Krooninen sairaus

tiivistelmä

syövän hoitoon välittyy nanohiukkasten perustuva lääkeaineen jakelujärjestelmä (DDS), yleinen tehokkuus riippuu vapauttamisesta tehokkuudesta lastien peräisin nanohiukkasten syöpäsoluissa sekä spesifisyys toimitus kasvainkudoksen. Kuitenkin tavanomaiset liposomipohjaisen DDS ei ole mekanismia nimenomaan vapauttaa kapseloitu lastien sisällä syöpäsoluja. Voit voittaa tämän esteen, kehitimme nanohiukkasia, joka sisältää uuden liposomimembraaniin epävakautta peptidi (LMDP), joka voi horjuttaa kalvoja pilkkomalla kalvonsisäiseksi proteaaseilla on /syöpäsoluissa. Calcein kapseloitu liposomeihin modifioitu LMDP (LMDP-lipo) on tosiasiallisesti vapautettu läsnä kalvon osa, joka sisältää LMDP-katkaistavissa proteaasi. Vapauttaminen estyi proteaasinestäjä, mikä viittaa siihen, että LMDP-lipo voisi tehokkaasti vapauttaa sen lasti soluihin vastauksena syöpää proteaasilla. Lisäksi kun LMDP-lipo sisälsi fusogeenistä lipidejä, vapautuminen lastin nopeutui, mikä viittaa siihen, että fuusio LMDP-lipo kanssa solukalvoissa oli ensimmäinen askel solunsisäisen toimituksen. Time-lapse mikroskooppisen havainnot osoittivat, että vapautuminen lastin LMDP-lipo ilmeni heti yhdistys LMDP-lipo kanssa kohdesolujen. Niinpä LMDP-lipo voisi olla hyödyllinen nanohiukkasten pystyy tehokkaasti vapautumisen lastien erityisesti kohdennettuihin syöpäsoluja.

Citation: Itakuralle S, Hama S, Ohgita T, Kogure K (2014) nanopartikkeleiden kehittämisessä Sisältävät Novel liposomimembraaniin destabilisaatio Peptide varten tehokas vapautuminen Cargos osaksi syöpäsoluja. PLoS ONE 9 (10): e111181. doi: 10,1371 /journal.pone.0111181

Editor: Pedro V. Baptista, Universidade Nova de Lisboa, Portugal

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 26 syyskuu 2014; Julkaistu: 24 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Itakura et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain JSPS KAKENHI Grant numerot 25860030, 26-9314, ja Kioton Pharmaceutical yliopiston rahasto edistäminen tieteellisen Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syövän hoidossa, lääkkeen jakelujärjestelmä (DDS), joka voi spesifisesti tuottaa erilaisia ​​terapeuttisia aineita kasvainkudokseen on tehokas keino saavuttaa syöpäsolu-terapiaan ilman haitallisia vaikutuksia. Nopea edistyminen genomi- ja proteomiikka tutkimus on johtanut tunnistamiseen välittävien molekyylien kehittymistä ja etenemistä syövän. Siten on tullut mahdolliseksi suunnitella tarkempia terapeuttisten syöpäsoluja vastaan. Yleensä erittäin spesifisiä lääkkeitä, kuten peptidejä, vasta-aineet, proteiinit ja nukleiinihapot ovat korkean molekyylipainon (HMW) aineita. Kuitenkin kliininen soveltaminen monien HMW aineiden rajoittuu johtuen niiden nopeasta hajoamiselle veren entsyymien sekä niiden riittämätön toimitus soluihin niiden kohdistaminen sivustot [1]. Näiden ongelmien ratkaisemiseksi, HMW aineet on kapseloitu nanohiukkasia kuten liposomit tai polymeerisiä misellejä omiaan suojelemaan lastien entsyymaattisesta hajoamista ja saavuttaa tehokas solunsisäiseen antoon. Nykyisissä nanohiukkasten perustuva DDS, muutos polyetyleeniglykolilla (PEGylaatio) on tärkeä strategia niiden toimittamista kasvainkudoksen kautta tehostetun läpäisevyyttä ja säilyttäminen (EPR) vaikutukset kuin PEGyloidun harjoittajat voivat liikkua pitkiä aikoja [2], [3]. Kuitenkin vain -10% injektoidusta molekyylien päästä kasvainkudoksen [4]. Siksi on tilaa parantaa toimitusta. Lisäksi kasvaimen toimitus kautta EPR, riippuu määrästä epäkypsä tuumoriverisuoniin. Näin ollen toimituksen tehokkuutta syövät alhainen verisuonitiheydessä, kuten haimasyöpä, on tehottomampi [5].

Vaikka kehitys syövän vastaisen DDS on nopeasti edennyt, ei ole vaihtoehtoista strategiaa pystyy parantamaan toimitus nanohiukkasten mukaan EPR vaikutuksia. Siksi on tarpeen maksimoida terapeuttisen tehon kapseloidun syöpälääkkeiden kompensoimiseksi alhaisen toimituksen tehokkuutta kasvainkudoksen. Kun syöpälääkkeet kapseloidaan nanohiukkasia, terapeuttinen teho riippuu siitä, kuinka paljon vapaata aineita vapautuu nanohiukkasia. Siten julkaisun tehokkuutta lastien peräisin nanohiukkasten on keskeinen vaihe parantaa terapeuttisen tehon. Saavuttaa syöpäsolu-spesifinen myrkyllisyys ilman ei-toivottuja sivuvaikutuksia, lastien kapseloitu nanohiukkasia on vapautettava vain silloin, kun nanohiukkaset toimitetaan kasvainkudoksen, ei aikana liikkeeseen. Aiemmin saavuttaa kasvain-spesifisen vapautumisen lastien, erilaisia ​​nanopartikkeleita on suunniteltu hyödyntämään kasvain ympäristössä. Esimerkiksi, nanopartikkelit, jotka voivat vapauttaa kasvainspesifisen hapan solunulkoisen ympäristöissä on kehitetty [6] – [8]. Kuitenkin, kun nanohiukkasten vastaa solunulkoiseen ympäristöön, lasti vapautuu solujen ulkopuolella. Tämä muotoilu luo uuden teknisen ongelman, koska monet HMW aineita, kuten nukleiinihappojen ja proteiinien on toimitettava ja vapautetaan sisällä syöpäsoluja. Lisäksi tarvitaan erityisiä vapauttamista pienimolekyylipainoisen (LMW) syöpälääke sisällä kasvaimen solut osoittivat tehokkaampaa syövän vastaista aktiivisuutta kuin solunulkoisen julkaisu [9].

Tässä suhteessa DDS kantaja kykenee vapauttamaan lastin osaksi syöpäsolut on kehitetty. Esimerkiksi yksi nukleiinihappo kantaja-riippuu proteiinikinaasi Ca (PKC-a), joka on yli-ilmentynyt syöpäsoluissa [10], [11]. Tämä kantaja on monimutkainen nukleiinihapot ja kationiset polymeerit, joissa on substraatin sekvenssi, joka voidaan kohdistaa PKC-a. Heidän sähköstaattisen vuorovaikutuksen vähennetään fosforylaation substraatin sekvenssin polymeerin PKC-a, jonka jälkeen nukleiinihappo vapautuu. Erilainen lähestymistapa hyödyntää kohonnut ATP pitoisuus syöpäsoluja. Tämä tarkoittaa sitä, että aine on kapseloitu chaperonin vapautuu jälkeen ATP-välitteisen liipaisimen [12]. Kuitenkin näissä vapauttavat järjestelmät, aineiden antaminen on rajallinen ja

in vivo

sovellus on vaikeaa. Siten lisäparannuksia farmakokinetiikkaa ja solunsisäinen dynamiikkaa tarvitaan. Tässä suhteessa liposomit voivat kapseloida HMW huumeita ja LMW aineita. Hydrofobisia aineita voidaan kuljettaa lipidikalvoon ja hydrofiilisiä aineita voidaan säilyttää vesifaasissa [13]. Siten monipuolisuus liposomien tekee niistä kiehtovia suunnittelu uusien DDSs.

osalta vapauttaa lastien liposomeista, monet järjestelmät on kehitetty indusoivan fuusio liposomimembraanit kanssa endosomaalisiin-lysosomien membraanit happamassa ympäristössä endosomin-lysosomiin [14]. Kuitenkin, kun tehokkuus paeta endosomissa on alhainen, huumeet voivat läpikäydä lysosomaalisen hajoamisen ja endosyyttisissä kierrätys [15]. Siksi parannuksia lääkeaineiden vapautumisen kautta kalvofuusioon tarvitaan. Tässä tarkoituksessa olemme kehittäneet järjestelmän, joka horjuttaa liposomimembraaniin aikana fuusiota syöpäsolun kalvot. Olemme keskittyneet kalvolle luontainen proteiini γ-sekretaasin syöpäsolujen. Tämä kalvonsisäiseksi proteaasi voi pilkkoa transmembraanidomeeni alustan proteiinin Notch [16], [17]. Käyttää tätä mekanismia, me sisällytetään peptidejä jäljitteleviä transmembraanidomeeni Notch osaksi lipidikalvon liposomien. Näin ollen, kun liposomikalvon osittain yhdistää solukalvon kanssa, kapseloitu lastien vapautuisi soluihin epävakautta liposomimembraanit by kalvonsisäiseksi γ-sekretaasi. Käyttämällä tätä käsitettä, me sisällytetty liposomimembraaniin epävakautta peptidi (LMDP) liposomeihin (LMDP-lipo), joka jäljitteli transmembraanidomeeni Notch. Tässä osoitamme, että vapautuminen lastien peräisin LMDP-lipo oli reagoi y-sekretaasi syövän solukalvojen.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

munafosfatidyylikoliinia saatiin NOF Corporation (Tokio, Japani). 1,2-dioleoyyli-3-trimetyyliammonium propaania (DOTAP) ja 1,2-dioleoyyli-sn-glysero-3-fosfoetanoliamiini (DOPE) hankittiin Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA). Cell Tracker CM-Dil saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Koles- hemisukkinaatti (CHEMS) ja kalseiini ostettiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO, U.S.A.). Bio-Beads SM-2 Adsorbentit hankittiin BIO-RAD (Hercules, CA, USA). HUEhT-2-solut, kuolemattomaksi ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) rivi perustettu elektroporaatiolla pIRES-hTERT-hygr, HeLa-solut, ihmisen kohdunkaulan epithelioid masolulinjassa, ja MCF-7-solut, ihmisen maitorauhasen kasvain solulinja, saatiin JCRB Cell Bank (Osaka, Japani). A549-soluja, ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolulinjasta toimittivat riken Cell Bank (Saitama, Japani). Liposomimembraaniin epävakautta peptidi (LMDP), LHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRR, syntetisoitiin SCRUM (Tokio, Japani). Fluoresenssin sammutusta peptidisubstraattia, Nma-GGVVIATVK (Dnp) RRR-NH

2 ja inhibiittori γ-sekretaasin, N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl) -L-alanyyli] -S-fenyyliglysiini t butyyliesteriä (DAPT), saatiin Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japani). 3 – [(3-kolamidopropyyli) dimetyyliammonio] -2-hydroxypropanesulfonate (CHAPSO) hankittiin Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japani).

Membrane erillään solujen

membraanifraktio valmistettiin aiempien raporttien [18]. Kaikki toimenpiteet suoritettiin jäissä. Viljellyt Hela-solut, A549-solut, MCF-7-soluissa ja HUEhT-2-soluja (noin 1 x 10

8 solua) pelletoitiin. Solut suspendoitiin uudelleen puskuriin, joka sisälsi 20 mM Hepesiä, pH 7,5, 50 mM KCI, 2 mM EGTA, ja proteaasiestäjäseostabletit, Complete Mini (Roche Applied Science), ja homogenoitiin käyttäen 15 iskua Dounce-homogenisaattoria, jossa on tiukka survin. Solu Homogenaatteja sentrifugoitiin 800 x

g

10 minuuttia ja homogenisoidaan uudelleen kuten edellä. Supernatantit sentrifugoitiin 100.000 x

g

1 h ja suspendoitiin uudelleen samaan puskuriin ja muisteli sentrifugoimalla 100.000 x

g

30 min käyttäen Optima XL-90 (BECKMAN COULTER) . Membraanit suspendoitiin uudelleen 20 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM KCI, 2 mM EGTA: ta, 1% (w /v) CHAPSO, ja Complete Mini ja liuotetaan 4 ° C: ssa 1 tunnin ajan end-over-end-kierto. Liukoiseksi kalvot sentrifugoitiin 100.000 x

g

1 h, ja supernatantit kerättiin. Yhteenlaskettu Proteiinipitoisuus määritettiin BCA Protein Assay Kit (Thermo tieteellinen).

γ-sekretaasin aktiivisuuden mittaus

mittaamiseksi γ-sekretaasiaktiivisuudessa, liuotettua kalvo valmisteet (15 ug kokonaisproteiinia) inkuboitiin kahdeksan uM fluoresenssin sammutusta peptidisubstraattia 37 ° C: ssa yön yli ja sentrifugoitiin 16100 x

g

15 min. Fluoresenssi Päällysnesteiden mitattiin Plate Infinite M200 (TECAN) eksitaatioaallonpituudella 355 nm ja emissio aallonpituudella 440 nm.

valmistaminen LMDP-lipo

Ohut lipidikalvoihin muodostuu EPC , EPC /DOPE /DOTAP (4/4/1), EPC /DOPE /CHEMS (4,5 /4,5 /2) lasiputkeen hydratoitiin PBS (-) tai 30 mM calcein liuosta PBS (-) 10 min , jonka jälkeen sonikoitiin 5 minuuttia kylpyyn sonikaattorissa (NEY). Liposomit sekoitettiin 1% Triton X-100 ja inkuboitiin kallellaan 1 tunnin ajan. Yksi mM LMDP liuotettiin 1% Triton X-100 lisättiin liposomiliuokseen (3-5 mol-%) ja inkuboitiin kallellaan 1 tunnin ajan. Sitten, SM-2 bio-helmiä lisättiin lipidiä LMDP-pesuaineen liuoksella 1 tunnin ajan helmiä-to-pesuainetta suhde 30 (w /w), jotta voitaisiin poistaa pesuainetta. Saatua liuosta sentrifugoitiin 16000 x

g

10 minuutin ajan ja supernatantti liposomi liuos otettiin talteen. Liposomeja, jotka sisältävät calcein, vapaa kalseiini poistettiin käyttäen Sephadex G-50 -pylvääseen, joka tasapainotettiin PBS: llä (-). Lipidikonsentraatio Liposomien määritettiin kanssa koliinioksidaasia-DAOS menetelmällä (fosfolipidejä C-testi Wako kit). Hiukkaskoko ja pinnan potentiaali valmis liposomeja mitattiin Zetasizer nano (Malvern Ins. Ltd.).

LMDP pilkkominen aktiivisuus γ-sekretaasi

Tutkia LMDP lohkaisu γ-sekretaasi, kilpailukykyinen estävä vaikutus LMDP tai LMDP-lipo on peptidi oli substraattia (sama, jota käytettiin 2,2) arvioitiin. Liukoiseksi kalvovalmisteiden A549 (16,5 ug kokonaisproteiinia) inkuboitiin 5 uM peptidisubstraatin ja 0, 5, 10, 50 tai 100 uM LMDP tai LMDP-lipo kuin LMDP pitoisuus pidettiin vakiona 37 ° C: ssa yön yli. Sitten mitattiin fluoresenssi-intensiteetti, kuten on kuvattu 2,2.

lohkaisu LMDP arvioitiin myös HPLC-analyysillä. Liukoiseksi kalvovalmisteiden A549 (16,5 ug kokonaisproteiinia) inkuboitiin 100 uM LMDP tai LMDP-lipo 37 ° C: ssa 1 h. LMDP pitoisuutena 100 uM oli estäviä vaikutuksia kilpailluilla Inhibitiotutkimuksissa ja inkubaatioaika (1 h) oli sovitettu reaktio sairaudentilassa calcein vapautumisen määrityksellä. LMDP-lipo liuotettiin 1% Triton X-100, ja LMDP liuoksessa jäljellä havaittiin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) käyttäen Alliance järjestelmää (Waters, Milford, MA, USA) on liitetty pylvääseen, jossa oli SunFire C18 ( 5 um, 4,6 x 150 mm, Waters, Milford, MA, USA). Liikkuva faasi koostui 0,1% TFA: lla H

2O (liikkuva faasi A) /ja asetonitriilin 0,1% TFA (liikkuva faasi B). Gradientti aloitettava suhde 80% liikkuvaa faasia A ja 20% liikkuvaa faasia B, mitä seurasi lineaarinen gradientti 80-10% liikkuvaa faasia A 20 min. Virtausnopeus oli 0,3 ml /min ja detektointiaallonpituuden oli 220 nm.

Kalseiini vapautumisen määrityksellä

Tutkia vapautumisen lastien liposomeista, Ohjaus-lipo tai LMDP-lipo sisältävä calcein olivat inkuboitiin liukoiseksi kalvoja (lipidi /proteiini = 2,0 (w /w)) tai PBS: ää tai 1% Triton X-100, 37 ° C: ssa 1 h: n läsnä tai poissa ollessa γ-sekretaasin estäjä DAPT. Liukoiseksi membraaneja esi-inkuboitiin γ-sekretaasin estäjä DAPT (10 uM) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan ennen käsittelyä liposomien kanssa. Vapautunut calcein määritettiin mittaamalla fluoresenssin voimakkuus käyttäen PIASTRA Infinite M200 (TECAN) eksitaatioaallonpituudella 490 nm ja emissio aallonpituudella 515 nm. Kalseiinin prosenttiosuus vapautuminen laskettiin seuraavalla kaavalla:

Kalseiini Release (%) = [(F-F

0) /(F

100-F

0)] × 100, missä F, F

0 ja F

100 olivat fluoresenssin kalseiinin jälkeen inkuboinnin läsnä ollessa kalvon osa, PBS: ssä ja 1% Triton, vastaavasti.

konfokaali laserskannaus mikroskooppisia havaintoja LMDP-lipo

A549-soluja viljeltiin 0,002% poly-L-lysiinillä (PLL) päällystettyjen 96-imaging-levyjä (BD Falcon) tiheyteen 1 x 10

4 solua /kuoppa 24 tunnin ajan DMEM: ssä, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Kun oli pesty PBS: llä (-), soluja käsiteltiin valvonta-lipo tai LMDP-lipo, joka sisälsi 0,2 mooli-% CM-Dil ja 30 mM calcein 1 h seerumittomassa DMEM. CM-Dil ja calceinia olivat innoissaan He /Ne (543 nm) ja Ar (488 nm) laserit, vastaavasti. Kuvasarjan saatiin CLSM (CLSM) (LSM 510 META, Carl Zeiss Co Ltd, Jena, Saksa) varustettu immersioöljyobjektiivilinssillä (Plan-Apochromat 63 /NA1.4). Estävän γ-sekretaasin aktiivisuutta, ja endosytoottiselle reitin, A549-soluja viljeltiin, kuten edellä, ja soluja esi-inkuboitiin seerumivapaassa DMEM, joka sisälsi 50 pM DAPT tai 0,4 M sakkaroosia, 37 ° C: ssa tai 30 min, 2,5 mM amiloridi 37 ° C: ssa 10 min ja 5 ug /ml FilipinIII 37 ° C: ssa 1 h, mitä seuraa käsittely liposomeja 37 ° C: ssa 1 h ja noudatettava CLSM, kuten edellä on kuvattu. Yksityiskohtainen tutkimus calceinia julkaisu, liposomit havainnoitiin nopeutus kuvantaminen liposomien elävissä A549-soluja. Soluja viljeltiin PLL-päällystetyt 35 mm lasi-bottom astiat (IWAKI), tiheydellä 2 x 10

5 solua /malja 24 tuntia DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solut pestiin PBS: llä (-) ja käsiteltiin LMDP-lipo, joka sisälsi 0,2 mooli-% CM-Dil ja 30 mM kalseiini 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan seerumittomassa DMEM. Poistamisen jälkeen liposomien, solut pestiin 3 kertaa PBS: llä (-), minkä jälkeen lisättiin tuoretta seerumitonta DMEM. Viivästys kuvantaminen saatiin käyttäen Nikon A1 CLSM (Nikon Instruments Inc., Melville, USA) varustettuna öljy-upotus objektiivilinssin (Plan Apo VC 60X 1.4 N.A.). Näytteitä pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 kaikissa kuvantamisen kokeissa. Laser valo 488 nm: ssä ja 561 nm käytettiin virittämään calcein ja Dil, vastaavasti. Ajastettu hankinta oli konfiguroitu ottamaan kuvia saman kentän 30 s välein 30 minuutin aikana. Viive kuvantamisessa noin 3 pistettä /kenno 5 soluja kutakin näytettä analysoitiin käyttäen NIS-Elements (Nikon Instruments Inc., Melville, USA).

Tilastollinen

Tilastollinen merkitys määritettiin käyttämällä Studentin t-testejä ja Tukey-Kramer HSD-testejä. Erot P-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Järjestelmän suunnittelu: vapautuminen lastien soluihin kautta γ-sekretaasi-riippuvainen lohkaisu LMDP sisällytetty liposomimembraaniin

kehitetty järjestelmä, jossa substraatti peptidin γ-sekretaasin sisällytettiin liposomimembraanit. Tällaiset liposomit tulisi kyetä lastina ja tehokkaasti vapauttamalla sen syöpäsoluja. Peptidi, kuten on esitetty kuviossa. 1, koostui 29 aminohapon tähteet, jotka koostuvat hydrofiilisestä sivuston solun sisällä ja hydrofobisen sekvenssin transmembraanidomeenin Notch. Sitä kutsutaan ”liposomimembraaniin destabilisaatio Peptide” (LMDP). Sekundaarirakenne LMDP ennustettiin käyttämällä SOSUI ohjelmiston [19]. Kuten kuviossa. 1, on osoitettu, että 23 tähdettä N-terminaalisesta oletetaan kierukkamainen rakenne ja tunkeutui kalvon, ja 6 tähdettä C-pään puolella olivat erittäin hydrofiilisiä ja ne sijaitsevat ulkopuolella lipidikalvoon. Siksi LMDP suunniteltiin tunkeutumaan lipidikaksoiskerroksen. Lisäksi, LMDP voidaan lohkaista 3 pistettä γ-sekretaasi [17]. Sen määrittämiseksi spesifisyys LMDP varten γ-sekretaasi, teimme homologian etsimään LMDP BLAST. Ei ollut mitään proteiinia, jolla on suuri homologia LMDP. Näin ollen, LMDP ehkä ole substraatti proteaasien erittäin ilmaistaan ​​syöpäsolut, kuten matriisin metalloproteinaasi. Näin ollen, kun sisällyttää liposomeihin (LMDP-lipo), lohkaisu LMDP olisi horjuttaa lipidikaksoiskerroksen laukaisemalla kalvon fuusiota, minkä jälkeen vapautuminen lastien soluun.

Tämä kuva kuvaa käsite kantajia sisältävien LMDP osaksi liposomimembraaniin (LMDP-lipo). Lipidikaksoiskerroksen of LMDP-lipo on horjuttaa lohkaisemalla LMDP kuin laukaista kalvofuusioon. Epävakautta edistää lastien vapauttaa soluun.

lohkaisu LMDP by γ-sekretaasi

Varmista, että LMDP pilkottiin γ-sekretaasi, päätimme A549 (ihmisen keuhko karsinooma), MCF-7 (ihmisen rintasyöpä) ja HeLa (ihmisen kohdunkaulansyövän) solulinjoja, jossa korkea-aktiivisten γ-sekretaasin oli raportoitu [20] – [22]. Γ-sekretaasi aktiivisuus kalvon osa näistä soluista tutkittiin käyttäen fluoresoivaa substraattia peptidin koettimia, jotka voidaan lohkaista γ-sekretaasi. Lisäksi, HUEhT-2 (ihmisen verisuonten endoteelisolujen viiva) tutkittiin myös tavallisena ohjaus. Ennen pilkkominen, fluoresenssin substraatin peptidien sammutettiin vuoksi fluoresenssiresonanssienergiansiirto (FRET) välillä sammuttava ryhmä (Dnp), ja fluoresoiva ryhmä (Nma) N-päähän peptidin koko pilkkomiskohdan. Näin ollen, fluoresenssi olisi esiintynyt poistamalla FRET vuoksi pilkkominen peptidejä. Tällainen peptidi koettimia käytetään usein arviointia γ-sekretaasin aktiivisuus [18]. Olemme havainneet, että γ-sekretaasin toiminta oli lähes sama HeLa-soluissa ja normaali HUEhT-2-soluja, mutta olivat merkittävästi korkeammat MCF-7 ja A549-solut (Fig. 2a). Lisäksi, ekspressio preseniliini-1, joka on aktiivinen keskus γ-sekretaasin, tutkittiin virtaussytometrillä. Kuten on esitetty kuviossa. S1, ilmentyminen preseniliini-1 havaittiin samalla tasolla kaikissa soluissa. Spesifinen aktiivisuus γ-sekretaasin (γ-sekretaasin aktiivisuutta /preseniliini-1 ekspressio) laskettiin ja γ-sekretaasi aktiivisuus oli suurempi MCF-7 ja A549-solut kuin muissa solulinjoissa. Koska A549-soluja oli suurempi solukalvon aloilla kuin MCF-7-solut, ne edullisia solunsisäisen vapauttaa määrityksiä.

(a) γ-sekretaasi aktiivisuus viljellyissä soluissa. Fluoresenssin peptidi koetinta inkuboitiin kalvofraktiot HUEhT-2, HeLa, MCF-7 ja A549-solut. (B) estää kilpailevasti LMDP. Peptidi koetin ja LMDP inkuboitiin osoitettuun pitoisuuksina kalvon osa A549-solut 37 ° C: ssa yön yli. Arvot ja palkit edustavat keinot ja SD, vastaavasti. (C) edustaja kromatogrammit LMDP kanssa tai ilman kalvon osa määritettynä HPLC-analyysillä kolmesta itsenäisestä kokeesta. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 versus HUEhT-2 (a), 0 uM LMDP (b), n = 3.

kalvofraktio eristettiin A549-soluja, ja sen arvioitiin LMDP katkaisuaktiivisuuden . Arvioimaan vuorovaikutusta LMDP kanssa γ-sekretaasi, tutkimme kilpaileva esto LMDP katkaisuun fluoresoivan substraatin peptidin koetin membraanifraktiota, joka sisältää γ-sekretaasin. Fluoresenssin voimakkuus substraatin koetin oli merkittävästi vähentynyt on LMDP pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (IC

50:29 uM) (Fig. 2b). Tämä tulos viittaa siihen, että pilkkominen fluoresoiva alustan peptidin γ-sekretaasi kilpailukykyisesti estää LMDP. Merkittävä väheneminen fluoresenssin intensiteetti ei havaittu, kun sitä tutkittiin samalla tavalla käyttämällä toista polypeptidiä, joka oli samanlainen koko (30 tähdettä) (Fig. S2). Nämä tulokset ehdottivat, että LMDP sekvenssi tunnistaa spesifisesti γ-sekretaasin.

lohkaisu LMDP by γ-sekretaasi seuraavaksi tutkittiin HPLC: llä. Piikin pinta-ala LMDP pieneni noin 22,6 ± 10,5%, kun läsnä kalvon osa, jossa γ-sekretaasin aktiivisuutta (taulukko 1), mikä vahvistaa pilkkominen LMDP. Kuva. 2c esittää edustavan kromatogrammia LMDP käsitelty tai ilman membraanifraktiota. Nämä tulokset viittaavat siihen, synteettinen LMDP pilkottiin A549 solukalvofraktio jolla korkea γ-sekretaasiaktiivisuudessa.

rakentaminen LMDP-lipo

LMDP sisällytettiin liposomimembraanit jonka pesuaineella poistomenetelmä. LMDP liuotettiin pinta-aktiivisen aineen (1% Triton X-100) ja sekoitettiin fosfolipidin. Sitten pinta-aktiivinen lipidi /LMDP seos poistettiin valmistamiseksi liposomien, joissa LMDP palle adsorptiomenetelmällä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Olemme todenneet, että 2,3 ± 0,2% LMDP sisällytettiin liposomeihin HPLC-analyysillä. Kalseiini käytettiin mallina lasti ja sen kapseloitu liposomeihin. Olemme arvioineet vuoto kalseiini läsnä ollessa A549 solukalvofraktio. Kun sisällyttämällä LMDP liposomeihin koostuu EPC, ei ollut eroa vuotonopeuksista calceinia verrattuna liposomien ilman LMDP (Fig. 3). Tässä järjestelmässä, transmembraanidomeeni substraatin peptidin liposomimembraanit on lohkaista y-sekretaasin solukalvon. Koska se oli välttämätöntä optimoida lipidi- koostumus liposomien, yritimme antaa liposomien membraanifuusion ominaisuus.

Ohjaus-lipo koostui EPC tai EPC /DOPE /DOTAP (DOTAP), tai EPC /DOPE /CHEMS (CHEMS). LMDP-lipo sisälsi 5 mol-% LMDP. Niitä inkuboitiin membraanin kanssa fraktio A549-soluja 37 ° C: ssa 1 h. Valkoinen ja musta pylväät osoittavat Ohjaus-lipo ja LMDP-lipo, vastaavasti. Arvot edustavat keinot kolmesta erillisestä kokeesta. Pylväät edustavat SD. *, P 0,05.

Näin DOPE sisällytettiin lipidikoostumus. Lisäksi, koska LMDP oli hydrofobinen transmembraanidomeeni ja hydrofiilinen sivuston emäksisten aminohappojen (arginiini ja lysiini) (Fig. 1), me otaksuttu, että sähköstaattinen vuorovaikutus pinnan vastaava liposomien ja vastaava hydrofiilisen sivuston vaikuttaisi sekä sisällyttäminen LMDP liposomeihin ja niiden toiminnallisuutta. Niinpä valmis kalvo fuusio liposomien positiivisia tai negatiivisia varauksia sisältävä DOTAP tai CHEMS EPC /DOPE ja sisällytettiin LMDP kuhunkin.

vuoto kapseloitu kalseiinin päässä negatiivisesti varautuneita EPC /DOPE /CHEMS liposomeja lisääntynyt kolme-kertaiseksi, kun läsnä on membraanifraktio, jossa γ-sekretaasi. Toisaalta, kun koostumus sisälsi kationista DOTAP-lipidiä, vuoto kalseiini ei lisääntynyt LMDP (Fig. 3). Tulokset viittasivat siihen, että sisällyttäminen CHEMS ja DOPE kanssa EPC vaadittiin optimoida toiminnallisuus LMDP. Fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien liposomien ja niiden koostumukset on esitetty taulukossa 2.

mekanismia lääkeaineen vapautumisen LMDP-lipo

Ensin määritetään, onko LMDP pilkottiin γ-sekretaasi kun se oli sisällytetty liposomeihin. Näin ollen testasimme kykyä LMDP-lipo estää kompetitiivisesti pilkkominen fluoresoivan substraatin koetin y-sekretaasi. Olemme varmistaneet, että lohkaisu fluoresoivan peptidin koetin inhiboitui merkittävästi, vaikka LMDP-lipo lisättiin membraanifraktiota, joka sisältää γ-sekretaasin (Fig. 4a). Vaikka inhiboivaa vaikutusta LMDP-lipo oli alle LMDP yksinään, todettiin, että LMDP on liposomimembraanit voisi reagoida γ-sekretaasi. Pilkkominen LMDP in liposomimembraanit arvioitiin myös HPLC: llä läsnä ollessa γ-sekretaasin sisältävä membraanifraktiota. Piikin pinta-ala LMDP liposomeissa laskivat noin 36,8 ± 7,0%, ja lohkaisu LMDP on esitetty, kun läsnä on membraanifraktiota (taulukko 3). Kuva. 4b esittää edustavat kromatogrammit LMDP-liposomin kanssa tai ilman kalvon osa.

(a) estää kilpailevasti LMDP liposomeihin. Fluoresenssin peptidi koetinta inkuboitiin Control-lipo (EPC /DOPE /CHEMS) tai LMDP-lipo (EPC /DOPE /CHEMS /3 mooli-% LMDP) on ilmoitettu LMDP pitoisuuksina läsnä kalvon osa A549-soluja 37 ° C: ° C yön yli. Valkoinen ja musta pylväät osoittavat Ohjaus-lipo tai LMDP-lipo, vastaavasti. (B) edustaja kromatogrammit LMDP-liposomien kanssa tai ilman kalvon osa määritettynä HPLC-analyysillä kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) kokojakauma liposomien läsnä ollessa membraanifraktio saatu A549-soluja tai ilman γ-sekretaasin estäjä mitattiin käyttämällä Zetasizer nano. Yhtenäinen viiva ja pisteviiva osoittaa Ohjaus-lipo ja LMDP-lipo, vastaavasti. (D) Polydispersiivisyysindeksi (PDI) huipusta käyttäen Ctrl-lipo tai LMDP-lipo. Valkoinen, harmaa ja musta pylväät osoittavat liposomien yksin, liposomien läsnä ollessa A549 solukalvofraktio tai liposomien läsnä ollessa kalvon osa, jossa on 10 uM DAPT, vastaavasti. (E) runsaus jakautuminen huippu Control-lipo (mustat ympyrät) ja LMDP-lipo (musta kolmiot) samoissa olosuhteissa kuin (d). (Arvot ja palkit edustavat keinot ja SD, vastaavasti. *, P 0,05 ja ***, P 0,001 versus 0 uM LMDP (a), ohjaus-lipo (c, d), n = 3.

Seuraavaksi arvioitiin muutos LMDP-lipo hiukkaskoko läsnä ollessa γ-sekretaasin sisältävän kalvon osa. myös arvioitiin vaikutuksen hiukkaskoko, kun läsnä on N- [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanyyli] -S-fenyyliglysiini-t-butyyliesteri (DAPT), joka on γ-sekretaasi-estäjä. estovaikutus DAPT vahvistettiin käyttämällä substraattina peptidiä koetin. Erityisesti, γ-sekretaasi aktiivisuus estyi noin 60%: iin lisäämällä DAPT (Fig. S3). Fig. 4b esittää, että hiukkaskokojakauma LMDP-lipo on laaja verrattuna Ohjaus-lipo läsnä ollessa kalvofraktio. Tämä laaja jakautuminen inhiboitui käsittelemällä DAPT. Polydispersiteettiluku (PDI) on LMDP-lipo lisääntyi merkitsevästi läsnäollessa membraanijakeen verrattuna Ohjaus-lipo, ero, joka pieneni käsittelemällä DAPT. Lisäksi PDI Control-lipo käsiteltyjen membraanifraktio hieman lisääntynyt verrattuna, että ohjaus-lipo ilman kalvofraktiossa. Kasvu oli kuitenkin ei muuttunut samanaikainen hoito kanssa γ-sekretaasin estäjä, DAPT, mikä viittaa siihen, että kasvu PDI Control-lipo johtui läsnäolo membraanifraktiota. (Fig. 4c). Runsaus jakautuminen pääpiikki liposomien verrattiin puuttuessa tai läsnä membraanifraktion. Runsaasti suurten huipun LMDP-lipo väheni huomattavasti, kun läsnä on membraanifraktion. Näiden muutosten tukahdutti DAPT, ja se ei havaittu Control-lipo (Fig. 4d). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kokojakauma on muutettu, koska LMDP pilkottiin γ-sekretaasi, mikä aiheuttaa epävakautta liposomimembraaniin ja muuttamalla hiukkaskoko.

γ-sekretaasi-riippuvainen vapautuminen lastien peräisin LMDP-lipo

tutki julkaisun lastien riippui γ-sekretaasin aktiivisuutta. Siten LMDP-lipo kapseloidaan calceinia sekoitettiin kalvofraktio A549, HeLa-solut, MCF-7-soluja tai HUEhT-2-soluissa. Kun LMDP-lipo sekoitettiin kalvofraktiot eristetty A549-soluja ja MCF-7-solujen erittäin γ-sekretaasin toimintaa, vuoto kalseiinin lisääntynyt verrattuna ohjaus-lipo. Lisääntynyt vuoto oli merkittävästi tukahdutti käsittelemällä DAPT. Toisaalta, kalseiini vuoto ei lisäänny, kun membraanifraktioiden HeLa-solujen ja normaalien HUEhT-2-soluja (hieman korkea tai matala γ-sekretaasin aktiivisuutta, vastaavasti) käytettiin (Fig. 5). Tämän vuoksi tulokset viittaavat siihen, että vapautuminen lastien peräisin LMDP-lipo riippuu korkea γ-sekretaasiaktiivisuudessa syöpäsoluissa.

Ohjaus-lipo (EPC /DOPE /CHEMS) tai LMDP-lipo (EPC /DOPE /CHEMS /5mol% LMDP) inkuboitiin, kun läsnä on kalvofraktio HUEhT-2-solut (valkoiset pylväät), HeLa-solut (pisteviiva pylväät), MCF-7-solut (ristiviivoitetut pylväät), A549-solut (mustat pylväät) tai A549-solut 10 uM DAPT (har- maat pylväät), 37 ° C: ssa 1 h. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D. (N = 3-7) *, P 0,05, **, P 0,01 ja ***, P 0,001.

Solunsisäinen vapautuminen lastien peräisin LMDP-lipo

Me seuraavaksi tutki siirto lastien peräisin LMDP-lipo viljeltyihin soluihin käyttäen A549 linja.