Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvutekijän reseptori tyrosiinikinaasin estäjät gefitinibi ja erlotinibi on käytetty laajalti potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Valitettavasti teho EGFR-TKI on rajallista, koska luonnollisten ja hankitun resistenssin. Uutena cytoprotective mekanismi kasvainsolujen selviytyä epäsuotuisissa olosuhteissa, autophagy on ehdotettu rooli lääkeresistenssin tuumorisolujen. Onko autophagy voidaan aktivoida gefitinibi tai erlotinibi ja siten heikentää herkkyyttä täsmähoitoihin keuhkosyövän soluja on edelleen tuntematon. Täällä ensimmäinen ilmoittaa, että gefitinibi tai erlotinibi voi aiheuttaa korkeaa autophagy, joka oli mukana estyminen PI3K /Akt /mTOR signalointireitin. Lisäksi sytotoksisuus aiheuttama gefitinibi tai erlotinibi oli suuresti parannettu jälkeen autophagy inhibition farmakologinen estäjän klorokiinin (CQ) ja siRNA kohdistaminen ATG5 ja ATG7, tärkeimmät komponentit muodostumista autophagosome. Mielenkiintoista, EGFR-TKI voi silti aiheuttaa solun autophagy jälkeenkin EGFR väheni EGFR erityisiä siRNA. Lopuksi, olemme huomanneet, että autophagy voidaan aktivoida EGFR-TKI: in keuhkosyövän soluja ja inhibitio autophagy täydennetty kasvua estävää vaikutusta EGFR-TKI. Autophagy esto edustaa siten lupaava lähestymistapa parantaa tehoa EGFR-TKI hoidettaessa potilaita, joilla on edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

Citation: Han W, Pan H, Chen Y, Sun J, Wang Y, Li J., et ai. (2011) EGFR-tyrosiinikinaasin estäjät Aktivoi Autophagy solua suojaavana Response in Human Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (6): e18691. doi: 10,1371 /journal.pone.0018691

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 marraskuu 2010; Hyväksytty: 15 maaliskuu 2011; Julkaistu: 02 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Han et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (lupanumeroon 30901740, www.nsfc.gov.cn), Kiinan kansallinen opetusministeriö Grant (lupanumeroon 20090101120124, www.moe.edu.cn), Zhejiang Luonnontieteet Foundation Grant ( myöntää numero Y2090166, www.zjnsf.net:81), ja tutkimushankkeissa Zhejiang opetusviraston (lupanumeroon Y200805751, www.zjedu.gov.cn) W. Han, ja perustutkimus rahastojen Keski yliopistojen H. Jin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [1]. Kemoterapia ei ole vielä riittävän tehokas potilailla, joilla on edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja vastausprosentti on vain 20%: sta 35% ja mediaanielossaolosta 10-12kuukausi [2], [3]. Kohdistamalla molekyylit kriittistä syövän kehitykseen, täsmähoitoihin yksin tai yhdessä muiden hoitojen hiljattain tunnustettu lupaava strategia valloittaa syöpiä, kuten NSCLC [4].

Yhtenä reseptorin (RTK: t) tärkeää syöpäsolujen kasvua, lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden, epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) oli yleensä vapautettiin NSCLCs [5]. EGFR yli-ilmentyminen havaittiin noin 62% levyepiteelisyöpä ja adenokarsinooma alatyyppiä [6]. EGR voi aktivoituvat kolmen signalointipolkujen tärkeitä taudin alkamisen ja etenemisen syöpien, Ras /MAPK, PI3K /Akt ja JAK /STAT [7]. Tämän seurauksena, EGFR tuli yksi molekyylien kehittämiseen täsmähoitoihin NSCLC. Estämällä tyrosiinikinaasin EGFR, kaksi tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) nimeltään gefitinibin (IRESSA, AstraZeneca) ja erlotinibin (Tarceva, Genentech) on kehitetty hoitoon NSCLC. Gefitinibi ja erlotinibi voi estää kasvaimen kasvua sekä in vitro että in vivo. Kliinisesti, sekä EGFR-TKI osoitti hyvää siedettävyyttä ja antituumorivaikutus NSCLC potilaille, joiden tauti etenee jälkeen ensilinjan platinapohjaisen kemoterapian [5], [8], [9]. Kuitenkin teho EGFR-TKI on merkittävästi vähentynyt luonnolliset ja hankitun resistenssin. Mekanismi on edelleen suurelta osin tuntematon, vaikka EGFR mutaatioita on ehdotettu olevan yksi mekanismeista vaikuttaa herkkyyteen EGFR että nämä inhibiittorit [10], [11].

Macroautophagy (jäljempänä autophagy) on self-proteolyysi prosessi eukaryoottisoluissa, joka johtaa jakautuminen solunsisäisen materiaalin macroautophagosome tai lysosomeihin [12], [13]. Under solustressiä olosuhteissa kuten ravinteiden puutteesta ympäristö, autophagy nopeasti aktivoituu tarjota vaihtoehtoinen energialähde ja siten mahdollistaa solujen hengissä [14]. Autophagy säädeltiin voimakkaammaksi aikana myöhemmässä vaiheessa kasvaimen kasvun takia induktio autophagy mahdollistaa kasvainsolujen hengissä mikroympäristöihin puute ravinteiden ja hapen [15]. Edistämällä selviytymisen kasvainsolujen epäsuotuisissa olosuhteissa, autophagy ehdotettiin vaihtoehdoksi mekanismi lääkeresistenssin. Esimerkiksi, autophagy edistää vastustuskykyä rintasyövän solujen bortetsomibihoidon [16]. Esto autophagy voi herkistää kasvainsolut monia sytotoksisten lääkkeiden tai taaksepäin vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä, mikä on lupaava strategia parantaa tehokkuutta syövän hoidossa [17].

signalointireitit alavirtaan EGFR ja muita RTK: ista, kuten PI3K /Akt-reitin osallistuvat säätelyyn autophagy, mikä viittaa mahdolliseen yhteys RTK eston ja autophagy. Toinen TKI nimetty imatinibi voikaan aktivoida autophagy vastaavissa solutyypeissä [18], [19]. Lisäksi, salpaus macroautophagosome muodostumisen parantaa tehoa anti-HER2 monoklonaalinen vasta-aine trastutsumabi (TZB) [20]. Kuitenkin onko autophagy liittyy gefitinibin ja erlotinibin hoitoon keuhko- syöpäsoluja edelleen tuntematon. Nykyisessä tutkimuksessa, ensin osoittaa, että gefitinibi tai erlotinibi aktivoitu autophagy keuhkojen syöpäsoluja ja lukkiutuvat autophagy tehostetun vaikutuksen gefitinibin tai erlotinibin.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta

käytetyt kemikaalit olivat gefitinibin (J K kemialliset Ltd., G304000), erlotinibi (J K kemialliset Ltd., E625000) ja klorokiinin (CQ) (J K kemialliset Ltd., 147236). Ensisijainen vasta-aineet olivat vasta-aineita mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3) (Cell Signaling Technology, # 2775), ATG5 (Cell Signaling Technology, # 2630), ATG7 (Cell Signaling Technology, # 2631), fosfori-mTOR ( S2448) (Cell Signaling Technology, # 2971), yhteensä mTOR (Cell Signaling Technology, # 2983), fosfori-p70S6K (T389) (Cell Signaling Technology, # 9234), fosfori-AKT (S473) (Cell Signaling Technology, # 4051 ), kokonaismäärä AKT (Cell Signaling Technology, # 9272), GAPDH (Cell Signaling Technology, # 3683). Toissijainen vasta-aineet olivat HRP konjugoitua anti-kani (Santa Cruz Biotechnology, sc-2357) ja anti-hiiri-IgG (Santa Cruz Biotechnology, sc-2371).

Soluviljelmät

keuhkosyöpä solulinjoja (A549, NCI-H1299, NCI-H292, NCI-H1650 ja SK-MES-1) ostettiin solusta pankin (Chinese Academy of Sciences). Yksikerrosviljelmään syöpäsolujen pidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% (v /v) FBS: ää ja antibiootteja. Kantaliuos gefitinibin tai erlotinibin valmistettiin dimetyylisulfoksidissa (DMSO) (Sigma, D4540), ja laimennettiin väliaine ennen käyttöä. Lopullinen DMSO-pitoisuus oli 0,1%.

Sytotoksisuusmääritvs

sytotoksisuus kemikaaleja vastaan ​​keuhkosyövän solulinjoja määritettiin MTT-määrityksellä. Solut ympättiin 96-kuoppalevyille (viljelty yön yli kiinnittyneet solut) ja käsiteltiin kemikaaleja eri pitoisuuksilla. Sen jälkeen, kun 48-tunnin inkuboinnin 20 ui MTT: tä (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kaivoon 4-tunnin inkuboinnin. Tämän jälkeen supernatantti poistettiin, ja 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan, jotta liuottamiseksi sini-violetti kiteitä formatsaanin. Absorbanssi mitattiin sitten käyttäen mallia ELX800 Micro Plate Reader (Bio-Tek Instruments, Inc.) 570 nm: ssä.

Immunofluoresoivat konfokaali laser mikroskoopilla LC3 ja lysosomifuusio yhteisten tilojen

lysosomi oli ensinnäkin leimataan inkuboimalla lyso Tracker (Invitrogen, L7528), lysosomiin reportteriväriä, 90 min ajan 37 ° C: ssa. Solut kerättiin, kiinteä ja läpäiseviksi 1% CHAPS-puskuria (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 1,0% CHAPS), huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan, inkuboitiin anti-LC3 2 h huoneen lämpötilassa ja pestiin PBS: llä, inkuboitiin vielä 45 min FITC-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (Beyotime, A0562). Sitten solujen tumat värjättiin DAPI (Sigma, D9564). Näytteet tutkittiin Zeiss LSM 710 -konfokaalimikroskoopilla järjestelmä (Carl Zeiss, Saksa). Kuvan käsittelyssä oli ZEN LE -ohjelmisto.

elektronimikroskopialla

solut huuhdottiin ja kiinteät 30 minuuttia 2,5% glutaarialdehydiä. Näytteet käsiteltiin 1,5% osmiumtetroksidilla, dehydratoitiin asetonilla ja upotettu Durcupan hartsia. Ohuet leikkeet poststained lyijyä sitraatti ja tutkitaan TECNAI 10 elektronimikroskoopilla (Philips, Hollanti) 60 kV.

Western blot-analyysi

Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [21] . Proteiini levitettiin asianmukainen pitoisuus SDS-polyakryyliamidigeelillä, siirrettiin PVDF-membraanille ja sitten havaitaan oikea ensisijaisen ja toissijaisen vasta-aineita ennen kuin visualisoinnin kanssa kemiluminesenssin kit. Visualisointi suoritettiin Image Quant LAS-4000 (Fujifilm, Tokio, Japani) käyttämällä kuvan Multi-ulottuma Software (Fujifilm, Tokio, Japani).

RNA-interferenssi

transfektoitiin epäspesifisiksi siRNA (Qiagen, 1027280), ATG5 siRNA (Qiagen, SI02655310), ATG7 siRNA (Qiagen, SI02655373) tai EGFR siRNA (Cell Signaling Technology, # 6481) (siRNA loppukonsentraatio, 100 nmol /l) kautta LipofectAMINEa RNAi max (Invitrogen, +13.778.150) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Soluja inkuboitiin sitten 48 tuntia ennen Western blot tai MTT-määritystä.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-menetelmää, ja cDNA syntetisoitiin mRNA: sta, jossa PrimeScipt MMLV RT reagenssia (Takara, # 6110). Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-reaktio suoritettiin käyttäen SYBR vihreä, kuten fluoresoiva reportteri (Bio-Rad, 170-8882). QPCR kokeet tehtiin ABI-7500 ja GAPDH oli toiminut endogeeninen kontrolli. Kukin näyte normalisoitui pohjalta sen GAPDH sisällöstä. Yhteensä 40 sykliä (5-t denaturaatio 95 ° C: ssa, 34-s annealingt /pidennys 55 ° C: ssa) ajettiin kutakin aluketta. Alukesekvensseissä olivat seuraavat: for ATG5, TTC AAT CAG GTT TGG TGG AGG C (sense) ja ATG GCA GTG GAG GAA AGC AGA G (antisense); for ATG7, ATG CCT GGG CAT CCA GTG AAC TTC (sense) ja CAT CAT TGC AGA AGT AGC AGC CA (antisense); GAPDH, GGA GTC AAC GGA TTT GGT (sense) ja GTG ATG GGA TTT CCA TTG AT (antisense).

Tilastolliset analyysit

Ellei toisin mainita, tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD ja analysoitiin Studentin t-testillä.

tulokset

EGFR-TKI aiheuttaa autophagy keuhkojen syöpäsoluja

arvioimiseksi aktivoituminen autophagy by EGFR-TKI, muuntaminen LC3-I osaksi LC3-II ennen ja jälkeen TKI hoidon määritettiin western blotting-analyysi. A549 ja NCI-H1299-soluissa, sekä gefitinibi ja erlotinibi voi aiheuttaa kytkimen LC3-I LC3-II annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla, mikä osoittaa, että autophagy voidaan aktivoida sekä TKI (kuvio 1A ja B). Edelleen vahvistaa sitä, lokerointi LC3 soluissa ennen ja jälkeen TKI hoidon seurattiin epäsuoralla immunofluoresenssivärjäyksen. Todellakin, TKI indusoi rinnakkaispaikantumisen of LC3-II lysosomifuusio, osoittaa muodostumista autolysosome (kuvio 1C ja kuvio S1). Mikroskooppitutkimus analyysi elektronimikroskoopilla Lisäksi vahvistettiin, että lukuisia suuria autophagic onteloita tyypillinen kaksikerroksinen kalvo, joka sisältää organelle jäänteitä esitetty gefitinibin-käsiteltyjen A549-solut sen sijaan, että käsittelemättömät solut (kuvio 2A, B ja C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin erlotinibin (kuvio 2D ja E).

A ja B, keuhkosyövän soluja inkuboitiin vaihtelevilla gefitinibi tai erlotinibi 24 tuntia tai inkuboitiin 25 uM gefitinibi tai erlotinibi varten sopivin väliajoin. Kytkin on LC3-I LC3-II havaittiin immunoblottauksella. C, A549 tai NCI-H1299-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 25 uM gefitinibin 24 tuntia. Solut leimattiin fluoresenssi ja kuvattiin konfokaalimikrosko-. Punainen, lyso tracker-leimattua lysosomeihin; Green, FITC-leimattu LC3; Sininen, DAPI-leimattu ydin. Peittokuvan näytettiin oikeassa sarakkeessa. Oranssi-värjättyjen solujen osoitetuista LC3 sijaitsee yhdessä lysosomeihin.

A549-soluja käsiteltiin 25 uM gefitinibin 24 h (A, DMSO, B, Gefitinb, vähän virtaa, C, Gefitinb, korkea teho). D (matala resoluutio) ja E (korkea resoluutio), AGS soluja käsiteltiin 25 uM erlotinibin 24 tuntia (D, erlotinibi, vähän virtaa, E, erlotinibi, suuri teho). Lukuisat autophagical vacuoles tyypillinen kaksikerroksinen kalvo sisältävä organelle jäänteitä oli korostettu nuolin. Bar = 1 pm.

vieressä tutki vaikutuksia EGFR-TKI: n ekspressioon ATG5 ja ATG7, kaksi kriittisiä komponentteja säätelyssä muodostumiseen autophagosomes [22]. Sekä EGFR-TKI: lisääntynyt ATG5 ja ATG7 mRNA: n tai proteiinin tasot (kuvio 3), mikä vahvistaa induktio autophagy EGFR-TKI.

A, A549-soluja käsiteltiin 25 uM gefitinibin 6 tuntia ja mRNA taso ATG5 /7 mitattiin Reaaliaikainen RT-PCR kuvatulla M M. RQ, suhteellinen määrä. musta, gefitinibi käsiteltyjä soluja; harmaa, ohjata soluja. B, immunoblottaus Atg5 tai Atg7 käyttämällä lysaatit A549 käsitelty vaihtelevilla gefitinibi tai erlotinibi 24 tunnin ajan. Data ilmaistiin keskiarvona ± SD, ja analysoitiin Studentin t-testiä. ** P 0,01.

esto Akt /mTOR /p70S6K signalointireittiä EGFR-TKI

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että PI3K /Akt /mTOR /p70S6K akseli on tärkeä rooli inhibitio autophagy [23], [24], siksi vaikutuksen tutkimiseksi gefitinibin ja erlotinibin tämän autophagy heikentävän signalointireitin. Todellakin, fosforylaatiota AKT, mTOR ja p70S6K sekä A549 ja H1299 solut vähentää merkittävästi gefitinibi ja erlotinibi on ajasta riippuva tavalla (kuvio 4A ja B). Kuitenkaan mitään muutoksia PTEN ilmaisun havaittiin jälkeen TKI hoidon (kuvio 4C ja D).

fosforylaatio mTOR, Akt ja p70s6k A549 (A) tai NCI-H1299 (B) käsiteltyjä soluja gefitinibin tai erlotinibin määritettiin western blottauksella. Ilmaisu PTEN A549 (C) tai NCI-H1299 (D) solut käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla gefitinibin tai erlotinibin havaittiin Western blot.

tukkeutuminen autophagy parantaa EGFR-TKI: indusoimaan solukuoleman

Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että autophagy voi toimia suojaava vaste estää kasvainsolujen hoidon indusoimaa solukuolemaa [17], [20], [25], [26], [27], [28], [29], [30]. Keuhkosyövän solulinjassa NCI-H292 ja NCI-H1650, jotka ovat suhteellisen herkkiä gefitinibin ja erlotinibin, ei autophagy havaittu sen jälkeen, kun gefitinibi tai erlotinibi hoitoon (kuvio 5A). Kuitenkin autophagy havaittiin EGFR-TKI käsiteltyjen syöpäsolujen, jotka ovat suhteellisen resistenttejä EGFR-TKI, kuten A549, NCI-H1299 ja SK-MES-1-soluissa (kuvio 1 ja 5A). Nämä tiedot osoittivat, että autophagy voi heikentää herkkyyttä syöpäsolujen EGFR-TKI. Testata tätä kulutusta, vertasimme kasvua estävää vaikutusta gefitinibin tai erlotinibin syöpäsoluihin ennen ja jälkeen farmakologinen ja geneettinen inhibitio autophagy. Kuten kuviossa 5B on esitetty, CQ, jotka voivat haitata toiminnan lysosomeihin ja estää autophagy on myöhäisessä vaiheessa merkittävästi lisätyn kasvun esto indusoi gefitinibi tai erlotinibi A549, NCI-H1299 ja SK-MES-1, jotka ovat suhteellisen resistenttejä EGFR-TKI. Kuitenkin, se ei voi estää keuhkojen syöpäsolujen kasvua oman. (Kuvio 5B). Vastaavasti, kasvun inhibitio aiheuttama gefitinibi tai erlotinibi A549-soluissa kasvaa, kun autophagy estyi knockdovvn ATG5 tai ATG7 (kuvio 5C ja D), kaksi olennaista komponentit muodostumista autophagosome, vahvistavat, että autophagy suojattu kasvainsolujen EGFR- TKI solukuolema.

, Autophagy indusoitiin EGFR-TKI: in kestävä mutta ei herkkä keuhkosyöpään soluja. LC3 ilmentyminen keuhkosyövän soluja inkuboitiin 25 uM gefitinibi tai erlotinibi 24 tunnin analysoitiin immunoblottauksella. B, elinkelpoisuus syöpäsolujen käsitelty 12,5 uM gefitinibi tai erlotinibi 48 tuntia tai ilman 5 uM CQ mitattiin MTT: llä. C, ilmentyminen ATG5 ja ATG7 A549-soluja transfektoitiin ohimenevästi negatiivisen kontrollin siRNA, Atg7 tai Atg5 siRNA määritettiin immunoblottauksella. D, solut transfektoitiin ohimenevästi negatiivisen kontrollin siRNA, Atg7 tai Atg5 siRNA käsiteltiin 12,5 uM gefitinibin tai 25 uM erlotinibin 48 tuntia. Vaikutus EGFR-TKI syöpäsolujen tai ilman ATG5 tai ATG7 pudotus analysoitiin MTT: llä. NC, ohjaus siRNA. Data ilmaistiin keskiarvona ± SD, ja analysoitiin Studentin t-testiä. * P 0,05, ** P 0,01.

EGFR-TKI aiheuttaa autophagy syöpäsoluja EGFR-Knockdown

Seuraavaksi haluaisimme tietää roolia EGFR gefitinibi tai erlotinibi aiheuttama autophagy. Kaksi erityistä siRNA: t käytettiin pudotus EGFR. SiRNA 1 voisi vähentää EGFR suuresti kun siRNA 2 joilla oli kohtalainen vaikutus EGFR (kuva 6A ja B). Mielenkiintoista, autophagy aktivoidaan joko gefitinibi tai erlotinibi ei inhiboinut vaan lisätyn jälkeen EGFR väheni dramaattisesti siRNA 1 (kuvio 6C ja D). Sen sijaan siRNA 2 tuskin mitään vaikutusta autophagy aiheuttama molempien EGFR-TKI (kuvio 6C ja D).

EGFR A549 (A) tai H1299 (B), jotka on transfektoitu ohjaus siRNA, EGFR siRNA1 tai siRNA2 määritettiin western blottauksella. LC3 ilmentyminen EGFR-TKI käsiteltyjen A549 (C) tai H1299 (D) soluja tai ilman EGFR pudotus määritettiin western blottauksella.

Keskustelu

Autophagy nimettiin ohjelmoitu solu kuolema tyypin II, kun taas apoptoosi on tunnettu ohjelmoidun solukuoleman tyyppi I. kuitenkin viime aikoina autophagy todettiin edistää solujen eloonjäämistä epäsuotuisissa olosuhteissa kuten menetyksen aminohappojen tai ATPS, paljastaen uuden roolin autophagy syövän kehittymisessä.

Autophagy on morfologisesti tyypillistä ulkonäköä ”double-kalvo” vacuoles (autophagosomes) sytoplasmassa. Lisäksi nisäkkään homologi hiivan proteiinin Apg8p, (myös nimeltään LC3), on havaittu olevan spesifinen biokemiallinen merkkiaine autophagy. Vasta syntetisoitu LC3 kutsutaan LC3-1 tasaisesti koko sytoplasmassa. Kun induktio autophagy, jotkut LC3-I muunnetaan LC3-II, joka on tiukasti sitoutunut autophagosomal kalvot, jotka muodostavat renkaan muotoinen rakenteita sytosoliin. Olemme vahvisti biokemiallisesti ja morfologisesti että autophagy voidaan aktivoida gefitinibi tai erlotinibi, kaksi hyvin käyttää EGFR-TKI, kaksi erillistä keuhkosyövän solulinjat. Mielenkiintoista, hyvin äskettäin paperi raportoitu, että autophagy voidaan saada aikaan anti-EGFR-vasta-aineiden [31]. Sekä EGFR-vasta-aineita ja EGFR-TKI: käytetään laajasti syövän hoitoon potilaalle EGFR, paljastaen uuden yhteyden EGFR eston ja autophagy aktivointi.

Autophagy voidaan aktivoida solujen vaste syövän hoidossa. Useat syöpähoitojen, kuten DNA: ta vaurioittavien kemoterapeuttisten aineiden, hormonaalisten hoidot (esim. Tamoksifeeni), ja sädehoitoa on havaittu indusoivan autophagy in vitro ja in vivo [32], [33], [34]. Äskettäin todettiin, että autophagy voidaan aktivoida ja suojattu kasvainsolujen kohdennetun hoitoja, kuten imatinibimesylaatti Philadelphia-kromosomi-positiivisten solujen [18], trastutsumabi rintasyövän [20], Src-kinaasi-inhibiittorit eturauhassyövässä [35 ], proteasomiestäjät eturauhassyövässä [16]. Johdonmukaisesti, huomasimme, että autophagy voidaan aktivoida gefitinibi ja erlotinibi keuhkosyövässä ja edistää solujen eloonjäämisen tavoite terapiassa käyttämällä EGFR-TKI. Lukkiutuvat autophagy farmakologisin tai geneettinen lähestymistapoja suuresti parannettu kasvua estävää vaikutusta gefitinibin tai erlotinibin. Siten inhibitio autophagy on mahdollista parantaa kliinistä tehoa EGFR-TKI: syövän hoitoon.

Koska anturi aminohappoja ja ATP, mTOR säätelee negatiivisesti autophagy. Todellakin, huomasimme, että molemmat TKI voi estää aktivoinnin mTOR sekä sen alkupään säädin, PI3K /Akt. Toinen signalointireitin tärkeää autophagy on Raf /MAPK-reitin [23]. Emme kuitenkaan ole löytänyt selvää korrelaatiota Raf /MAPK-reitin ja autophagy solulinjoissa käytimme. Tämä johtunee kasvaimia mutaatioita pääasiassa tapahtunut Ras /MAPK reittejä. Esimerkiksi k-Ras-geenin tiedetään olevan mutatoitunut A549-soluja. Kliinisesti potilailla, joilla on k-Ras mutaatiot eivät vaste TKI hoitoon. Olisi mielenkiintoista tietää, onko potilaalla on k-Ras mutaatiot voisivat hyötyä yhdistelmästä TKI ja estäjiä autophagy.

Mielenkiintoisesti meidän tulokset osoittivat, että gefitinibi tai erlotinibi aiheuttama autophagy ehkä EGFR riippumattomia. Kuten kuviossa 6 on esitetty, sekä EGFR-TKI: saattavat aiheuttaa autophagy jopa EGFR oli vähentynyt huomattavasti. Vaikka gefitinibin ja erlotinibin kehitettiin erityisiä inhibiittorit kohdennettuja kinaasidomeenisekvenssiin EGFR kuitenkin viimeaikaiset tulokset syytteeseen, että nämä kaksi inhibiittorit voi olla muita tavoitteita, kuten ei-reseptorityrosiinikinaaseilla joka toimii myös ylävirtaan PI3K /Akt /mTOR-reitin [36]. Johdonmukaisesti, suuren mittakaavan kliinisissä tutkimuksissa on vahvistettu, että mittaus EGFR immunohistokemiallisesti ollut hyödyllistä poimien potilaille voidaan hyötynyt gefitinibiä. Varmasti, emme silti voinut täysin sulkea pois merkitystä EGFR gefitinibin tai erlotinibin aiheuttama autophagy koska tietty määrä EGFR oli vielä havaitaan sen jälkeen Knockdown mukaan EGFR siRNA. Todellakin, EGFR-TKI: aktivoitu autophagy on paljon parantaa siRNA 1, joka paremmin esillä pudotus hyötysuhde kuin siRNA 2 (kuvio 6B). Näin ollen meidän täytyy lisätutkimuksia selvittämään roolin EGFR on gefitinibi tai erlotinibi aiheuttama autophagy. Kuitenkin, EGFR-TKI ja EGFR siRNA oli synerginen vaikutus induktioon autophagy, joka voisi olla nimenomaan estetty lisätä kliinistä tehoa täsmähoitoihin.

Yhteenvetona työmme vahvisti käsitystä, että syöpäsolut selviytyä stressaava ympäristö, inhiboitu kriittinen onkogeenisten kulkuväylillä indusoimalla autophagy. Nämä kasvainsolut pohjustetaan jatkamaan leviämisen kerran lääkeaineen pitoisuus laskee, kun vieroitusoireista haittavaikutusten vuoksi tai mutaatioita kehittyä resistenssi lääkkeelle. Siten yhdistelmä hoitostrategioita jotka tähtäävät estämään autophagy saaneilla potilailla tavanomaisten kemoterapia tai uusien täsmähoitoihin EGFR-TKI edustaa lupaava lähestymistapa on suurempi tehokkuus syöpäpotilaille.

tukeminen Information

Kuva S1 .

kvantifiointi autophagy keuhkojen syöpäsoluja käsitelty gefitinibi. Solujen prosenttiosuus oranssi signaalit laskettiin laskemalla solut 3-4 aloilla mikroskoopilla. Tiedot olivat edustettuina keskiarvo ± SD.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0018691.s001

(TIF) B