Krooninen sairaus

tiivistelmä

Molekyyli chaperone GRP78 /BiP on keskeinen säätelijä proteiinin laskostumisen endoplasmakalvostossa, ja se on keskeinen rooli syövän solujen eloonjäämistä ja chemoresistance. Sen toiminnan inhibointi on siis ollut tärkeä strategia estämään kasvainsolujen kasvua syövän hoidossa. Edellinen ponnisteluja tämän tavoitteen saavuttamiseksi on käytetty sitoutuvien peptidien GRP78 /BiP konjugoida pro-lääkkeitä tai solukuolemaa indusoiva sekvenssit. Tässä kuvaamme peptidi, joka indusoi eturauhaskasvainsolun syöttämällä ilman mitään konjugoimiseksi sekvenssejä. Tämä peptidi on joka on johdettu cochaperone Bag-1. Olemme osoittaneet, että tämä sekvenssi on vuorovaikutuksessa ja estää uudelleenpoimuttumisen aktiivisuutta GRP78 /BiP. Lisäksi olemme osoittaneet, että se moduloi avatulla proteiinivaste ER stressin seurauksena PARP ja kaspaasi-4 pilkkominen. Syöpäsolujen stabiilisti ilmentävät tätä peptidiä osoitti alentuneita kasvu ja apoptoosin

in vivo

ksenografti- kasvainmuodoista. Aminohapposubstituutioita, jotka tuhosivat sitoutumisen Bag-1-peptidin GRP78 /BiP tai vaimennussäätely ilmentymisen GRP78 vaarantuu estävää vaikutusta tämän peptidin. Tämä sekvenssi edustaa siksi ehdokkaan johtaa peptidin kasvainhoitojen.

Citation: Maddalo D, Neeb A, Jehle K, Schmitz K, Muhle-Goll C, Shatkina L, et ai. (2012) pepti- Konjugoimattoman GRP78 /BiP- Ligandi moduloi taitettuna proteiinivaste ja indusoi Eturauhassyöpä Cell Death. PLoS ONE 7 (10): e45690. doi: 10,1371 /journal.pone.0045690

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 tammikuu 2012; Hyväksytty: 23 elokuu 2012; Julkaistu: 01 lokakuu 2012

Copyright: © Maddalo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Association for International Cancer Research, Iso-Britannia; Saksan Science Foundation, Euroopan unionin kuudes puiteohjelma PRIMA, ja käynnistysvaiheen varoja Karlsruhe Institute of Technology. Danilo Maddalo oli vastaanottaja Marie Curie tutkimusta apurahan CANCURE Euroopan unionissa kuudes puiteohjelma. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

glukoosin säätelemä proteiini GRP78 (tunnetaan myös BiP, immunoglobuling raskasketjun sitova proteiini) on jäsen lämpöshokkiproteiiniperheen ja sillä on tärkeä rooli ylläpitää solujen homeostaasin [1]. Se on avain säätelijä avatulla proteiinivaste (UPR), koulutusjakson aktivoituu kertymistä kehitettyjen peptidien aikana rasittavissa olosuhteissa kuten lämpö shokki, asidoosi, ravinteiden nälkään ja hypoksia [2].

GRP78 säätelee UPR sitomalla transmembraaninen anturi proteiineja Perk (PKR kaltainen Endoplasmakalvosto asuva kinaasi), ATF6 (aktivoiva transkriptiotekijä 6) ja IRE1α (inositoli-vaativat entsyymin α) (katsaus [3]) johtava toisaalta lisääntyneeseen transkription molekyyli- chaperoneiksi kuten GRP78 itse, GRP94 ja proteiini-isomeraasin (PDI) [4], [5], ja toisaalta proteiinisynteesin sammutuksen fosforylaatio alfa-alayksikön eukaryoottisen aloittamista tekijä eIF2α [6]. Tämän seurauksena näiden kahden vaikutuksista, solua voitettu ylikuormittamista poikkeaviin peptidien ja he elävät [7]. Kuitenkin pitkäaikainen eIF2α fosforylaatio aktivoi transkriptiotekijä ATF4 [8], [9], mikä johtaa kohonneeseen pro-apoptoottinen tekijä CHOP (C /EBP homologista proteiinia) [10], [11]. Aktivointi ER-stressi välitteistä apoptoosia tuloksia pilkkoutumisen caspsase 4, ER-stressi erityisiä kaspaasi, ja PARP (poly (ADP) -ribosome polymeraasi) [12], [13].

GRP78 on yli-ilmentynyt useaan eri kasvaimia, kuten eturauhasen [14], rintojen [15], [16] ja paksusuolen ja sen ilmaisun usein korreloi huonon ennusteen [17], [18], [19]. Kuitenkin GRP78 downregulation siRNA kasvattaa apoptoosin ja herkistää solut kemoterapeuttisten [20], [21]. Yleensä transformoituja soluja upregulate GRP78 taso [15] hengissä vaikeisiin olosuhteisiin kasvaimen microenvironment [22], [23], [24]. Useat terapeuttiset aineet ovat näin ollen kohdistettu UPR tai vastaan ​​GRP78 /BiP hillitsemiseksi kasvainsolujen kasvua [25], [26], mutta todella selektiivisiä ovat vielä tunnistettu [15]. Vuonna etsiä uusia estäjiä GRP78 /BiP että olisi terapeuttista merkitystä, olemme käyttäneet tietoa sääntelystä ER stressin jonka cochaperone Bag-1 [27] määrittämään sekvenssin Bag-1, joka sitoutuu ja estää toiminnan GRP78 /BiP.

Bag-1 on perheen neljä polypeptidien (Bag-1L, -1M, -1 ja -1S) monimuotoisen verkkotunnuksia, joka on vuorovaikutuksessa ja toimintaa säätelevään erilaisia ​​solun proteiinien [ ,,,0],28]. Nämä proteiinit omaavat erilaiset N-terminaaliset sekvenssit, mutta yhteinen keskeisellä paikalla ubikitiini-kaltaisen domeenin, joka muodostaa linkin HSC /Hsp70, että proteasomin [29] ja konservoitunut C-terminaalinen Hsp70 sitovan domeenin (joka tunnetaan myös BAG domain), joka sitoo ja Hsp70 /Hsc70 ja toimii nukleotidin vaihdon tekijä [30], [31]. Bag-1 on myös osoitettu säätelevän solulimakalvostoon (ER) stressin indusoiman apoptoosin [27] ja sitoa GADD34, komponentti ER stressiä [32], mutta tiedot sen toimintaa ei tunneta.

tässä tiedonannossa osoitamme, että Bag-1 sitoutuu GRP78 /BiP kautta peptidin päällekkäisiä sen ubikitiinistä kaltaisen domeenin. Olemme lisäksi osoittavat, että GRP78 /BiP sitojapeptidi Bag-1 estää toiminnan GRP78 /BiP ja häiritsee UPR johtaa apoptoosin induktioon. Olemme rajanneet tämä peptidi ja yksilöitiin ydinmotiivin seitsemän aminohappoa, joka näkyy välttämättömiä sitoutumiselle GRP78 /BiP ja negatiiviseen säätelyyn eturauhaskasvainsolun kasvua. Tämä ydin sarja voisi olla lähtökohta tulevien terapeuttisten suuntautuu esto GRP78 /BiP toiminta ja UPR.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Human hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvun solulinjaa BPH-1 viljeltiin Dulbeccon modifioitu Eagles (DMEM) täydennetty glutamiinilla. PC3 ja DU145-soluja viljeltiin myös DMEM ilman glutamiinia 22Rv.1, LNCaP ja PNT-2-soluja viljeltiin RPMI 1640 Kaikki edellä mainitut viljelyalustassa, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. RWPE-1-soluja viljeltiin keratinosyyttien seerumivapaassa väliaineessa. Kaikki elatusaineet pidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

Vasta

Goat monoklonaalinen vasta GRP78 (N20), kanin polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​Bag-1 (C-16), eIF2α ja fosfori-PERK ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa. Kaniinin polyklonaalista anti-GRP78 (ab21685), anti-GCN2 (ab37674), anti-PERK (ab65142), anti-fosfo-IRE1α (ab124945) vasta-aineet, kanin monoklonaalista anti-phopsho-GCN2 (ab75836) vasta-aineen ja hiiren monoklonaalinen anti-β aktiini (ab8226) vasta-aine hankittiin Abcam, Cambridge, Iso-Britannia. Hiiren vasta-ainetta HA-tag (HA.11 klooni 16B12) hankittiin Covance, Munich, Saksa. Rotan monoklonaalinen vasta-aine HA (3F10) ostettiin Roche, Mannheim, Saksa. Vasta-aineet IRE1α, fosfori-eIF2α CHOP, PARP ja ATF4 ostettiin Cell Signaling Technology, Frankfurt am Main, Saksa. Anti-ATF6 vasta-aine hankittiin IMGENEX, Hampuri, Saksa. Caspase 4-vasta-aine hankittiin MBL, Munich, Saksa.

Ekspressiovektorit ja Plasmidit

Ekspressiovektori pcDNA3.1-HA-Bag-1 koodaus Bag-1 on aiemmin kuvannut [ ,,,0],33]. Koodittava rakenne Bag-1Δ68mer (Bag-1, josta puuttuvat aminohapot 202-269) luotiin korvaaminen Sac II-Xbal pussin-1 cDNA pcDNA3-Bag-1 konstruktio. Konstrukti pcDNA3-HA Bag-1-peptidin (naisille1-L 202-269), N-terminaalinen (Bag-1L 202-241), C-terminaalinen (Bag-1L 241-269), 19-mer (Bag-1L 202 -220), ΔUbi (Bag-1L 220-269) ja 19-mer-mutantin (Bag-1L 202-220) peptidit luotiin PCR-monistuksella, jossa on HA-sekvenssin. Kontrollina, otimme käyttöön HA sekvenssi pcDNA3-vektoriin tuottaa tyhjän ekspressiovektoriin pcDNA3.1-HA. pcDNA3.1 Bag-1ΔC47 (Bag-1, josta puuttuu viimeinen 47 aminohappoa) kloonattiin BamHI-XhoI-kohtiin pcDNA3.1-HA vektorin PCR-monistamisen jälkeen käyttäen pcDNA3.1-HA Bag-1 templaattina. GST-pull-down kokeissa pGEX4T.1-Bag-1 68mer-sekvenssin, pGEX4T.1-N-terminaalinen peptidi, pGEX4T.1-C-terminaalinen peptidi, pGEX4T.1 Bag-1Δ Ubi, pGEX4T.1-19mer ja pGEX4T.1-19mer mutantit luotiin fuusioimalla PCR-amplifikaation tuotteita vastaavien Bag-1L sekvenssi lukukehyksessä GST vektorissa pGEX4T.1. GST koodaavat plasmidit GST-fuusioitu GRP78, GRP78-ATPaasi (GRP78 1-408), GRP78-SBD (GRP78 409-651) ja Bag-1-isoformit tuotettiin PCR: llä ja kloonattiin pGEX4T.1 jälkeen BamHI-XhoI ruoansulatusta. Plasmidi pCMV6-GRP78 [34] hankittiin Origene Technologies (Darmstadt, Saksa).

Solun transfektio, siRNA Knock-down ja Western-blottaus

Ellei toisin mainita, stabiili transfektio suoritettiin in 22Rv.1 tai BPH-1-soluissa 10 ug: lla plasmidi-DNA: lla käyttäen FuGene 6 ™ (Roche Diagnostics Mannheim, Saksa) on stabiilisti transfektoitu 22Rv.1 solut valittiin 0,8 mg /ml, kun taas BPH-1 solun kloonit valittiin 1,2 mg /ml G418: aa. LNCaP, PC3, DU145, PNT-2 ja RWPE-1 solun kloonit valittiin 1 mg /ml G418: aa. Erityiset downregulation GRP78 ilmentyminen saavutettiin transfektoimalla siRNA-dupleksit (GRP78:5′-GGAGCGCAUUGAUACUAGATT-3 ’) kaksi kertaa 72 tuntia käyttäen HiPerfect ™ (Qiagen Hilden, Saksa). siRNA GFP (5’-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3 ’) käytettiin kontrollina. Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [35].

Co-immunosaostus

22Rv.1 soluja käytettiin vuorovaikutuksen tutkimuksessa endogeenisen Bag-1 ja GRP78 /BiP, kun taas

in vivo

vuorovaikutusta Bag-1-peptidin ja GRP78 /BiP, HEK-293-soluja transfektoitiin plasmidilla, joka koodaa HA-merkitty Bag-1-peptidin. Kaksikymmentäneljä tuntia ennen koetta solut molemmissa tapauksissa pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja käsiteltiin 20 mM Ditiobis (sukkinimidyylipropionaatti) (DSP) PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktio pysäytettiin 20 mM Tris ja solut hajotettiin 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,4% NP40: tä ja 1% proteaasiestäjäseostabletit. Immunosaostus GRP78 /BiP suoritettiin yön yli 4 ° C: ssa anti-GRP78-vasta-ainetta, joka on kytketty Sepharose helmiä (Abcam, ab21685). Sitovat endogeenisen Bag-1 tai HA-peptidi määritettiin Western blotting käyttämällä Bag-1 tai HA spesifistä vasta-ainetta.

Protein Expression ja näytteiden valmistus

TEV-proteaasi-katkaistavissa oleva GB1 -fuusioitunut Bag-1 peptidi ilmaistu

Escherichia coli

BL21 (DE3) plys S. Uniform leimaamisen

15N NMR-spektroskopialaatu saavutettiin kasvattamalla bakteereita minimaalikasvualustassa täydennettynä 0,5 g /l

15NH

4cl. GB1-His

6-merkittyä proteiini puhdistettiin Ni-NTA-pylvästä (Qiagen, Hilden, Saksa), sen jälkeen hajotettiin rekombinantti-TEV-proteaasia ja johdettiin toisen Ni-NTA-pylvääseen, jolloin poistetaan sekä fuusio tag ja hänen

6-tagged proteaasi. Lopuksi, proteiini puskuri vaihdettiin 20 mM kaliumfosfaatti, 100 mM NaCI, pH 6,8. Proteiinipitoisuus arvioitiin vertaamalla intensiteetti 1D NMR-spektrin kanssa, joka on vertailuaine (DSS, 2,2-dimetyyli-2-silapentaani-5-sulfonihappo).

GST-HA-merkitty N-terminaaliset ja C-terminaaliset peptidit tuotettiin käyttäen protokollaa. GST-osasta pilkottiin pois pilkkomalla trombiinin mukaan valmistajan protokollan (Roche, Mannheim, Saksa). Saatu raaka peptidi valmistamiseksi puhdistettiin edelleen käänteisfaasi-HPLC: llä (C18-kolonni, 250 x 10 mm, Grace), jossa vesi /asetonitriili lineaarinen gradientti. Identiteetti ja puhtaus jakeet analysoitiin MALDI-TOF-massaspektrometrialla (Bruker AUTOFLEX III). PH neutraloitiin ennen lyofilisointia. Peptidi liuotettiin 20 mM KPO

4, pH 6,8. Proteiinikonsentraatio laskettiin optisen tiheyden 275 nm: ssä absorbanssista tyrosiinien HA-tag.

CD-spektroskopia

CD-spektrit peptidien rekisteröitiin Jasco J- 810-spektropolarimetrillä (Jasco Co., Tokio, Japani) 20 ° C: ssa, käyttäen vesi-termostaatilla solun haltijalle. Pitoisuuksien Bag-1, N-terminaalin ja C-terminaaliset peptidit olivat 17 uM, 12 uM, ja 11 uM, vastaavasti. CD-spektrit ovat keskiarvoja kolmesta skannaa pyyhkäisynopeudella 10 nm min

-1, 4 s vasteaika ja 1 nm kaistanleveys, ja ne tasoitetaan adaptiivisen tasoituksen menetelmää, joka on osa Jasco Spectra Analyysiohjelmisto . Puskuri osuus vähennettiin.

NMR Kokeet

Proteiinipitoisuus varten NMR kokeessa oli 0,5 mM. Kemiallinen siirtymä kalibrointia ja verrata suhteellisia signaalin intensiteetti, 0,2 mM DSS (2,2 dimetyyli-2-silpentane-5-sulfonihappo) lisättiin.

15N-HSQC spektrit saatiin 23 ° C: ssä Bruker Avance II 600 spektrometri (Bruker, Karlsruhe) varustettu laajakaista kolmoisresonanssimittapäätä pään 4 skannausta per lisäystä ja yhteensä 128 lisäykset epäsuoran ulottuvuuden. Tiedot käsiteltiin kanssa NMRPIPE [36] ja analysoitiin NMR: llä VIEW.

Fluoresenssi Polarisaatio määritykset

Fluoresenssi polarisaatio määritykset suoritettiin käyttäen Infinite F-200 (TECAN) virityksen ollessa 490 nm: ssä ja emissio 535 nm.

-tuumoriksenografti Studies

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaan eurooppalaisten ja Saksan lain määräyksiä. Tuottamiseen ksenograftimalleissa 5 x 10

6 LNCaP-solut suspendoitiin uudelleen liuokseen, joka sisälsi 50% Matrigel® (BD Bioscience, Heidelberg, Saksa) PBS: ssä tai 5 x 10

6 22Rv.1 solua 100 ul: ssa PBS: ää ihonalaisesti injektoituna molempiin kylkiin 6-8 viikon ikäisiä kateenkorvattomia nude-hiiriin. Tuumorin koko mitattiin paksuus joka viikko. Kasvaimet, jotka ovat peräisin injektion stabiilien kloonien yli-ilmentävät Bag-1-peptidin, analysoitiin ajan 9viikko, kun taas kasvaimissa, jotka on transfektoitu tyhjällä ekspressiovektorilla, tai ilmentämään N-terminaalin, C-terminaalin ja An-peptidi analysoitiin 5 viikon aikana. Tuumorin koko arvioitiin mittaamalla kolme kohtisuorassa halkaisijat kaavan mukaisesti: V = (1/6) [π] (d1d2d3), jossa π on matemaattinen vakio ja d1, d2 ja d3 ovat kolme paikkatietojen mitat (leveys, syvyys ja korkeus ). Hiiret lopetettiin kaulan sijoiltaanmenolla ja tuumorit poistettiin lisäanalyysiä.

GST-pull-down Kokeet

Expression of GST-fuusioproteiinien GST-pull-down-kokeet suoritettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [37].

immunohistokemia

kudokset kiinnitettiin 10% formaliinilla 16 h ajan huoneenlämpötilassa, tallennetaan etanolia (50%), parafiiniin ja leikattiin 5 um: n paksuinen Leica RM 2155 mikrotomi. Apoptoottisia soluja havaittiin kautta terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia-välitteisen deoksiuridiini-trifosfaatti-biotiini nick end merkintöjä (TUNEL) määritys käyttäen DNA: n fragmentoituminen ApopTag® peroksidaasi

in situ

apoptoosin havaitsemiseen kit (Millipore, Schwalbach, Saksa).

solunelinkykyisyysmääritys

CellTiter-Blue® solunelinkykyisyysmääritys kit (Promega) käytettiin määrittämiseksi solujen elinkykyä. Lyhyesti 22Rv.1 solut stabiilisti yliekspressoivat Bag-1-peptidin ympättiin kahteen 96-kuoppaiselle levylle (4500 solua /kuoppa), ja mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Yksi levy analysoitiin päivänä 0 ja toinen levy 2 päivää myöhemmin. Kolme tuntia ymppäyksen jälkeen, 20 ui väriaine lisättiin kuhunkin kuoppaan, joka sisälsi 100 ui viljelyalustaa ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Fluoresenssi mitattiin levyn käsittelyssä fluorometrillä Fluostar Optima (2001 BMG Labtechnology, ohjelmistoversio 1,10-0) ja esitetään suhde arvoon virityksen aallonpituus (560 nm) yli päästöjen aallonpituus (590 nm). Solujen proliferaatio määritettiin ero fluoresenssin intensiteetti viimeisessä aikapisteessä, ja saatu arvo on päivä kylvö solujen (päivä 0).

In vivo

uudelleenlaskostus Assay

In vivo uudelleenpoimuttamista määritys suoritettiin olennaisesti kuvatun menetelmän mukaan [38]. HEK-293 on 70% -confluent 10 cm malja transfektoitiin β-aktiini-fire fly lusiferaarikonstrukti (2 ug), pcMV6-GRP78 (3 ug), Bag-1 tai Bag-1 peptidien pcDNA3.1-HA (6 ug) ja Renilla lusiferaarikonstrukti (0,5 ug) samanarvoisesta transfektion valvontaa. Kaksi päivää transfektion jälkeen solut jaettiin kahteen ja inkuboitiin lämpöshokin puskurissa (MOPS 20 mM ja sykloheksimidillä 20 ug /ml) 30 min ajan 37 ° C: ssa. Yksi puoli transfektoitujen solujen oli lämpösokki 30 min 45 ° C: ssa ja annettiin toipua 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Toinen puoli jätettiin käsittelemättä ja käytettiin kontrollina. Lopussa kokeiden, solut otettiin talteen, hajotettiin ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Aktiivisuus mitattiin ei-lämpösokki solut asetettiin 100% uudelleen laskostuneen, lusiferaasi ja toiminnan mittaukset lämpösokki solut ilmaistu suhteessa tähän arvoon.

Tilastollinen analyysi

Ellei toisin mainita, laskelmat tilastollista merkittävyyttä tässä työssä suoritettiin Studentin t-testillä.

tulokset

Bag-1 on vuorovaikutuksessa GRP78 /BiP

Bag-1 on raportoitu välittävän ER-stressi ja vuorovaikutuksessa yhden komponenteista UPS [27], [32], tutkimme onko sitoutuu myös GRP78 /BiP, keskeinen osa ER stressin kautta. Ensin määritetään onko Bag-1 on vuorovaikutuksessa GRP78 /BiP on GST avattavassa määritys käyttäen lysaatti 22Rv.1 syöpäsolujen. Western blot-analyysi käyttämällä GRP78 /BiP spesifistä vasta-ainetta osoitti, että kaikki jäsenet Bag-1 proteiinien perheen kanssa vuorovaikutuksessa GRP78 /BiP (kuvio 1A).

In vivo

vuorovaikutusta on osoitettu myös samanaikainen immunosaostus määritys, jossa Bag-1: n osoitettiin sitoutuvan GRP78 /BiP on 22Rv.1 soluissa (kuvio 1 B). Lisäksi voisimme osoittaa perinuclear lokalisoinnin Bag-1 ja GRP78 /BiP sisään immunofluoresenssianalyysia käyttämällä 22Rv.1 soluja (kuvio 1 C) edellytäkään ER lokalisaatio Bag-1. Tämä havainto vahvistettiin toisessa immunofluoresenssilla kokeessa, jossa voisimme osoittaa rinnakkaispaikantumisen Bag-1 ER tracker (kuva S1).

Voit selvittää toimialueen GRP78 /BiP mukana sen sitoutumiseen Bag-1, me käytetyt GST-fuusiorakenteet kahden tärkeimmän alueen GRP78 /BiP- (ATPaasi ja alustan sitovan domeenin-SBD) (kuvio 1 D) in avattavassa kokeita HEK-293-solut yli-ilmentävät Bag-1. Western blot-analyysi osoitti, että Bag-1 vuorovaikutuksessa ei vain täyspitkä GRP78 /BiP vaan myös sen ATPaasi ja SBD (kuvio 1 E). Kuten Bag-1 on raportoitu sitoutuvan ATP-aasin sidosdomeeniin molekyyli- kaperonin Hsp70 /Hsp70 [39] ja GRP78 /BiP kuuluu tähän perheeseen chaperones [40], meidän havainto, että SBD on GRP78 /BiP sitoo myös Bag-1 on varsin kiehtova ja tunnistaa uutta vuorovaikutusta sivuston Bag-1 molekyyli kaperoni perhe. Siksi käytetään SBD on GRP78 /BiP edelleen luonnehdinta vuorovaikutuksen GRP78 /BiP kanssa Bag-1.

. Bag-1 proteiinien perhe sitoutuu GRP78 /BiP. GST pull-down-määritys suoritettiin inkuboimalla 5 ug kutakin GST-fuusioitu Bag-1-proteiinien kanssa 400 ug 22Rv.1 solulysaatin. Western blotting tietyn antibodiy vastaan ​​GRP78 /BiP käytettiin sitoutumisen havaitsemiseksi ja anti-GST-vasta-ainetta käytettiin määrän määrittämiseksi bakteerissa puhdistetusta proteiinista käytetään määrityksessä. B. Bag-1 ja GRP78 vuorovaikutuksessa

in vivo

. GRP78 immunosaostettiin anti-GRP78 /BiP-vasta-ainetta tai IgG: tä kontrollina 22Rv.1 soluissa. Western blotting anti-Bag-1 ja anti-GRP78-vasta-aine tehtiin sen määrittämiseksi, GRP78-Bag-1 vuorovaikutusta. C. Bag-1 ja GRP78 /BiP osoittavat perinuclear rinnakkaispaikantumisen. Confocal mikroskooppiset analyysit tehtiin 22Rv.1 soluissa, jotka ovat olleet paraformaldehydillä kiinnitettiin ja värjättiin Bag-1-vasta-aineen havaitsemiseksi Bag-1 (vihreä kanava) ja GRP78 /BiP spesifistä vasta-ainetta havaitsemaan GRP78 /BiP (punainen kanava) . Oranssi värjäytymistä yhdistämisen kahden kanavan ilmaisee asteen kolokalisaation kahden proteiinin. Kaikki kuvat (40X) on hankittu Leica TCS SPE -konfokaalimikroskoopilla (Leica Microsystems; Scale palkit osoittavat 25 pm). D. kaaviomainen esitys domeeneista GRP78. E. Bag-1 sitoutuu useita sivustoja GRP78. GST-pull down määritys suoritetaan inkuboimalla 500 ug lysaattia HEK-293-solut transfektoitu HA-tagged Bag-1 ja 10 ug GST-fuusioitu GRP78 täyspitkä ja sen ATPaasi ja alustan sitova domeeni (SBD). Western blot analyysi suoritettiin käyttäen HA-vasta-ainetta havaitsemaan Bag-1-merkitty proteiini. Näkyy on Coomassie sinivärjäyksen bakteerissa puhdistettua GST proteiineja osoittaa yhtä suuri kuormitus GST proteiineista.

GST-pull down analyysit tehtiin kanssa SBD on GRP78 /BiP ja lysaatin HEK293 cell ilmentävät villityypin Bag-1, t-1ΔC47, joka on C-terminaalinen deleetio mutantin tai Bag-1Δ68mer, sisäinen deleetiomutantti. Nämä tutkimukset tunnistaa sisäisen sekvenssin 68 aminohappoja tavoitteeksi vuorovaikutuksen Bag-1 GRP78 /BiP (kuviot 2A ja B). Poistetaan tämä sekvenssin (Bag-1Δ68mer) poisti vuorovaikutus Bag-1 GRP78 /BiP (kuvio 2B kaista 11), kun taas ilmaus 68 aminohapposekvenssin yksinään osoitti, että se on todellakin tarpeen sitomiseksi SBD on GRP78 /BiP ( Kuva 2B kaista 12). Tämä havainto vahvistettiin lisäksi käytettäessä

in vivo

yhteistyössä immunosaostuskokeesta jossa HA-tagged Bag-1-peptidin ilmaistu HEK 293-soluissa vuorovaikutuksessa endogeenisten GRP78 /BiP proteiinia (kuvio 2C kaista 3).

. Kaavamaisesti Bag-1 ja sen häviämämutantteja käytetään tunnistamiseen tarvittavat sekvenssit sitomiseen SBD on GRP78 /BiP. Kuvattu sininen ja punainen ovat ubikitiinipromoottori kaltainen domeeni ja BAG domain vastaavasti. B. tunnistetiedot Bag-1-peptidin sitoutumista GRP78 /BiP. GST-pull down määritys suoritetaan inkuboimalla 500 ug lysaatit HEK-293-solut, jotka on transfektoitu osoitti Bag-1 rakentaa ja 10 ug GST-GRP78 (SBD) tai GST kontrollina. Western blot-analyysi, jossa on HA-vasta havaitsi Bag-1-mutanttien näytetään. Coomassie blue värjäys suoritettiin osoittamaan yhtä suuri kuormitus GST fuusioproteiineja. C. Bag-1 68 aminohapon peptidi sitoo

in vivo

ja GRP78. HEK 293-solut kotransfektoitiin pcDNA-HA-merkitty Bag-1-peptidin. Transfektoituja soluja käsiteltiin 2 mM Ditiobis (sukkinimidyylipropionaatti) silloittaa proteiinit ja solulysaatit immunosaostettiin anti-HA-vasta-ainetta tai IgG: tä kontrollina, jota seurasi Western-blottauksella anti-GRP78 /BiP-vasta-ainetta. D. Bag-1 68 aminohapon peptidi inhiboi GRP78 /BiP uudelleenlaskostumiseen aktiivisuutta.

In vivo

lusiferaasin uudelleenpoimuttamista Määritys suoritettiin HEK-293-solut transfektoitiin 70%: n konfluenssiin 2 ug β-aktiini-fire fly lusiferaasi-konstrukti, 3 ug pcDNA3 tyhjän vektorin, kuten ohjaus- tai pCMV6-GRP78 /Bip, 6 ug osoitti pcDNA3.1-Bag-1 tai mutantti-rakenteet ja 0,5 ug Renilla lusiferaasi konstrukti määrittää transfektion tehokkuutta. Transfektoidut solut jaettiin kahteen. Yksi puoli jätettiin käsittelemättä ja toinen puoli on lämpöshokki 45 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sen jälkeen lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina uudelleenpoimuttamisen aktiivisuuden suhteen ilman lämpöä järkyttynyt solujen ja esitetään pylvästaulukot keskiarvo kolmen erillisen kokeen ± SEM. * P 0,05.

. UPR modulaatio upon Bag-1-peptidin yli-ilmentymisen. Yhdistettiin kloonit 22Rv.1 transfektoitujen solujen pcDNA3.1-HA-Bag-1 68 aminohapon peptidi, tai tyhjä ekspressiovektori käsiteltiin 300 nM thapsigargin (TG) varten ilmoitettuina ajankohtina. Solut hajotettiin ja suoritettiin Western blot-analyysi käyttämällä mainituilla vasta-aineilla tai fosfo-spesifisten vasta-aineiden. B. Bag-1-peptidin herkistää 22Rv.1 solujen ER-stressin aiheuttamaa apoptoosia. Yhdistettiin klooneja 22Rv.1 transfektoitu Bag-1-peptidin tai tyhjän ekspressiovektori käsiteltiin thapsigargin (TG) tai glukoosi-ruokittu (GS) 24 tuntia. Solut hajotettiin ja suoritettiin Western blot-analyysi käyttämällä anti-PARP ja kaspaasi 4 spesifisiä vasta-aineita. Anti-HA-vasta-ainetta käytetään havaitsemaan HA-Bag-1-peptidin. Anti-β-aktiini-vasta-ainetta käytettiin osoittamaan yhtä suuri kuormitus proteiinin näytteitä. C. GRP78 downregulation lisää PARP pilkkominen. Yhdistettiin klooneja 22Rv.1 ilmentävät HA-tagged Bag-1-peptidin tai tyhjän ekspressiovektori transfektoitiin GRP78 /BiP siRNA tai ohjaus GFP siRNA. Solut hajotettiin ja Western blot suoritettiin anti-PARP, anti-GRP78 ja anti-HA-vasta-aineita. β-aktiini vasta-ainetta käytettiin tason määrittämiseksi proteiinin geelin pinnalle.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että GRP78 /BiP yhteistyötä PDI uudelleenpoimuttumisessa denaturoidut proteiinit

in vitro

[ ,,,0],41], [42]. Sen määrittämiseksi, ovatko GRP78 /BiP- myös on kyky taittaa denaturoidut proteiinit

in vivo

, hyväksyimme uudelleenpoimuttamista määritystä käytetään aikaisemmin määrittämään kaperonitoiminta Hsp70

in vivo

[43] Tässä määritys, HEK-293-solut transfektoitiin plasmidilla, joka koodaa lusiferaasigeenin ja ekspressioplasmidin GRP78 /BiP. Solut lyhyesti lämpöshokkikäsittelyssä ja sen jälkeen lusiferaasin aktiivisuus ekspressoivien transfektoitujen solujen GRP78 /BiP verrattiin ei-GRP78 /BiP: ilmentäviä soluja. Tämä tutkimus osoitti, että yli-ilmentyminen GRP78 /BiP merkittävästi parannettu lusiferaasiaktiivisuus jälkeen lämpöshokin (kuvio 2D), jotka osoittavat kykyä GRP78 /BiP poimuttuvan denaturoituun lusiferaasi

in vivo

. Jos solut transfektoitiin lisäksi Bag-1 tai 68 aminohappo Bag-1-peptidi, joka sitoutuu GRP78 /BiP, uudelleenpoimuttava aktiivisuus GRP78 /BiP alennettiin ohjaus- tasolle (kuvio 2D). Tämä ei pidä paikkaansa, kun pussista 1Δ68mer joka ei sitoudu GRP78 /BiP kotransfektoitiin. Nämä tutkimukset osoittavat, että Bag-1 peptidi häiritsee uudelleenpoimuttumisen aktiivisuutta GRP78 /BiP. Kuitenkin Bag-1 peptidi ei ollut mitään vaikutusta ATPaasi-aktiviteettia GRP78 /BiP vaikka Bag-1 kasvoi tämän entsymaattisen aktiivisuuden (kuviot S2A ja S2B). Tämä osoittaa, että Bag-1-peptidin toimii eri tavalla kuin täyspitkä Bag-1. Siksi aloitti luonnehdinta tämän peptidin ligandina GRP78 /BiP tulevaa terapeuttista käyttöä.

. Vakaa kloonit 22Rv.1 soluilla alentunut solujen elinkelpoisuuden

in vitro

. Stabiilien kloonien ympättiin 96-kuoppalevylle, ja solujen lukumäärä kussakin kuopassa arvioitiin mittaamalla suhde aallonpituudella viritys- ja emissio 560/590 nm: ssä käyttämällä CellTiter-Blue ™ lisääntymisen määritys. Palkki kaaviot edustavat keskiarvoa vähintään neljän itsenäisen kokeen ± SD (* p 0,05). B. määrittäminen tason Bag-1 ilmentyy 22Rv.1 klooneja. Solu-uutteet ja 22v.1 stabiilien kloonien tehtiin Western blot -analyysi. Anti-HA-vasta-ainetta käytetään havaitsemaan peptidin ja anti-β-aktiini-vasta-aineen yhtä suuri kuormituksen valvonta. CD. Bag-1 peptidi vähentää 22Rv.1 eturauhaskasvainsolun kasvu

in vivo

. Kuusiviikkoisilla kateenkorvattomia nude-hiiriin ruiskutettiin ihon alle molempiin kylkiin kanssa 5 x 10

6 solua jokaisen vakaa klooni. Kasvaimen koko mitattiin kerran viikossa käyttäen paksuus ja ilmaistaan ​​kasvaimen tilavuuden mm

3. On esitetty (C) kasvainten tilavuuden kloonien transfektoitu tyhjällä ekspressiovektorilla ja (D) ilmentävien kloonien Bag-1-peptidin. Jokainen piste edustaa keskimääräinen tilavuus ja keskihajonta vähintään 5-10 kasvaimia. E. Ksenograftien stabiilien ilmentävien Bag-1-peptidin osoittavat lisääntynyttä apoptoosia. Viiden mikronin leikkeitä, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kasvaimen kudokset altistettiin immunohistokemiallisesti. Ytimien värjätään blue-violetti hematoksyliinillä samalla apoptoottisia soluja havaittiin TUNEL määrityksen värjätään ruskea. Edustavia osat ksenograftien saatu kustakin 22Rv.1 vakaa klooni hankittiin kanssa Axioscop mikroskoopilla (Zeiss). V: sanoista tyhjän vektorin ilmentävän kloonin ja P: peptidi ilmentävän kloonin.

hyötykäyttö a Bag-1 peptidi apoptoosin ja vähentää Eturauhassyöpä Cell Growth

aikana ER stressi, taittamista peptidejä kerääntyvät ER ja GRP78 /BiP on keskeinen rooli säätää proteiinilaskostumisen kapasiteettia aktivoimalla kolme signalointireittejä (PERK, IRE1α, ja ATF6) [44], [45]. PERK on autofosforyloidun johtaa fosforylaatioon alfa-alayksikön eIF2 ja proteiinisynteesiä sulkemisen. Fosforyloitua eIF2α selektiivisesti parantaa käännös transkriptiotekijän ATF4, joka lisää UPR kohdegeenin ilmentymisen, kuten GRP78 /BiP [44], [45], ja IRE1α on myös autofosforyloidun johtaa aktivaatioon kaperonia synteesin kautta Xbp1 aktivointi. ATF6 pilkkoutuu proteolyyttisesti osallistua säätely ilmentymisen UPR kohdegeenien [44], [45]. Kuitenkin apoptoosin aiheutetaan jos homoeostasis ei voida todeta [46]. Siksi määritettävä, sitoutumisen Bag-1-peptidin GRP78 /BiP, keskeinen osa ER stressiä, vaikuttaa signalointi polkuja UPR.

. Kaavakuva Bag-1-peptidin ja sen deleetiomutanttien. Ubikitiinipromoottori kaltainen domeeni on edustettuna sinisellä ja BAG toimialueen punaisella. Numerot viittaavat aminohappoasemat eri aloilla. Aminohappotähteet on numeroitu jälkeen numerointi Bag-1L. B. Prediction sekundäärisen rakenteen Bag-1-peptidin, jossa oli N-terminaalinen β-hiusneula päässä ubikitiini-kaltaisen domeenin (sininen), ja C-terminaalisen α-heliksin BAG-domain (punainen). C. Normalized Sirkulaaridikroismispektrit pussin-1-peptidejä. 30 uM Bag-1-peptidin mitattiin 20 mM KHPO

4-puskuria, pH 6,8 (musta viiva). Sen α-kierteisen pitoisuus arvioitiin olevan noin 25% dekonvoluution spektrejä (punainen viiva). 12 uM N-termi peptidi (vihreä viiva) ja 11 uM C aikavälin (sininen viiva) mitattiin samoissa olosuhteissa. D.

1 H

15N-HSQC NMR-spektri

15N-leimattu Bag-1 peptidi (202-269) 20 mm KHPO

4 puskurissa, pH 6,8, 23 ° C: ssa. Kapea spektrin hajonta osoittaa, että peptidi ei ilmene taitettu pallomainen rakenne. H

δ ja H

ε sivuketjun signaaleja asparagiini ja glutamiini on yhdistetty ohuita viivoja. E. N-terminaalinen alue Bag-1 peptidi on tärkeä GRP78 sitoutumisen. (* P 0,05). * P 0,05.