Krooninen sairaus

tiivistelmä

Helicobacter pylori

, gram-negatiivinen, mikroaerofiilisessä bakteeri löytyy vatsassa, oletetaan liittyvän syövän synnyn, invaasio ja etäpesäkkeiden ruoansulatuskanavan sairaudet. Sytotoksiini liittyvä geeni A (CagA) on onkogeenisessä proteiini

H. pylori

joka koodaa Cag patogeenisyyssaarekkeen kehittämiseen liittyvät mahasyövän. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on tärkein biologinen tapahtuma invaasion tai etäpesäkkeen epiteelisolujen.

H. pylori

voi edistää EMT ihmisen mahasyövän solulinjoissa, mutta erityinen mekanismit ovat vielä epäselviä. Selvitimme taustalla molekyylitason mekanismi EMT aiheuttamien

H. pylori

CagA mahasyövän. Meidän artikkelissa olemme havainneet mahasyövän yksilöitä ja viereisen ei-syöpä yksilöitä immunohistokemiallisesti ja todettu lisääntyneen ekspression EMT liittyvien säätelijäproteiinin TWIST1 ja mesenkymaaliset markkeri vimentiinista syövän kudoksissa, kun taas ohjelmoidun solukuoleman tekijä 4 (PDCD4) ja epiteelin merkki E-kadheriinin ilmentymisen pienentynyt syövän yksilöitä. Nämä muutokset liittyivät verran kudoksen maligniteetin. Lisäksi PDCD4 ja TWIST1 tasot liittyivät. Mahalaukun syöpäsolut viljellään kanssa CagA ekspressioplasmidin, CagA aktivoitu TWIST1 ja vimentiinista ilmaisun, ja se esti E-kadheriinin ilmentymisen vähen- tämisessä PDCD4. CagA myös edistänyt liikkuvuutta mahalaukun syöpäsolujen säätelemällä PDCD4. Siten

H. pylori

CagA aiheuttama EMT mahalaukun syöpäsoluissa, joka paljastaa uuden signalointireitiksi EMT mahasyövän solulinjoissa.

Citation: Yu H, Zeng J, Liang X, Wang W, Zhou Y, Sun Y, et ai. (2014)

Helicobacter pylori

Edistää epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon mahasyövän by downregulating ohjelmoidun solukuoleman Protein 4 (PDCD4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10,1371 /journal.pone.0105306

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 helmikuu 2014; Hyväksytty: 21 heinäkuu 2014; Julkaistu: 21 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Basic Research Program of China (no. 973 Program 2012CB911202), National Natural Science Foundation of China (nos: 81171536, 81371781, 81272654, 81372680 ja 81170514), Medical Technology Development Program Shandong (ei . 2013WS0209) ja Independent Innovation Foundation Shandongin yliopistossa (no. 2012TS106). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Helicobacter pylori

(

H. pylori

) on helix-muotoinen, gram-negatiivinen bakteeri, joka liittyy ruoansulatuskanavan sairaudet, mukaan lukien krooninen gastriitti, mahahaava, mahasyöpä, ja limakalvojen-liittyvässä imukudoksessa lymfooma.

H. pylori

on luokiteltu syöpää Maailman terveysjärjestön ja International Agency for Research Cancer (WHO /IARC) vuonna 1994 [1], [2].

H. pylori

geenit hallussaan sytotoksiiniin liittyvän geenin A (CagA) patogeenisuus saari, joka koodaa suuria virulenssin proteiinin CagA ja tyypin IV eritystä järjestelmä (T4SS). CagA toimitetaan isäntä soluihin T4SS ja aiheuttaa syövän muodostumisen ja etenemisen [3].

H. pylori

voi vapauttaa solujen lisääntymistä, vaikuttaa normaaliin apoptoottisen reitin, vaikuttaa solun muoto, poistaa junktionaalinen toimintaa ja helpottaa epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi jälkeen se translokoituu isäntäsolun [4], [5].

H. pylori

efektoriproteiini CagA vaikuttaa useimmat näistä reiteistä.

In vivo

kokeet osoittivat, että siirtogeeninen ilmentymä CagA voi aiheuttaa useita pahanlaatuisia kasvaimia hiirissä, mukaan lukien mahalaukun epiteeli- liikakasvu, myelooisen leukemian ja B-solu- lymfoomat, tai mahalaukun polyypit ja adenokarsinoomat mahalaukun ja ohutsuolen [6]. Kuitenkin, molekyylimekanismi

H. pylori

CagA vuorovaikutuksessa isännän soluissa on vielä epäselvä.

EMT alun perin tunnustettu piirre alkionkehityksen elintärkeä prosessi morphogenesis alkionkehityksen aikana ja sydämen kehitystä. Kuitenkin, se myötävaikuttaa myös kudosfibroosi, kasvaimen invaasion ja metastaasin. EMT on ominaista useita erillisiä ominaisuuksia, kuten menetys soluadheesion, lisääntynyt solujen liikkuvuuden, resistenssin apoptoosia, ja jotkut ominaisuudet kantasoluja. EMT: n kanssa, epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin määrä aleni ilmaisua ja mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista osoittavat lisääntynyt ilmentyminen. Muita säätelymolekyyleja kuten SNAIL, TWIST ja SLUG osoittavat muuttunut ilme [7], [8], [9]. Onkogeeniset polkuja, jotka voivat aiheuttaa EMT ovat transformoivan kasvutekijän β (TGF-β), Src, Ets, Ras, Wnt /β-kateniinin, Notch, Nukleaaritekijä-KB ja integriini [10], [11], [12].

Infektio ihmisen patogeeninen tekijä

H. pylori

oletetaan johtavan EMT, invaasio tai etäpesäke mahasyövän. Esimerkiksi säätelyä matriksimetalloproteinaasi 7 taudinaiheuttajaorganismien

H. pylori

osittain riippuvainen gastriinin ja voi olla funktio kehittämisessä mahasyövän, mahdollisesti kautta EMT, jonka välillisesti indusoimalla tasoja liukoista hepariinia sitovat endoteelikasvutekijä [13].

H. pylori

CagA on mukana hyökkäys kasvainsoluja vapauttamalla c-met-reseptori-signalointireitin [14]. Samoin, CagA voi lisätä aktivointi Wnt /β-kateniinin signalointireitin häiritsemällä vakauttamiseen E-kadheriinin-β-kateniinin monimutkainen. Siten CagA on tärkeä rooli kehityksessä suoliston metaplasiaa [15]. Lisäksi, microarray-analyysi viittasi siihen, että fosforylaatio asema CagA voi vaikuttaa ilmentämiseen EMT liittyvien geenien mahasyövän soluihin [16]. Kuitenkin tiedetään vähän mekanismeista, jotka ovat Euroopan EMT aiheuttama CagA.

ohjelmoidun solukuoleman proteiini 4 (PDCD4) paikantuu tumaan lisääntyvissä soluissa [17]. Koska merkittävä transkription jälkeisen kohde mikroRNA (MIR) miR-21, PDCD4 liittyy kasvaimen etenemisen ja ennusteen ihmisen keuhkojen, paksusuolen ja peräsuolen, rinta- ja mahasyövän [18], [19]. Tuumorisuppressorigeenin PDCD4 voivat sitoutua eIF4A tai eIF4G ja translaation inhiboimiseksi. PDCD4 voi säädellä mitogeeniaktivoidun proteiini 4 kinaasi 1 tai urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin reseptorin (uPAR) ilmentyminen estää karsinooma invaasion ja intravasation [20], [21]. PDCD4 voi vaikuttaa myös geenien transkriptiota. Se on vuorovaikutuksessa DNA: ta sitovan domeenin TWIST1 ja estää Y-box sitovan proteiinin 1 ilme [22]. Samoin menetys PDCD4 ilmentyminen liittyy pahanlaatuisiin mahasyövän [23], [24]. Downregulation PDCD4 liittyy kasvaimen erilaistumiseen ruuansulatuskanavassa syöpien [25]. Kuitenkin onko PDCD4 osallistuu EMT aiheuttama CagA mahasyövän ja erityinen mekanismi tarvitaan vielä selventämiseksi.

Täällä selvitimme sääntely EMT liittyvien proteiinien ja PDCD4 ilmentymistä mahasyövässä kudosten ja CagA aktivointi TWIST1 ilmaisun ja estäminen E-kadheriinin ja PDCD4 ilmaisun mahalaukun syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kudosnäytteiden

tutkimus hyväksynyt eettinen komitean Shandong University School of Medicine, ja kaikki näytteet ja tiedot kerättiin kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Mahakasvaimen kudokset ja niiden yhteensovitettujen kuin syöpäkudokset kerättiin 30 leikkauksen aikana Qilu sairaalan Shandong University (Jinan, Kiina) vuodesta 2010 vuoteen 2012. Kukaan potilaista ei ollut saanut adjuvanttihoitoa tai sädehoidon ennen leikkausta. Diagnoosi mahasyöpä oli histopatologisesti vahvistettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäystä.

Soluviljely ja transfektio

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat (AGS, BGC-823 ja SGC-7901) saatiin Kiinasta Academia Sinica Cell Repository (Shanghai). Soluja inkuboitiin suositellun median ja kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa ilman antibiootteja. SGC-7901-soluja ja BGC-823-soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ja AGS soluja viljeltiin F12-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Media ja FBS ostettiin Invitrogen (USA). Sitten solut transfektoitiin lyhytaikaisesti plasmideilla pCDNA3.1 tai pCDNA3.1-CagA (lahja tri Yongliang Zhu, Zhejiangin yliopisto, Kiina) ja pEGFP-C1 tai pEGFP-C1-PDCD4 (rakennettu ja saatiin tri Youhai Chen , Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) käyttäen X-treme GENE HP transfektioreagenssia (Roche Diagnostics, Saksa) mukaan valmistajan protokollia.

RNA: n eristys, käänteinen transkriptio ja qRT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, USA). Käänteinen transkriptio mukana Superscript III First Strand Synthesis Kit (Invitrogen). Geenien ilmentymistä havaittiin käyttämällä Quantitative real-time PCR SYBR Esiseos Ex Taq (Takara, Kiina) ja normalisointi mukana 2

– △△ ct menetelmä suhteessa P-aktiini. Alukesekvenssit olivat PDCD4, sense, 5′-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 ’ja antisense, 5′-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3′; E-kadheriinin, sense, 5’-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 ’ja antisense, 5′-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3′; CagA, sense, 5’-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 ’ja antisense, 5′-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3′; ja TWIST1, sense, 5’-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 ’ja antisense, 5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3′; vimentiinin, sense, 5’-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 ’ja antisense, 5′-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3′; SNAIL, sense, 5’-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 ’ja antisense, 5′-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3′; β-aktiini, sense, 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 ’ja antisense, 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’.

Western blot-analyysi

Proteiini uutettiin näytteistä ja erotettiin SDS-PAGE , sitten siirrettiin PVDF-membraaneille (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), joka oli estetty välittömästi 5% rasvatonta maitoa TBST, joka sisälsi 1% Tween-20: ssa 1,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen, kun on pesty fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) 3 kertaa, membraaneja inkuboitiin vasta-aineiden PDCD4 (1:500; Cell Signaling Technology, USA), TWIST1 (1:2000, Novus Biologicals, USA), SNAIL (1:1000 , Cell Signaling Technology, USA), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), E-kadheriinin (1:1000, Cell Signaling Technology, USA), vimentiinistä (1:1000, Cell Signaling Technology, USA ), ja β-aktiini (1:2000, Sigma-Aldrich, USA), kuten normalisoinnin ohjaus, 4 ° C: ssa yön yli, sitten piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita huoneen lämpötilassa 1 tunti. Pesun, immunoreaktiivisia bändit visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssin (Millipore Corp., Billerica, MA, USA). Western-blottaus suoritettiin 3 kertaa jokaiselle näytteelle. Proteiini ladattiin 20-50 ug kaistaa kohti.

immunohistokemia

parafinoidut dosnäytteistä de-paraffinized ksyleenillä ja kuivattu asteittaisella sarjan alkoholia. Antigeeni haku lämpökäsittely suoritetaan 0,1 M sitraattipuskurissa. Ja estämällä endogeenisen peroksidaasin käytti 3% H

2O

2. Sitten laseja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa vastaan ​​PDCD4 (1:200), Twist1 (1:500), vimentiinistä (1:100) tai E-kadheriinin (1:500), ja vastaavat piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineet ja DAB varten ytimet. Vasta-aineet immunohistokemiallista värjäystä niitä käytettiin western blot. Lopuksi, hematoksyliinillä käytettiin counterstaining dioja. Kasvain eriyttäminen syövän kudosten määritettiin sokkoutetuilla tavalla. Ensimmäinen vasta-aine korvattiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella negatiivisena kontrollina. Näytteet tarkasteltiin Nikon Eclipse E800 (Nikon, Tokio, Japani) mikroskoopilla.

Kaikki värjätyt leikkeet havaittiin ja tekee 2 itsenäistä sokaissut tutkijoita, ja dioja annettiin yhteensä värjäytymistä (SI) pisteet mukaan värjäytymisintensiteettiä ja prosenttiosuus positiivisia kasvainsoluja. Värjäytymisintensiteettiä luokiteltiin 0, ei värjäystä; 1, heikko värjäytyminen; 2, kohtalainen värjäytyminen; ja 3, vahva värjäytyminen. Kasvainsolujen osuus pisteytettiin 0, ≤20% positiivisia kasvainsoluja; 1, 20% -40% positiivisia kasvainsoluja; 2, 40% -60% positiivisia kasvainsoluja; 3, 60% -80% positiivisia kasvainsoluja; ja 4, ≥80% positiivisia kasvainsoluja. Arvioimalla SI, värjäytyminen tulokset lopulta kirjattiin 0-4, alhainen ilmaisu; 4-6, kohtalainen ilmaisu; ja 6-12, korkea ilme. Jos värjäytyminen tulkinta vaihteli tutkijat, data osion hylättiin.

Matrigel invaasiomääritys

Matrigel invaasiomääritys mukana transwell kammio (Costar, New York, USA). SGC-7901-soluja transfektoitiin 2 ug: pCDNA3.1, pEGFP-C1; pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1; tai pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-PDCD4. 48 tunnin kuluttua, 1 x 10

5 jälkeisen transfektoidut solut trypsinoitiin ja maljattiin transwell kammiot ennalta päällystetty 20 ug Matrigel. Alustassa, joka sisälsi 20% FBS: ää alemmassa kammiossa toimi kemoattraktanttia, ja ylempi kammio täytettiin alustalla, joka sisälsi 10% FBS: ää. Non-Siirretyt solut poistettiin vanutupoilla jälkeen 24 tai 48 tuntia. Liikkuvien solujen alapuolelle suodattimen värjättiin 0,1% kristallivioletilla ja laskettiin mikroskoopilla. Lopuksi, jäljelle jäävä solut kerättiin proteiinin ja RNA: n eristämistä. Kukin käsittely toistettiin 3 kertaa.

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Student

t

testillä tai chi-neliö testiä käytettiin vertaamaan 2 ryhmää. Tietojen analysointi mukana SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

1. Expression of TWIST1, E-kadheriinin, vimentiinistä ja PDCD4 mahasyövän

tutkimiseksi yhdistyksen EMT ja mahasyövän, me korjataan 30 kliinistä kudosnäytteitä mahalaukun syöpäpotilailla. Biopsiat jaettiin keski /matala erilaistumista kudos, korkea eriyttäminen kudosta ja ei-syöpäkudoksen vieressä karsinooma hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys (Kuva. 1A). On Immunohistokemia, TWIST1 ja vimentiinin ilmentyminen oli suurempi pahanlaatuiseen kudokseen kuin ei-syöpäkudoksen, kun taas ekspressio E-kadheriinin ja PDCD4 oli vastakkainen TWIST1 (Fig. 1A-E). TWIST1 ja PDCD4 ilmentyminen liittyi aste kasvain eriyttäminen, mutta ei sukupuolta tai ikää (p = 0,021 ja p = 0,013, taulukko 1). Samoin vähentynyt PDCD4 ekspressio käänteisesti yhteydessä muuttuneiden TWIST1 ilmaisun aikana mahasyövässä (p = 0,035, taulukko 2). Siksi EMT voi olla tärkeä rooli mahasyövän ja kehittämiseen.

(A) hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys vahvisti leikkausta edeltävän diagnoosin ja histologisia laatu. Edustavia immunohistokemiallinen värjäys TWIST1, SNAIL, PDCD4, vimentiinistä ja E-kadheriinin erillisiä viereiseen normaaliin kudokseen ja korkea eriyttäminen syövän kudosta ja keski /matala eriyttäminen syövän kudosta. (B-E) kvantifiointi TWIST1-, SNAIL-, PDCD4-, vimentin- ja E-cadherin- ilmentyminen normaaleissa ja syövän kudoksissa. Kokonaismäärä näytteiden 30 ja jokainen piste edustaa 1 näyte. Vaaka keskipitkän baari on keskiarvo ja viikset ovat SD.

*

P

0,05 ja

**

P

0,01 verrokkiin nähden.

2. TWIST1, vimentiinistä tai E-kadheriinin ilmentymisen mahalaukun solulinjoissa säätelee CagA

Seuraavaksi tutkimme, CagA, sillä elinvoimaiset kertoimella

H. pylori

, vaikutti EMT ja siksi edistänyt hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden mahasyövän. Valitsimme 3 ihmisen mahasyövän solulinjoissa erilaistumisen tilojen (AGS, hyvin erilaistunut mahalaukun epiteelisolujen linja, SGC-7901, kohtuullisesti erilaistunut solulinja ja BGC-823 huonosti eriytetty solulinja). CagA ilmentämisplasmidi transfektoitiin eri mahan solulinjoja. Vaikka morfologiset muutokset CagA-transfektoituja soluja ei havaittu (tuloksia ei ole esitetty), ilmaus transkriptiotekijöiden ja solujen markkereita vaikuttivat CagA. MRNA ja proteiini ilmentymä TWIST1 ja vimentiinista oli voimistunut kanssa CagA transfektiolla (Fig. 2A-G) ja että PDCD4 ja E-kadheriinin säädeltiin vähentävästi (Fig. 2A-G), mutta mitään merkittäviä muutoksia SNAIL ilmentymistä havaittiin CagA transfektio ryhmä. Siksi

H. pylori

CagA voivat vaikuttaa EMT sääntelyviranomaisten lukien TWIST1. Lisäksi E-kadheriinin, tärkeänä epiteelin merkki ja vimentiinista, kun mesenkymaaliset merkki säännelty TWIST1, vaikutti lisäksi CagA, ja EMT liittyvä geeni PDCD4 säädeltiin vähentävästi.

CagA täyspitkän transfektoitiin osaksi AGS, SGC-7901 ja BGC-823 solua 48 tuntia, ja solut kerättiin mRNA ja western blot-analyysi. (A-C) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi mRNA-tasolla ja PDCD4, EMT liittyvät transkriptiotekijöiden (TWIST1 ja SNAIL) ja solujen markkereita (vimentiinista ja E-kadheriini) 3 mahasyövän solulinjoissa. Kaikki arvot normalisoitiin beeta- aktiini-mRNA samasta näytteestä. (D) Western blot-analyysi proteiinin tason CagA, TWIST1, SNAIL, PDCD4, vimentiinistä ja E-kadheriinin hallinnassa tai CagA-transfektoiduissa soluissa. (E-G) Western blot densitometria kvantitoitiin (ImageJ) ja taso ilmoitetaan proteiinin normalisoitiin P-aktiini. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvoa ± SD 3 riippumattoman kokeen. *

P

0,05, **

P

0,01 verrokkiin nähden.

3. Expression of TWIST1, vimentiinistä ja E-kadheriinin vaikutti PDCD4

seuraava analysoitu molekyylitason mekanismi EMT säätelevät

H. pylori

CagA mahalaukun syöpäsoluja. PDCD4 tukahduttaa solujen kasvun kautta suora vuorovaikutus TWIST1 ihmisen eturauhassyövän [22]. Immunohistokemia ja tilastollinen analyysi osoitti merkitystä PDCD4 ja TWIST1 olemassa mahalaukun karsinooma (Kuva. 1, taulukko 2). Kuitenkin taustalla olevat mekanismit PDCD4 toiminto mahasyövän solut ole selvä. Joten AGS? GSC-7901 ja BGC-823-soluja me transfek- yli-ilmentämään PDCD4. PDCD4 mRNA ja proteiini ilmentyminen säädeltiin kaikki plasmidi-transfektoituja solulinjoja (Fig. 3A-G). Lisäksi mRNA ja proteiini tasoilla TWIST1 ja vimentiinista, mutta ei SNAIL, oli laskenut eriasteista, ja E-kadheriinin kohoamiseen (Fig. 3A-G). Siksi TWIST1, vimentiinistä ja E-kadheriinin ilmentymisen voidaan säädellä PDCD4 mahalaukun epiteelisolujen.

plasmidit pEGFP-C1 ja pEGFP-C1-PDCD4 olivat vastaavasti transfektoitiin AGS, SGC-7901 ja BGC-823 soluja 48 tuntia, ja sitten solut kerättiin eristämällä solun kokonais-RNA: ta tai proteiinia. (A-C) qRT-PCR-analyysi mRNA tason TWIST1, SNAIL, PDCD4, vimentiinistä ja E-kadheriinin in AGS, SGC-7901 ja BGC-823 soluja. Kaikki arvot normalisoitiin p-aktiini-mRNA: n samasta näytteestä. (D) Western blot-analyysi 5 kohde- proteiinien ilmentyminen ohjaus soluissa ja PDCD4 yliekspressio soluissa. (E-G) Western blot tulokset kvantifioitiin (ImageJ) ja taso kohdeproteiinin normalisoitiin P-aktiini. Tiedot ovat keskiarvo ± SD 3 erilliselle kokeelle. *

P

0,05, **

P

0,01 versus pEGFP-C1 con.

4. EMT säätelee CagA kautta estämällä PDCD4 mahalaukun epiteelisolujen

Edellä esitettyjen havaintojen me hypoteesit että EMT prosessi aiheuttama

H. pylori

CagA tapahtunut vähen- tämisessä PDCD4, me kotransfektoitiin mahalaukun epiteelisolujen CagA plasmidilla ja PDCD4 yli-ilmentymisen plasmidi. Vähentynyt ilmentyminen PDCD4 otettiin talteen CagA ja yli-ilmentyy PDCD4 transfektio. Kuten hyvin, lisääntyneen ekspression TWIST1 ja vimentiinin estyi ja vähentyneen ilmentämisen E-kadheriinin on voimistunut, että ko-transfektoitiin ryhmä. Nämä muutokset tapahtui sekä mRNA: ta ja proteiinia tasoilla (Fig. 4A-G). Migraatio ihmisen mahasyövän solulinja SGC-7901 plasmidien kanssa määritettiin Matrigel invaasiomääritys. Tulokset osoittavat, että se indusoitiin CagA plasmidi. Solun migraatiokokeessa paljasti myös, että PDCD4 yli-ilmentyminen säädeltiin vähentävästi CagA aiheuttamaa niiden invaasio ja etäpesäkkeiden kyky (Kuva. 5A). Kuva. 5B esittää siirretyn solujen määrä SGC-7901 in CagA transfektion ryhmässä ovat ilmeisesti enemmän kuin kontrolliryhmässä, kun taas määrä siirtynyt solun kotransfektiojärjestelmää ryhmä on merkittävästi pienempi kuin CagA transfektion ryhmä. Biologinen ilmiöt osoittavat EMT edistäneet CagA otettiin talteen osittain kohonnut PDCD4 ilme. Sen näytön perusteella, se johtopäätös, että PDCD4 voidaan tarvita

H. pylori

CagA välittämää mahalaukun syövän etenemisessä.

Kaikki kokeet jaettu kolmeen ryhmään: 1) pCDNA3.1 + pEGFP-C1 (kontrolli), 2) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1, 3) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4. Mukaan eri ryhmien, vastaavat plasmidit transfektoitiin AGS, SGC-7901 ja BGC-823-soluja. Sitten solut kerättiin mRNA ja western blot-analyysi. (A-C) qRT-PCR-analyysi mRNA-tasolla ja TWIST1, SNAIL, PDCD4, vimentiinistä ja E-kadheriinin mahasyövän solulinjoissa. Kaikki arvot normalisoitiin beeta- aktiini-mRNA samasta näytteestä. (D) Western blot analyysi CagA, TWIST1, SNAIL, PDCD4, vimentiinistä ja E-kadheriinin proteiinin ilmentymistä kaikissa soluissa. (E-G) Western blot tulokset kvantifioitiin (ImageJ) ja normalisoidaan p-aktiini. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvoa ± SD 3 erilliselle kokeelle. *

P

0,05, **

P

0,01 versus con,

Δ

P

0,05,

ΔΔ

P

0,01 versus pEGFP + CagA.

(A) koe jaettiin kolmeen ryhmään: 1) pCDNA3.1 + pEGFP-C1 (kontrolli), 2) pCDNA3.1- CagA + pEGFP-C1, 3) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4.The vastaavat plasmidit transfektoitiin SGC-7901-solut mukaan eri ryhmiin. Invaasio ja etäpesäkkeiden solujen kykyä analysoitiin Matrigel invaasiomääritys. (B) määrälliset siirrettyjä solujen lukumäärät SGC-7901 kolmessa ryhmässä. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvoa ± SD 3 kokeita. *

P

0,05 versus con,

Δ

P

0,05 versus pEGFP + CagA.

Keskustelu

tärkeimmät tulokset tämän tutkimuksen voidaan tiivistää seuraavasti: 1)

H. pylori

CagA vastaa induktio TWIST1 tai vimentiinista ja inhibition E-kadheriinin mahalaukun syöpäsoluja. 2) CagA aiheuttama epiteelin-mesenkymaalitransitioon on osittain riippuvainen sääntelystä PDCD4. 3) TWIST1 ja PDCD4 kuuluu muun EMT mahasyövän.

Mahalaukun syöpä on monivaiheinen ja asteittaista sairaus. Ylimääräinen leviämisen epiteelisolujen on tärkeä osa alkuperäisen kasvaimen angiogeneesi tai aikaisin kasvu [5]. Sen jälkeen, solujen invaasiota, aluksi heijastuu tyvikalvon läpi, pidettiin ennustaja loppuvaiheessa syöpä; se lopulta johtaa metastaattisen leviämisen ja kuolleisuutta [26]. Patogeeninen infektio voi aiheuttaa syöpää tumorgenesis ja pahanlaatuinen transformaatio isäntäsoluihin. Tärkeänä patogeenisen riskitekijä,

Helicobacter pylori

olivat läheisesti mahahaavan, limakalvon liittyvä imukudokseen lymfooma vatsa, ja mahalaukun adenokarsinoomaa [20], [27], [28], [29] . CagA, yksi periaatteen virulenssitekijöistä

H. pylori

, indusoi esiintyminen ja mahalaukun syövän syntyyn. Pahanlaatuisiin isäntäsolujen kuuluu muun regulationary verkkoon, mukaan lukien lukuisia solun proteiinit, ei-koodaavat RNA: n ja muiden biologista aktiivisuutta molekyylejä. Kuitenkin mekanismi taustalla CagA vaikutuksia mahalaukun limakalvo on niin monimutkainen ja epäselvä.

EMT on erittäin konservoitunut biologinen prosessi alkion urut kehitystä, joka sallii epiteelisolujen menettää epiteelin fenotyyppiin ja saada mesenkymaalisten fenotyypin. Tämä sisältää menetys solun polariteetti epiteelisoluissa, menetys kyky yhteyden tyvikalvon, pääsy mesenkymaaliset fenotyyppiin, kuten suuremmat muuttoliike ja invaasio, anti-apoptoosin, ja kyky hajottaa solunulkoisen matriisin [8], [30] . EMT on keskeinen rooli kroonisissa tulehdussairauksissa, fibroottisia sairauksia, syövän etenemiseen ja kudosrekonstruktiossa prosessia erityisesti hankintaan muuttoliikkeen ja invaasion kyky pahanlaatuisia epiteelisolujen. Epänormaali toiminta EMT epith aikuisten epiteelisolujen inhiboi soluadheesion molekyylejä, aiheuttama vähentynyt soluadheesiota kapasiteettia, ja siten mahdollisuus tuumorisolujen levitä kehoon, lopulta edistää kasvaimen etäpesäke [31], [32], [33]. Siksi EMT pidetään alussa ja metastaasit ja on myös merkki vahva kyky ja metastaasit syöpäsoluja.

H.pylori

indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon TNF-α indusoivaa proteiinia [34]. Nykyinen tutkimus osoittaa CagA voi johtaa epiteelisolujen morfologisia muutoksia. On ehdotettu, että CagA ilmentyminen ei ollut ainoastaan ​​riittävä häiritä apikaalisella risteyksissä, mutta myös muistuttaa epiteelin ja mesenkymaalitransitioon Madin-Darby koiran munuaissolut [35]. Epiteelisolujen tartunnan bakteerit näyttivät eri genomiikka muutoksia, ja vaikutus EMT markkereita aiheuttama

H. pylori

oli todennäköisesti on cagPaI liittyvää tavalla. Tiedot osoittivat, että epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) liittyvien geenien olivat ylös- tai alaspäin säätelee CagA-positiivisten

H. pylori

kantojen AGS [36], [37]. Huomattavaa on, että sääntelyn verkosto CagA joihin on EMT mahasyövän on vielä selvennettävä.

tutkimiseksi erityinen mekanismi EMT edistää CagA mahasyövän, vertasimme geenien ilmentymistä viereisten ei- kasvain kudosten ja mahakarsinoo- kudosten immunohistokemiallisesti. Tulokset osoittivat, että Twist1 /vimentiinista ilmentymisen kohdunkaulan kudoksissa olivat korkeammat kuin viereisen ei-kasvain kudosten, ja sen ilmentyminen keski /matala erilaistumisen karsinooma kudoksia korkeampi kuin korkea erilaistumisen kudoksia. Kuitenkin, E-kadheriinin ja PDCD4 laski prosessin epiteelin-mesenkymaalitransitioon mahasyövän. Mielenkiintoista on, että on olemassa negatiivinen korrelaatio ilmentymiseen TWIST1 ja PDCD4. Tutkimuksemme ehdotti EMT liittyvät geenit liittyvät prosessin mahasyövän, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten tarkkailemalla menetyksen epiteelin proteiinia ja /tai hankkiminen ilmentymisen mesenkymaalisten proteiinien tapahtui mahakarsinoo-. Lisäksi ne olivat vastaavasti korreloi huonosti eriytetty histologian pitkälle ja köyhien potilaiden hoitotuloksiin [38]. Lisäksi PDCD4 on äskettäin löydetty molekyyli, joka on tärkeä rooli monissa biologisissa prosesseissa, jotka voivat aiheuttaa sairauksia tai esiintyminen ja kehittäminen kasvain. PDCD4 estää käännösprosessia sitoutumalla translaation aloituksen tekijä eIF4A tai eIF4G. Eri indusoijat apoptoosin stimuloida soluja ja upregulate ilmaus PDCD4, joka voi säädellä P21, Cdk4 hiilihappoanhydraasilla II ja JNK /c-Jun /AP-1. PDCD4 voisi estää invaasio liittyviä urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin reseptorin ilmentymisen, invaasio tai tunkeutumisen verisuonten, ja etäpesäkkeiden; Näin ollen, vähentynyt ilmentyminen PDCD4 on tärkeä rooli kasvaimen esiintyminen, kehitys ja ennuste [17], [33], [39], [40]. Joten mietimme jos Twist1 ja PDCD4 osallistui CagA aiheuttama EMT.

Sitten havaitsimme EMT liittyvien transkriptiotekijöiden ja merkkiaineiden ilmentymisen CagA-transfektoiduissa mahasyövässä solulinjoissa. Tuloksemme osoittivat, että

H. pylori

CagA voi säätää ylös ilmentymistä TWIST1 ja vimentiinista muttei SNAIL, ja alas säädellä E-kadheriinin ja PDCD4 mahalaukun solulinjoissa (AGS, SGC-7901 ja BGC-823). Tuloksia ei vaikuttanut erilaistumista tilan transfektoitujen solujen. Vaikka emme tarkkailla morfologiset muutokset CagA-transfektoitujen solujen, invaasio ja etäpesäkkeiden kyky mahalaukun syöpäsoluja voitaisiin nopeuttaa CagA kautta siirtokuoppaan solun invaasiomääritys. Tämä on osittain aiheutuneet toiminnalliset heterogeenisuus CagA eri kudoksissa. Joten vaikutus EMT aiheuttama

H. pylori

oli vielä tutkittava tarkemmin. MiR-21 edistää TGF-β-indusoidun myofibroblastin erilaistumista prosessi kohdistamalla PDCD4. TGF-β indusoi miR-21 ilmentyminen fibroblasteissa ja mir-183 vaimentua PDCD4 ja inhiboi TGF-β-indusoitua apoptoosia ihmisen maksasyövän soluihin [41], [42]. Samaan aikaan TGF-β säännelty SNAIL, TWIST tai ZEB1 ja vaikutti EMT ja etäpesäkkeiden [43]. Lisäksi PDCD4 havaittiin olevan osallisena transkription liikaa. Todellakin, COOH-päähän Twist1 perustiedot sisältävän helix-loop-helix domain ehdotettiin, että välittämä suora vuorovaikutus PDCD4 proteiineja. Niin, PDCD4 vuorovaikutuksessa DNA: ta sitovan domeenin Twist1 ja estää sen DNA: ta sitova kyky kohdentaa geenien ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [22] .Siksi, testasimme lisäksi, onko PDCD4 voivat säännellä TWIST1 mahalaukun syöpäsoluja. Tutkimuksemme osoitti, että TWIST1 oli alas säätelee PDCD4 korkea ekspressioplasmidin reaaliaikaisella PCR ja Western blotting, kun taas E-kadheriinin ilmentyminen oli vastapäätä TWIST1 vuonna AGS, SGC-7901 ja BGC-823. MRNA ilmentyminen SNAIL säädeltiin vähentävästi vuonna AGS ja SGC-7901, kun taas preotein ilmentymistä ei havaittu samat muutokset. Se voi johtua monimutkaisuudesta proteiinisynteesiä. Toisin sanoen, proteiinia ei ainoastaan ​​säädellään transkription tasolla että käännös ja käännä tasolla. Se joskus siltä, ​​että mRNA ei ole suora osoitus proteiinin taso soluissa. Viime, toteutimme lisätutkimuksia roolista PDCD4 in CagA aiheuttama epiteelin-mesenkymaalitransitioon. Mahalaukun epiteelin solut transfektoitiin CagA ekspressioplasmidilla ja PDCD4 yliekspressio plasmidi samanaikaisesti. Palauttaminen PDCD4 ilmaisun voisi estää TWIST1 ja vimentiinista ja aiheuttaa E-kadheriinin, joka säätelee CagA, PDCD4 myös sertifioitu, jotka voivat vaikuttaa hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden kyky mahalaukun soluissa Matrigel invaasiomääritys. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan testata tätä hypoteesia, päättelimme pohjimmiltaan että CagA aiheuttama epiteelin-mesenkymaalitransitioon on osittain riippuvainen sääntelystä PDCD4.

Yhteenvetona osoitamme, että

H. pylori

CagA aiheuttaa TWIST1 ilmaisun ja EMT mahasyövän soluissa säätelemällä PDCD4 (Fig. 6). Tarjoamme jonkinlaisen käsityksen molekulaariverkosto mahasyövän aiheuttama

H. pylori

infektio, ja toimittaa teoreettisen pohjan PDCD4 biologisena kohteena diagnosointiin tai syövän hoitoon. Tulevaisuuden tutkimus, johon hiiri malleja voi johtaa ymmärtämään paremmin roolin PDCD4

H. pylori

indusoima EMT mahasyövän.

H.