Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Up-regulation runsain H perhe ihmisen endogeenisen retrovirus (HERV-H), erityisesti env-sukuisia kopioita, korreloi paksusuolen syöpä. Kuitenkin ekspressiokuviota saumattu ei-koodaavan selostukset HERV-H ei ole selvä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa ilmaus HERV-H saumattu transkriptien paksusuolensyöpä tutkittiin jonka RT-PCR strategiaa käyttäen alukkeita kohdistaminen tRNA

His alukkeen sitoutumiskohdan ja R alue 3 ’long terminal repeat (LTR), mitä seurasi kloonaus ja sekvensointi amplikonien. Sekvenssit sitten liittää yksittäisiin HERV-H loci käyttämällä yksityisen nukleotidin eroja loci. Eri ekspressiomalleja HERV-H saumattu selostukset erillisiä aktiivisia elementtejä löytyivät koolonsyöpäsolulinjaa HT29, LS 174T, RKO, SW480 ja SW620. Lisäksi ilmaisu kuviot SW480 ja RKO merkittävästi muuttanut demetylaation hoitoa. Mielenkiintoista, enemmän HERV-H elementit havaittiin olevan kopioinnin suhteen aktiivisia paksusuolen kasvain kudoksissa kuin viereisissä normaaleissa kudoksissa (14

vs.

7).

Johtopäätökset /merkitys

Tämä on ensimmäinen tutkimus tutkia luonnetta ilmentymisen ei-koodaavan saumattu selostukset HERV-H elementtejä paksusuolensyöpä. Expression malleja HERV-H saumattu transkriptien erosivat joukossa koolonsyöpäsolulinjaa ja voi vaikuttaa genomista DNA metylaatiotasoilla. Vielä tärkeämpää on, lisäksi yleisesti hyväksytty näkemys säätely ylöspäin HERV-H ilmentymisen paksusuolen kasvain kudoksissa, löysimme aktiivisempi HERV-H lokusten paksusuolen kasvain verrattuna viereisten normaaleissa kudoksissa.

Citation: Liang Q , Xu Z, Xu R, Wu L, Zheng S (2012) Expression Patterns of koodaamattoman mukoituna Transcripts Human endogeeninen retrovirus HERV-H Elements in Colon Cancer. PLoS ONE 7 (1): e29950. doi: 10,1371 /journal.pone.0029950

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: 15 syyskuu 2011; Hyväksytty: 7. joulukuuta 2011; Julkaistu: 06 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Liang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat kansainvälisen yhteistyön tieteen ja teknologian Key Foundation Zhejiangin maakunnassa (2009C14010), Zhejiangin maakunnan Natural Science Foundation (R2090353), National Natural Science Foundation of China (30973382 ja 81101488). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ihmisen endogeeniset retrovirukset (HERVs) muodostavat 8% ihmisen genomin [1]. Ne päätellä olevan peräisin itusolujen infektion eksogeeniset retrovirukset aikana kädellinen evoluution [2]. Provirus- rakenne HERV elementtejä koostuu pääasiassa 5 ’LTR-

gag

–

pro

–

pol

–

env

-3′ LTR, vuonna jossa neljä geenit (

gag

: ryhmä-antigeeni,

pro

: proteaasi,

pol

: polymeraasi, ja

env

: kirjekuori) koodata rakenteelliset /toiminnalliset proteiineja olennaista on replikoitumiskykyisen retrovirus, ja pitkät terminaaliset toistot (LTR) molemmista päistä eroavat HERVs muista retrotransposoneja kuten kauan siroteltu ydin- elementit (viivat). Useimmat jäännökset HERVs yksinkertaisesti eristetään LTR kappaletta, jossa sisäinen sekvenssi jotka on menetetty integraatio tai homologisen rekombinaation kautta. HERV perheet määritellään erilaisia ​​kriteerejä, kuten homogeenisuus niiden eksogeenisen kollegansa, sekvenssin samankaltaisuus

pol

geenejä, ja alukkeen sitoutumiskohdan (PBS) välittömästi alavirtaan 5’LTR. H perhe HERV (HERV-H) sisältää PBS, jonka järjestysnumero samankaltainen kuin ihmisen tRNA

His. On noin tuhat HERV-H elementtejä ihmisen perimän, ja useimmat niistä (800-900) puuttuu lähes koko

env

alue [3], [4]. On raportoitu, että vain 18 HERV-H elementit ihmisen genomissa ovat melko täydellinen [5], ja vain kolme tunnistettiin sisältävän ehjä

env

avointa lukukehystä (ORF) [6].

Vaikka suurin osa HERV-H elementit ovat rakenteeltaan puutteellisia mutaatiosta johtuen ja poistetaan evoluution aikana, on satoja heistä säilyttää täydellisen 5 ’ja 3’ LTR ja PBS-tRNA

Hänen välittömästi alavirtaan 5 ’ LTR [7]. Ilmaus HERV elementit on enimmäkseen valvonnassa niiden LTR: [8]. Täydellinen LTR-elementti on rakenne U3-R-U5 (5 ’→ 3’), joka sisältää sekä transkription käynnistäminen ja päättämisestä signaaleja. Transkription HERV elementtejä alkaa yleensä R alue 5 ’LTR ja päättyy päähän R alueen 3’-LTR. On myös ehdotettu, että riippuvaista solutyypistä ilmentyminen HERV elementtejä ohjataan yleensä erityisten sääntelyyn, jotka sijaitsevat lähinnä U3-alue [9].

Koska immunosuppressiivisten omaisuutta vaippaproteiinin HERV-H, monet tutkimukset keskittyivät

env

-aiheiset selostukset [10], ja niitä ei

env

-aiheiset transkriptit harvoin kiinnitetty huomiota. Up-regulation runsain H perhe HERV, varsinkin

env

-aiheiset selostukset, on raportoitu liittyvän kolorektaalisyöpä [5], [11], [12]. Edellisessä tutkimuksessa havaitsimme, että oli monia saumattu ei-koodaavat RNA: n transkriptoitu HERV-H elementtejä, sekä normaalissa ja syöpä- paksusuolen kudoksiin, sekä paksusuolen syövän solulinjat. Ilmaisulla kuvio saumattu ei-koodaavan selostukset HERV-Hs ei ole selvä. Opintojen aikana kolmeen vastikään havaittuja HERV-H liittyviä geenejä [13], [14], [15] laboratoriossamme, havaitsimme, että yleinen ilmaus HERV-H elementit paksusuolensyöpä oli monimutkainen ja erilainen välillä kasvainnäytteestä ja vieressä normaali näytteitä. Havaitsimme myös, että monia

env

-deleted HERV-Hs oli transkriptionaalisesti aktiivinen, ja monet saumattu ei-koodaavan RNA: ta transkriptoitiin sekä kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa, samoin kuin syövän solulinjat. Tässä tutkimuksessa aloitimme ensimmäinen tutkimus selvittää tarkka loci aktiivisimmista HERV-H elementtejä paksusuolensyöpä.

Tulokset

RT-PCR-sekvensointi strategia koukkaaminen HERV H koodaamattomalla transkriptien

Koska on olemassa yli tuhat jäsentä HERV-H perheen koko ihmisen genomin, jossa sekvenssien alhainen monimutkaisuus ja homologisia toisiinsa, on vaikea tutkia niiden transkriptio profiilia kun jokainen jäsen huomioon. Jotta profiili ilmentymisen HERV-H koolonsyöpäsolulinjaa, paksusuolen kasvain ja viereisten normaaleista kudoksista, ja määritellä tarkkaan loci aktiivisimmista HERV-H elementit, kehitimme RT-PCR-kloonaus strategiaa koukku valikoiduille HERV-H-sukuisia kopioita. Transkription HERV elementtien tyypillisesti aloitetaan 5 ’R ja se lopetettiin lopussa 3 ”R-alueella [16]. Suunnittelimme alukkeet viittaamalla sekvenssin HERV-H konsensus rakennettiin Jern

et al.

[5], jossa forward-aluketta kohdistuvat PBS-tRNA

His alavirtaan 5 ’LTR ja reverse-aluke kohdistettu R-alueen 3 ’LTR (Fig. 1A). Tämä alukkeiden parin piti tuottaa PCR-tuotteiden HERV-H selostukset erikokoiset. Näin ollen koko RT-PCR-tuotteet kloonattiin pGEM-T-Easy-vektorit ja transfektoitiin

E. coli

. Yli kolmekymmentä pesäkettä kutakin näytettä valittiin satunnaisesti ja plasmidit sekvensoidaan. Sekvensoinnin tulokset jaettiin tiettyjä HERV-H loci perustuu yksityiseen nukleotidin eroja yksittäisten loci (yhden tai useamman nukleotidin, jotka ovat ominaisia ​​varten HERV-H-lokus). Sekven- kaikki satunnaisesti valittua pesäkettä osoittavat ettei insertit olivat kuin HERV-H selostukset, mikä osoittaa strategiamme toiminut hyvin.

. Kaavamainen osoitus pohjamaali paikoissa. TSS, transkription aloituskohdasta; TTS, transkription terminaatiokohta. B. RT-PCR suoritettiin havaitsemiseksi HERV-H saumattu transkriptien koolonsyöpäsolulinjoissa kanssa /ilman demetylaatio /histoni asetylaatio hoitoon käytetään DNA-demetylaation aineen DAC ja histonideasetylaasi-inhibiittori TSA. H2O: n ja genomisen DNA: n seosta (gDNA mix) käytettiin kontrolleina. Genomi-DNA-seoksesta bändejä erillään cDNA näytteistä, jotka oli käänteistranskriptio päässä DNaasi-käsitellyn RNA.

Expression of HERV-H saumattu transkriptien koolonsyöpäsolulinjoissa, ja muuttunut ilmentyminen vasteena DNA-demetylaatio hoidon

RT-PCR-määritykset suoritettiin viisi koolonsyöpäsolulinjoissa, mukaan lukien HT29, LS 174T, RKO, SW480 ja SW620. Eri juovakuviot saatiin näistä solulinjoista (Fig. 1 B vasemmalla). Suhteellisen alhaisempi HERV-H ilmentymistä havaittiin RKO. On raportoitu, että on olemassa DNA metylaatio maailmanlaajuisesti genomitason kohdistamalla toistuvat sekvenssit [17], joten tutki tarkemmin sitä demetylaatio hoito muuttaisi transkriptio rakenteessa HERV-H elementtejä. Syövän soluja käsiteltiin DNA: n metylaation ja histonideasetylaasi-inhibiittorit (DAC ja TSA vastaavasti). RT-PCR tulokset osoittivat, että ilmentyminen malleja HERV-H olivat muuttuneet huomattavasti SW480 ja RKO soluja (Kuva. 1 B oikealla). Nämä havainnot ehdottivat, että epigeneettisten yhteydessä genomin vaikuttanut ekspressioon joidenkin HERV-H elementtejä.

RT-PCR-tuotteen kunkin koolonisyöpäsolulinja analysoitiin edelleen sekvensoimalla kloonauksen jälkeen. Sekven- jaettiin genomista lokuksiin BLAT vastaan ​​haettaessa ihmisen genomin kokoonpano (hg19). Genomi-DNA-sekvenssit noudetaan sitten ja analysoitiin RepeatMasker määrittämiseksi HERV-H-sekvenssit. Vain rajallinen määrä HERV-H elementit havaittiin olevan transkriptionaalisesti aktiivinen kussakin näistä solulinjoista, kuusi loci (seitsemän elementtiä) on HT29 ja kaksi tai kolme jokaisessa muita solulinjoja (taulukko 1).

karakterisointi aktiivisen HERV-H alkuaineita ja niiden saumattu transkriptien koolonsyöpäsolulinjaa

pareittain rinnastukset tehtiin kanssa 9.0-kb HERV-H konsensus rakentama Jern

et al.

määrittää fragmentti-poistamalla kuvioita kunkin HERV-H elementti. Tasaus Tulokset osoittivat kaikkien HERV-H elementtejä aktiivinen koolonsyöpäsolulinjaa olivat rakenteellisesti keskeneräinen ja pisin on 6488 emäsparin (taulukko 1 ja kuva. S1). Kuusi fragmentteja havaittiin yleisesti poistaa nämä elementit, mukaan lukien lyhyt

gag alue

, neljä

pol alue

, ja lähes koko

env

alue (Fig. 2A). Oli joitakin poikkeuksia. Elementti sijaitsee 16q24.1 (aktiivinen HT29) ja yksi sijaitsee 22q11.1 (aktiivinen LS 174T) olivat erittäin lyhyitä (Fig. 2B). Yksitellen 16q24.1 oli vain 3185 emäsparin pituinen, ja koko

gag alue

ja suuri fragmentti, joka sisältää

pol

ja

env

poistettu. Yksitellen 22q11.1 oli 3842 emäsparia pitkä, lähes koko

pol

ja

env

alueet poistetaan. Useimmat amplikonien ( 90%), mistä LS 174T sisälsivät sekvenssejä, jotka vastaavat saumattu RNA: t 3,8 kb HERV-H elementin 22q11.1, joista suurin osa ( 60%) oli moninkertaisesti saumattu. Kiinnostavaa kyllä, kaksi HERV-H elementit sijaitsevat 1p32.3 (2,8 kb erotettu) havaittiin olevan aktiivisia HT29, hyödyntäen 5 ’LTR ensimmäisen HERV-H ja 3’ LTR: ssä ja toinen (edustaja transkriptisekvenssi JK017392). Sekvenssianalyysi paljasti, että 5 ’LTR puuttui jälkimmäinen 2298-bp HERV-H-elementti (Fig. 2C).

. Kaaviokuva kuuden yleisesti poistettu alueet aktiivisen HERV-H elementit koolonsyöpäsolulinjoissa. B. Kaavio kahden Epätavallisen lyhyet HERV-H elementtejä ja niiden selostukset. Pareittain rinnastukset kunkin HERV-H elementti tehtiin kanssa HERV-H konsensus rakentama Jern P,

et al

. Lyhennetty linjaus Tulokset esitettiin osoittamaan puuttuvat alueet tarkasti. Värin tiheys edustaa laajuutta homologia HERV-H konsensuksen. Harmaat alueet edustavat poistettu alueet HERV-H elementtejä verrattuna HERV-H konsensus. Saumattu selostukset yläpuolella näkyvät linjaus tuloksia vastaavasti. Paksu pylväät edustavat eksonit, ja viivat edustavat intronit. Alueet LTR, pre-gag,

gag

,

pro

,

pol

ja

env

on merkitty alla. C. Kaavio kahdesta toisiinsa yhdistettyinä aktiivinen HERV-H elementit sijaitsevat 1p32.3 vuonna HT29.

Lisää HERV-H elementit olivat kopioinnin suhteen aktiivisia paksusuolen kasvain kuin viereisissä normaaleissa kudoksissa

ilmentäminen HERV-H-transkriptien paksusuolen kasvaimen ja viereisten normaaleissa kudoksissa analysoitiin RT-PCR: llä. Hieman ero RT-PCR-tuotteet paksusuolen kasvain ja vieressä normaali näytteissä havaittiin, joidenkin tuotteiden suurempia kokoja läsnä Tuumorinäytteissä (Fig. 3). Jälkeen sekvensointi ja sekvenssin analyysi PCR-tuotteiden, 14 HERV-H elementit havaittiin olevan transkriptionaalisesti aktiivinen paksusuolen kasvain näytteissä. Sitä vastoin, vain 7 HERV-H elementit havaittiin olevan aktiivisia viereisen normaalin paksusuolen näytteitä. Tiedot näistä HERV-H-elementit taulukossa 2. Tämä sekvenssianalyysi pareittain linjaus vastaan ​​HERV-H konsensus paljasti, että kaikki aktiiviset HERV-H elementit olivat rakenteellisesti puutteellisia, kuusi fragmenttien yleisesti poistetaan, kuten kuviossa. 2A (Fig. S2).

M, DL2000 tikkaat; T, kasvain; N, normaali.

neljä HERV-H elementit, joka sijaitsee 1q42.2, 16q24.1, 19q13.31 ja 5q23.2 vastaavasti olivat aktiivisia sekä kasvaimen ja viereisten normaaleissa kudoksissa . Olemme edelleen analysoineet transkriptio runsaus kustakin aktiivinen HERV-H elementti. Mielenkiintoista, kolme yleisesti aktiivisia elementtejä (sijaitsee 1q42.2, 16q24.1 ja 19q13.31), joista kukin osaltaan on yli 10%: n transkriptien sekä kasvaimen ja viereisen normaalin näytteitä. Siellä oli toinen elementti, joka sijaitsee 1p31.3, jotka tuottavat yli 10%: n transkriptien kasvain. Neljä eniten aktiivista elementtiä tuumorinäyte, eli ne, joka sijaitsee 1q42.2, 16q24.1, 19q13.31 ja 1p31.3, yhteensä osaltaan 68,89%: n transkriptien kasvaimen näytteestä. Sitä vastoin kolme kaikkein aktiiviset elementit normaaleissa näytteissä (sijaitsee 1q42.2, 16q24.1 ja 19q13.31) osallistui 85,71% koko transkriptien. Nämä tulokset osoittivat, että oli enemmän HERV-H elementtejä aktiivinen paksusuolen kasvain kudoksissa kuin viereisissä normaaleissa kudoksissa. Lisäksi suurin osa transkriptien viereisissä normaalissa näytteet valmistetaan vähemmän HERV-H elementtejä verrattuna kasvain näytteissä.

Keskustelu

Koska runsaasti HERV-H elementit ihmisen genomissa ja niiden korkea sekvenssin samankaltaisuus toisiinsa, ei näytä olevan mitään asianmukaista lähestymistapaa tutkii genominlaajuisten transkriptio profiilia HERV-H elementtejä samalla kun otetaan kunkin elementin huomioon erikseen. Vaikka tämän tutkimuksen tulokset eivät edusta yleistä todellinen genominlaajuisten ilmaisullisella profiilia HERV-H elementit, otimme etu PCR rikastamiseen strategiaa koukku aktiivisimpia HERV-H elementtejä, jotka tuottivat transkriptit, jotka sisältävät PBS-tRNA

Hänen ja 3 ’R alueilla, ja onnistuneesti ilmoittanut tarkkaa provirus- loci näiden elementtien koolonsyöpäsolulinjaa ja kudosnäytteitä. Ekspressiomalleja HERV-H saumattu selostukset HERV-H elementit olivat erilaisia ​​joukossa paksusuolen kasvaimen vieressä normaalia näytettä ja paksusuolen syövän solulinjat.

ekspressiomalleja HERV-H saumattu selostukset HERV-H elementit ovat eri yksi viidestä koolonsyöpäsolulinjoissa testataan, osoittaa sekä geelielektroforeesi RT-PCR-tuotteet (Fig. 1 B vasemmalla) ja sekvensointi amplikonien kloonauksen jälkeen (taulukko 1). Sekvenssianalyysissa vertaamalla niitä laskennallisen HERV-H konsensus osoitti, että aktiivinen HERV-H elementtejä löytyy tässä tutkimuksessa olivat kaikki rakenteellisesti puutteellisia jossain määrin. Tämä voidaan myös päätellä pituudet, jotka kaikki olivat paljon lyhyempiä kuin täysipitkä HERV-H konsensus (9,0-kb). Juovakuviot olivat erilaiset SW480 ja SW620-soluissa. Vaikka ne peräisin ensisijainen ja etäpesäkkeitä saman potilaan, tämä ero SW480 ja SW620 voi olla vain johtuen pitkäaikaiseen viljelyyn. Samoin rajallinen määrä aktiivisia HERV-H elementit kussakin solulinjassa saattaa johtua myös pitkäaikainen kulttuurin määritelty

in vitro

olosuhteissa. On myös mielenkiintoista, että demetyloimalla hoitoon käytetään DNA: n metylaation ja histonideasetylaasi estäjät, ilmaisu kuviot RKO ja SW480-soluja muuttuneet merkittävästi, mikä viittaa siihen, että transkriptio joidenkin HERV-H elementit ovat säänneltyjä epigeneettiseltä.

Vaikka mitään selvää eroa havaittiin RT-PCR-tuotteen kaistaa kasvaimen ja viereisen normaalin näytteiden kokonaismäärät ja käyrän aktiivista HERV-H elementit olivat merkittävästi erilaiset (Fig. 3, taulukko 2). Seitsemän HERV-H elementit havaittiin olevan transkriptionaalisesti aktiivinen viereisen normaalin paksusuolen näytteitä. Vertailun vuoksi, 14 elementtiä havaittiin olevan aktiivinen testattu paksusuolen kasvaimen kudokset. Expression kolmesta yleisesti kaikkein aktiivisia elementtejä ( 10%) näytti olevan tavallisia; yksi sijaitsee 1q24.2 tuotti 17,78% ja 26,19% tuotteista kasvaimen ja normaali näytteitä, ja tuotteet yhdestä sijaitsee 16q24.1 koostui 26,67% kasvaimen ja 16,67% normaaleissa näytteissä, vastaavasti. Mielenkiintoista, yksi elementti sijaitsee 19q13.31 oli aktiivisin viereisissä normaaleissa kudoksissa, jotka tuottavat 42,86%: n tuotteita, kun taas vain 11,11% tuumorinäytteistä kuului 19q13.31. Nämä tulokset osoittivat, että suurin osa HERV-H saumattu transkriptien viereisten normaalissa paksusuolen kudokset olivat 19q13.31, kun selostukset paksusuolen kasvain kudosten mukana enemmän elementtejä.

Kaikki aktiiviset HERV-H elementtejä löytyy tässä tutkimuksessa ovat rakenteellisesti epätäydellinen, kuusi fragmenttien yleisesti poistettu, joita myy

gag

,

pol

ja

env

alueilla (Fig. 2A); jopa niin, jotkut heistä (40%) pitää otaksuttu avointa lukukehystä (ORF) (taulukot 1 ja 2; Fig. S1 ja S2). Vaikka jotkin näistä oletetun ORF: ien on tehty sekvensoida poistetaan jossain määrin verrattuna vastaava alue HERV-H konsensus, seitsemän oletetun peptidisekvenssejä (koodaa 6 HERV-H elementit) sisältävät konservoituneita domeeneja, ja yksi konservoituneen proteaasi verkkotunnuksen, yksi konservoitunut CREB5 (cAMP-vaste-elementtiin sitoutuvan proteiinin 5) verkkotunnus ja viisi konservoituneita käänteistranskriptaasia (RT) kaltaisia ​​domeeneja. Mielenkiintoista, kaikki kolme yleisesti aktiivisin HERV-H elementit (sijaitsee 1q42.2, 16q24.1 ja 19q13.31) kasvaimen ja viereisten normaaleissa kudoksissa sisältävät otaksutun ORF kanssa konservoituneiden domeenien (taulukko 2; kuvio. S2). Ovatko nämä ORF todella tuottaa proteiineja paksusuolen kudoksiin ja mitä niiden rooli paksusuolen syövän synnyn ovat käsiteltäviä asioita.

Syytä transkription eron HERV-H elementtien välillä paksusuolen kasvain ja viereisten normaaleissa kudoksissa on edelleen tuntematon. Solut kasvaimen ja vieressä normaali näytteet ovat erilaisia ​​monin tavoin. Koolontuumorisolut näytteessä ovat heterogeenisiä ja koskea vaiheet solusyklin, kun taas ei-kasvainsoluihin ovat yleensä G0. Kuitenkin, ei ole tutkimuksen käsitellä, onko HERVs ilmaistaan ​​solusykliä riippuvaisella tavalla vielä. Lisäksi kasvaimen solut ovat entistä eriyttämätön tilaan verrattuna ei-kasvainsoluja, muistuttaa tilasta alkion solujen. Expression of HERVs on kudosspesifisiä ja kehitysvaiheen-riippuvaisella tavalla on raportoitu [18]. HERV elementit on myös havaittu olevan erittäin ilmaistaan ​​lisääntymiskudosten kuten kiveksissä ja istukassa, jotka sisältävät eriytymättömiä soluja [5], [19]. Olipa HERV-H elementit ilmentyvät erilaistumiseen riippuvaisella tavalla, myöhemmin aiheuttaa eroa paksusuolen kasvain ja viereisten normaaleissa kudoksissa, on myös tutkittava. Nämä kaksi seikkaa voivat ilmaista ohjeita lisätutkimuksia mekanismi, jonka HERV-H elementit eri tavalla säädeltyjä paksusuolen kasvain ja viereisten normaaleissa kudoksissa.

Tämä on ensimmäinen yritys tutkia ominaisuuksien ilmentymisen HERV-H saumattu transkriptien paksusuolensyöpä. Yhteenvetona tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen malleja HERV-H elementit erosivat joukossa koolonsyöpäsolulinjaa ja voi vaikuttaa demetylaation hoitoa. Vielä tärkeämpää on, meidän havainnot osoittivat, että HERV-H ilmaisu mukana aktiivisempaa HERV-H elementit paksusuolen kasvain kuin viereisissä normaaleissa kudoksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimus hyväksyi eettinen komitea Zhejiangin yliopistossa, ja kirjalliset hyväksynnät saatiin kaikista potilaista mukana.

kudosnäytteitä, soluviljelmissä ja RNA: n valmistaminen

Colon kasvain ja vieressä normaali kudosnäytteet saatu resektioleikkaukselle toisella sidoksissa sairaalaan Zhejiangin yliopistossa ja säilytettiin jäädytettynä -80 ° C: ssa, kunnes RNA. Tissue tyypit (kasvain tai normaali) arvioitiin histologisten värjäys. Syövän solut saatiin American Type Culture Collection ja niitä kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia. Kokonais-RNA valmistettiin Trizol reagenssia (Invitrogen) mukaan valmistajan oppaassa. RNA aina käsiteltiin RQ1 RNaasi-vapaata DNaasia (Promega), ennen kuin cDNA-synteesi poistaa genomista DNA-kontaminaation.

Demetylaatio käsittelemällä DNA: n metylaation ja histonideasetylaasi-inhibiittorit

Soluja käsiteltiin DNA-metylaatio inhibiittori 5-atsa-2′-deoksisytidiini (DAC, Sigma) ja histonideasetylaasi-inhibiittori trikostatiini A (TSA; Beyotime), kuten on kuvattu [20]: ensimmäinen käsittely DAC (200 nM) 48 h, huumeiden ja väliaine korvata 24 h kuluttua hoidon aloittamisesta, ja sen jälkeen korvaamalla alustassa, joka sisälsi TSA (300 nM) ja vielä 24 h. Kokonais-RNA lääkkeellä käsiteltyjen solujen tai ei-käsitellyt solut eristettiin Trizol-reagenssin ja käsiteltiin DNaasi ennen cDNA-synteesiä.

Käänteinen transkriptio-PCR (RT-PCR) B

RNA käänteistranskriboitiin cDNA käyttäen M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega) mukaan valmistajan oppaassa. PCR-määrityksissä suoritettiin

Taq

DNA-polymeraasia (Promega) reaktiossa, jotka sisältävät 0,2 mikromol /l eteen ja taakse alukkeita kutakin. Lämpösyklilaite parametrit olivat 94 ° C 5 min, (94 ° C 30 s, 55 ° C 30 s, 72 ° C 90 s) x 36 sykliä, 72 ° C 10 min. PCR-tuotteet Kunkin solun näytteestä, PCR-tuote seoksella kuusi kasvain näytteitä ja PCR-tuote seoksella kuusi vierekkäisten normaali näytteet puhdistettiin AxyPrep PCR uudelleenjärjestäminen Kit (Axygen), kloonattiin pGEM-T-easy-vektoriin (Promega) ja transfektoitiin

E. coli

bakteerit. Yli 30 pesäkettä kustakin solusta näytettä ja 100 pesäkettä kasvaimen tai normaalin kudoksen näytteille suoritettiin Sangerin sekvensoinnilla. Tavoitteet alukkeet on esitetty kuviossa. 1A ja niiden nukleotidisekvenssit ovat seuraavat: eteenpäin (kohdistaminen PBS-tRNA

His): 5′-TGGTGCCGTGACTCGGAT-3 ’, kääntää (kohdistaminen R alue): 5′-GCTGAGTCCGAAAAGAGAGTC-3’. Alukkeet suunniteltiin viittaamalla HERV-H konsensus rakentama Jern

et al.

[5], jossa ”G” forward-aluketta modifioitu mukaan genominlaajuisia sekvenssin analyysi HERV-H-liittyvä pohjamaali sitoutumiskohdat omaan (ei kuvassa).

Sekvenssianalyysissa

Jaksot etsittiin BLAT menetelmällä ihmisen genomi käyttämällä online-palvelin (https://genome.ucsc.edu/cgi -bin /hgBlat? komento = käy). Sekvensoinnin tulokset suljettiin pois, jos sekvenssit-alukkeiden välissä oli enemmän kuin viisi eroavaisuuksia genomiseen DNA: han. Genomisia DNA-sekvenssejä haettiin ihmisen genomin kokoonpano (hg19) on https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway. Sekvenssit analysoitiin työkalun RepeatMasker klo https://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker tunnistaa toista elementtejä. Pairwise rinnastukset tehtiin GeneDoc. ORF ennustus tehtiin käyttämällä online-ohjelma ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Sitten otaksuttu aminohapposekvenssejä räjäytettiin vastaan ​​ei-tarpeeton proteiinisekvenssitietokannassa käyttämällä verkossa BLASTP-ohjelma (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Sequence toimittamista

yhteensä 92 nukleotidisekvenssit vasta tunnistettu HERV-H saumattu selostukset on talletettu dbEST kanssa liittymiseen lukumäärät JK017330-JK017415 ja JK475044-JK475049 (7 EST kirjaston liittyminen numerot LIBEST_027280 – 027286).

tukeminen Information

Kuva S1.

pareittain rinnastukset kunkin HERV-H elementti tehtiin kanssa HERV-H konsensus rakentama Jern P,

et al

. Lyhennetty linjaus Tulokset esitetään osoittamaan puuttuvat alueet tarkasti. Värin tiheys edustaa laajuutta homologia HERV-H konsensuksen. Viivat edustavat poistettu alueet HERV-H elementtejä verrattuna HERV-H konsensus. Punainen suorakaide osoittavat alueita, joilla otaksuttu ORF kanna, kun taas punainen suorakaide paksut viivat osoittavat ORF kanssa konservoituneiden verkkotunnuksia. Alueet LTR, pre-gag,

gag

,

pro

,

pol

ja

env

on merkitty alla. Genomisen lokuksen kunkin HERV-H elementti on merkitty vastaavasti oikealla puolella.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0029950.s001

(TIF) B Kuva S2.

pareittain rinnastukset kunkin HERV-H elementti tehtiin kanssa HERV-H konsensus rakentama Jern P,

et al

. Lyhennetty linjaus Tulokset esitetään osoittamaan puuttuvat alueet tarkasti. Värin tiheys edustaa laajuutta homologia HERV-H konsensuksen. Viivat edustavat poistettu alueet HERV-H elementtejä verrattuna HERV-H konsensus. Punainen suorakaide osoittavat alueita, joilla otaksuttu ORF kanna, kun taas punainen suorakaide paksut viivat osoittavat ORF kanssa konservoituneiden verkkotunnuksia. Alueet LTR, pre-gag,

gag

,

pro

,

pol

ja

env

on merkitty alla. Genomisen lokuksen kunkin HERV-H elementti on merkitty vastaavasti oikealla puolella. Määrä kunkin elementin näkyy vasemmalla kuten taulukossa 2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0029950.s002

(TIF) B

Kiitokset

kirjoittajat ovat kiitollisia Ms Heather Simkin oikoluettaessa käsikirjoituksen.