Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

N

-butylidenephthalide (BP) näyttelyitä antituumorivaikutus eri syöpäsolulinjojen. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli saada lisää oivalluksia mekanismeja BP solukuolema ihmisen eturauhasen syöpäsoluja.

Methods /Principal Havainnot

Kaksi ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, PC- 3 ja LNCaP, käsiteltiin BP, ja sen jälkeen arvioitiin niiden elinkelpoisuuden ja solukierron profiileja. BP aiheutti solusyklin pysähtymiseen ja solukuoleman molemmissa solulinjoissa. G0 /G1 vaiheen pysähtymisen korreloi kasvun taso CDK-inhibiittorit (p16, p21 ja p27) ja vähentää tarkistuspisteen proteiineja. Määrittämään mekanismeja BP-indusoidun kasvun pysähtymisen ja solukuoleman eturauhassyövän solulinjoissa, teimme microarray tutkimuksen tunnistaa muutoksia geenien ilmentymisessä aiheuttama BP LNCaP-soluissa. Useat BP aiheuttama geenien, mukaan lukien GADD153 /CHOP, joka on solulimakalvoston stressi (ER stressi) -regulated geeni, tunnistettiin. BP aiheuttama ER stressiä oli osoituksena lisääntynyt ilmentyminen loppupään molekyylien GRP78 /BiP, IRE1-α ja GADD153 /CHOP molemmissa solulinjoissa. Tukos IRE1-α tai GADD153 /CHOP ilmentymisen siRNA vähentää merkittävästi BP indusoimaa solukuolemaa LNCaP. Lisäksi tukos JNK1 /2 signalointi JNK siRNA, johti vähentyneeseen ekspressioon IRE1-α ja GADD153 /CHOP geenit, syytetään, että BP-indusoidun ER stressi voi tulla esiin kautta JNK1 /2 signalointi eturauhassyöpäsoluissa. BP myös tukahdutti LNCaP ksenograftin kasvaimen kasvua NOD-SCID-hiirissä. Se aiheutti 68% vähennys kasvaimen tilavuuden 18 päivän kuluttua hoidon aloittamisesta.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että BP voi aiheuttaa G0 /G1 vaiheen pysähtymisen eturauhassyöpäsoluissa ja sen sytotoksisuus välittyy ER stressi induktio. Näin ollen, BP voi toimia syöpälääke indusoimalla ER stressiä eturauhasen syöpä.

Citation: Chiu S-C, Chen S-P, Huang S-Y, Wang M-J, Lin S-Z, Harn H-J, et al. (2012) induktio Apoptosis Kytketty Endoplasmakalvosto Stressi ihmisen eturauhasen syöpäsolujen

n

-butylidenephthalide. PLoS ONE 7 (3): e33742. doi: 10,1371 /journal.pone.0033742

Editor: Ashraf B. Abdel-Naim, Farmasian tiedekunta, Ain Shams University, Egypti

vastaanotettu: 22 marraskuu 2011; Hyväksytty: 16 helmikuu 2012; Julkaistu: 28 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Chiu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Science Council, Taiwan (NSC-93-2320-B-303-004, NSC-94-2320-B-303-005, NSC-96-2113-M-303-001), ja buddhalainen Tzu-Chi General Hospital, Hualien, Taiwan (TCSP-01-02, TCRD-I9801-03). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin pahanlaatuinen kasvain American men ja toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään [1]. Hoitovaihtoehtoja potilaille ovat leikkaus, sädehoito, hormonihoito, kemoterapia ja yhdistelmät joitakin näistä hoidoista. Yksi yleisimmistä kemoterapian ainetta käytetään eturauhassyövän hoitoon ovat taksaanit, kuten ensimmäisen sukupolven lääke paklitakseli (Taxol, tavaramerkki Bristol-Myers Squibb) [2], [3]. Kohonneet pitoisuudet sytotoksisten lääkkeiden ja suuremmat annokset säteilytyksen eivät parantaa hoitovaste, ja se johtaa apoptoosin resistenssin eturauhasen syöpäsoluja. Siksi hiljattain kehitetty syöpälääkkeiden, jotka ovat myrkyttömiä ja erittäin tehokas apoptoosin edullisesti kasvainsoluissa ovat arvokkaita.

Äskettäin ei-perinteisten hoitojen avulla yrttejä ja ravintolisiä on pidetty vaihtoehtoisia lääkkeitä syövän hoitoon.

Angelica sinensis

(kutsutaan myös danggui kiinaksi) on yksi yleisimmin käytetty perinteistä yrttejä Kiinassa. Sitä suositellaan tonic, hemopoetic, spasmolyyttinen ja kipulääke huumeiden kliinisessä työssä [4]. Edellisessä tutkimuksessa,

n

-butylidenephthalide (BP), joka on yhdiste eristettiin

Angelica sinensis

kloroformiuute, ilmentää kasvua estävä aktiivisuus erilaisissa ihmisen syöpäsolulinjoissa, mukaan lukien aivot, keuhkot ja maksa syöpäsoluja. BP aiheutti kasvun pysähtymisen ja apoptoosin näissä tuumorisoluissa

in vitro

ja

in vivo

[5] – [7]. Nämä havainnot osoittavat, että BP on lupaava uusi syövän vastaisen yhdisteen kanssa mahdollisesti kliiniseen käyttöön. Kuitenkin vaikutus BP eturauhassyövän soluissa ei ole käsitelty.

proteiini taittuvat endoplasmakalvostossa (ER) on alentunut alle erilaisia ​​fyysisiä ja patologisia tiloja, joita kutsutaan ER stressiä. Erityinen signalointireitin, avatulla proteiinin vaste (UPR), on osoitettu solun voittamiseksi ER stressiä [8]. Induktio glukoosin säätelemä proteiini GRP78 /BiP on laajalti tunnustettu merkkiaineena ER stressiä ja puhkeamista UPR. UPR signaalit kolme erillistä jännityksen antureita sijaitsee ER-membraanin: proteiinikinaasi RNA-like ER kinaasi (PERK), inositoli-vaatii proteiini-1 α (IRE1-α) ja aktivoiva transkriptiotekijä-6 (ATF6) [9]. Niistä IRE1 aktivaatiota N-terminaalista Jun-kinaasia (JNK) vaikuttaa solukuolemaan fosforyloimalla ja inaktivoimalla anti-apoptoottisten säädin BCL-2 [10]. Transkriptiotekijän CCAAT /tehostajana sitovan proteiinin (C /EBP) -homologous proteiini (CHOP; tunnetaan myös DDIT3 /GADD153) toimii lähentyminen PERK, IRE1-α ja ATF6 reittejä [11], [12]. Yliekspressio CHOP tärkeä rooli apoptoosin [13] kautta defosforyloi proapoptoottiset BH3 vain proteiinia Bad ja alas-säätelee Bcl-2: n ilmentymisen [14].

Tällä hetkellä tutkimuksessa pyrittiin: 1) määrittää anti -proliferative vaikutus BP

in vitro

ja

in vivo

, 2) määrittämään vaikutuksia BP solusyklin etenemisen ja apoptoosin, 3) tutkia ER stressiä mahdollisena molekyylitasolla BP, ja 4) sen toteamiseksi MAPK /ER stressi signalointi on osallisena BP-välitteisen apoptoosin eturauhassyövässä. Vaikutukset BP eturauhassyövässä arvioitiin

in vitro

LNCaP ja PC-3-solulinjojen. LNCaP-NOD-SCID vierassiirrettä koe käytettiin arvioimaan syövän vastaisen vaikutuksen BP

in vivo

.

Tulokset

BP esti lisääntymistä ja indusoi morfologian muutoksiin ihmisen eturauhassyövän solut

BP on voimakas antiproliferatiivinen vaikutus GBM soluihin ja aiheutti G0 /G1 vaiheen pysähtymisen ja apoptoosin ajasta ja pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Määrittää sytotoksisuutta vaikutus BP eturauhassyövän soluissa, kolme ihmisen eturauhassyövän solulinjaa käsiteltiin konsentraation kasvaessa BP 24 ja 48 h, ja arvioitiin MTT-määritystä. Kuten on esitetty kuviossa. 1A ja B, BP merkittävästi vähentynyt elinkelpoisuutta DU-145, PC-3 ja LNCaP-solujen annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla. Hoito LNCaP ja PC-3-solujen kanssa 75 ug /ml BP 48 tuntia johti 24,48% ja 45,88% solujen eloonjääminen, vastaavasti (kuvio. 1 B). Näiden tietojen perusteella, käytimme 70 ug /ml BP seuraavissa tutkimuksissa. Jotta voitaisiin edelleen tutkia sytotoksisuutta vaikutus BP eturauhasen syöpäsolujen, LNCaP (androgeenistä riippuva) ja PC-3 (androgeeni-riippumaton) solut valittiin lisätutkimuksia varten. BP-käsitelty LNCaP ja PC-3-solut osoittivat selvää solun kutistuminen ja pyöristäminen, ominaisuuksia tyypillistä solujen apoptoosin (Fig. 1 D ja F).

DU-145 (musta), PC-3 (harmaa) LNCaP (valkoinen) soluja käsiteltiin konsentraation kasvaessa BP (25-100 ug /ml) ja 24 (A) ja 48 h (B) ja analysoitiin MTT-määritys. LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin 0,2% DMSO: ta (C ja E, vastaavasti), tai 70 ug /ml BP (D ja F, vastaavasti) 24 h, ei näytetty.

BP indusoi solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheen ja muutti ekspressiotasot G0 /G1 sääteleviä proteiineja

jotta valaista sen toimintatapa, tutkimme vaikutuksia BP solusyklin etenemisen. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että BP-hoito johti kertyminen solujen G0 /G1 vaihe ajasta riippuvalla tavalla (kuvio. 2A ja B). Kvantifiointi lisääntyvien käsittelemättömien solujen osoitti, että 67,95% soluista olivat G0 /G1 vaiheeseen, 24,96% soluista oli S vaiheessa, ja 7,73% soluista oli G2 /M vaiheessa solusyklin 12 h kuluttua pinnoituksen LNCaP solut; 62.71% soluista olivat G0 /G1 vaiheeseen, 17,78% soluista oli S vaiheessa, ja 19,50% soluista oli G2 /M vaiheessa solusyklin 12 h kuluttua maljaamalla PC-3-solut. Solujen käsittely 70 ug /ml BP 12 h prosenttiosuus kasvoi solujen G0 /G1 vaiheen 81,94% ja vähensi prosenttiosuus solujen S ja G2 /M-vaihetta 10,6 ja 8%, vastaavasti, LNCaP-soluja. PC-3-soluja käsiteltiin 70 ug /ml BP 12 tuntia, prosenttiosuus solujen G0 /G1 faasi kasvoi 69,94%, ja solut S ja G2 /M-vaiheisiin laski 18,11 ja 11,97%, vastaavasti .

BP aiheuttama solusyklin G0 /G1 pidätys (A) LNCaP ja (B) PC-3-solut. Solut ympättiin 8 x 10

5 (LNCaP) ja 6 x 10

5 (PC-3) per 6 cm levyn kolmena rinnakkaisena ja käsiteltiin 70 ug /ml BP 12-24 tuntia. Data esitetään keskiarvoina ± S.D. kolmesta eri kokeesta. *,

P

0,05; **,

P

0,01. Western blot-analyysi sykliini D1, CDK2, p16, p21, p27 ja fosfo-Rb (Ser807 /811) suoritettiin LNCaP-soluissa (C) ja PC-3-soluja (D). β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Western blot-analyysi fosfo-Akt (Ser473), Akt, fosfo-GSK-3β (Ser9) ja GSK-3β suoritettiin LNCaP-soluissa (E) ja PC-3-soluja (F). β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina.

Voit selvittää molekyylitason mekanismit G0 /G1 solukierron pysähtymisen eturauhassyöpäsoluissa aiheuttama BP, tutkimme ilmentymistä tiettyjen G0 /G1 sääntely- proteiinit LNCaP ja PC-3-solut käsiteltiin 70 ug /ml BP. Ensin tarkasteltiin tasoa sykliini D1, tärkein sykliini ohjaamalla G0 /G1 tarkastuspiste. BP hoito johti nopeaan vähentämiseen sykliini D1-proteiinin taso (Fig. 2C ja D). Säätelyä G0 /G1 solusykliä sääteleviä proteiineja kuten p16, p21, P27, ja downregulation CDK2 havaittiin myös ajasta riippuva tavalla (Kuva. 2C ja D) Meillä myös havaittu nopeasti vähennettyä Rb fosforylaation taso (kuvio . 2C ja D), joka osoittaa vaarantunut aktivoitumisen CDK4 /6.

on todettu, että sykliini-D1-fosforylaatiota välittyy Akt-GSK-3β-reitin. Aktivoitu Akt fosforyloi ja estää GSK-3β-toiminto, joka johtaa de-fosforylaation ja vakauttamiseen sykliini D1. Siksi tutkimme onko Akt-GSK-3β-sykliini D1 polku oli mukana BP aiheuttama hajoaminen sykliini D1 eturauhasen syöpäsoluja. Western blot-analyysi osoitti, että BP nopeasti ja merkittävästi tukahdutti Akt-fosforylaation, jo 10 min (Fig. 2E ja F). Yhdenmukainen inhibitio Akt-aktiivisuutta, vähentää fosforylaation Ser9 GSK-3β, tavoite Akt-kinaasin, oli myös huomattava (Fig. 2E ja F), mikä viittaa siihen, että BP edistää sykliini D1 fosforylaation kautta tukahduttaminen Akt ja aktivointi GSK- 3β. Nämä tiedot viittaavat siihen, että BP estää Akt-GSK-3β-reitin eturauhassyöpäsoluissa ja aiheuttaa G0 /G1 kasvun pysähtymisen vaikuttamalla ilmentymistä G0 /G1 sääteleviä proteiineja.

BP indusoi apoptoosin LNCaP-ja PC-3-soluja

arvioimiseksi rooli apoptoosin BP-solukuolema, western blotting ja TUNEL värjäys suoritettiin. Kaspaasien aktivaatio ovat ratkaisevan tärkeitä mekanismeja apoptoosin induktiota. Caspase -8 ja -3 olivat avain proteaasin kuolemantapauksia reseptorivälitteisten-apoptoosin ja niiden osallistumista BP aiheuttaman apoptoosin tutkittiin sekä LNCaP-ja PC-3-solut. BP-indusoidun kaspaasi -8 ja -3 cleavages lisääntynyt annosriippuvaisesti sekä LNCaP-ja PC-3-solut (Fig. 3A ja B). Pro-apoptoottinen Bcl-2-perheen jäsentä, Bax, myös lisääntynyt jälkeen BP kohtelu, joka on tärkeä yhteys IRE1 ja ER-stressin aiheuttama apoptoosin. TUNEL värjäys 48 tuntia sen jälkeen, kun 70 ug /ml BP hoitoa paljasti myös lisääntynyt määrä apoptoottisten solujen sekä LNCaP-ja PC-3-solut (Fig. 3d ja F, vastaavasti).

Western blot-analyysi aktiivisen kaspaasin 8 aktiivinen kaspaasi 3: n ja Bax suoritettiin LNCaP-soluissa (A) ja PC-3-soluja (B). β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. LNCaP-soluja ja PC-3-soluja inkuboitiin ilman (C ja E, vastaavasti) tai läsnä ollessa (D ja F, vastaavasti) 70 ug /ml BP 48 tuntia ja sitten altistettiin TUNEL-määritystä.

geeniekspressioanalyysissä cDNA microarray BP-käsiteltyjen LNCaP

Saadakseen käsityksen mekanismi BP aiheuttama kasvun esto ja solukuolema, käytimme Oligodeoksinukleotidin perustuvia microarray tunnistaa BP-välitteisen geeniekspression . LNCaP-soluja käsiteltiin 70 ug /ml BP 3 ja 24 tuntia, ja RNA uutettiin ja käytettiin mikrosiruanalyysillä. Geenit lukien GADD153 /CHOP havaittiin olevan säädellään ylöspäin ajasta riippuva tavalla (taulukko 1). Me validoitu ylös-säätely GADD153 /CHOP geenit Western blot. BP sai aikaan lisääntyneen ilmentymisen GADD153 /CHOP-proteiinin sekä LNCaP-ja PC-3-solut (Fig. 4A ja B). Up-regulation GADD153 /CHOP on määritelty ER stressin vasteen, joka puolestaan ​​laukaisee signaaleja apoptoosin. Meillä on siis tutkittu roolia ER stressin BP-solukuolema eturauhassyöpäsoluissa.

Western blot-analyysi BiP, kalneksiini, PDI, ATF6, fosfo-eIF2α (Ser51), IRE1-α, GADD153 /CHOP, fosfori-ASK1 (Thr845), ASK1 ja Fas tehtiin LNCaP-soluissa (A) ja PC-3-soluja (B). β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Western blot-analyysi BiP, IRE1-α, GADD153 /CHOP ja Ero1-la- suoritettiin LNCaP-soluissa (C) ja PC-3-soluja (D). β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina.

BP aiheuttamaa ER stressiä LNCaP ja PC-3-solujen

hahmotta- induktion ER stressiä BP eturauhasen syöpäsolut, tutkimme induktiota UPR liittyvien geenien jälkeen BP hoidon LNCaP-ja PC-3-solut (Fig. 4A ja B, vastaavasti). Expression of BiP lisääntyi jälkeen BP hoidon, mutta mitään eroja havaittiin kalneksiini ja PDI ilmaisuja (Fig. 4A ja B). Ylössäätöä ER stressin anturin IRE1-α havaittiin muttei ATF6 ja p-eIF-2α. BP aiheuttama IRE1-α ilme näkyi 3 h (1,16 taittuu) ja lisääntynyt till 48 h (2,47 taittuu) LNCaP-soluissa. Tasot Fas lisääntyi jälkeen BP kohtelu sekä LNCaP-ja PC-3-solujen ja vastasivat microarray löydös LNCaP. Lisäksi ilmaisuja BiP, IRE1-α ja GADD153 lisääntynyt annosriippuvaisesti sekä LNCaP-ja PC-3-solut (Fig. 4C ja D). GADD153 transkription tavoite, ER oksidaasi 1 kuten α (ERO1-la-) kasvoi myös annoksesta riippuvalla tavalla, kun BP hoidon (Fig. 4C ja D).

BP aiheuttama ydinaseiden translokaatiota GADD153 /CHOP LNCaP ja PC-3-solujen

tutkia osallistumisen GADD153 /CHOP BP hoidossa, ensin tutkitaan, onko BP edisti translokaatiota GADD153 /CHOP proteiinin tumaan. GADD153 /CHOP tumaansiirtymiseen edustaa kantoa stressin signaalin tumaan ja siksi toiminnallinen aktivointi. Klo 12 h kuluttua 70 ug /ml BP hoitoon, GADD153 /CHOP oli ilmeisesti runsaampaa tumassa BP-käsiteltyjen LNCaP ja PC-3-solujen kuin että valvonnan (Fig. 5A ja B).

(A) LNCaP-soluja, ja (B) PC-3-soluja käsiteltiin 0,2% DMSO: ta (kontrolli) tai 70 ug /ml BP: ssa 12 h, kiinnitettiin ja värjättiin anti-GADD153 /CHOP. FITC-leimattu sekundaarinen vasta-ainetta käytettiin (vihreä fluoresenssi) Nuclei värjättiin DAPI (sininen fluoresenssi). Kuvat otettiin vangiksi konfokaali laser mikroskoopilla.

rooli ER stressin BP välittämän anti-leviämisen

lisäksi käyttäneet siRNA lähestymistapaa merkityksen määrittämiseksi GADD153 vuonna syövän vastainen potentiaali BP eturauhassyövässä. LNCaP-solut transfektoitiin siRNA: t ja GADD153 ja IRE1-α, vastaavasti, tai ilman hoidon jälkeen 70 ug /ml BP 48 tuntia. Western blot-analyysi osoitti, että transfektio si-GADD153 /CHOP johti tukahduttaminen GADD153 /CHOP ilmentyminen indusoi BP LNCaP-soluissa, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus salattu siRNA (Fig. 6A). Solukuolema BP hoito pelastettiin 21,18% soluissa, jotka on transfektoitu GADD153 /CHOP siRNA verrattuna salattu siRNA-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 6B). Koska GADD153 /CHOP-geenin promoottori sisältää sitoutumiskohdat kaikkien suurten indusoijia UPR, ja vain IRE1-α indusoitiin jälkeen BP hoidon (Fig. 4), me edelleen tunnettu rooli IRE1-α BP aiheuttaman solukasvun pidätys ja solukuolemaa. Me vaiennetaan IRE1-α ilmentyminen si-IRE1-α transfektiota ennen 70 ug /ml BP hoitoa. Kuten on esitetty kuviossa. 6C, IRE1-a siRNA merkittävästi estetty IRE1-α-proteiinin ilmentyminen indusoitiin BP käsittely annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi GADD153 /CHOP myös tukahdutti IRE1-α siRNA transfektiota. MTT-analyysi osoitti, että 11,67 ja 20,8% solukuoleman estyi 20 ja 50 nM IRE1-a siRNA transfektion jälkeen solujen altistaminen 70 ug /ml BP, vastaavasti (kuvio. 6D). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että BP-solukuolema voi olla mukana, ainakin osittain, indusoimalla ER stressin ja säätely ylöspäin IRE1-α ja GADD153 /CHOP proteiinien ilmentyminen.

( A) LNCaP-solut transfektoitiin sekoituskoodin siRNA (

#), 20, tai 40 nM GADD153 siRNA: lla, 48 tunnin ajan käyttäen RNAifect transfektioreagenssia. 24 tunnin kuluttua hoidon 70 ug /ml BP, western blot-analyysi suoritettiin GADD153. (B) BP-indusoi anti-proliferatiivinen aktiivisuus mitattiin MTT-määritystä LNCaP-soluissa, jotka on transfektoitu sekoituskoodin siRNA (

#) tai 20 nM GADD153 siRNA 48 h ja käsiteltiin sitten 70 ug /ml BP 24 tuntia. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. ***,

P

0,001. (C) LNCaP-solut transfektoitiin sekoituskoodin siRNA (

#), 20, tai 50 nM IRE1-a siRNA, vastaavasti, 48 tunnin ajan käyttäen RNAifect transfektioreagenssia. 24 tunnin kuluttua hoidon 70 ug /ml BP, western blot-analyysi suoritettiin IRE1-α ja GADD153, vastaavasti. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (D) BP-indusoi anti-proliferatiivinen aktiivisuus mitattiin MTT-määritystä LNCaP-soluissa, jotka on transfektoitu sekoituskoodin siRNA (

#), 20, tai 50 nM IRE1-a siRNA, vastaavasti, 48 tuntia ja sitten käsiteltiin 70 ug: /ml BP 24 tuntia. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. ***,

P

0,001 versus ajoneuvo.

Rooli MAPK BP aiheuttama ER stressiä ja solukuolemaa

aktivointi MAPK on ollut sekaantunut säätelyyn ER-stressin aiheuttamaa solukuolemaa. Olemme tutkineet vaikutus BP MAPK aktivointia. Altistuminen LNCaP-ja PC-3-solujen 70 ug /ml BP johti fosforylaatioon JNK 1/2 ja ERK 1/2, mutta ei p38 MAPK (Fig. 7A ja B). ERK 1/2 fosforylaatio jälkeen BP hoidon tapahtui 10 min ja alassäätöä tapahtui 30 min. Päinvastoin, fosforylaatiota JNK 1/2 yllä on 10-180 min. Edelleen karakterisoimiseksi roolin JNK 1/2 BP kohtelu, me vaiennetaan JNK 1/2 ilmaisun erityisten siRNA transfektiolla. Kuten on esitetty kuviossa. 7C, JNK 1/2 ilmaisun ja fosforylaatio jälkeen BP hoidon vähennetään si-JNK transfektiota. Lisäksi BP-indusoidun ilmentymisen IRE1-α ja GADD153 myös vähentää si-JNK transfektiota. BP-solukuolema pelastettiin si-JNK transfektion verrattuna salattu siRNA transfektiota (siRNA1: 26.14%, siRNA2: 20,95%, Fig. 7D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että JNK: n aktivoituminen on osallisena BP-solukuolema ja osallistuu IRE1-α ja GADD153 aktivointi.

(A) LNCaP-soluja, ja (B) PC-3-soluja käsiteltiin 70 ug /ml BP varten ilmoitettu kertaa. Fosfo-ERK1 /2, yhteensä ERK1 /2, fosfo-JNK1 /2, yhteensä JNK1 /2, fosfo-p38, ja yhteensä p38 havaittiin Western blot vastaavasti. (C) LNCaP-solut transfektoitiin sekoituskoodin (

#) tai 20 nM JNK1 /2 siRNA 48 h käyttäen RNAifect transfektioreagenssia. Hoidon jälkeen 70 ug /ml BP 24 tuntia, western blot-analyysi suoritettiin fosfo-JNK1 /2, yhteensä JNK1 /2, IRE1-α ja GADD153. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (D) BP-indusoi anti-proliferatiivinen aktiivisuus mitattiin MTT-määritystä LNCaP-soluissa, jotka on transfektoitu sekoituskoodin (

#) tai JNK1 /2 siRNA 48 h ja käsiteltiin sitten 70 ug /ml BP 24 tuntia. Data ilmaistiin keskiarvoina ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. ***,

P

0,001 versus ajoneuvo.

BP estää syöpäsolujen kasvua LNCaP-NOD-SCID vierassiirrettä

arvioimiseksi antituumorivaikutuksen BP

in vivo

, ihmisen eturauhassyöpäksenograftista määritettiin injektoimalla ihon alle 5 x 10

5 LNCaP-soluja selän ihonalaiseen kudokseen NOD-SCID-hiirissä. Kuten on esitetty kuviossa. 8A, suhteellinen kasvaimen tilavuus hoidetuilla hiirillä 500 mg /kg BP oli merkitsevästi 68% pienempi kuin apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään hiiriin päivänä 18. Tuumorin paino oli vähentynyt merkittävästi 56% BP-käsitellyssä ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään päivänä 18 (Fig. 8B). Kasvaimet kontrollieläimiltä luokiteltiin Gleason 5B koska mitään rauhaskudoksen löytynyt (Fig. 8C). BP-hoidetuista eläimistä, epäsäännöllinen sulatettu rauhaset havaittiin ja ne järjestetään Gleason 4A (kuvio. 8D). Näin ollen, astetta kasvaimen erilaistumiseen BP-käsitellyssä ryhmässä olivat parempia kuin kontrolliryhmässä. Lisäksi säätely ylöspäin GADD153 /CHOP BP-hoito kasvain havaittiin immunohistokemialla värjäytymistä (kuvio. 8E ja F) ja western blot-analyysi (kuvio. 8G), tässä järjestyksessä. Kaspaasi-3 aktivaatio havaittiin myös BP-hoidon kasvain (Fig. 8G). Ei ollut merkittäviä eroja kehon painosta sekä ohjaus ja BP-käsiteltyjen ryhmien. Nämä tulokset osoittivat, että BP-indusoidun eturauhassyövän solukuolemaa korreloi ER stressiä

in vivo

.

(A) NOD-SCID-hiiriin injektoitiin noin 5 x 10

5 LNCaP solut selän ihonalaiseen kudokseen. Kun kasvain saavutti 100-250 mm

3, LNCaP kasvain hiiret ylläpitäjä s.c. ajoneuvon ohjaus (▪) tai 500 mg /kg BP (•) päivinä 0-4 5 päivää. Suhteellinen kasvain tilavuudet ohjaus ja BP-käsiteltyjen ryhmien esitettiin keskiarvoina ± S.D. Kasvaimen tilavuus kunakin ajankohtana. (B) Kasvaimet valvonta- ja terapeuttisen ryhmät poistettiin ja painotettu päivänä 18. Keskimäärin kasvaimen painoa BP-hoidetussa ryhmässä oli 56% pienempi kuin verrokkiryhmässä. Data ilmaistiin keskiarvoina ± S.D. Kasvaimen painon valvontaa ja BP-käsiteltyjen ryhmien. **,

P

0,01. (C, D) kasvainkudossektioista HE värjäytymisen ohjaus (C) ja terapeuttinen ryhmät (D) .GADD153 ilmaisuja olivat immunohistokemiallisesti havaittu kontrolliryhmässä (E) ja BP-hoidetussa ryhmässä (F). GADD153-positiiviset solut värjättiin ruskea. Expression of GADD153 ja aktiivisessa muodossa kaspaasi-3 LNCaP ksenograftissa tuumorikudokseen voimistunut jälkeen BP annon verrattuna kontrolliryhmään western blotting-analyysi (G).

Keskustelu

Tällä hetkellä lupaavia luonnossa esiintyviä ruokavalion terapeuttisia yhdisteitä ovat resveratroli, kurkumiini, genisteiini, diallyylisulfidi ja muiden aineiden, joille on yhteistä kyky indusoida syöpäsolujen on hyödynnetty [15]. Aiemmissa tutkimuksissa osoitimme, että BP teko voimakkaasti vastaan ​​glioblastoma multiforme (GBM) aivokasvaimia ja maksasolusyövän (HCC) kasvaimet

in vitro

ja

in vivo

[5], [6] , [16]. Kuitenkin vaikutukset BP ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ei ole määritetty. Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että BP on sytotoksinen kolmen eri eturauhassyövän solulinjoissa. Koska molemmat androgeeniriippuvaisen ja riippumattaman syöpäsolujen osoitti samanlaista herkkyyttä BP hoito, osallistuminen androgeenireseptorin koulutusjakson ei otettu huomioon tässä tutkimuksessa.

Menetys solukierron säätelyssä on tunnusomaista syöpään. Tutkia mekanismeja osuus vaikutuksen BP eturauhassyövän soluissa, solunjakautumissykliä seurattiin. BP aiheuttama solukierron pysähtymisen näkyi ylössäätöä p16, p21 ja p27, ja alas-säätely CDK2 ja sykliini D1. P16, p21 ja p27-proteiinit ovat CDK estäjiä, jotka säädellä negatiivisesti cdk tai sykliini /cdk kompleksin [17]. P16-proteiini, jäsen INK4 perheen, sitoutuu CDK4 /6 estää kinaasiaktiivisuutta puoliväliin G1 vaiheessa [18]. P21 (CIP1) ja p27 (kip1) proteiinit sitoutuvat sykliini /cdk kompleksi, jolloin esto G1 S-vaiheeseen siirtymisen kautta kumoamisen Rb-fosforylaation sykliini /cdk-kompleksien [19]. Täten lasku fosforyloidun Rb tulisi olla seurausta BP-laukaisi ilmentymisen cdk-inhibiittorit, mikä puolestaan ​​vähentää aktiivisuutta sykliini /cdk monimutkainen. Usein aktivaatio Akt signalointireitin on raportoitu monissa ihmisen syövissä [20], [21], ja GSK-3β on tunnistettu yhdeksi Akt: n molekyyli tavoitteita. Akt inaktivoi GSK-3β kinaasiaktiivisuuden kautta paikkasidonnainen fosforylaation Ser9 [22]. Suppressio Akt joka johtaa de-fosforylaation ja aktivaation GSK-3β aiheuttaa fosforylaatio sykliini D1 Thr286 ja myöhemmin proteasomaalisten hajoaminen [23]. Sykliini D1 on osoitettu yliekspressoituvan moniin syöpiin kuten rinta-, pään ja kaulan, ruokatorven ja eturauhasen [24],. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että BP pystyy inhiboimaan Akt aktivaation vähentämällä Ser473 fosforylaation, ja palauttaa GSK-3β kinaasiaktiivisuuden vähentämällä Ser9 fosforylaation eturauhassyöpäsoluissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että BP estää syöpäsolujen lisääntymistä kautta solusyklin pysähtymisen säätelemällä sykliini /CDK /CKI solusykliä säätelijäproteiinin ja kohdistaminen Akt-GSK-3β-sykliini D1 signalointi akselilla.

tutkimiseksi taustalla molekyylimekanismeja BP aiheuttama eturauhasen syöpäsolujen kuolemaa, tutkimme BP aiheuttamat muutokset geenien ilmentyminen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen käyttäen oligodeoksinukleotidia-pohjainen microarray seulonta-analyysissä. Useita geenejä, joilla oli suurempi kuin kaksinkertainen lisäys ilmentymisessä 24 h BP hoidon tunnistettiin (taulukko 1). GADD153 /CHOP osoitti dramaattisesti 11,89 taittuu kasvua ilmaisun jälkeen BP hoidon. GADD153 /CHOP on geeni, kun se on mukana ER stressi-välitteisen apoptoottisen reitin. Aktivointi UPR näyttelee suojaava rooli soluja ER stressin [26]. Kuitenkin pitkäaikainen aktivointi UPR liiallinen ER stressi voi muuntaa sen rooli sytotoksisten aktivoimalla useita apoptoottisten reittien nisäkässoluissa [27]. ER stressiä anturi proteiineja ATF6, IRE1-α ja PERK muodostavat ytimen stressi säätelijä UPR, ja välittää signaaleja siitä ER sytoplasmaan ja tuman jälkeen ER stressin [28] – [30]. Tutkimuksessamme BP indusoi vain IRE1-α aktivaation, mutta ei ATF6 tai p-eIF2α eturauhassyöpäsoluissa. Lisääntyvä ja ylläpitämisessä ilmentyminen IRE1-α ja sen alavirran kohde GADD153 /CHOP jälkeen BP hoidon havaittiin aika- ja annoksesta riippuvasti. Yksi mekanismeista osallisena GADD153 /CHOP-välitteisen apoptoosin on oksidatiivista stressiä [31]. Hapettuminen ER ontelon indusoi GADD153 /CHOP alavirran kohde ERO1-la-. ERO1-la- on arveltu hyperoxidize ER onteloon, ja se aiheuttaa sytotoksisen reaktiivisen hapen (ROS) tuotanto, joka johtaa solun kuolemaan. Toinen mekanismi liittyy rooliin Bax in GADD153 /CHOP aiheuttamaa apoptoosia. ER-stressin aiheuttama sydänlihassolujen aopotosis, Bax kasvaa ER stressiä on GADD153 /CHOP-riippuvaisella tavalla [32]. Bax ja Bak moduloida myös UPR suoraa vuorovaikutusta IRE1-α, ja ne ovat tärkeitä yhteys IRE1-α välitteisen ER-stressi-indusoitua apoptoosia. Tulokset osoittavat, että transfektio siRNA: iden ja IRE1-α tai GADD153 /CHOP tukahdutetaan BP-solukuolema. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että BP voi moduloida ER stressi-välitteisen apoptoosin ihmisen eturauhasen syöpäsolujen aktivaation kautta IRE1-α-GADD153 /CHOP-signalointireitin.

hoito BP laukaisi voimistunutta ilmentymistä Fas, joka johti että kaspaasi-8 ja -3 pahanlaatuisen aivokasvaimen edellisessä tutkimuksessa [5]. Fas yliekspressio lisäsi myös 3 tunnin kuluttua BP hoidon. Siten BP: n indusoiman apoptoosin ihmisen eturauhasen syöpäsolujen saattaa välittyä, ainakin osittain, kuolema reseptorin apoptoosireitin.

Lisäksi aktivointi MAPK on osallisena geeniekspression säätelyssä ER stressin signalointi kaskadi ja on mukana monessa valvontaan soluproliferaation ja apoptoosin. JNK-reitin on myös osoitettu olevan positiivinen säätelijä ER stressin indusoiman apoptoosin [33]. Tutkimuksessamme fosforylaatio JNK jälkeen havaittiin BP hoidon. Inhibitio JNK ilmentymiseen siRNA johti alas-säätely IRE1-α ja GADD153 /CHOP, ja osittain pelastettiin BP-solukuolema. ER stressi-aktivoidun IRE1-α sitoo sovittimen tuumorinekroositekijä reseptoriin liittyvän factor2 (TRAF2), E3-ubikitiini-ligaasia, joka puolestaan ​​aktivoi apoptoosin signaalin säätelevää kinaasi 1: n (ASK1; tunnetaan myös nimellä MAP3K5), tämän jälkeen aiheuttaa JNK aktivointi. Pääteltiin ajatus, että BP aiheuttama ER stressin välittävät solukuoleman kautta yhteistyö JNK-reitin.

Tuumorinekroositekijä sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) on kuolema reseptoriligandiin jotka voivat valikoivasti aloittaa apoptoosin erilaisia ​​kasvainsoluja. Äskettäin TRAIL-terapeuttisten, mukaan lukien TRAIL geeniterapia, rekombinantti TRAIL ja TRAIL-reseptori-agonistinen vasta-aineita on pääsy kliinisissä tutkimuksissa [34] – [37]. Kuitenkin samanlainen kuin monet muut syövät, eturauhassyöpä kehittyy resistenssi TRAIL [38], [39]. Siksi etsien TRAIL herkistävät aineet, joilla voidaan poistaa TRAIL resistenssin syöpäsoluissa ovat arvokkaita. LNCaP tiedetään olevan resistenttejä TRAIL: n indusoiman apoptoosin, jotka liittyvät ilman PTEN, jotka edistävät konstitutiivinen aktivointi AKT /PI3K kautta. Koska BP tehokkaasti vähentäneet Akt-aktiivisuutta vähentämällä taso fosfo-Akt Ser473, mikä tekee BP ehdokas TRAIL herkistävä.

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoitti, että BP 1) aiheuttaa eturauhassyöpää solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheessa kohdistamalla Akt-GSK-3β-sykliini D1 signalointi akseli; 2) indusoi solukuolemaa kautta ER-stressi-ja JNK-välitteisen UPR; 3) laukaisee apoptoosin ihmisen eturauhasen syöpäsolujen läpi useita apoptoottisten reittien

in vitro

ja

in vivo

(Fig. 9).

BP indusoi apoptoosin ihmisen eturauhasen syöpäsolujen läpi useita apoptoottisia reittejä, kuten G0 /G1 vaihe solusyklin pysähtymiseen, kuolema reseptorin reitin ja ER stressin riippuvaisen reitin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät ja reagenssit

ihmisen eturauhasen solulinjoissa LNCaP-ja PC-3 hankittiin ATCC: ltä (American Type Culture Collection, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jossa oli 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä, 1% natriumpyruvaattia, 2 mM L-glutamiinia (kaikki nämä reagenssit ovat Invitrogen, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO2.