Krooninen sairaus

tiivistelmä

Standard syöpäsolun rivit eivät mallintaa intratumoraalisesti heterogeenisyys tilannetta riittävästi. Kloonijalostus johtaa homogeenisen solupopulaation geneettisillä drift. Heterogeenisyys kasvainsolujen, mutta on erityisen kriittinen terapeuttisesti asiaan liittyvät tutkimukset, koska se on edellytys hankkia lääkeresistenssin ja uusiutumisen kasvaimia. Täällä raportoimme eristämisen erittäin kasvaimia ensisijainen haimasyöpä solulinja, nimeltään JoPaca-1 ja sen yksityiskohtainen karakterisointi eri tasoilla. Istuttaminen niin vähän kuin 100 JoPaca-1 soluja immuunivajaisiin hiirissä aiheutti kasvaimia, jotka olivat histologisesti hyvin samankaltaisia ​​primaarikasvaimen. Korkea heterogeenisyys JoPaca-1 näkyi erilaiset solumorfologian ja huomattavan määrän kromosomipoikkeavuuksien. Vertaileva koko genomin sekvensointi JoPaca-1 ja BxPC-3 paljasti mutaatioita geeneissä usein muuttunut haimasyöpä. Poikkeuksellisen korkea ilmentyminen syövän kantasolujen markkereita ja korkea klonogeeniset potentiaali

in vitro

ja

in vivo

havaittiin. Kaikki nämä ominaisuudet tekevät tästä solulinjasta erittäin arvokas malli tutkia biologian ja lääketeollisuuden vaikutuksista haimasyöpä.

Citation: Fredebohm J, Boettcher M, Eisen C, Gaida MM, Heller A, Keleg S, et ai. (2012) perustaminen ja karakterisointi erittäin kasvaimia ja syövän kantasolujen rikastetun Haimasyöpä Cell Line hyvin määritelty Model System. PLoS ONE 7 (11): e48503. doi: 10,1371 /journal.pone.0048503

Editor: Nathan A. Ellis, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 26 syyskuu 2012; Julkaistu: 12 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Fredebohm et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ oli taloudellisesti tukevat Saksan opetus- ja tutkimusministeriö (BMBF) osana NGFN PaCaNet konsortion (BMBF-01GS08117). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Jörg Hoheisel ja Jörg Tost toimivat editorit PLoS ONE. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaalit ..

Johdanto

Haimasyöpä on yksi aggressiivinen syöpien. Kuolleisuus on lähes identtinen esiintymistä. On viiden vuoden pysyvyys on alle 5%, se on neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien kehittyneissä maissa [1]. Syyt heikkoon ennusteeseen ovat myöhässä kliininen diagnoosi [2] ja kasvaimen vastustuskykyä tavanomaisen kemoterapian [3]. Noin 90% tapauksista, haiman adenokarsinooma (PDAC) on yleisin muoto ja vastaa korkea kuolleisuus; muut, harvinainen syöpä alatyyppejä, kuten kystinen kasvaimia, ovat vähemmän tappava. PDAC oletetaan syntyvän epiteelisolujen haimatiehyen järjestelmän [4]. Jakelu kasvainsolujen sisällä pahanlaatuinen kudos on tyypillisesti hajanainen ja sisältää alueet vaihtelevalla histologisia erilaistumista. Se on ominaista myös yleinen heterogeeninen tuumorisolupopulaatioon (intratumoraalisesti epäyhtenäisyys) [5], [6].

Huomattava määrä PDAC solulinjoja eri ominaisuuksia on perustettu ja tarjota solulähteestä tutkimisesta molekyyli näkökohtia tuhoisan taudin (tarkastanut Ulrich et al. [7]). Kuitenkin viljelemällä solulinjoja tarkkaan määritellyin edellytyksin väistämättä valinta osapopulaatioiden ajan. Siten standardi solulinjat eivät mallintaa tilannetta intratumoraalisesti heterogeenisyys, koska kloonivalinnan on tapahtunut yli monissa kohdissa

in vitro

. Tämä johtaa homogeenisen populaation solujen geneettinen ajautuminen [8]. Päinvastoin, ensisijainen solulinjojen hyvin läheisesti muistuttavat heterogeenisyys primaarikasvaimen ja siksi antaa hyvä voimavara soluviljelmäkokeita.

in vivo

heterogeenisyys kasvainsolujen on erityisen kriittinen kokeissa testaamalla vaikutukset kemoterapiaa, koska heterogeenisyys antaa perustan resistenttien alapopulaatioiden, joka puolestaan ​​muodostaa perustan hankitun lääkeresistenssin ja uusiutumisen kasvain [3], [9]. Väestön keskuudessa resistenttien solujen syöpä kantasolut olemaan ratkaisevan tärkeä rooli niillä on kyky itse uudistaa [3] ja pystyvät kiinnittyä uudelleen kasvainta ensisijaisen sivuston tai johtaa etäpesäkkeiden muodostumisen kaukaisiin kohtiin [10].

Syöpä kantasolut tai kasvain aloittamista soluja, jotka ajavat syövän etenemistä on saanut paljon huomiota viime vuosikymmeninä [11], [12], [13]. Haimasyöpä, useita molekyylimarkkerit on ehdotettu olevan ominaisia ​​syövän kantasoluja. Näiden joukossa ovat ilmaus kolmikon CD44, CD24 ja ESA [14], solun pinnan proteiinin CD133 (prominin I) [15], [16], [17], ja – viime aikoina – lisääntynyt aktiivisuus aldehydidehydrogenaasille 1 (ALDH1 ) [18]. Expression of ALDH1 on myös korreloi invaasiota ja muuttoliike sekä mesenkymaalisten ominaisuuksia kasvain [19]. Lisäksi se on yhteydessä huonoon kokonaiselossaolo. Mielenkiintoista kyllä, kaksi vastakkaista tutkimukset osoittavat, että korkeat [19] tai alhainen [20] ilmaus ALDH1, on haitallinen vaikutus potilaan selviytymistä. Toinen tunnusmerkki kasvain aloittamisesta on kyky muodostaa rakeita kasvain pallojen suspensiona [21], [22]. Syövän kantasoluja uskotaan myös edistää lääkeresistenssin. Samalla se on osoitettu, että sisältö CD133 ilmentävien solujen voidaan rikastaa gemsitabiinihoidon [23], [24], [25] mikä viittaa keskeinen rooli tämän CSC merkkiaineen gemsitabiinin vastarintaa.

Täällä Kirjoittajat raportoivat eristämistä ja karakterisointia uusi ensisijainen solulinja on johdettu suoraan ihmisen kasvaimen näyte potilaan haiman adenokarsinooma. Tätä solulinjaa, nimetty JoPaca-1, osoittaa korkea lajikkeen morfologia ja kuljettaa monia kromosomipoikkeavuuksia. Patologisesti, hiiri-ksenografteissa ja primaarikasvaimen ovat hyvin samankaltaisia ​​kannalta diffuuseissa erilaistumisen ja soluttautumista ympäröivä haiman ja ei-haiman kudosta. JoPaca-1-solut ilmentävät tuumorimarkkeri Mesothelin ja useita sytokeratiineja. Sen lisäksi korkea heterogeenisyys, todennäköisesti tärkein ominaisuus tämän uuden solulinjan on sen korkea pitoisuus kasvaimen aloittamista solujen osoituksena

in vivo

rajoittavan laimennuksen määrityksen ja korkeat ekspressiotasot syövän kantasolujen merkkiaineita. Ottaen huomioon muistutti ehdottomasti alkuperäisestä kasvaimesta ja yhdessä perusteellisen molekyylien karakterisointia, solulinja tarjoaa erinomaisen voimavara tahansa solu-pohjainen sijaan kudospohjaisia ​​analyysiin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tietoon kirjallinen suostumus saatiin potilaasta. Eettinen hyväksyntä on saatu eettisen komission lääketieteellisen tiedekunnan yliopistollisen sairaalan Heidelberg, Saksa. Kaikki eläinten hoito ja menettelyt Saksan lainsäädännön perusteella ja aiemmin hyväksynyt valtiollisten kistusneuvostolta tilasta badenwuerttemberg, Saksa.

Solujen eristämisen

tuore kudos saatu 46- vuotiaan miespotilas kärsii haimasyöpä, joka tehtiin pylorus säilyttävää pancreatecto-duodenectomy. Operaation aikana otettiin näyte poistetusta kasvain ja varastoida suoraan Hankin tasapainotettu suolaliuos (HBSS, H6648, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksa) 4 ° C: ssa 12 tuntia ennen jatkokäsittelyä. Kudos näyte leikattiin sitten kappaleiksi noin 5 mm halkaisijaltaan ja siirrettiin kulttuurin pulloon, joka sisältää Hamin /F-12 Medium (21765-029, Life Technologies, Darmstadt, Saksa), jota oli täydennetty seerumin vaihto reagenssilla (S0638, Sigma Aldrich) . Kudos palat on kiinnitetty alustaan, ja solut kasvoivat ulos viikon kuluttua, jotka muodostavat ryppäitä kudoksen fragmentit. Fibroblasteista tähtisolut poistettiin kaksi kierrosta sarja entsymaattisia irrallisuus 0,05% trypsiini /EDTA (25300054, Life Technologies). Saatu populaatio kasvainsolujen jäädytettiin kanavan numero neljä ja varastoidaan erissä. Kokeissa tässä kuvatuista, JoPaca-1-soluja käytettiin kohdissa 6 19. kuolemattomuus eristettyjä soluja ei ollut tarpeen.

Soluviljely

vakiintunut haimasyövän solulinjoissa MiaPaca -2, MDAPanc-28, BxPC-3, AsPC-1, ja Capan-1 saatiin ATCC: ltä (Rockville, MD, USA). Lisäksi FamPAC oli ystävällisesti professori Eisold [26] ja HDPE C7 solut professori Francisco Real (Spanish National Cancer Research Centre, CNIO) [27]. BxPC-3 oli todennettu Saksan kerääminen mikro-organismien ja Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Saksa). Kaikki solulinjat olivat vapaat mykoplasmatyypeissä, virusten ja solulinjan saastuminen kuin testattiin PCR [28].

Soluja viljeltiin vakio keskipitkällä ja ravintolisiä, jotka saatiin Life Technologies, Darmstadt, Saksa jollei toisin: JoPaca-1 Isocove muokattu Dulbeccon Medium (IMDM) (Cat. No. 21056), 10% naudan sikiön poikia seerumia (FCS) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (P /S); BxPC-3 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 väliaine (Cat. No. 21875), 10% FCS, ja 1% PS; HDPE C7 Keratinosyyttien Serum-Free Medium (KSFM), 0,15 ng /ml epidermaalisen kasvutekijän reseptori, ja 25 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta (Cat. Nro 17005075) [29]. Kasvaimen pallo muodostumista, JoPaca-1-soluja viljeltiin Hamin /F12-väliaineessa, jota oli täydennetty 20 ng /ml fibroblastien kasvutekijä (bFGF, F0291, Sigma Aldrich, Munich, Saksa), 1 x B-27 lisäravinteet (Cat. Nro . 0080085-SA), 2 mM L-glutamiinia (Cat. No. 25030024), ja 1% P /S alhaisissa kiinnityslevyyn (Cat. No. 3473, Corning, Amsterdam, Alankomaat). Solut jaettiin suhteessa 1-10, ellei toisin mainita. Solujen elinkyky gemsitabiinihoidon (G6423, Sigma Aldrich) määritettiin resazurine määrityksellä [30]. Pitkän aikavälin gemsitabiinihoidon, JoPaca-1-soluja kanavassa 10 alistettiin ajaksi 72 h kasvavia pitoisuuksia lääkkeen: 10, 15, 20 ja 25 nM. Solut jaettiin 1/3 jokaisen kierroksen jälkeen hoidon ja kontrolliin verrattuna kanavassa 13 ilmentämiseen CD133. Kuvia vanhempien JoPaca-1 ja sub kloonien kulttuuri otettiin käännettyä mikroskooppia (DM Irbe, Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa) varustettu CCD-kameralla (Progressive Scan CV-M1, JAI, Frankfurt, Saksa). Mittaviivat lisättiin ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) laskemalla mitatun pikselikoot.

sytogenetiikka – monivärinen fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (mFISH) B

JoPaca -1-soluja käsiteltiin 10 ng /ml vinblastiini 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 4 tuntia pidättämään niitä metafaasissa. Metafaasissa levitteet valmistettiin standardimenetelmien mukaisesti [31]. Lyhyesti, suspendoidut solut käsiteltiin 75 mM KCl: a 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja kiinnitettiin jääkylmällä Carnoy liuosta (methanol:acetic acid = 03:01) kolme pesuvaihetta. Liuos kiinnitettyjä soluja pudotettiin 1 metri päälle käännetyssä dia, joka oli aiemmin kostutettu 70% etanolilla. mFISH suoritettiin käyttäen monivärinen koetinpakkauksen 24XCyte (Metasystems, Altlußheim, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Hybridisoitiin metafaasissa levitteet analysoitiin käyttämällä tietokoneavusteista fluoresenssimikroskooppia (Axioplan 2, Zeiss, Göttingen, Saksa) varustettu asianmukaisella suodatin asetetaan. Kuvat tallennettiin CCD-kamera (Photometrics, Tucson, AZ, USA) ja analysoitiin quips SpectraVysion ™ Software (Vysis, nyt jaellaan Applied Imaging).

klonogeeninen potentiaali ja tumourgeneity

in vitro

-rajoittavia laimennusmenetelmällä.

JoPaca-1-solut ympättiin 96-kuoppaisen levyn one-to-one laimennussarja alkaen 125 solua per kuoppa, ja jokainen laimennus 16 jäljittelee. Elatusaine ei muutettu, jotta autokriiniseen signalointi. 10 päivän jälkeen, kaivot osoittaa erilliset pesäkkeet laskettiin. 15 päivän kuluttua, pesäkkeitä osoittaa monipuolinen morfologisia fenotyypit valokuvattiin.

In vivo

-rajoittavia laimennuksen määrityksen.

Alustavat vierassiirrekokeissa suoritettiin injektoimalla 1 miljoonaa soluja NOD. cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl (NOD /SCID /γ tai NSG) hiirillä. Arvioida in vivo aiheuttavan kasvaimia JoPaca-1, 104, 103 ja 102 solut, vastaavasti, injektoitiin 70 ui Matrigel (2 mg /ml) (BD, Heidelberg, Saksa) kautta haiman elin NSG hiirillä. Onnistunut siirteen kasvainten ja niiden kasvua seurattiin säännöllisesti tunnustelu implantointikohdassa.

määrällisesti klonogeeniset potentiaali ja kasvaimen aloittamista taajuus, tiedot analysoitiin regression sovituksen algoritmia (ELDA) [32].

H anti-sytokeratiini 19 käytettiin 1:50; anti-sytokeratiini Ä1 /AE3 (koodi M3515, DakoCytomation) käytetään 1:300; anti-CD133 /1 (AC133) (130-090-422, Miltenyi Biotech) käytettiin 1:50; ja universaali negatiivinen kontrolli, joka sisältää hiiren IgG: t (IS750, DakoCytomation) käytettiin 1:02 laimennus. Levyjä inkuboitiin 4 ° C: ssa 16 tuntia. Havaitsemiseksi primaarisen vasta-aineen, sekundäärisen anti-hiiri-vasta-ainetta, joka oli konjugoitu peroksidaasiin (K4001, DakoCytomation) levitettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Värireaktio kanssa diaminobenzodine (DAB) oli vasta- värjättiin hematoksyliinillä. Lopuksi, dioja koettiin käyttämällä Axioplan 2 mikroskoopilla otettua kuvaa ja jota AxioCam HRc CCD-kamera (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Saksa). Mittaviivat lisättiin oheisissa AxioVision 4-ohjelmisto.

Immunofluoresenssi

immunofluoresenssi Mesothelin ja sytokeratiini 19, JoPaca-1, BxPC-3 ja HDPE C7-soluja kasvatettiin viljelmässä kalvot (Cat . 354559, BD Biosciences), kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä, ja läpäiseviksi 0,2% Triton X-100: ssa 5 min. Dioja blokattiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), jossa oli 10% naudan seerumin albumiinia (BSA) ja epitoopit noutaa PBS, johon oli lisätty 10% proteinaasi K IgG1-vasta-aineita Mesothelin K1 (Cat. Sc-33672, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa ) ja sytokeratiinia 19 (klooni RCK108, Code-Nr. M 0888, DakoCytomation, Hampuri, Saksa) sekä hiiren IgG1 (MCA928, Serotec, Puchheim, Saksa) negatiivisena kontrollina käytettiin laimennoksena 1:50. Sekundaarinen vasta-aine Alexa Fluor 488 vuohen anti-hiiri-lgG1 (A-11001, Life Technologies) käytettiin laimennoksena 1:500. Objektilasit asennettu sisältävässä vesiväliaineessa 4 ’, 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) ja vasta-tahra ytimet (sc-24941, Santa Cruz Biotechnology). Kuvat otettiin laaja-kentän mikroskoopilla varustettu AxioCam CCD-kamera (Zeiss Cell Observer, Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Saksa).

fluoresoiva avustaa solun lajittelu (FACS) B

Expression of CD133 havaittiin FACS: llä (FACS Canto II, BD Biosciences, Heidelberg, Saksa) käyttämällä fykoerytriinikonjugoitua CD133 /2 (293C3) ja CD133 /1 (AC133) vasta-aineita (Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Saksa). Aktiivisuus ALDH1 mitattiin Aldefluor alustalle +/- DEAB estäjä (StemCell Technologies, Grenoble, Ranska). ALDH-kirkas soluja (ALDH

br) havaittiin FITC kanavalla ja kompensoi vastaan ​​fykoerytriini- ja päinvastoin käyttämällä yksittäin merkittävä soluja verrokkeina. Expression tripletin CD44 /CD24 /ESA testattiin käyttäen seuraavia vasta-BD Biosciences: EpCAM (ESA) -APC (Cat. 347200), CD44-PE-Cy7 (Cat. 560533), CD24-FITC (Cat. 555427) . Inkubointi solujen kanssa vasta-aineiden ja substraattien, FcR esto ja pesuvaiheet suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

kaikkiaan Genomikartoituksen

genomista DNA: ta solulinjoista JoPaca-1 (passage 8) ja BxPC-3 uutettiin käyttämällä standardimenetelmiä. Koko genomin sekvensointi ja lukea linjaus tehtiin käyttäen Illumina HighSeq 2000 sekvensseri klo Centre National de Génotypage (Evry, Ranska). Tiedot alkuun 17 ei-synonyymi koodaus geenit mutatoitunut haimasyövän saatiin Sanger Institute luettelo somaattisten mutaatioiden syövän kotisivuilta (https://www.sanger.ac.uk/cosmic) [33]. Lisäksi kolme geeniä sisällytettiin päässä OMIM tietokannasta alla hakusana ”haimasyöpä” (https://www.omim.org/entry/260350) [34]. Kaikki nämä geenit tarkastettiin eksoni ei-synonyymi mutaatiot BxPC-3 ja JoPaca-1 (taulukko S2). Lisäksi ei-koodaava vaihtelut liittyvät haimasyöpä saatiin genomin laajuinen yhdistys tutkimukset (GWAS) (taulukko S3). Luettelointi muuntunut ja villityyppisen lukee tehtiin käsin käyttäen Ensembl genomin selaimen [35] ja integroiva genomin katsoja [36] laskemalla jokaisen kartoitettuja lukea.

Sangerin sekvensoinnilla

KRAS

alueella noin kodonin 12

KRAS

monistettiin cDNA syntyvät solulinjoista standardeilla PCR käyttämällä Phusion polymeraasia (F-530, Fermentasilta, St. Leon-Rot, Saksa) ja seuraavia alukkeita : KRAS-F (5′- CCC CGC CAT TTC GGA CTG GG-3 ’) ja KRAS-R (5′-ACT CCT CTT GAC CTG CTG TGT CG-3’). PCR-tuotteet sekvensoitiin GATC (Constance, Saksa) käyttäen aluketta KRAS-F.

Tulokset

JoPaca-1-solut ovat peräisin huonosti eriytetty adenokarsinooma haiman

eristämiseen primaarikasvaimen solut, tuoreesta kudoksesta saatiin 46-vuotiaan miehen sairastavan potilaan haimasyövän, joka tehtiin pylorus säilyttävää pancreatecto-duodenectomy (pp-Whipple toimintaa). Hän kuoli viiden kuukauden kuluttua leikkauksesta. Histopatologista tutkimusta kudoksen paljasti heikosti eriytetty adenokarsinooma haima, jossa kasvain tunkeutumisen pohjukais- haimansisäisen sappitiehyen ja peripancreatic pehmytkudoksen. Hermoa, lymphogenic ja hematogenic kasvaimen tunkeutuminen voisi löytyä sekä kaksi imusolmukemetastaaseja 22 alueellisiin imusolmukkeisiin. TNM vaihe oli pT3, PN1 (2/22), G3. Kliinisesti ei ollut esiintyminen kaukainen elimen etäpesäkkeitä. Ensisijainen solulinja JoPaca-1 eristettiin resektoidun syöpäkudoksessa, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti menetelmiä osassa. Tuloksena populaatio puhdasta kasvainsolujen jäädytettiin neljän kasvun kohtia. Kokeita on raportoitu alla, solujen 6-19 kohtia käytettiin. Soluja kasvatettiin standardin soluviljelyväliaineessa IMDM täydennetty 10% FCS: ää ja 1% PS.

subklooneja JoPaca-1 osoittavat fenotyypin heterogeenisuus vanhempien väestöstä

Yhden soluja JoPaca-1 viljellään täydellisessä eristyksessä synnytti pesäkkeitä, joissa havaittiin vaihteleva morfologia (Fig. 1). Tyypillisesti kaksi erilaista kasvua voitiin havaita: tiiviisti yhteyttä saari muodostumista ja no-yhteystiedot leviäminen (Fig. 1 B, C). Cellular heterogeenisyys näkyi myös valikoima erilaisia ​​solujen muotoja, jotka havaittiin. Pyöreä ja vesicular solujen tapahtui samoin karamaisen fenotyyppi. Lisäksi, muodostumista pitkän pseudopods voidaan nähdä (Fig. 1 D-F). Molemmat, erilaiset kasvuominaisuudet ja erilaisten solun muotoja voidaan myös havaita vanhempien väestöstä (Fig. 1A), joka osoittaa sen hyvä edustus eristetyn sub-klooneja.

Faasikontrasti- kuvia esittelyyn of JoPaca-1 emosoluilta ja alakloonien näyttää erilaisia ​​kasvua ominaisuudet ja morfologioita. A. JoPaca-1 vanhempien solupopulaation. B, C. Kaksi eri kasvuominaisuudet voidaan havaita: close-kontakti saari muodostumiseen (B) ja no-yhteystiedot leviäminen (C). D-F. Kolme erilaista solujen muotoja havaittiin: pyöreä ja vesicular (D), kara-like (E), ja pseudo-pod muodostava (F) solua.

JoPaca-1 solut ovat tetra pentaploid ja genomisesti instable

JoPaca-1 pidätettiin metafaasissa tutkia karyotyyppi ja kromosomipoikkeavuuksia. Metaphase levitteet 26 solut analysoitiin. Ne muotoutuneet tetra pentaploidic karyotype viisi todettiin yleisesti kromosomivirheitä (Fig. 2). Nämä ovat translokaatiot t (17; 5) (5; 17), t (7, 4), t (13; 12), ja t (2; 9) ja inversio kromosomin 13 (I13). Kaikkiaan 47 eri poikkeamia havaittiin 26 karyograms. Mutta suhteellisen usein aberraatioita edellä, useimmat (38) havaittiin vain kerran. Kolme muuta toiselle siirtäminen havaittiin kahdesti tai kolmesti (taulukko S1). Y-kromosomi menetettiin 20 ulos 26 karyograms.

edustaja karyogram of JoPaca-1 Tässä näytetään. JoPaca-1 on tetra penta-ploidic solulinjassa. Alla yleiskatsaus kuva, viisi useimmin havaittu poikkeavuuksia 26 karyograms esittelyyn. Translokaatioita voitiin tunnistaa hybridisoimalla erivärisistä antureista tuloksena dual-värinen kromosomeja. Inversion kromosomin 13 (I13) on fuusioimalla kaksi q-aseet on Kinetokori. Y-kromosomin usein menetetään tuumorisoluissa, kuten se on tässä esitys.

JoPaca-1 osoittaa lisääntyneen resistenssin gemsitabiinin yli BxPC-3

JoPaca-1-soluja verrattiin että BxPC-3 vastauksessaan gemsitabiinin, standardin ensilinjan kemoterapeuttisen hoito haimasyöpä. Puuttuessa huumeiden, kaksinkertaistaminen aika oli 28 h JoPaca-1 ja 19 h BxPC-3. Aikana 72 h kasvukausi, tämä vastaa 3,79 solun osastojen BxPC-3 ja 2,57 sekä JoPaca-1. Jotta jakaa 3,79 kertaa, JoPaca-1 vaatisi 106 h. Näin ollen pitkittynyt inkubointi gemsitabiinihoito oli voimakkaampi vaikutus solujen elinkelpoisuudesta JoPaca-1 (Fig. 3A). Verrattuna BxPC-3, JoPaca-1 osoitti huomattavasti suuremman toleranssin gemsitabiinin kanssa IC

50 28 nM verrattuna 11 nM BxPC-3 jälkeenkin puolet solupopulaation läpi ylimääräisen kierroksen mitoosin (3.79+ 0,49 = 4,28 solujakaantumisia = 120 h) (Fig. 3B). Näin ollen, lisääntynyt vastus JoPaca-1 on riippumaton määrä leviämisen.

BxPC-3 ja JoPaca-1-solut me käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla gemsitabiinin 72, 96, ja 120 tuntia. Solujen elinkelpoisuus normalisoidaan ei-käsiteltyihin kontrolleihin. Tietopisteet edustavat keskiarvotuloksista kuuden rinnakkaisten kokeilut standardipoikkeamat merkitty virhepalkeilla. A. lisääminen inkubaatioajan gemsitabiinihoito johtaa lisääntyneeseen sytotoksisuuteen varten JoPaca-1. B. Solujen elinkelpoisuus verrattiin 3,79 ja 4,28 solujakaantumisia varten BxPC-3 ja JoPaca-1, tässä järjestyksessä. JoPaca-1 esittää korkeampi toleranssi kohti gemsitabiinia kuin BxPC-3 jälkeenkin laajennettu inkuboitu 0,49 solunjakautumisten.

JoPaca-1-solut ovat erittäin tuumorigeenisemmiksi ja ovat lisänneet klonogeeniset potentiaali

perustaa klonogeenisten potentiaalin JoPaca-1, solut passage 10 laskettiin, ja siirrostettiin 1-1 laimennussarja kahdessa 96-kuoppalevyille alkaen 125 solua kuoppaa kohden ja alas, 4 solua kuoppaa kohti. Kukin laimennos tehtiin 16 kertaa. Sen jälkeen, kun 15 päivää inkuboinnin kuopista, jotka sisälsivät erillisiä pesäkkeet laskettiin. Laskennallinen analyysi pesäkeluvut käyttäen ”äärimmäinen LDA” algoritmi [32] osoittivat, että yksi solu 48 (~ 2%) oli kyky muodostaa pesäkkeitä (Fig. 4A). Tämä klonogeeniset potentiaali on kymmenen kertaa suurempi kuin vakiintuneesta solulinjasta Capan-1 ja 0,2% [19].

klonogeeninen potentiaalia ja tumourgenicity of JoPaca-1 määritettiin rajoittavan laimennuksen määritykset

in vitro

ja

in vivo

. A. laimentaminen solujen 96-kuoppalevylle ja laskenta pesäkkeitä sisältävien solujen 10 päivän jälkeen johtaa klonogeeniset potentiaalia 1 solun 48 laskema ELDA [32]. B. Orthotopic injektio 10.000, 1.000, ja 100 JoPaca-1 solut 6 NOD.Cg-

Prkdc

scid Il2rg

tm1Wjl

hiirille kussakin aiheutti kasvainten muodostumisen joista irti, punnittiin ja valokuvataan. Keskimäärin kasvain massat esitetään.

Määrittää tumourgenicity of JoPaca-1

in vivo

, kolme ryhmää kuudesta immuunikatopotilaiden NOD.Cg-

Prkdc

scid Il2rg

tm1Wjl

hiiriin injektoitiin ortotooppisesti 10

4, 10

3, ja 10

2-soluissa, vastaavasti. Jälkeen 100 päivää, kaikki hiiret olivat vielä elossa. Kaikkiaan 11 hiiret oli muodostunut kasvaimia: 6/6 eläimille 10

4 solut, 4/6 10

3-soluissa ja 1/6 10

2-solut (Fig. 4B). Kasvaimen aloittamista taajuus arvioitiin ELDA algoritmia 1 solu 831 alemman ja yläraja 1 in 2114 ja 1 327, tässä järjestyksessä. Kasvaimet leikattiin irti ja painotettu. Kasvain paino korreloi suoraan määrä pistetään soluja. 10

4 solut, keskimääräinen kasvaimen paino oli 927 mg; induktio 10

3-soluissa johti kasvainten 618 mg keskimäärin. Yksittäinen kasvain johtuvat 10

2-solut oli 300 mg.

JoPaca-1-solut hyökkäävät ympäröivä normaali kudos ja osoittavat metastasizing potentiaalia in vivo

primaarikasvaimen olivat tunkeutuneet sileän lihaskudoksen proksimaalisen pohjukaissuolen (Fig. 5A). Ksenograftikasvaimissa ei koteloitu; Lisäksi ne paljastivat invasiivisen edessä alueilla infiltratiivinen kasvaimen laajentumista viereiseen normaaliin haiman kudosta (Fig. 5B) Etäpesäkkeitä voitiin havaita yhdellä kolmesta hiirestä aikana alkuperäisen kokeiluja, mutta ei analysoitu tarkemmin (Fig. 5C).

Ohessa H & E tahrat ensisijaisen (A) ja -ksenografti (B) kudoksen viipaleiksi. A. sileää lihaskudosta pohjukaissuolen oli tunkeutunut kasvainsoluja primaarikasvaimen. B. Invasiivinen edessä ksenograftikasvaimissa alueiden kanssa infiltratiivinen kasvaimen laajentumista viereiseen normaaliin haiman kudos (nuoli päätä). C. Yksi kolmesta NSG hiirille kehittyi etäpesäkkeiden aikana Alkukokeissa kun 1 miljoonaa solua injektoitiin ortotooppisesti (nuoli päätä).

Ensisijainen ja ksenograftikasvaimissa nostettiin JoPaca-1 on hyvin samankaltainen histologia

Histopatologisesti ksenograftikasvaimissa osoittavat suurta samankaltaisuutta primaarikasvaimen. Cellular morfologia ja kasvua kuvioita yleistä huonosti eriytetty ominaista yhden solu- tai vakaa kasvu. Kuitenkin alueilla micropapillary kasvuvauhtiin ja ductular muodostumat löytyivät sekä ensimmäisen ja ksenograftikudoksesta (Fig. 6A). Lisäksi muuttavien ja invasiivisen käyttäytymisen havaittiin samassa määrin. Ensisijainen ja Ksenograftikudoksista osoitti hermoa soluttautuminen ja tunkeutuminen imukudoksen ja verisuonet (Fig. 6B, CII ja 11C).

Ohessa H & E tahrat pää- ja ksenograftikasvaimissa. A. Ensisijainen ja ksenograftikasvaimissa osoittavat samanlaista erilaistuminen fenotyypit vaihtelevat yleisesti huonon erilaistumiseen (-) yli micropapillary kasvu (x) eriytetympien ductular muodostelmia (*). B. Perineuronal invaasio voidaan havaita sekä ensimmäisen ja ksenograftikasvaimissa (nuoli päätä). C. Kuvassa ovat alueita tuumorinekroositekijä, rajaamaa neutrofiilien granulosyyttien (C i, tähdellä) ja kasvaimen infiltraatiota imusuonien (C ii, nuolen pää). D. jakautuminen stroman (S) alemman ja ksenografti- kasvainkudoksen. Syöpäsolut Molempien näytteitä upotettu desmoplastic kasvain strooman. Vaikka strooman in primaarikasvaimen on hajallaan kasvain, se on enemmän lokalisoitu ksenografti-.

Ominaisuudet vuoksi immunologisten ominaisuuksien olivat luonnostaan ​​voimakkaampi primaarikasvaimen kuin ksenograftissa kuin NSG hiiret eivät kykene asennuksen synnynnäinen tai adaptiivista immuunivastetta. Näitä immunologisia ominaisuuksia ovat alueita tuumorinekroositekijä, jotka rajaavat neutrofiilien granulosyyttien (Fig. 6Ci) sekä tunkeutumisatmosfäärin tulehdussolujen, pääasiassa lymfosyyttejä ja granulosyyttejä. Vuonna primaarikasvaimen solut upotetaan desmoplastic kasvain strooman. Ksenograftikasvaimissa osittain lomassa strooman kudoksen samoin. Täällä nämä alueet on lokalisoitu eikä kaikkialla läsnä kuin primaarikasvaimen (Fig. 6D).

JoPaca-1 ilmaisee sytokeratiineja ja tuumorimarkkeri Mesothelin

immunohistokemialla sytokeratiineja suoritettiin ensisijainen ja -ksenografti kasvainkudoksen viipaleiksi. Sekä ensisijainen ja ksenograftikasvaimissa värjättiin positiivinen yleiseurooppalaisen sytokeratiini kloonit AE1 ja AE3. Expression of sytokeratiineja ensisijaisen kasvaimen oli hieman enemmän hajallaan kuin ksenografteissa, joissa se selvästi värjäsivät epiteelisolujen luumenin puolella kanavat. Tarkemmin sanottuna ilmentyminen sytokeratiinista 19 oli vielä ominaista Duktaalinen molemmissa kudoksissa. Isotyyppikontrolleja olivat negatiivisia (Fig. 7). Immunofluoresenssimenetelmällä vahvistaa ilmentyminen sytokeratiinia 19 eristetyissä JoPaca-1-soluissa. Sytokeratiinia 19 on välissä hehkulamppuja proteiinia ja ilmaistiin JoPaca-1 kasvavasta edessä solun pesäkkeitä (Fig. 8A). Lisäksi JoPaca-1 testattiin ilmentyminen tuumorimarkkeri Mesothelin. Vakiintuneet haimasyövän solulinjaa BxPC-3, ja normaali haimatiehyen solulinjaa HDPE C7 käytettiin positiiviset ja negatiiviset kontrollit, vastaavasti. Expression of Mesothelin voitiin havaita JoPaca-1 ja BxPC-3-soluissa, mutta ei normaaleissa haimatiehyt- solut HPDE C7. Isotyyppi-kontrollit olivat negatiivisia (Fig. 8B).

Immunohistokemia suoritettiin ensisijainen ja ksenograftin kasvaimen viipaleiksi. Sytokeratiineja AE1 /AE3 ja tarkemmin sytokeratiinia 19 ilmaistiin duktaalisessa rakenteiden ensisijainen ja ksenograftikasvaimissa (ruskea). Isotyyppikontrolleja olivat negatiivisia.

Faasikontrasti- kuvia esittelyyn, jotka osoittavat Mesothelin ja sytokeratiinia 19 havaittuna kiinteissä JoPaca-1, BxPC-3 ja HDPE C7 soluja. Molemmat proteiinit merkitty ensisijaisen ja FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (vihreä). Tumat värjättiin DAPI (sininen). Isotyyppikontrolleja olivat negatiivisia. A. sytokeratiinivasta 19 ilmentyy kasvava edessä JoPaca-1-soluissa. B. JoPaca-1 ja vakiintuneesta solulinjasta BxPC-3 sekä ilmaista Mesothelin kun normaali haimatiehyen solulinjassa HDPE C7 ei.

JoPaca-1-solut ovat erittäin rikastettu syövän kantasolujen markkereita

itseuudistuvien syövän kantasoluja ajatellaan olevan liikkeellepaneva voima kasvainprogression ja vastaa vastustuskykyä kemoterapiaa.