erityisiä karsinogeeni, nitrosamiini 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyyli) -1-butanonia (NNK), ja 6 kuukautta. NNK altistus indusoi fenotyyppisiä muutoksia BEAS-2B-soluja, jotka olivat samanlaisia ​​kuin progressiivinen tapahtuvat muutokset aikana ihmisen keuhkojen syövän synnyn [13].

Näissä tutkimuksissa olemme systemaattisesti profiloitu geenien ilmentyminen normaalissa (NHBE), ikuistettu ( BEAS-2B) ja muunnetaan kokonaisuudessaan (NNK-BEAS-2B) ihmisen keuhkoputken epiteelisolut, sekä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinja (H157) peräisin tupakoitsija (kuvio 1A). Expression profiilit, jotka seuraavat kuolemattomuutta ja /tai muuttamista keuhkoputken epiteelisolujen kertyi, ja ilmentymistä 28 geenien validoitiin immunoblottauksella. 4 heistä arvioitiin edelleen immunohistokemiallinen analyysit kudossiruina jotka sisältävät NSCLC yksilöitä, ympäröivän ei-sairaiden kudosten ja ei-keuhkojen normaalien kudosten. Vaikka kaikki 4 geenit pääasiassa ilmaistu tuumorikudoksissa menetys ilmentyminen sytoplasman CDK1 oli kliinisesti merkittävä, koska se liittyy huono ennuste pienisoluista keuhkosyöpää. Tämä huono ennusteen arvioinnissa voi liittyä terapeuttinen vastus, koska vähenevän sytoplasman CDK1

in vitro

lisääntyneen resistenssin standardin chemotherapies käytetään hoitoon NSCLC, erityisesti mikrotubulusten aineet missä vastus oli lähes täydellinen. Nämä tutkimukset osoittavat, miten yhdistettyä microarray lähestymistapa voi helpottaa tunnistamista uuden, asiaa tavoitteet syöpään.

. Järjestelmä ja strategia tutkia geeniekspressioprofiili, sen kliininen merkitys ja toiminnallista roolia aikana NSCLC karsinogeneesin ja kemoterapia-vastus. B. luokittelu 1688 geenien joukossa BEAS-2B (B), NNK-BEAS-2B (NB) ja H157 (H) verrattuna NHBE (N). Geenejä, joiden ilmentymistaso ei muuttunut välillä solulinjat ulkopuolelle. Suhdeluvut graafisesti visualisoida Cluster ja TreeView ohjelmat (https://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm). Paria kaistoja ja vastavuoroinen punainen ja vihreä väri osoittaa väriaineen vaihtoa. C. Geenien ilmentyminen dynamiikka aikana kuolemattomaksi ja /tai muuntuminen. Käyrät luotiin Cluster analyysi Gene Expression Dynamics-ohjelma (https://www.genomethods.org/caged). A, C, J ja H symbolit kuvaavat geeniryhmien esitetty kuvassa 1B.

Tulokset

luokittelu ilmentyvät eri geenien BEAS-2B, NNK-BEAS-2B ja H157 soluja verrattuna NHBE soluihin

NHBE ohjearvon, 1688-geenit ilmentyvät differentiaalisesti BEAS-2B, NNK-BEAS-2B ja /tai H157-solut. Differentiaalisesti ilmentyvien geenien luokiteltiin kirjaimin ryhmät (A-P), joka perustuu jakelu ilmentyminen muuttuu (kuvio 1 B). Geeniekspressioprofiilien ryhmiteltiin perustuvat ilmiasussa. NHBE, BEAS-2B, NNK-BEAS-2B soluihin edustaa normaalia, kuolemattomaksi, ja muutetaan vaiheissa keuhko- syövän synnyn, vastaavasti, ja H157-soluja käytettiin liity täysin transformoitua solulinjaa peräisin NSCLC potilas. Geenien ryhmien A (65, 3,9%) tai J (101, 6%) oli voimistunut tai vaimentua, vastaavasti, BEAS-2B, NNK-BEAS-2B ja H157-soluissa, mikä osoittaa, että nämä geenit ilmentyminen muuttuu olivat yhteisiä kuolemattomiksi ja transformaatio NHBE. Geenien ilmentymistä ryhmissä B (38, 2,3%) tai I (31, 1,8%) oli lisääntynyt tai vähentynyt, vastaavasti, BEAS-2B ja NNK-BEAS-2B, mutta ei H157 soluja, mikä viittaa siihen, että nämä muutokset johtuivat SV40- välittämä kuolemattomaksi. Geenit ryhmissä C (112, 6,6%) tai H (39, 2,3%) oli differentiaalisesti ilmaistut NNK-BEAS-2B ja H157-soluissa, epäilynalaisiksi että nämä geenit edistävät koko solutransformaatio. Ryhmät D (407, 24,1%) ja G (571, 33,8%), joka koostuu suurin määrä geenejä ja olivat spesifisiä NNK-BEAS-2B-soluja. Tämä viittaa siihen, että NNK-välitteinen transformaatio on monimutkainen tapahtuma, joka vaatii ilmentymisen muutosten monia geenejä. Muita muutoksia geenien ilmentyminen olivat spesifisiä tietyssä solutyypissä, ja jätettiin pois lisäanalyysiä. Täydellinen geeni luetteloa ja niihin liittyviä suhde tiedot annetaan tiedot (taulukko S1).

geeniekspressioprofiili huomautusta ja biologinen analyysi

joukossa luokitukset, ryhmät A ja J ovat geenit, jotka ovat elintärkeitä koko kasvaimen kehittymisen, mistä kuolemattomaksi transformaatioon, ja ryhmien C ja H ovat geenit, jotka liittyvät koko muutosta. Määrällinen muutoksia geenien ilmentyminen on esitetty (kuvio 1 C). Analysoimaan geeni-ilmentymisen muutoksia näiden ryhmien genomisesta mittakaavassa ja tarjota yhteyksiä oletetun biologisia prosesseja, suoritimme High-Throughtput GoMiner analyysi (taulukko 1, siihen liittyvät geenit luetellaan taulukossa S2). A-ryhmässä, osallistuvat geenit mitoosin olivat erittäin rikastettua. Ryhmässä J, osallistuvat geenit ectoderm kehittämiseen oli vähentynyt. Mitään merkittävää geeni ontologian (GO) luokat havaittiin ryhmille B ja I. Ryhmissä C tai H, jossa geenin ilmentymisen muutoksiin liittyi transformaatio, osallistuvat geenit mitoosin asetuksessa parannettiin, kun geenit, jotka säädellä negatiivisesti solujen lisääntymistä ja biologiset prosessit vähentynyt (Pöytä 1). Useita GO luokat havaittiin ryhmille D ja G, jotka liittyvät muutoksiin liittyviä transformaation NNK (taulukko S3). Nämä tulokset laajennettiin suorittamalla Gene mikrosirujen Pathway Profiler analyysi, joka osoitti, että kumulatiivinen vaikutus geenien ilmentymisen muutoksia karsinogeneesissä voidaan ennustaa kasvavan itsenäistä etenemistä solusyklin läpi (kuva S1) kiertämisen ja apoptoosin (kuva S2).

Validation ilmaisun profiilit proteiinin tason immunoblottauksella

validoida meidän microarray data, me suoritetaan immunoblottaus 28 kandidaattigeenit peräisin eri ryhmien (kuva 2). Valinta geenien perustui kaupallisesti saatavilla vasta-aineita, jotka oli aiemmin käytetty immuunitäpläkokeilla. Ryhmät A tai J edustaa geenejä, jotka olivat ali- tai ilmaistu immortalisaatioon ja transformaatio, vastaavasti. Verrattuna NHBE, BEAS2B, NNK-BEAS-2B ja H157-soluja oli kasvanut ilmentyminen CDK1, sykliini A, STMN1, PTTG1, ja TOP2A (ryhmä A), ja vähentynyt ilmentyminen KRT14, PERP, S100A8, maspiini, TRAIL, ja p63 (ryhmä J). Verrattaessa mRNA ilmaisun proteiinin ilmentymistä ryhmissä A ja J, vain p63 ilmestyi luokiteltu väärin, että p63 luokiteltiin ryhmään J perustuvat microarray tietoja, mutta immunoblottauksella paljasti, että vähentynyt p63 ilmentymistä havaittiin vain H157-soluissa (ryhmä N). Tämä voi liittyä vaihtelevaan vasta–spesifinen reaktiivisuus p63-isoformit ja silmukointivariantit. Geenit ryhmissä C tai H luokiteltiin transformaatio erityisiä perustuvat microarray tietoihin. Immunoblottaus paljasti, että monet geenit tässä ryhmässä C olivat luokitellut väärin. Esimerkiksi sykliini B2, Galectin1 ja PBK näyttivät olevan pääasiassa ilmaistaan ​​NNK-BEAS-2B-soluja (ryhmä D), kun taas Cyr61 ja hnRNPA2 /B1 olivat yhteisiä soluja, jotka olivat kuolemattomiksi ja transformoitiin (ryhmä A). p21 ja Klf4 ryhmästä H oli tarkasti luokiteltu, koska niiden mRNA ja proteiini-tasot laskivat NNK-BEAS-2B ja H157 transformoituja soluja. D tai G edustaa NNK-geenit. NNK-BEAS-2B-soluja yksilöllisesti ilmen- tymisen lisääntymisen proteiinin surviviinin ilmentymistä, DNMT1, HIP1 PLK1, SPARC ja ETS1 (ryhmä D), ja vaimentua proteiinin ilmentymistä p15, FKHR ja TAO1 (ryhmä G). Korrelaatio mRNA ilmaisun ja proteiinin ilmentyminen oli korkea näille ryhmille. XAGE1, alun perin luokiteltu H157 soluspesifisestä geeni (ryhmä M), osoittivat suurinta ilmentymistä H157-soluissa. Kaiken immunoblottauksella paljasti, että 22/28 geenit (79%) oli luokiteltu oikein päässä microarray data, joka ilmaisee korkeaa korrelaatiota mRNA ja proteiinin ilmentymisen.

Immunoblottausmääritys analyysi NHBE (N), BEAS-2B (B ), NNK-BEAS-2B (NB) ja H157 (H) solujen 28 Molekyylit edustavien ryhmien ja vertailu ilmaisun muuttuu mRNA tasot microarray data.

immunohistokemiallinen värjäys on keuhkokudoksen mikrosirujen

onko geenit tunnistettiin mikrosiruanalyysi ja edelleen vahvistetaan käyttämällä immunoblottauksella oli kliinistä merkitystä, suoritimme immunohistokemia (IHC) arvioimaan ilmentymistä ihmisen NSCLC yksilöitä. Niistä 22 luokiteltu oikein geenejä, CDK1, TOP2A, PTTG1 ja Surviviinispesifisiä valittiin perustuen kaupallinen saatavuus vasta-aineita, oli validoitu IHC. Expression arvioitiin kudossiruina (TMA), sisältävät 300 NSCLC tapaukset (150 adenokarsinoomat (AD) ja 150 okasolusyöpää (SCC)), 100 vieressä ei-sairaiden keuhkokudokset AD ja SCC tapauksissa ja 50 ei-keuhkojen normaalien kudosten [14]. Pisteytys perustui intensiteetin, jakelun ja solunosasijaintia. Värjäys kaavoja CDK1, PTTG1 ja surviviinia olivat samanlaisia, että värjäytymistä joko pääasiassa sytoplasmista tai molempia ydin- ja sytoplasman. Sen sijaan, värjäys TOP2A oli joko yksinomaan ydin- tai molemmat soluliman ja ydin- (kuvio 3A). Verrattuna kasvainsoluihin, värjäys ympäröivän strooman kudosta oli minimaaliset tai puuttuvat.

. Esimerkkejä CDK1, PTTG1, Surviviinispesifisiä ja TOP2A subcellular värjäytyminen kliinisissä Tuumorinäytteissä (-C: sytoplasminen värjäys, N: tumavärjäystä). Värjäys on esitetty 400-kertaisella suurennuksella. B. kudosjakaumamalli positiivisten hinnat CDK1, PTTG1, surviviinin ja TOP2A. AD: Adenokarsinooma; SCC: Okasolusyöpä; N-AD: Vieressä ei-sairaiden keuhkojen kudoksia Adenokarsinooma; N-SCC: Vieressä ei-sairaiden keuhkojen kudoksia okasolusyöpä; N-O: Non-keuhkojen normaali elimiin. C. Yleistä koko kudoksen microarray värjäytymisen ilmentymistä näiden antigeenien sytoplasmassa tai tumassa.

Kaikki neljä proteiineja ekspressoidaan pääasiallisesti kasvainkudoksissa, verrattuna viereiseen ei-sairastuneiden keuhkojen kudoksiin (kuvio 3B ). Tämä oli erityisen selvää, kun tumavärjäystä pidettiin. Useimmat NSCLC näytteet olivat positiivisia CDK1 sytoplasmista värjäytymistä (86% AD ja SCC), ja 40% AD yksilöiden ja 36% SCC näytteistä osoitti tumavärjäystä. Ympäröivät normaali keuhkojen kudosten ja muissa normaaleissa kudoksissa ilmaisi sytoplasmisen CDK1, mutta ei ilmaissut ydinvoiman CDK1. Värjäys TOP2A oli yleisesti ottaen vähemmän yleisiä NSCLC yksilöitä kuin muiden proteiinien (20-34%), mutta oli tasaisemmin jakautunut sytoplasmista ja tumavärjäystä. Värjäys TOP2A oli yksinoikeus NSCLC yksilöitä vs. ympäröivään terveeseen keuhkojen kudoksiin. PTTG1 ja Surviviinivasteita oli korkea esiintyvyys sytoplasmista värjäytymistä (PTTG1- 79% AD ja 69% vuonna SCC; Survivin- 73% AD ja 61% vuonna SCC) sekä tumavärjäystä (PTTG1- 35% AD ja 49 % in SCC; Survivin- 44% AD ja 33% SCC). Kaiken värjäys kaikille neljälle proteiineihin oli selektiivinen NSCLC yksilöitä vs. ympäröivän normaaleissa kudoksissa, riippumatta solunosasijaintia (kuvio 3C).

Käytimme kaksisuuntainen klustereiden analysoida värjäyskuvioiden, ja χ

2 testi tutkia sovittava kunkin vasta-aineen ja yhdistyksen vasta värjäyksen kanssa kliiniset tekijät. Kasvaimet, jotka värjättiin TOP2A oli huomattavinta, verrattuna CDK1, PTTG1 ja surviviinin (kuvio 4A). Vahvin yhdistys vasta-aineen värjäys oli välillä TOP2A ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä (taulukko 2), joka on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että TOP2A on lokalisoitu tumaan ja liittyy usein sytoplasman värjäytymistä (kuvio 3A). Toisin kuin TOP2A, värjäystä varten CDK1, PTTG1, ja Surviviinispesifisiä oli pääasiassa sytoplasmista. Soluliman tai tuman värjäytymisen varten PTTG1 ja Surviviinispesifisiä myös ryhmitelty hyvin samalla tavalla, ja tämä oli sopusoinnussa χ

2 testit (taulukko 2). CDK1 tumavärjäystä oli voimakkaasti yhteydessä joko ydin- tai sytoplasmista TOP2A värjäys. Kaiken välinen sopimus värjäytyminen näillä vasta-aineilla oli erittäin vahva, paitsi yhdistys sytoplasman CDK1 värjäyksen ydin- Surviviinispesifisiä värjäytymistä (kuvio 4A ja taulukko 2).

. Hierarchial klusterointia sekä vasta-aineiden ja kasvaimet käyttävät Cluster 3.0 ja Java TreeView. B. Positiivinen hinnat CDK1, PTTG1, surviviinia ja TOP2A alkuvaiheessa (1-2) ja pitkälle edennyt (3-4). C. Kaplan-Meier selviytymisen analyysin sytoplasmista CDK1 värjäyskuvion NSCLC. Permutaatio testiä käytettiin laskettaessa

p

arvo kaikille kasvaimet ja kasvaimet vaiheelta.

Kun analysoidaan vaiheessa värjäys kaikille neljälle proteiineihin oli suurempi vaiheessa 1-2 tauti (kuvio 4B). Tämä oli erityisen totta TOP2A tumavärjäystä, jossa 56% vaiheen 1-2 näytteet olivat positiivisia taas vain 26% vaiheen 3-4 yksilöitä oli positiivisia. Kun värjäystä liittyi kliinisten muuttujien, ei ollut suhdetta iän, sukupuolen tai erilaistumiseen (taulukko 2). Sytoplasmisen TOP2A värjäys oli voimakkaasti yhteydessä pienempiä kasvaimia ( 5 cm) (

p

= 0,00745), ja sytoplasminen Surviviinispesifisiä värjäys liittyi vaihe I sairaus (vaihe 1 vaiheessa 2-3-4,

p

= 0,0436) (taulukko 2).

Only sytoplasmista CDK1 värjäys liittyi selviytymisen, vaikka oli suuntaus kohti elinajan kanssa sytoplasmisen PTTG1 positiivisia potilaita, joilla kasvaimia alle 5 cm (

p

= 0,089). Riippumatta vaiheen menetys sytoplasminen CDK1 annetaan huono ennuste (

p

= 0,040) (taulukko 2). Koska määrä vaiheen 2 kasvainten negatiivisia sytoplasman CDK1 on liian pieni ja kiellettyjä mielekäs vertailu myönteinen vaihe 2 kasvaimia, ja eloonjäämisaste potilaiden tietojen asetettu vaihe 1 ja vaihe 2 potilasta on samanlainen, yhdistimme vaihe 1 ja vaihe 2 kasvaimissa alkuvaiheen kasvaimet. Verrattaessa alkuvaiheen (1 ja 2) sekä pitkälle kasvaimia (3 ja 4), huomasimme, että menetys sytoplasmisen CDK1 oli rajatapaus merkittävä alkuvaiheen kasvaimet (

p

= 0,063), mutta suuri merkitys myöhään kasvaimet (

p

= 0,008) (kuvio 4C ja taulukko 2).

menetys soluliman CDK1 ja kemoterapian resistenssin

se, että menetys sytoplasmisen CDK1 koitui huono ennuste erityisesti kehittyneiden pienisoluista keuhkosyöpää, jotka ovat todennäköisesti saada kemoterapiaa tai sädehoitoa, ehdotti sitä voisi edistää kemoterapia-vastus. Tämän hypoteesin testaamiseksi, lämpöherkkä P34cdc2 /CDK1 mutantti hiiren karsinooma FT210 solulinjaa käytettiin. Kun FT210 soluja viljellään ei-sallivassa lämpötilassa 39 ° C: n sallivassa lämpötilassa 32 ° C, CDK1 tulee edullisesti inaktivoitu ja huonontuneen sytoplasmasta [15]. Chemotherapies tyypillisesti käytetään hoitamaan NSCLC testattiin näissä soluissa kussakin lämpötilassa. Etoposidi, topoisomeraasin II: n estäjä, tai sisplatiinin DNA vaurioittavan aineen, huomattavasti apoptoosin sallivassa lämpötilassa. Tällä ei-sallivassa lämpötilassa, apoptoosin oli osittain inhiboitu (kuvio 5A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin sallivassa lämpötilassa kolme erilaista mikrotubulusten hoidoissa, joissa merkittävän lisäyksen apoptoosin havaittiin (kuvio 5B). Sen sijaan ei-salliva olosuhteet, solut olivat lähes täysin resistenttejä kullekin mikrotubulia kohdistettuja agentti. Yhteensä tasot CDK1 proteiinin laski 39 ° C: ssa, kuten fosforylaatio CDK1 on Y15. Fosfo-Tyr15 CDK1 on passiivinen soluliman muoto CDK1 johtuu fosforylaatiota Myt1. Pilkkominen PARP kussakin lämpötilassa paklitakselin oli yhdenmukainen mittaus apoptoosin (kuvio 5B). Verrattuna emosolulinjassa FM3A, FT210 solut edullisesti menetetty sytoplasmista CDK1 proteiinin ilmentymisen (kuvio 5C) ja aktiivisuus osoitetaan vähentynyt fosforylaatio surviviinin at Thr34, sivusto CyclinB-CDK1 kinaasi [16] (kuvio 5D). Paklitakseli aiheutti merkittäviä sytotoksisuuden FM3A ja FT210 soluja 32 ° C: ssa, mutta vain FM3A-soluja 39 ° C: ssa. Samoin FM3A solut tapettiin doketakselin ja vinorelbiinin joko 32 ° C tai 39 ° C (kuvio 5E). Siten menetys CDK1 vuonna FT210-solujen määrä nousi suhteessa vastustuskykyä etoposidin ja sisplatiinin, mutta indusoi selvästi vastustuskyvyn mikrotubulusten kohdentamisaineita.

. FT210-soluja pidettiin seerumin starvated 0,1% FBS RPMI1640: ssa yön yli, sitten sitä käsiteltiin 10 uM etoposidin tai sisplatiinin 0,1% FBS sisältävässä elatusaineessa 4 päivää 32 ° C: ssa tai 39 ° C: ssa. Apoptosis (sub-G1 DNA pitoisuus) määritettiin virtaussytometrialla (C: Ohjaus, T: Treatment). B. FT210-soluja viljeltiin tavanomaisessa väliaineessa ja käsiteltiin 1 uM paklitakselin tai doketakselin, ja 0,1 uM vinorelbiini 1-4 päivää. CDK1 proteiini havaittiin Päivä 3 käyttämällä CDK1 tai p-Y15 CDK1 vasta-aineita ja apoptoottista kuolemaa tarkkailtiin PARP pilkkominen. Apoptoosi määritettiin 4. päivä C. FT210 ja sen emosolulinjassa FM3A-soluja viljeltiin 6 tunnin ajan, sitten altistettiin subsellulaarifraktiointikokeet immuuni-analyysiä. αTubulin ja p53 toimi lastaus säätimet sytoplasmista ja ydinvoiman jakeet, vastaavasti. D. FM3A ja FT210-soluja viljeltiin 39 ° C: ssa 72 tunnin ajan ja altistettiin subsellulaarifraktiointikokeet. Expression of CDK1, p-Surviviinispesifisiä (Thr34) ja Surviviinispesifisiä arvioitiin immunoblottauksella. E. FM3A ja FT210-soluja käsiteltiin 1 uM paklitakselin tai doketakselin, ja 0,1 uM vinorelbiini. Apoptoosi määritettiin 4. päivä

tutki tarkemmin roolia CDK1 kemoterapeuttisessa vastarintaa muuntelemiseksi CDK1 ihmisen NSCLC soluissa. Yliekspressio CDK1 on H157-soluissa hieman koholla-tasojen apoptoosin ja voimistaa paklitakselin indusoiman apoptoosin (kuvio 6A). Sen sijaan downregulation CDK1 vuonna H157-soluissa käyttämällä siRNA resistenssin paklitakseliin. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin erillisessä NSCLC solulinja (A549), kun CDK1 ilmentyminen väheni käyttämällä siRNA (kuvio 6B). Vaikka pudotus on CDK1 ei vaikuttanut solusyklin jakautuminen käsittelemättömän A549-solut, se ei vähentää ala-G1 DNA-pitoisuutta ja PARP pilkkominen, kun A549-solut altistettiin paklitakselia. Kasvu G2 /M murto kanssa CDK1 Knockdown on sopusoinnussa rooli CDK1 G2 M faasimuutoksen. Leikellä rooli CDK1 apoptoosissa vs. G2 /M siirtymä, A549-soluja transfektoitiin tyhjällä vektorilla, villityypin

CDK1

tai hallitseva negatiivinen

CDK1

(

CDK1DN

) rakentaa, kasvu pidätettiin seerumideprivaation ja PI3K estäjä LY294002, ja sitten hoidettiin paklitakselilla. Heikentynyt proliferaatiota havaittiin mikroskoopilla ja varmistettiin puute G2 /M rikastettu paklitakselihoidolla (kuvio 6C). Huolimatta solusyklin pysähtymiseen, yliekspressio CDK1 vielä lisännyt osa-G1 murto joka korreloi menetys G1 väestöstä. Näitä vaikutuksia ei havaittu yli-ilmentymisen CDK1DN, jolta puuttuu kinaasiaktiivisuuden kautta määräävä pistemutaatio (D146N) [17].

. CDK1 proteiinia yli- tai ilmaistu H157-soluissa. Solut transfektoitiin

CDK1

plasmidiin tai siRNA, 48 h tai 72 tuntia myöhemmin, käsiteltiin 1 uM paklitakselin 2 päivää. CDK1 proteiini taso seurattiin CDK1 tai p-Y15 CDK1 vasta-aineita. Sub-G1-DNA-pitoisuus määritettiin virtaussytometrialla. B. knockdovvn CDK1 A549-soluissa. Solut transfektoitiin

CDK1

siRNA, 72 h myöhemmin, käsiteltiin 1 uM paklitakselin 2 päivää. Apoptoosi määritettiin PARP lohkaisu käyttämällä immunoblottauksen tai osa-G1 DNA sisältöä käyttämällä virtaussytometria. CDK1 proteiini taso seurattiin CDK1 tai p-Y15 CDK1 vasta-aineita. C. yliekspressio CDK1 tai CDK1DN A549-soluissa. Solut transfektoitiin

CDK1

tai

CDK1DN

plasmidit, 48 tuntia myöhemmin, solukierron pysähtyi yön esikäsittely matalan seerumin (0,1% FBS) alustassa PI3K-inhibiittori LY294002 (10 uM), sitten soluja käsiteltiin 1 uM paklitakselin matalan seerumin elatusaineessa, joka sisälsi LY294002 (10 uM, juuri lisätty) ja 2 päivää. Sub-G1 osa ja solusyklin profiili määritettiin virtaussytometrialla. Yliekspression CDK1 ja CDK1DN havaittiin CDK1-vasta-aine.

Edellä mainitut kokeet osoittavat, että CDK1-proteiinin tason ja aktiivisuuden liittyy herkkyys syöpäsolujen kemoterapiaa. Tämän havainnon varmistamiseksi, me etsinyt NCI60 ihmisen syövän solulinja yhdiste herkkyys ja molekyylikohteista tietokantoja ja suoritetaan COMPARE [18] analysoidaan. Ilmaus CDK1 aktivaattorin CDC25A, p-Y15 /T14 CDK1, yhteensä CDK1, sekä CDK1 sitoutumisosapuolet sykliini B ja sykliini A: ta positiivisesti liittyy herkkyys paklitakselin, etoposidi ja doketakselia. Korkeimmat Pearson korrelaatiokertoimet (PCC) havaittiin dosetakselia ja paklitakselia (taulukko 3). Vaikka CDC25A, p-Y15 CDK1 ja sykliini A: ta vaatimattomasti liittyy sisplatiinin, CDK6 ja TYMS olivat alkuun korreloi. Siten CDK1 ja sen aktivoiva koneiden osat (kuva 7A) on laajasti tunnistettiin tekijöitä, jotka taustalla herkkyys monet hoitoon käytetyt aineet ihmisen syöpien, erityisesti mikrotubulia suunnattu aineita.

. Malli CDK1 aktivointi. Kun aktiivinen p-Y15 /T14 CDK1 on defosforyloitiin päälle Y15 ja T14 mennessä CDC25A, jonka se yhdistää sykliini A /B ja aktivoituu sytoplasmassa, sitten nopeasti translokoituu tumaan, jossa se edistää G1 S ja G2 /M siirtymiä. Aktiivinen CDK1 inaktivoidaan kautta peräkkäinen fosforylaatioon Y15 ja T14 WEE1- ja Myt1, ja sequestrated jonka 14-3-3σ sytoplasmassa. Tämä prosessi toistuu solujen pyöräily ajaa soluproliferaatioon. B. kaavio havainnollistaa kaksoisrooli CDK1 kuin tuumorigeenisuudesta kuljettaja keuhkojen syövän synnyn ja herkistävä kemoterapeuttisten reagointikykyä.

Keskustelu

tunnistaminen kliinisesti merkittävää proteiinin tavoitteet syöpä on vaikeaa. Olemme strategisesti profiloitu transkription muutoksia malleja keuhkojen Karsinogeneesin validoitu tavoitteita proteiinin tasolla, ja arvioidaan ilmaisun ja solunosasijaintia alkuun ehdokkaiden kliinisten kudossiruina. Geenien tunnistettu cDNA mikrosiruja ja tukee immunoblottauksella, CDK1, TOP2A, PTTG1 ja Surviviinispesifisiä valittiin lisäarviointia. CDK1, PTTG1 ja Surviviinispesifisiä olivat erittäin ilmaistaan ​​keuhkojen kasvain kudoksissa. Nuclear CDK1 ja TOP2A oli yksinomaan ilmaistu tuumorikudoksissa verrattuna normaaleissa kudoksissa, mukaan lukien ei-keuhkojen normaali elimiin. Se, että nämä geenit ilmentyy tuumorin kudoksissa, erityisesti varhaisessa vaiheessa NSCLC, viittaa siihen, että ne saattavat olla käyttökelpoisia biomarkkereita ja terapeuttisia kohteita alkuvaiheen NSCLC.

CDK1 on tärkeä, syntymässä tavoite syöpään. CDK1 on katalyyttinen alayksikkö M-vaiheen edistäjänä, joka on välttämätön G1 /S- ja G2 /M-vaiheen siirtymiä eukaryoottisen solusyklin. Korkeimmat värjäystä NSCLC kliinisissä näytteissä ja vahvin ilmentyminen tuumorigeenisia NNK-BEAS2B solut viittaavat siihen, että CDK1 on keskeinen rooli kasvainten synnyssä. Itse asiassa, yliekspressio CDK1 on havaittu varhaisessa vaiheessa keuhkojen adenokarsinoomat [19]. Tuloksemme osoittivat, että vaikka useimmat NSCLC yksilöitä ilmaisi sytoplasmisen CDK1, sen menetys koitui huono ennuste, erityisesti kehittyneiden pienisoluista keuhkosyöpää. Menetys sytoplasman CDK1 voidaan selittää menetys koko proteiinin ekspressiota tai translokaatio tumaan. Hyvin harvat kasvain näytteet (4 tapausta) ilmaista ydinvoiman muttei sytoplasmisen CDK1, mikä viittaa siihen, että menetys proteiinien kuten 14-3-3σ että eristää CDK1 sytoplasmassa voisi edistää tätä päätelmää [20] [21], mutta menetys tai vähentämistä 14-3-3σ on erittäin harvinainen ensisijainen NSCLC yksilöt [4]. Meidän kemoterapian kokeet osoittavat, että alentamalla yhteensä tasot CDK1 tai pitoisuudet sytoplasmassa CDK1 antaa kemoterapeuttisten vastustuskyvyn monille hoitoon käytetyt aineet keuhkosyöpää, erityisesti mikrotubulusten-suunnattu aineita.

Data peräisin NCI 60 ihmisen syövän solulinja tietokanta ehdottaa, että asema monien osien CDK1 koneen, saattaa olla laaja merkitys herkkyys kemoterapia, joka ei rajoitu vain NSCLC solulinjoja. CDC25 dual-spesifisyys fosfataasit ovat keskeisiä säätelijöitä solusyklin etenemistä aktivoimalla CDK mukaan defosforyloimaan CDK treoniini 14 ja tyrosiini 15, kaksi kriittistä aminohappotähteet johtavat myöhemmin yhdistys CDK niihin liittyvine sykliinien. Kolme homologeja esiintyy nisäkkäiden: CDC25A, CDC25B, ja CDC25C. CDC25A [22], [23], [24] ja CDC25B on onkogeeninen ominaisuuksia ja ne yli-ilmentyvät joissakin kasvaimia [25]. CDC25B ja CDC25C ovat osallisina säätelijöinä mitoosia mutta menetys näiden geenien hiirillä tai soluja ei muuta solusyklin tai tarkastuspiste vastauksia, mikä viittaa mahdollinen toiminnallinen korvausta CDC25A [26]. CDC25A proteiini sukkulat välillä tumaan ja sytoplasmaan [27], [28] ja on kattava funktio säätelyssä G1 /S, S ja G2 /M siirtymiä [29]. Siten CDC25A ajallisesti ja paikallisesti on enemmän mahdollisuuksia kuin CDC25B /C ennenaikaisesti aktivoimaan CDK1. Mukana CDK1 defosforylaatio CDC25A, CDK1 kumppaniaan sykliini A /B ja sen jälkeen etenee nopeasti tumaan [30]. Solusyklin on säänneltävä sekä ajan ja tilan [31]. Ennakoimaton, ennenaikainen tai jatkuva CDK1 aktivointi voidaan johtaa solukuolemaan, mitoosi katastrofin tai apoptoosin induktion [32], [33], [34], varsinkin kun CDK1 aktivoimalla koneen osat ovat erittäin ilmaistaan ​​[35]. Fosforyloituu CDK1, inaktiivisessa muodossa pääasiassa solulimassa [31], on substraatti CDC25A, ja sen runsaus sytoplasmassa lisää CDK1 aktivoimispotentiaalia.