Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvava kiinnostus määrällisesti molekyyliperustan proteiinikinaasi aktivaation ja allosteerinen säätely syöpä mutaatioiden on lisännyt laskennallisia tutkimuksia allosteerisen signaloinnin proteiinikinaasien. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme yhdistetty tietokonesimulaatiot ja energian maiseman analyysi proteiinikinaasien luonnehtia vuorovaikutus onkogeeninen mutaatioiden ja paikallisesti tyhjäksi sivustoja tärkeitä katalyytteinä allostetric kinaasin aktivaation. Vaikka rakenteellisesti jäykkä kinaasi ytimen muodostaa minimaalisesti turhautunut keskus katalyyttiseen, paikallisesti turhautunut jäännös klustereita, joiden vuorovaikutus verkkoja ei energeettisesti optimoitu, ovat alttiita dynaamisia modulaatio ja saattaa mahdollistaa allosteric konformationaalisia siirtymiä. Tulokset Tämän tutkimuksen ovat osoittaneet, että energiamaisema vaikutus onkogeenisten mutaatiot voivat olla allosteric aikaansaamaan maailmanlaajuisia muutoksia tasaisempaa jakautumista erittäin turhautuneita jäämiä. Olemme havainneet, että mutaatio aiheuttama allosteeristen signalointi voi käsittää dynaamisen välisen kytkennän rakenteellisesti jäykkä (minimaalisesti tyhjäksi) ja muovia (paikallisesti tyhjäksi) klustereita jäämiä. Esitetty tutkimus on osoittanut, että aktivointi syöpää mutaatiot voivat vaikuttaa termodynaaminen tasapaino kinaasi valtioiden allosterically muuttamalla jakautuminen paikallisesti turhautunut sivustoja ja lisäämällä paikallista turhautumista aktiivisessa muodossa, ja samalla poistaa paikallisesti turhautunut sivustoja ja palauttaa rakenteellinen jäykkyys aktiivinen muoto. Energia landsape analyysi proteiinikinaasien ja ehdotettu rooli paikallisesti turhautuneita sivustojen aktivointi mekanismit voivat olla hyödyllisiä vaikutuksia bioinformatiikan-seulontaa ja havaitsemista toiminnallisten sivustojen kriittinen allosteric sääntelyn monimutkaisia ​​biomolekulaaristen järjestelmissä.

Citation: Dixit A, Verkhivker GM (2011) Energy Landscape Analysis of Cancer Mutaatiot Proteiinikinaasit. PLoS ONE 6 (10): e26071. doi: 10,1371 /journal.pone.0026071

Editor: Jie Zheng, University of Akron, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 19 syyskuu 2011; Julkaistu: 06 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Dixit, Verkhivker. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuetaan osittain rahoituksella Kansasin yliopistossa. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Nopea ja tehokas viestintä pitkän kantaman konformaatiomuutoksia proteiineista on tärkeä rooli allosteerinen säätely biologisten järjestelmien [1], [2]. Viimeaikaiset uraauurtava arvostelut proteiinia allostery ovat korostaneet keskeinen rooli yhteistyöhaluisesti ja käsitystä, että katalyysi ja allostery voi syntyä kautta yhteinen liikenneväyliä [3], [4]. Modeling allosteerisen siirtymien biologisten molekyylien on merkittävästi edistynyt kehittämällä elastisen verkon malleja ja normaalitilassa analyysi lähestymistapoja [5] – [22]. Elastinen verkkomalleissa proteiinia dynamiikan ja signaalin eteneminen teoria on mahdollistanut kvantitatiivisen analyysin pitkän kantaman allosteric proteiini vuorovaikutusten [13] – [16]. Sequence-pohjainen evoluution analyysi [23], [24] ja rakenne lähestymistapoja [19], [20], [25] – [27] ovat osoittaneet, että allosteric reittejä proteiineja voidaan muodostaa vuorovaikutusten kautta evoluution säilyneitä ja harvaan kytketty klustereita tähteitä, joita energeettisesti kytketty välittävän pitkän kantaman viestintää. Kattava analyysi allosteerisen mekanismeja on johtanut yhtenäisen näkymän allosteerinen säätely, joka merkitsee, että on olemassa ennestään konformationaalisten valtioiden ja useiden viestinnän reitit konformationaaliselle maisemaan [28] – [32]. Energiamaisema teoriat ja yksinkertaistettuja energiamalleja ovat tarjonneet vankka teoreettinen kehys valaista perusnäkökohtia proteiinien rakenteen, dynamiikan ja allosteerinen säätely [33] – [43]. Mukaan modernin energiamaisema teoriassa satunnainen sekvenssit ovat jylhissä maisemissa monia paikallisia minimit johtuvat vakavista ristiriitaisia ​​vuorovaikutusta (ilmiö kutsutaan ”turhautumista”) ja sen seurauksena, esiintyvyys rakenteellisesti vaihtoehtoisten vielä energeettisesti samanlaisia ​​konformaatioita. Energia maisema mallit ovat myös ehdottaneet, että proteiini kaltaisia ​​sekvenssit voivat ovat kehittyneet osittain poistaa turhautunut vuorovaikutukset aminohappojen ja ovat tasoitetaan ( ”suppilomainen”) maisemat varmistaa nopea taitto niiden termodynaamisesti stabiileja native rakenteita. Tämä on tullut tunnetuksi nimellä ”periaate minimaalinen turhautumista” [44], [45]. Suppilotiehyen kaltainen luonne energiaa maisemien luonnon proteiineja, tarkoittaa, että konformaatioita, jotka ovat rakenteellisesti samanlaisia ​​kuin natiivi tila on myös vähäkalorisuudesta ja natiivi tila vuorovaikutuksia minimaalisesti turhautuneita [33] – [45]. Yleistynyt näkymä allosteerinen säätely perustuu energiamaisema teoria (usein ilmaisua kuin ”konformaationaalinen valinta malli”) viittaa siihen, että proteiini voi toimia dynaamisessa tasapaino rakenteellisesti erilaisia ​​konformationaalisten valtioissa, jolloin sitova vaikutus tai mutaatio voi levittävät yli pitkiä matkoja yhteistoiminnassa tasapainon siirtyessä toiminnallisesti merkitykselliset konformaatioon [46] – [52]. ”Vanha” näkemys (aiheuttama sovituksen mekanismilla) ja ”uusi” näkemys (konformationaalisen valintamekanismi) proteiinin allostery ei näyttänyt olevan toisiaan poissulkevia vaan toisiaan täydentäviä järkeistämisessä allosteric mekanismeja molekyylitasolla [53] – [56]. Fysiikkapohjaiset simulointi lähestymistavat ovat tarjonneet vakuuttavia todisteita välisen kytkennän kollektiivisen liikkeiden ja paikallisia rakennemuutoksia tärkeänä perusperiaatteena allosteerisen viestinnän biomolekyylien [53] – [60]. Termodynamiikka lähestymistavat ovat edelleen sidoksissa globaalien ja paikallisten rakenteellisten häiriöiden kanssa vapaan energian muutokset allosteerisen kytkimen mekanismeja konformaation vaihtumisen [61] – [64]. Lisäksi energiamaisema mallit ovat osoittaneet, että pitkän kantaman yhteistoiminnalla proteiini-proteiini vuorovaikutusten aikana allosteric siirtymiä voi suosia yhdistelmä väestön-shift ja aiheuttama-fit mekanismit, kun taas lyhyen kantaman, allosteerinen sitovien proteiinien estäjät voivat usein edetä kautta väestöstä-siirtomekanismi [65] – [72].

Ferreiro ja Wolynes [69] ovat äskettäin kehittynyt energiamaisema teoriaa yhdistämällä biofysikaalisten mallintamista ja rakenteellinen bioinformatiikan analyysit paikallisten proteiinivuorovaikutussuhteiden jotka ovat välttämättömiä taitto sitovia ja allosteerinen säätely. Tämän mallin mukaan, vähän turhautunut maisemat proteiinia verkoille on kehittynyt hankkia kyky sääntelyn kautta osuuskunta allosteric muutoksia. Ehdotettu menetelmä on määrällisesti asteen paikkatietojen paikallisten turhautumista proteiineja käyttäen paikallisen version maailmanlaajuinen kuilu kriteerin muotoiluun minimaalinen turhautumista periaate [33] – [45]. Tämä malli käyttöön paikallinen turhautumista metrinen kutsutaan ”konfiguraatioanisotropia turhautumista indeksi” mittana paikallisen vakauttaminen yksittäisen natiivi parin suhteen joukko rakenteellisia houkutuslintuina syntyy häiritsemällä sekä identiteettien ja sijainti vuorovaikutuksessa aminohappojen [69], [ ,,,0],70]. Tämän kriteerin, jos vuorovaikutus energia natiivin pari jäämien riittävän vakauttava verrattuna rakenteellisia houkutuslintuina, tämä jäännös pari nimetty ”minimaalisesti turhautunut ”, toisin vuorovaikutukset voidaan luokitella joko” neutraali ” tai ”paikallisesti turhautunut”. On syytä huomata, että periaate minimaalinen turhautumista ei vaadi täydellistä poistamista paikallisesti vakaa vaihtoehtoisia rakenteita. Tietty paikallisten turhautuminen on aina läsnä muuten pitkälti unfrustrated proteiinien rakenteen ja joita on syntynyt evoluution vaatimuksista sopeutua proteiinin dynamiikkaa tiettyjä toimintoja [43].

analyysi paikallisesti turhautuneita proteiinin alueita käyttämällä ei -redundant joukko 314 monomeerisen proteiinin verkkotunnuksia ja valikoidun joukon nonredundant dimeerisiä komplekseja on havaittu, että paikallisesti turhautunut sivustoja vastaavat alueet osallistuvat sitovia muiden makromolekyylien ja ligandit ja saattaa usein collocate funktionaalisten ryhmien kanssa altis suuria rakenteellisia muutoksia [69 ], [70]. Wolynes ja työtoverit ovat äskettäin tutkituista valikoidun tietokanta allosteerisen proteiinien tiedetään aktiivinen ja aktiivinen kiderakenteet ja ovat osoittaneet, että allosteric proteiinidomeeneja on yhdistetty web minimaalisesti turhautuneita vuorovaikutusten, kun taas erittäin turhautunut jäämät voitaisiin ensisijaisesti ryhmittyneet lähelle proteiinin pinnalla [71 ], [72]. Tämän tutkimuksen mukaan, vähän turhautunut alueet allosteric proteiinien verkkotunnusten muodostavat lähes 40% koko kontakteja, jossa noin 10% koko vuorovaikutusten katsotaan olevan ”erittäin turhautunut”, ja loput vuorovaikutusten johtuvan ”” neutraali ”luokkaan .

proteiinikinaasien signalointi kytkimet säilynyt katalyyttinen verkkotunnuksen, joka fosforyloivat proteiinisubstraatteja ja olla kriittinen rooli solujen signalointipolkujen [73] – [82]. Proteiinikinaasi geenit muodostavat ~ 2% kaikista geenien ihmisen genomin ja tämän proteiinin perhe koostuu yli 500 monipuolinen jäsentä. Kiderakenteet ihmisen proteiini-kinaasien ovat 167 ainutlaatuinen ihmisen proteiinikinaasi domeenit ja 170 kinaasien, ottaen huomioon läheisesti ortologeja (https://www.sgc.ox.ac.uk/research/kinases/). Rakennetutkimukset proteiinikinaasi katalyyttinen domeenirakenteet ja sääntelyn proteiini kompleksit ovat paljastaneet erillisiä skenaarioita, jotka kinaasit voidaan ohjata dynaaminen tasapaino rakenteellisesti samankaltaisia ​​aktiivinen ja erittäin spesifinen aktiivinen kinaasi valtiot – rakenteellinen tunnusmerkki kinaasidomee- kriittinen sen normaali toiminta [83] – [89]. Allosteerinen säätely voidaan saavuttaa kautta eri mekanismit, mukaan lukien estäjän aiheuttama vakauttaminen erityisen aktiivinen konformaation ABL [90] – [95], BRAF [96], KIT [97], PDGFR, P38 [98], PI3K-kinaasien [99] ja sitoutuminen allosteric myristoyyli sitova tasku ABL [100] – [103]. Proteiinikinaasi aktivointi voidaan myös säädellä muodostamalla rakenteellisesti erilaiset sääntely- komplekseja etenkin esimerkkeinä ABL [104], [105] ja EGFR-kinaasien [106] – [109], mutta yhdistävä rakenteellinen mekanismi liittyy epäsymmetrinen tyrosiinikinaasin järjestelyt sääntelyyn komplekseja voisi taustalla aktivoitumismekanismi koko EGF-proteiinia perheen [110] – [113]. Tasainen edistyminen ymmärrystä proteiinikinaasi mekanismien on vauhdittanut huomattavia ponnisteluja löytää ja muotoilu selektiivinen ATP-kilpailukykyinen ja allosteerinen estäjät kohdentamista tiettyihin syöpäsairaudet, kinaasi syöpään mutantit ja liittyvät kohdennetut reitit [114] – [116].

Epänormaali aktivoitumista sääntelyn proteiinikinaaseissa on hallitseva lähde kasvaimeen liittyvien somaattisten mutaatioiden. Rakenteelliset ja mutageneesi tutkimuksia ABL [93] – [95] ja EGFR-kinaasien [117] – [119] ovat osoittaneet rakenteellinen poikkeavuus kinaasien vastauksena aktivoivia mutaatioita. Kinome laajuinen bioinformatiikan tutkimustulokset ovat osaltaan tunnistamiseen konservoituneiden jaksoryhmittymät kätkeminen sairauteen liittyvää ja syöpään mutaatioita, mikä viittaa siihen, että huomattava määrä onkogeenisten syövän mutaatioiden voisivat muodostaa rakenteellisesti konservoituneet mutaatiotapahtumaa kuormittajat sisällä kinaasin katalyyttinen ydin [120] – [123]. Tietokonesimulointi tutkimukset ovat tutkineet molekyylimekanismeihin proteiinikinaasin aktivaation c-Src [124] – [127], adenylaattikinaasi [128], ABL [129], CDK5 [130], KIT [131], RET, MET [132] ja EGFR-kinaasin [133] – [135]. Multi-asteikko simulaatiotutkimuksia konformationaalisten siirtymiä normaalissa ja onkogeeniset muodot ABL ja EGFR-kinaasien ovat osoittaneet, että vaikutus onkogeenisel- mutantteja voi levinnyt välitön mutaation johtaa maailmanlaajuiseen allosteric muutoksia [134]. Viimeksi, laskennallinen mallinnus allosteerinen säätely on paljastanut järjestämällä periaatteita mutaation aiheuttaman aktivaation ABL ja EGFR kinaasien, joka voidaan määrittää dynaamisen kytkentä rakenteellisesti jäykän aF-kierteen ja konformaatioltaan mukautuva a i-kierteen ja aC-helices [136] . Nämä rakenneosat muodostavat dynaamisen verkoston tehokkaasti vuorovaikutuksessa toiminnallisia alueita, jotka voivat yleisesti ohjata pitkän kantaman interdomain viestintä ja allosteerinen aktivoinnin proteiinikinaasien. Energia maisema tutkimukset ovat aiemmin ehdottanut, että paikallinen turhautuminen voidaan liittää allosteric konformaatiomuutoksia proteiinit [69] – [72].

Yhdessä laskennalliset tutkimukset ovat ehdottaneet, että molekyylitason mekanismeja allosteerinen säätely proteiinikinaaseissa voi olla kuvataan malleja mutaation aiheuttama modulaatio konformationaalisten maiseman ja konformationaaliset valinta periaatteet termodynaamisesti asianomaisten valtioiden. Tässä työssä kinome perustuva rakenteellinen bioinformatiikan analyysi ja biofysikaalisten mallinnus proteiinikinaasi rakenteita käytettiin kuvaamaan ja määrällisesti vuorovaikutus onkogeeninen kinaasi mutaatioiden ja paikallisesti turhautunut sivustoja mahdollisina katalyytteinä ja välittäjiä kinaasiaktivaatiota. Tulokset Tämän tutkimuksen mukaan energia maisema vaikutus onkogeenisten mutaatiot voivat olla allosteeristen luonteeltaan, aikaansaamaan maailmanlaajuisia muutoksia tasaisempaa jakautumista erittäin turhautuneita jäämiä. Osoitamme, että syöpä mutaatiot voivat toimia samanaikaisesti häiriintymistä verkosto minimaalisesti turhautunut vuorovaikutusten aktiivisessa kinaasi tilassa, kun taas vähentää paikallista turhautumista ja palauttaa allosteeristen vuorovaikutusten aktiivisessa kinaasi muodossa. Siksi paikallisesti turhautunut sivustoja katalyyttinen ydin voi palvella tärkeä toiminnallista roolia mahdollistamalla mutaation aiheuttama konformationaalisen siirtymiä kohti konstitutiivisesti aktiivisen kinaasin konformaation.

Tulokset

Energia maisemat ja paikalliset Frustration in Protein kinaasit

Tässä tutkimuksessa, yhdistimme molekyylidynamiikan (MD) simulaatioita proteiinikinaasien kanssa energiamaisema analyysin luonnehtia rooli paikallisen turhautumista olevan tärkeä tekijä liittyy allostetric kinaasiaktivaatiota. Vuodesta energiamaisema näkökulmasta mekanistinen piirteet aktivoinnista siirtymien olisi määritettävä rakenteelliset topologia kinaasidomeenin kertaiseksi ja siksi voi kaapata keskeisiä näkökohtia aktivoivan mekanismin. Tutkia roolia paikallisen turhautumista konformationaalisia siirtymisistä rakenteellisesti eri toimintatiloja, me kartoitettiin paikallinen turhautumista profiilit proteiinikinaasi rakenteisiin ja tunnettu verkosto minimaalisesti turhautunut vuorovaikutusten vastuussa rakenteellista vakautta kinaasin katalyyttinen ydin. Olemme myös sijaitsee ja ominaista klustereita paikallisesti turhautuneita sivustot, joissa minimaalinen turhautumista periaate voisi loukata. Muutos konfiguraatioon turhautumista indeksi, kun mutaatio voi tarjota kvantitatiivinen mitta on taipumus saada aikaan konformaation muutos proteiinin. Vaikutus kinaasin syöpä mutaatioiden paikallisista turhautumista profiilit pystyimme määrittää, kuinka mutaation aiheuttama uudelleenjako paikallisesti turhautuneita jäämät voivat edistää allosteric siirtymisistä rakenteellisesti erillisen toimintatilaa. Konfiguraatio turhautumista indeksi voi mitata suhteellinen vakaus tietyn natiivin kontakti suhteessa kaikkien mahdollisten kontaktien kyseisessä paikassa, jolloin luokitella yksittäisiä natiivi kontakteja proteiinin rakenteen mukaan niiden turhautumista tasolle. Kinome laajuinen tutkiminen konfiguraation turhautumista indeksi lasketaan suuri määrä proteiinikinaasin kiderakenteet (taulukko S1 File S1) paljasti, että tyypilliset arvot voivat vaihdella välillä -4-4. Yleinen Jäännös-pohjainen jakelu turhautumista indeksi villityypin (WT) kinaasien oli puolueellinen vähän turhautunut tähteitä positiivisen arvot turhautumista indeksi (kuvio 1A). Jakauma näytetään myös pienempi matala piikin paikallisesti turhautunut tähteiden kanssa turhautumista indeksi on välillä -0,6–0,7 yksikköä. Vaikutus mutaatiot johtivat hienovarainen vielä havaittavaa muutosta jakeluun paikallisen turhautumista katalyyttisen ytimen, paljastaen toinen yhtä tärkeä tienoilla -1,0 arvo. Siten yleinen jaettiin lähes tasan jaettu minimaalisesti turhautunut ja turhautunut jäämiä, jättäen vähemmän jäämiä neutraalilla tila (kuvio 1 B).

(A) Villityypin kinaasien ja (B) mutanttikinaaseihin.

keskittyneet sitten paikallisen turhautumista analyysi suoritetaan osajoukko proteiinikinaasi geenien (ABL, EGFR, BTK, KIT, BRAF, MET, ja RET), joiden osuus valtaosa erittäin onkogeenisten mutaatioiden in katalyyttinen domeeni (taulukko S2 File S1). Nämä proteiinikinaasi geenit valittiin tarkemman analyysin, koska runsaasti rakenteellisia ja toiminnallisia tietoja, jotka tarjotaan täydentävää kokeellista tietoa validointi mallimme. Vielä tärkeämpää on kuitenkin monipuolinen ohjelmisto aktivoivan ja lääkkeille vastustuskykyiset mutaatiot näissä kinaasien geenit edustavat kriittistä syövän syyllisiä, jotka voivat usein myötävaikuttaa tilan onkogeenin riippuvuuden eri syöpiä. Jakautuminen paikallisten turhautumista näissä kinaasi geenejä, mitattuna konfiguraationaalinen turhautuminen indeksi, paljasti selvästi kuvioitu jossa piikit huomattavasti siirtynyt enemmän turhautuneita tähteitä sekä WT ja mutanttikinaaseihin (kuva 2). Prosenttiosuus minimaalisesti turhautunut vuorovaikutukset katalyyttistä ydintä osuus oli yli 40% koko kontakteja, jossa on noin 15-20% vuorovaikutusten pidettävä turhautunut ja loput neutraali. Tämä analyysi yleensä yhtyi raportoitu jakelu turhautuneita alueiden ja osio minimaalisesti ja erittäin turhautunut jäämiä proteiineja [69], [70]. Kuitenkin keskimääräinen osa paikallisesti turhautuneita jäämien oli suurempi proteiinikinaasien kuin yksi raportoitu pienille monomeeriset proteiinit. Siksi meidän tiedot osoittivat, että konformationaaliset maisemat kinaasin onkogeenien voi olla tunnusomaista tehostettuun paikallisten turhautumista ja proteiinin liikkuvuutta.

(A) Villityypin kinaasien ja (B) mutanttikinaaseihin. Joukko palveluksessa kinaasin onkogeenien mukana ABL, EGFR, BTK, KIT, MET, BRAF, ja RET kinaasien. Analyysi sisältyi mutantteja Näiden kinaasin geenien korkean onkogeenisiä taajuuden mukaan profiileja mutaatioprosessiin näytteistä ( 5) saatu COSMIC arkistosta [153].

Tämän analyysin perusteella, me ehdotti, että alueellisen jakautumisen paikallisten turhautumista proteiinikinaaseiksi voidaan säännellä ja helposti muuttaa onkogeeninen mutaatioita. Mukaan meidän arveluihin, aktivoivat kinaasi mutaatiot voi lisätä paikallista turhautumista aktiivisessa tilassa, ja samalla poistaa (tai osittain poistamalla) paikallisesti turhautunut sivustoja aktiivisessa tilassa. Tämän tuloksena mutaation aiheuttama uudelleenjako paikallisten turhautumista proteiinikinaasi rakenteet voivat myötävaikuttaa molekyylitason mekanismeja, jotka kontrolloivat kinaasiaktiivisuutta muuttamalla dynaamisen tasapainon toiminnallisen kinaasi muotoja. Voit tarkistaa tämän hypoteesin, analysoimme muutoksia paikallisessa turhautumista profiilit on edustava joukko erittäin onkogeenisten ABL (kuva 3) ja EGFR kinaasin mutantit (kuvio 4) sekä aktiivinen ja aktiivinen valtioissa. Havaitsimme, että erittäin onkogeeniset mutaatiot voivat todellakin aiheuttaa kasvua paikallisessa turhautumista mutatoitunut jäämien aktiivinen autoinhibitorinen tilan ABL (ATE ID 1IEP) [90] ja EGFR (ATE ID 1XKK) [117] (kuviot 3, 4). Siten kinaasi mutaatioita, joilla on korkea onkogeenisiä voi horjuttaa autoinhibited kinaasi muodossa. Tärkeää on, onkogeeniset mutaatiot voivat osittain lievittää paikallista turhautumista aktiivisessa kinaasi tila (kuviot 3, 4). Laajempi minimaalisesti turhautunut verkosto vuorovaikutusten rigidifies aktiivinen muoto katalyyttisen verkkotunnuksen ABL (ATE ID 1M52) [91], [92] ja EGFR (ATE ID 2J6M) [118]. Vaikka kiderakenteet käytettiin tutkimuksessamme (taulukko S1 File S1) käytti enimmäkseen ratkaistu sitoutumaton muodossa, oli joitakin rakenteita tutkitaan set (erityisesti ABL ja EGFR-kinaasien), jotka alun perin kiteytynyt komplekseja ATP tai pienmolekyylisalpaajien . Koska ATP: n sitoutuminen voi kasvattaa rakenteellista jäykkyyttä katalyyttisen domeenin, paikallinen turhautumista analyysi, joka sisälsi rakenteille poistettu ATP voi tuottaa keinotekoisia muutoksia turhautumista indeksissä sitoutumiskohtaan jäämiä. Olemme arvioineet koko tilastollinen jakauma konfigurationaalisesti turhautumista indeksin avulla kiderakenteet kanssa sidottu molekyylejä. Vaikutus todettiin olevan varsin vähäistä, ja tuloksena jakelu on lähes mahdoton erottaa yksi on esitetty kuviossa 1. Itse asiassa merkittävä osa proteiinikinaasin osallistuvat tähteet sitoutumiskohdan vuorovaikutukset kuuluvat rakenteellisesti jäykkä sarana-alueen, joka on vähän turhautunut elementti katalyyttisen ytimen ja siten vankka pieniä häiriöitä vuorovaikutuksen. Kuitenkin löysimme mielenkiintoisia pienet vaihtelut paikallisessa turhautumista profiilit ABL (kuva S1) ja EGFR-kinaasien (kuva S2), joka havaittiin onkogeeniselle mutaatioita glysiinirikkaan P-silmukka (ABL-G250E, ABL-Q252H, ABL-E255K, EGFR-G719S, EGFR-G719A, EGFR-G719C). Tiedetään, että P-silmukka ABL kinaasi voidaan stabiloitunut Imatinibiin sidottu aktiivinen rakenne, mikä voi selittää lisääntynyt paikallinen turhautumista upon P-silmukka mutaatiot aktiivisessa tilassa (kuviot S1, S2). Mielenkiintoista, nämä pistemutaatioita tiedetään heikentävän sitoutumisen Imatinib (Gleevec) ABL siirtämällä termodynaamisen tasapainon kohti aktiivinen muoto sovellu estäjän sitoutuminen [114] – [116]. Tuloksemme ehdotti, että mutaatio aiheuttama paikallinen turhautumista estäjä sidottu aktiivinen kinaasi valtio voi osaltaan edistää aloittamiseksi välinen muuttoliike toiminnallisia muotoja. Olemme myös analysoineet jakelu ja rakenteellinen osio minimaalisesti turhautuneita ja paikallisesti turhautunut alueiden ABL kinaasi (kuva S3). Tiheä minimaalisesti turhautuneita jäämiä löydettiin rakenteellisesti jäykkä ydin katalyyttinen domeeni (yhdistetty vihreitä viivoja). Tämä minimaalisesti turhautunut web muodostettiin rakenteellisesti konservoitunutta aF-kierteen ja αE-spiraali. Sen sijaan, klustereiden paikallisesti tyhjäksi jäämien (yhdistetty punaiset viivat) kootaan proteiinia kehällä, kuten aC-heliksi, aktivointi silmukka, P + 1 silmukan C-terminaalin lobe. Koska autoinhibiting vuorovaikutukset vapautuu aktiivisessa muodossa, proteiinikinaaseiksi voitaisiin muuttaa joustavammaksi, jolla on huomattava jäljellä paikallisten turhautumista. Tämä näkyi lisääntynyt läsnäolo paikallisesti turhautuneita jäämien yhdistetty punaiset viivat aC-kierteen, ja C-terminaali lohko aktiivisen ABL (kuvio S3B).

Jäännös-pohjainen turhautumista indeksin arvot ovat esitetty joukko kasvaimia synnyttävän ABL-kinaasin mutantit toimimattomassa (A) ja aktiivisia muotoja (B). Turhautumista indeksin arvot näkyvät täynnä keltaisia ​​palkkeja varten villityypin kinaasin muoto ja punaisella täytetyt pylväät varten mutanttimuotoihin. Analyysi tehtiin sitoutumattoman muodossa kiderakenteet ABL toimimattomassa muodossa (ATE ID 1IEP) [90] ja aktiivinen muoto (ATE ID 1M52) [91], [92].

jäännös-pohjainen turhautumista indeksin arvot on esitetty joukko kasvaimia synnyttävän EGFR kinaasin mutantit toimimattomassa (A) ja aktiivisia muotoja (B). Turhautumista indeksin arvot näkyvät täynnä keltaisia ​​palkkeja varten villityypin kinaasin muoto ja punaisella täytetyt pylväät varten mutanttimuotoihin. Analyysi tehtiin sitoutumattoman muodossa kiderakenteet EGFR-aktiivisessa muodossa (ATE ID 1XKK) [117] ja aktiivinen muoto (ATE ID 2J6M) [118].

Paikalliset Turhautuminen ja proteiini joustavuus

Tutkimme myös suhdetta paikallisen turhautumista ja proteiinin joustavuutta kinaasin rakenteita. Aiemmissa tutkimuksissa olemme tunnettu konformationaaliseen maisemat ABL, EGFR, RET ja MET kinaasien sekä erilaisia ​​syöpää mutantteja käyttämällä MD simulaatioita Apo kinaasin ja komplekseja ATP ja pienmolekyylisalpaajien [132], [134], [ ,,,0],136]. Täällä vertasimme tuloksia paikallisen turhautumista analyysin kanssa kinaasin joustavasti profiilit, jotka päätellä MD simulaatioita ja arvioitiin käyttämällä tehollisarvo vaihtelut (RMSF) katalyyttisen domeenin tähteitä. Erityisesti MD-tutkimukset ABL ja EGFR-kinaasien normaalin ja onkogeeninen todetaan näytetään suuren paikallisen joustavuuden alaosaan aktivointi silmukan [134], [136]. Samoin nippu α-heliksejä C-terminaali, joka edusti tihein klusterin minimaalisesti tyhjäksi jäämiä (kuviot S4, S5), osoitti myös pienin vaihtelu RMSF arvojen – ominaisuus rakenteellisesti jäykän proteiinin ytimen [134] . Paikallinen turhautumista profiilit myös Hyväksytty hienosti B-tekijät proteiinikinaasi jäämiä. Esimerkki tällaisesta vertaileva analyysi yksityiskohtana EGFR-WT aktiivisessa muodossa (kuva S5). Tukeva korrelaatio löytyi jäännös paikallislehteä turhautumista indeksi ja B-kerroin arvot (kuva S5 D). Havaitsimme myös, että erittäin turhautunut EGFR tähteitä vastasi konformaatioltaan mobiili alueita korkeamman B-tekijä arvoja. Kuvaamiseksi tarkemmin näitä havaintoja, suoritimme rakenteellinen kartoitus keskimääräisestä B-tekijät kiinni joukko aktiivinen (kuva S5 A) ja aktiivisia rakenteita (kuva S5 B) ABL, EGFR, BTK, KIT, BRAF, MET, ja RET kinaasien . Lisäksi paikallisesti turhautunut tähteet myös kartoitettu päälle katalyyttinen ydin. Paikallisesti turhautunut sivustoja vastasi proteiinia alueille lisääntynyt terminen liikkuvuutta ja päällekkäin proteiinin jäämiä suurempi B-tekijät.

analyysi proteiinikinaasi joustavuus on myös osoittanut, että konformaatiomuutoksia funktionaalisesti tärkeä kinaasi alueet voivat olla allosterically kytketty ja korreloi. Tarkemmin, löysimme todisteita korreloi proteiinin liikkeet ja allosteerinen kytkentää aC-kierteen ja aktivointi silmukka kaikkien muiden kinaasin alueilla (taulukko S3 File S1). Mielenkiintoista, aC-kierteen ja aktivointi silmukka edusti kaksi korkeimmin kytketty proteiinikinaasi alueilla. Muita erittäin korreloi segmenttiä katalyyttinen domeeni sisältyy (a) sarana-alueen ja katalyyttisesti silmukka, ja (b) P-silmukka ja aktivointi silmukka. Nämä havainnot vastaa meidän Tuore analyysi kollektiivisen liikkeiden ABL ja EGFR sääntelyn komplekseja että ilmenee ”hengittää” jäykän kappaleen liikkeiden katalyyttisen ytimen yhdessä heilahtelut P-silmukka, aktivointi loop, aC-kierteen ja αG helix C-terminaalin [136]. Lukuisat rakenteelliset biologiseen ovat myös osoittaneet keskeinen osallistumista aC-kierteen ja aktivoinnin silmukan allosteric kytkimen että valvonta säätely proteiinikinaasiaktiivisuuden [110] – [113].

allosteerinen vaikutus onkogeeninen Mutaatiot Local Frustration

selvitettävä, jos paikallinen jakautuminen paikallisten turhautuminen voi esittää aloittamista pistettä globaalin konformaatiomuutoksia ja onko vaikutus onkogeenisten mutaatioiden paikallisen turhautumista olisivat paikallisia tai allosteric. Jos vaikutus onkogeenisten mutaatioiden oli paikallinen, se aiheuttaisi vain paikallisia häiriöitä ja johtaa negatiivisten arvojen turhautumista indeksin jäämien välittömässä läheisyydessä mutaatiostatuksesta sivuston. Kuitenkin, jos vaikutus onkogeenisten mutaatioiden oli maailmanlaajuinen, alueellinen jakautuminen erittäin turhautuneita jäämiä voi allosterically vaikuttaa ja aiheuttaa havaittavia muutoksia klo etäällä mutaatiostatuksesta sivustosta alueilla. Vertailu paikallisesti turhautuneita tähteiden kartoitus ABL-WT ja ABL-T315I mutantti paljasti hienovaraisia ​​vielä merkittäviä muutoksia, jossa suurin osa toteutetaan jäämät olivat etäällä mutaatiostatuksesta sivustosta (kuva 5). Havaitsimme, että portinvartijan mutaatio inaktiivinen kinaasi muoto voi allosterically häiritä rakenteellista jäykkyyttä katalyyttisen ytimen ja lisätä paikallista turhautumista aF-kierteen, αE-spiraali, ja aC-kierteen alueilla. Meidän havainnot vahvistivat, joiden vetyvaihtoprosessia massaspektrometrian (HX MS) tutkimus ABL-kinaasin [100], mikä osoittaa, että vaikutus ABL-T315I mutaatio voi johtaa ei ainoastaan ​​paikallisia konformationaalisia häiriöitä lähellä aC-heliksin, mutta myös allosterically muuttaa proteiinin joustavuus etäällä mutaatio proteiinin alueita. Muutokset paikallisten turhautumista aiheuttama ABL-T315I mutaatio aktiivinen kinaasi voitaisiin havainnollistettu esimerkeissä esitetään kuvioissa S6, S7. Vaikka turhautumista kuvaajat ABL-WT ja ABL-T315I olivat yleensä samanlaiset, oli joitakin muutoksia punainen viiva klusterit yhdistävät Asp-381 DFG motiivi Glu-286, jolla on tärkeä vetysidos Lys-271 (kuva S6) . Toinen muutos voitiin todeta, että anti-rinnakkaisten β-arkin alaosan aktivointi silmukan (kuvio S7). Tällä alueella muutamia tähteitä tulee erittäin turhautunut kun mutaatio ilmeistä punaiset viivat yhdistävät tähteiden Tyr-393, Ala-395 ja Pro-402.

maantieteellinen jakautuminen paikallisten turhautumista toimimattomassa muotojen ABL WT (A) ja ABL-T315I (B). Väri liukuva järjestelmä paikallisten turhautumista vaihtelee minimaalisesti turhautunut (näkyy sinisenä) erittäin turhautunut (esitetty punaisella). Avain toiminnalliset alueet proteiinikinaasi yhdessä vastaavan eri proteiinin tähteitä viitataan nuolilla. Rakenteelliset kartoitus paikallisten turhautumista ABL-kinaasin katalyyttinen ydin näkyy epäaktiivisen ABL-WT rakenne (PDB ID 1IEP) [90]. Vaikutus T315I on aktiivinen ABL rakenne arvioitiin kautta rakennemallinnus yksityiskohtaisesti Materiaalit ja menetelmät osassa. Pymol ohjelma käytettiin visualisointiin proteiinikinaasi rakenteiden ja paikallisen turhautumista kartoitus (Sen PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.2r3pre, Schrödingerin, ja LLC).

Mikä tärkeintä, osittainen avaamista sekä anti- rinnakkaista β arkin alapäässä aktivoinnin silmukan aikaisemmin määritettiin edellytyksenä vakauttaminen väli Src kaltainen rakenne ja yhteinen mekanistinen piirre ABL ja EGFR aktivaatioteillä [134]. Vuonna Src kaltainen konformaatio, aC-spiraali pyöritettiin ja muutti pois aktiivista kohtaa (aC-helix-Glu-out asema), DFG Motif käännettyinä väli- DFG-asennossa, epäyhdensuuntaisesta β-arkki