Krooninen sairaus

tiivistelmä

LCRMP-1, uusi isoformi CRMP-1, voi edistää syöpäsolujen muuttoliike, invaasio ja liittävät huono kliiniseen tulokseen potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Kuitenkin taustalla sääntelyn mekanismeja LCRMP-1 syöpäsolun invasiivisuus edelleen epäselviä. Täällä me raportoimme että GSK3p voivat fosforyloida LCRMP-1 Thr-628 konsensus sekvenssit ja tämä fosforylaatio on ratkaiseva tehtävä LCRMP-1 edistää filopodia muodostumista, muuttoliikkeen ja invaasion syöpäsoluissa. Estymiseen Thr-628 fosforylaatio vaimentaa stimuloivia vaikutuksia LCRMP-1 filopodia muodostavien, muuttoliike ja invaasio kyvyt syöpäsoluissa; samanaikaisesti, kinaasi-kuollut GSK3p vähentää sääntelyä LCRMP-1 syöpäsoluinvaasiota. Lisäksi olemme havainneet, että potilailla, joilla on matala-Ser-9-fosforyloitu GSK3p ilmaisun ja korkean tason LCRMP-1 ilmentymisen on huonompi kokonaiselossaoloaikaa kuin korkean tason aktiivinen GSK3p ilmaisuja ja matalan tason LCRMP-1 ilmaisuja (P 0,0001). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että GSK3p-riippuvainen fosforylaatio LCRMP-1 on tärkeä mekanismi sääntelyä LCRMP-1 syöpäsolujen invasiivisuus ja kliiniseen tulokseen.

Citation: Wang WL, Hong TM, Chang YL, Wu CT, Pan SH, Yang PC (2012) fosforylaatio LCRMP-1 GSK3p Edistää Filopoda Formation, Migration and Invasion kyvyt Keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 7 (2): e31689. doi: 10,1371 /journal.pone.0031689

Editor: Adam I. Marcus, Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu 15 joulukuuta 2011; Hyväksytty: 11 tammikuu 2012; Julkaistu: 21 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Science (NSC 98-2628-B-002-086-MY3, NSC100-3112-B-006-005, ja NSC100-2321-B-002-071). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäke vaikuttaa hoidon epäonnistumiseen, ja kuoleman suurimmalle osalla syöpäpotilaita [1]. Kapasiteetti syöpäsolujen progressiivinen etäpesäke ohjataan monimutkainen solun prosesseja, joihin liittyy microenvironmental muutokset, kasvava kyky solumigraation tai invaasio, useita geneettisiä tapahtumia ja sääntelyyn tekijöistä. Tähän asti monet master indusoijat ja vaimentimet syövän etäpesäkkeiden on todettu olevan mukana näissä prosesseissa, ja näin purkautumassa ylävirran säätelyreittejä näiden proteiinien voivat helpottaa kuvaa yksityiskohtaisia ​​molekyylitason mekanismeja syövän etäpesäkkeiden [2].

glykogeenin taasikinaasi-3β (GSK3p) tunnetaan moniajoon seriini /treoniini-kinaasi, jotka kontrolloivat useat solun prosesseja kuten glykogeenin aineenvaihduntaan, solujen erilaistuminen, apoptoosi, solun tukirangan uudelleenjärjestely, solusyklin säätelyssä, ja solujen lisääntymistä [3], [4]. GSK3p säätelee monenlaisia ​​substraatteja fosforylaation kautta optimaalisen konsensusmotiiveja (Ser /Thr-X-X-X-Ser /Thr, jossa X edustaa mitä tahansa aminohappoa) [3], [5]. Yleensä yleisin substraatteja GSK3p tarvitsevat tietyn pohjustus kinaasia tehokkuuden lisäämiseksi ensimmäinen fosforylaatio seriini- tai treoniinitähde, että lähellä on neljä jäännöstä GSK3p: n fosforylaation sivuston karboksyylipään. Esimerkiksi kaseiinikinaasi 1 ennen alkulukuja β-kateniinin ja GSK3p fosforylaatioon [6], ja kaseiinikinaasi 2 on pohjustus kinaasi glykogeenisyntaasiaktiivisuuden [7].

kollapsiini vastaus sovittelija proteiini-1 (CRMP-1) estää hermosolujen kasvun kartio laajennus kehityksen aikana, ja se tunnetaan myös syövän invaasio vaimennin [8], [9]. Viime aikoina olemme tunnistaneet uuden isoformin CRMP-1, pitkää muotoa CRMP-1 (LCRMP-1) [10]. LCRMP-1 voi edistää filopodia muodostumista, syöpäsolujen muuttoliike, invaasion kautta toiminnallisesti vastaan ​​CRMP-1, ja sen ilme korreloi huonoon kliiniseen tulokseen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla. LCRMP-1 ja CRMP-1 satamissa identtinen C-pään sekvenssit eksonista-2 eksoni-14; kuitenkin, N-terminaalinen eksoni-1 sekvenssi LCRMP-1 on erillinen kanssa, CRMP-1 [11]. Niistä ihmisen CRMP perhe, aminohapposekvenssiä CRMP-2 on 78% ja 76% identiteetti CRMP-1 ja CRMP-3, vastaavasti [12]. Aiemmin CRMP-2 on raportoitu fosforyloida GSK3p: n on Thr-514, ja joka liittyy haittaavaa hermosolujen polarisaatio [13]. Varsinkin CRMP-1 ja CRMP-3 näytti hyvin samankaltainen GSK3p fosforylaatio konsensusyksiköitä kanssa CRMP-2 [14]. Yhdenmukainen CRMP-1, LCRMP-1 sisältää myös sama motiivi GSK3p fosforylaatiota.

Koska LCRMP-1 ja CRMP-1 on päinvastainen toiminto syövästä muuttoliikettä ja invaasio, onko toiminta LCRMP-1 voidaan säännellä by GSK3p pitäisi tutkia tarkemmin. Esillä olevassa raportissa, tutkimme mahdolliset sääntelyn GSK3p on LCRMP-1. Täällä, osoitimme, että GSK3p voivat fosforyloida LCRMP-1 ja moduloivat filopodia muodostumista, syöpä solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Olemme edelleen vahvistamaan GSK3p-fosforyloidun sivusto LCRMP-1, tutkia sen toiminta solujen invasiivisuus ja arvioida sen kliinistä merkitystä pienisoluista keuhkosyöpää.

Tulokset

GSK3p voi fosforyloida LCRMP-1 Thr 628

ennustaa, onko klassisen GSK3p fosforylaatio konsensus sekvenssit olemassa LCRMP-1, ensin linjassa proteiinisekvenssien keskuudessa CRMP-2, CRMP-1, ja LCRMP-1 (Fig. 1A). Edellinen tutkimus osoitti, että Cdk5 on pohjustus kinaasi, joka fosforyloi CRMP-2 at Ser-522, seuraavaa fosforylaatiota CRMP-2 at Thr-514 GSK3p ja johtaen toiminnallisen sääntelyn hermosolujen polarisaatio [13]. Näin ollen, olemme havainneet, että proteiinisekvenssien LCRMP-1 sisälsi erittäin yhdenmukainen Cdk5 ja GSK3p fosforylaatio aihe, näin me arveltu, että suuret mahdollisuudet fosforylaation sivusto LCRMP-1 sijaitsee Thr-628 (Fig. 1A). Sen tutkimiseksi, onko LCRMP-1 voidaan fosforyloida GSK3p, HEK293T-solut kotransfektoitiin villityypin Flag-merkityn LCRMP-1 (WT), kun läsnä on tyhjän vektorin, villityypin GSK3p (WT), konstitutiivisesti aktiivista GSK3p (CA) tai kinaasi-kuollut GSK3p (KD). Expression of GSK3p (CA) on selvemmin havaittiin liikkuvuuden siirtymät (nuolenpäät) sekä LCRMP-1 (WT) kuin GSK3p (WT) (Fig. 1 B, kaista 2 ja 3). Kuitenkin hitaasti muuttoliike ylänauhastojen oli täysin kadonnut soluissa, jotka ilmentävät kinaasi-puutosta muoto GSK3p (KD) (Fig. 1 B, kaista 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että LCRMP-1 on substraatti GSK3p: n ja hitaasti vaeltavat bändejä johtuivat sen fosforylaatio

in vivo

.

(A) proteiini-sekvenssin analyysi osoitti, että mahdolliset konsensus sivuston LCRMP- 1 varten fosforylaation GSK3p. Proteiini sekvenssit rinnastetaan keskuudessa CRMP2, CRMP-1, ja LCRMP-1. Numerot edustavat aminohappoa sivustoja ja alleviivaus esittää mahdollisen fosforylaatio sivusto Cdk5. (B) GSK3p fosforyloi LCRMP-1 (WT)

in vivo

. HEK293T solut kotransfektoitiin Flag-merkittyä LCRMP-1 ja erillisiä aktiivisuus Flag-merkittyjen GSK3p (WT, CA ja KD muoto). Sama määrä transfektoitiin kaikissa olosuhteissa käyttäen tyhjiä vektoreita. Solut hajotettiin 30 tuntia transfektion ja proteiinia uutteet analysoitiin immunoblottauksella anti-Flag-vasta-aineita. (C) GSK3p fosforyloi LCRMP-1 (WT) at Thr-628

in vivo

. CL1-0 solut kotransfektoitiin joko Flag-merkityn LCRMP-1 (WT) tai LCRMP-1 (T628A, T628D) mutanttien läsnä ollessa tai ilman erillisiä aktiivisuuden Flag-merkityn GSK3p (CA ja KD muodossa). Tyhjät vektoreita käytettiin täydentää yhtä paljon plasmidien transfektioanalyysissä. Solulysaatit kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja analysoitiin immunoblottauksella anti-Flag ja anti-β-aktiini-vasta-aineita.

Seuraavaksi, onko GSK3p: n fosforyloi LCRMP-1 Thr-628

in vivo

, joka on fosforyloimattomia LCRMP-1-mutantti tuotettiin korvaamalla Thr-628 Ala (T628A). CL1-0 solut kotransfektoitiin LCRMP-1 (WT) tai LCRMP-1 (T628A) fosforyloimattomia mutantin läsnä ollessa joko tyhjän vektorin, GSK3p (CA), tai GSK3p: n (KD). Yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen, GSK3p (CA) ja GSK3p (KD) on osoittautunut näyttää band shift ja ei-band shift (nuolenpäät) of LCRMP-1, tässä järjestyksessä (kuva. 1C, kaista 2 ja 3). Varsinkin LCRMP-1 (T628A) oli resistentti GSK3p (CA) aktiivisuutta ja siirretyn juovat lähes lakkautettiin (Fig. 1 C, kaista 4). Tämä tulos oli samanlainen kuin olosuhteet LCRMP-1 (WT) sekä GSK3p: n (KD) (Fig. 1 C, kaista 3 ja 4), ja lisäksi vahvistaa, että GSK3p todellakin fosforyloitua LCRMP-1 Thr-628 tähdettä. Yhdessä kaikki nämä tulokset osoittivat, että LCRMP-1 oli nimenomaan fosforyloitiin Thr-628 by GSK3p

in vivo

.

Thr-628 fosforylaation LCRMP-1 vaaditaan syöpäsoluinvaasiota, muuttoliike ja filopodia muodostuminen

meidän nykyisessä raporteissa, olemme havainneet, että villin tyypin LCRMP-1 tehostaa filopodia muodostumista, ja edistää solujen maahanmuuton ja hyökkäyksen noninvasive ihmisen keuhkosyövän solulinjat [10]. Koska LCRMP-1 voidaan fosforyloitu Thr-628 by GSK3p, me seuraavaksi epäilivät toiminta LCRMP-1 voidaan säännellä tällä fosforylaatio. Tilanteen korjaamiseksi olemme tuotti sarjan lentivirus jotka ilmentävät GFP (valvonta), ei-merkittyä LCRMP-1 (WT), LCRMP-1 (T628A), tai LCRMP-1 (T628D), ja transdusoitiin ne matalan invasiivisia CL1 -0 keuhkosyövän soluja, jotka ilmentävät alhainen endogeenisen LCRMP-1 [11]. Proteiinin ilmentyminen villin tyypin tai mutantti-LCRMP-1 vahvistettiin immunoblottauksella-analyysillä käyttämällä anti-LCRMP-1-vasta-aineita (Fig. 2A). Näitä soluja käytettiin sitten tutkia kykyä soluinvaasion. Kuten odotettua, LCRMP-1 (WT) yli-ilmentymisen osaltaan lisääntynyt solujen invasiivisuus verrattuna GFP-ohjaus (Fig. 2B). Kuitenkin, T628A fosforyloimattomia mutantti LCRMP-1 on suuresti vähentynyt solun invasiivisuus (Fig. 2B). Toisaalta, fosfo-matkivat LCRMP-1 (T628D), jonka odotettiin jäljitellä fosforyloitua muotoa, tehostunut invaasio kyky samanlainen kuin villityypin LCRMP-1 (WT). Tutkimaan edelleen vaikutusta Thr-628 fosforylaation LCRMP-1 ilme CL1-0 solun liikkuvuus, suoritimme video nopeutus mikroskopia määritys seurata liikkuvia kappaleita vähintään 10 yksittäistä solua yli 20 tunnin aikana. Lentivirus-transdusoidut CL1-0 soluja, jotka ilmentävät GFP-LCRMP-1 (WT) tai GFP-LCRMP-1 (T628D) lisääntyi sekä vaellusetäisyydet ja vaellusnopeus verrattuna GFP-vektorilla (kuvio. 2C, D ja E). Kuitenkin, GFP-LCRMP-1 (T628A) osoitti selvästi puristus etäisyyden ja vaellus- nopeuden (Fig. 2C, D ja E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että fosforylaatio LCRMP-1 Thr-628 on edellytys solun invasiivisuus ja migraatiota.

(A) Protein ekspressiotasot eksogeenisen korvamerkittöminä LCRMP-1 (WT), LCRMP-1 (T628A ), ja LCRMP-1 (T628D) vahvistaa immunoblottauksella. Sen jälkeen kun 48 tuntia lentivirus infektion, CL1-0 solut, jotka ekspressoivat stabiilisti villityypin ja mutantti LCRMP-1. Lentivirukselle ilmentävät GFP toimi kontrollina. Solulysaatit kerättiin sen jälkeen arvioimalla immuno- käyttäen anti-LCRMP-1-vasta-aine ja anti-β-aktiini-vasta-aineita. (B) fosforyloimattomia LCRMP-1 (T628A) mutantti alentaa aktiivisuutta soluinvaasiota. Invasiivista kapasiteetti näiden solujen määritettiin modifioidun Boyden kammiot invaasiomääritys

in vitro

. Prosenttiosuus invasiivisen kyvyn normalisoitiin GFP valvontaa. Tietoja on esitetty keskiarvoina ± SEM kolmelle-itsenäisestä kokeesta (n = 3). (C) fosforyloimattomia LCRMP-1 (T628A) mutantti suuresti tukahdutetaan solujen vaeltamiseen kappaleita. Tract koealojen osoitti CL1-0 soluja, jotka ekspressoivat GFP: tä, GFP-LCRMP-1 (WT), GFP-LCRMP-1 (T628A), GFP-LCRMP-1 (T628D), vastaavasti. Moving kappaleita vähintään 10 edustajan solua lähtöpisteessä valmiina ”0,0” yli 20 tuntia (eri riviä) osoitti edustaja motiliteettia soluja. Mittakaava, 100 pm. (D, E) Total vaellusetäisyydet (D) ja solujen vaellusnopeus (E) kvantitoitiin solusta seuranta määritys 20 tuntia. Tulokset esitettiin keskiarvo ± SEM.

Seuraavaksi tarkastellaan lähemmin vaikutuksia GSK3p on LCRMP-1 indusoi filopodia muodostumista. CL1-0 soluja transfektoitiin ohimenevästi GFP-ohjaus, GFP-LCRMP-1 (WT), GFP-LCRMP-1 (T628A) tai GFP-LCRMP-1 (T628D) ja seuraavat värjäämällä aktiini käyttäen rodamiinikonjugoitu phalloidin. Yhdenmukainen nykyinen raporttien, immunofluoresenssilla analyysi paljasti, että määrä filopodia joka indusoi kohdunulkoinen ilmaisu GFP-LCRMP-1 (WT) in CL1-0 soluja enemmän kuin GFP vektorisäädön. Toisaalta, numerot filopodia muodostuminen oli ilmeisesti heikennettyjä soluja, jotka ekspressoivat fosforyloimattomia mutantti GFP-LCRMP-1 (T628A) (Fig. 3A, 3B, p 0,0001). Lisäksi, GFP-LCRMP-1 (T628D) indusoitui myös lisää filopodia, että samanlainen GFP-LCRMP-1 (WT), (Fig. 3A, 3B, p 0,0001). Nämä tulokset osoittivat, että fosforylaatio LCRMP-1 Thr-628 on ratkaisevaa filopodia muodostumista.

(A) fosforyloimattomia LCRMP-1 (T628A) mutantti heikentää filopodia muodostumista. CL1-0 soluja transfektoitiin ohimenevästi GFP-merkittyjä LCRMP-1 (WT), LCRMP-1 (T628A), ja LCRMP-1 (T628D). 24 tunnin transfektion jälkeen nämä solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja sitten immunovärjättiin rodamiinikonjugoitu phalloidin (punainen) aktiinin ja DAPI (sininen) visualisointiin ytimeksi. Edustavia immunofluoresenssilla kuvat visualisoitiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Asteikko bar, 10 mikrometriä. Sisäkkeet osoittavat suurennettava (400 x). (B) numerot filopodia laskettiin ainakin kuusi solua per ryhmä. Tulokset esitettiin keskiarvo ± SEM.

GSK3p: n fosforyloi LCRMP-1 ja moduloi syöpäsoluinvaasiota

edelleen havaita vaikutuksia GSK3p on LCRMP-1 (WT) aiheuttaman syövän soluinvaasiota, lentivirus ilmentävät GFP ohjaus, GSK3p (WT), GSK3p (CA), tai GSK3p (KD) infektoitiin CL1-0 /LCRMP-1 yliekspressio soluissa (linjat 1015 ja 1003), jotka on aiemmin osoitettu voimakkaasti indusoivien solujen invasiivisuus [10]. Vastaa meidän aiempia havaintoja (Fig. 1 B ja C), immunoblotting-analyysi osoitti, että GSK3p (CA) indusoi LCRMP-1 siirtynyt kaistalla verrattuna GFP-ohjaus (Fig. 4A, kaista 1 ja 3, kaista 5 ja 7), mutta ei-siirtynyt bändi havaittiin GSK3p (KD) (Fig. 4A, kaista 4 ja kaista 8). Joka perustuu edellä mainituissa olosuhteissa, tulokset invaasiomääritys myös osoitettu, että GSK3p (CA) -introduced CL1-0 /LCRMP-1-soluja (1015) voi edelleen edistää solujen invaasio kontrollisoluihin verrattuna (Kuva. 4B). Kuitenkin GSK3p (KD) -introduced soluihin johti vähentynyt hyökkäys kyky (Fig. 4B). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että GSK3p saattaa moduloida LCRMP-1-aktiivisuuden kautta fosforylaatio riippuvalla tavalla hallita syöpäsoluinvaasiota.

(A) Lentivirus ilmaistuna GFP-ohjaus, myc-merkitty GSK3p (WT), GSK3p ( CA), tai GSK3p (KD) in CL1-0 /LCRMP-1 (WT) yliekspressio soluissa (1015 ja 1003). 48 tunnin kuluttua infektiosta, nämä solut lyysattiin ja suoritettiin immunoblottaus-analyysi käyttäen anti-Flag, anti-Myc ja anti-β-aktiini-vasta-aineita. (B) GSK3p toiminta vaikuttaa LCRMP-1 aiheuttama syöpäsoluinvaasiota. CL1-0 /LCRMP-1 yli-ilmentymisen soluissa (1015) infektoitiin lentiviruksen ilmentävät GFP-ohjaus, myc-merkitty GSK3p (CA) tai GSK3p: n (KD). 48 tunnin kuluttua infektion jälkeen, nämä solut altistettiin modifioidun Boyden kammioiden invaasiomääritys

in vitro

. Normalisoinnin GFP-ohjaus toimi prosentteina invasiivisen kyvyn.

Alhainen ilmentyminen toimeton GSK3 # ja korkea ilmentyminen LCRMP-1 korreloi huonoon eloonjäämisaste NSCLC potilaiden

Vaikka tulokset johdonmukaisesti ehdotti, että toiminta LCRMP-1 voitiin säädellä GSK3p fosforylaatio, tällaiset tutkimukset eivät täysin vastaa kliinistä maligniteetti. Niinpä laajensimme analyysiä tarkastelemalla inaktiivinen muoto GSK3p ja LCRMP-1-proteiinin ekspressiotasot kasvain näytteet 142 NSCLC potilaiden. Kliiniset ominaisuudet näiden potilaiden on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Sarja osia kunkin yksilön värjättiin vasta-aineilla LCRMP-1 ja Ser-9-fosforyloitiin GSK3p ilmoitettu tilan inaktiivisessa muodossa GSK3p johtuen Akt-aktivaatio, joka johtaa tukahduttaminen GSK3p toiminnan kautta fosforylaation Ser-9 [15]. Tuloksemme osoittivat tyypillisiä värjäytymisen LCRMP-1 ja Ser-9-fosforyloitu GSK3p in potilaan näytteestä (Kuva. 5A). Yhdenmukainen aiempien raporttien korkean tason LCRMP-1 oli merkitsevästi huono kokonaiseloonjääminen verrattuna matalan tason LCRMP-1 potilailla, joilla on NSCLC [10], [11]. Erityisesti analyysi yhdistetty vaikutus molempien proteiinien potilaiden ennusteita paljasti, että potilailla, joilla on matalan tason ilmentymistä inaktiivinen muoto GSK3 # ja korkean tason ilmentymisen LCRMP-1 oli huonompi kokonaiselossaoloaikaa kuin korkean tason inaktiivinen muoto GSK3p ilmaisun ja matalan tason LCRMP-1 ilmentymisen (Fig. 5B, p 0,00001). Monimuuttujalähettimet Coxin suhteellisen vaarat regressioanalyysisarjoissa, jossa on portaittain valinta malli, olivat läsnä arvioida yhdistysten useiden riippumattomien ennustetekijöiden kanssa elossaololuku (taulukko 2). Nämä tulokset viittaavat siihen, että suuri aktiivisuus GSK3p ja korkean tason LCRMP-1, mahdollisesti matkien fosforyloidun tilan LCRMP-1, liittyy yhä syövän invasiivisuus ja huonompi kokonaiselossaolo.

(A) Tyypillinen proteiinin ilmentyminen malleja fosforyloituu GSK3p ja LCRMP-1 havaittiin immunohistokemiallisesti käyttäen anti-fosfo-GSK3p (Ser9) ja anti-LCRMP-1-vasta-aineita (C2) sarjaan dissections primaarituumorin näytteitä 142 NSCLC potilasta joille tehtiin kirurginen asemointia. Tulokset esitetään + ja – tarkoittaa kasvaimia ja ilman yli-ilmentymisen osoitetun proteiinin vastaavasti. Mittaviivat 100 pm. p-GSK3p edusti fosforyloidulle GSK3p. (B) Kaplan-Meier-analyysi kokonaiselinaika varten 142 pienisoluista keuhkosyöpää p-GSK3p

– LCRMP-1

-, p-GSK3p

– LCRMP-1

+, p-GSK3p

+ – LCRMP-1

-, ja p-GSK3p

+ – LCRMP-1

+.

P

arvot suoritettiin 2-puolinen log-rank testejä.

Keskustelu

Tutkimuksemme ensisijaisesti tutkittiin sääntelymekanismiin post -KÄÄNTÄMIS- muutos, joka liittyy syövän solujen vaeltamiseen ja invasiivisuuden LCRMP-1. Täällä, osoitimme, että GSK3p-riippuvainen fosforylaatio LCRMP-1 säätelee positiivisesti filopodia muodostumista, muuttoliikkeen ja syöpäsoluinvaasiota. Pohjalta GSK3p-fosforyloitu konsensusmotiiveja, Thr-628 aminohappotähteen LCRMP-1 on master fosforylaatio sivuston GSK3p: n (Fig. 1). Substituutio Thr-628 Ala LCRMP-1 johtanut heikentää filopodia muodostumista, muuttoliikkeen ja syöpäsoluinvaasiota, kun taas korvaaminen Thr-628 Asp suuresti palauttaa sen toiminta (Fig. 2 ja 3). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, ektooppinen ilmentyminen kinaasi-dead GSK3p vähentynyt LCRMP-1 aiheuttama invasiivisen kyky (Fig. 4). Lisäksi kliininen pienisoluista keuhkosyöpää matalan tason aktiivinen GSK3 # ja korkean tason LCRMP-1-proteiinin ilmentyminen liittyy huono kokonaiselossaoloaikaa kuin korkean tason inaktiivinen muoto GSK3p ilmaisua ja matalan tason LCRMP-1 ilmentymisen (Fig. 5B) . Siten tuloksemme tarjota todisteita ratkaiseva mekanismi GSK3p-riippuvaisen fosforylaation valvoa LCRMP-1-välitteisen filopodia muodostumista, muuttoliikkeen ja invasiivisen kyvyt syöpäsoluissa.

sekvenssianalyysi osoitti, että on Cdk5 ( pohjustus kinaasi) fosforylaation päällä molemmissa LCRMP-1 ja CRMP-1 (Fig. 1A). Sen jälkeen fosforylaation Ser-636 by Cdk5, GSK3p vuorostaan ​​fosforyloi Ser-632 ja Thr-628 peräkkäin. Siksi GSK3p saattaa aiheuttaa hitaammin vaeltavat bändejä LCRMP-1 sisältää sekä Ser-632 ja Thr-628 fosforylaation soluissa, ja bändit aiheuttama konstitutiivisesti aktiivinen GSK3p olivat aktiivisempia kuin villityypin GSK3p (Fig. 1 B). Vuonna yksityiskohtainen analyysi, huomasimme, että LCRMP-1-mutantin, T628A, voivat estää useimmat GSK3p fosforylaation aiheuttama vaeltavat bändejä (Fig. 1 C). Tämä saattaa tarkoittaa, että Thr-628 LCRMP-1 saattaa olla hallitseva ja tärkeä fosforylaatio sivuston GSK3p: fosforylaatiota. Emme kuitenkaan voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että konstitutiivisesti aktiivinen GSK3p voi fosforyloida muita sivustoja LCRMP-1.

Prosessi kasvain invaasio on lähinnä alternations soluväliaineen myös aktiini polymerointi ja filopodia muodostumisen [16]. Meidän havainnot osoittavat, että tukos GSK3p-välitteisen fosforylaation LCRMP-1 Thr-628 johtaa taantumisen filopodia muodostumista. Aiempi raportti kuvattiin, että GSK-3 fosforylaation varten paksilliini on välttämätön solun tukirangan uudelleenjärjestely [17]. Niinpä spekuloida, että GSK3p saattaa positiivisesti edistää sääntelyn aktiinisytoskeletonin ja kasvaimen invaasio. Toisin kuin positiivisesti rooli, GSK3p on myös raportoitu sopivan sen ehkäisevästä rooleja sen alustoille [18]. GSK3p fosforylaatio joidenkin ydinvoiman transkriptiotekijöitä, kuten β-kateniinin ja Snail, laukaista proteasomaalisten hajoaminen, seuraa tukahduttaminen on epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja kasvaimen invaasio [6], [19] – [21]. GSK3p samanaikaisesti paikantuu sytoplasmassa ja tumassa [22], kuten vastaa meidän tulokset immunohistokemiallisella värjäyksellä (kuvio. 5A), ja LCRMP-1 on vakaa sytosoliproteiiniin [10]. Siksi GSK3p säätelevät solujen invaasio on mahdollisesti riippuu luonnehdinta sen proteiinin substraatteja. Korkean tason LCRMP-1 ilmentyminen liittyy yleensä ottaen heikkoa ja taudista vapaan eloonjäämisen verrattuna heikkoa ilmentymistä ryhmään pienisoluista keuhkosyöpää [10], [11]. Siten LCRMP-1 potentiaalisesti toimii paras ehdokas tunnistaa korkean riskin potilailla. Tässä tutkimuksessa osoitimme hyvin mielenkiintoinen havainto, että potilailla, joilla on matalan tason fosforyloidun GSK3p ja korkean tason LCRMP-1 ilmaisuja oli huonompi eloonjäämiseen kuin muut ryhmät. Keskittyminen matalan tason LCRMP-1 ilmentymisen tai korkean tason LCRMP-1 ilmentymisen ryhmässä, voisimme myös havaittu, että korkean tason fosforyloidun GSK3p ilmentyminen voi syrjiä parempi lopputulos matalan tason fosforyloidun GSK3p ilme, vastaavasti. Yhdistetyt vaikutukset inaktiivinen muoto GSK3 # ja LCRMP-1-proteiinin ilmentyminen voi olla tärkeitä kliinisiä osoittamaan korkean riskin alaryhmässä NSCLC potilaiden ehdokkaiksi ylimääräisiä tehokkaita adjuvanttihoito. Tulokset viittaavat siihen, että GSK3p fosforylaatio LCRMP-1 on yhteydessä huonoon kliiniseen tulokseen. Kuitenkin vielä joitakin rajoituksia kokeissa. Vaikka viittaus osoitti, että Ser-9-fosforyloitiin GSK3p voi osoittaa tilan inaktiivisessa muodossa GSK3p johtuen Akt aktivaatiota, joka johtaa tukahduttamiseen GSK3p toiminnan kautta fosforylaation Ser-9 [15], onko Ser-9 fosforylaatio GSK3p: estää sen kyky fosforyloida LCRMP-1 ei vielä ole selvä. Tämän ongelman ratkaisemiseksi, tuottaa erityinen anti-fosfo-Thr-628 LCRMP-1 vasta-aine immunohistokemia pitäisi olla tärkeimpiä kysymyksiä tulevaisuudessa. Tämä voi vahvistaa kliinistä merkitystä GSK3p aiheuttama fosforylaation LCRMP-1 in pienisoluista keuhkosyöpää.

Lisäksi olemme myös havainneet, että potilailla, joilla on matala-tasolla (n = 73) tai korkean tason (n = 69) Ser-9-fosforyloitiin GSK3p ilmentyminen oli lähes yhtä jakelussa. Solut olemassa eri nykyisten tasojen aktiivisten GSK3p ellei erillistä signalointireitteihin estämiseen GSK3p käynnistyvät samanaikaisesti, kuten MAPK ja fosfatidyyli-3-OH-kinaasi /Akt reitit [20]. Niinpä spekuloida, että erillisiä aktivoitu laajuus signalointireiteissä indusoimaan eston GSK3p toiminta voi johtaa erilaiseen lopputulokseen potilailla, joilla LCRMP-1 ilme. Siksi tutkia tarkemmin vastavirtaan signalointireitille säätelyyn GSK3p saattaa tarjota paremman diagnoosin pienisoluista keuhkosyöpää matalan tason tai korkean tason LCRMP-1 ilmentymisen.

Yhteenvetona osoitamme uuden sääntelyn mekanismi GSK3p: fosfory- hyökkäys tehostajana LCRMP-1 ja täten voisi lisähienosäätöä syöpäsoluinvaasiota kykyjä. Lisäksi LCRMP-1 ilmentymisen ja Ser-9-fosforyloitiin GSK3p: n tasoja voi olla kliinistä merkitystä tuloksissa ennustaminen potilaiden NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimus oli hyväksynyt Institutional Review Board of National Taiwan University Hospital ja saatu tietoisen kirjallisen suostumuksen lausunnon kaikilta osallistuja potilaiden mukana tutkimuksessamme.

potilaille ja kasvain näytteet

Lung kasvain kudosnäytteitä saatiin potilailta (n = 142), joilla on histologisesti vahvistettu NSCLC, joille oli tehty täydellinen kirurginen asemointia National Taiwan University Hospital (Taipei, Taiwan) välillä 28 joulukuu 1995, ja 26. joulukuuta 2005. tutkimus oli hyväksynyt Institutional Review Hallitus National Taiwan University Hospital. Osallistuneista potilaista ei ollut hoidettu neoadjuvanttikemoterapian tai sädehoidon. Kaikki näytteet olivat formaliinilla, leikattiin, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja tutkittiin mikroskoopilla. Patologinen lavastus suoritettiin Dr. Yih-Leong Chang (Kliinisen patologian ja Graduate Institute of Pathology, National Taiwan University) mukaan kansainvälisen lavastus järjestelmä keuhkosyövän [23].

immunohistokemiallinen analyysi

immunohistokemiallinen värjäys kasvainkudoksen näytteitä potilaista, joilla on NSCLC suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [11]. Lyhyesti, osat analyysiä varten LCRMP-1 tai fosforyloidun GSK3p proteiinin ilmentyminen ensin autoklavoidaan Trilogy Solution (Cell Marque Corp., Rocklin, CA) tai antigeeni nouto Citra Solution (Biogenex, San Ramon, CA), 121 ° C: ssa 10 minuuttia. Näytteet myöhemmin tekivät hoitoon 3% H

2O

2-metanolia, inkubointi DakoCytomation Dual EndogenousEnzyme Block (DakoCytomation, Inc., Carpinteria, CA) 10 minuutin ajan, Ultra V Block (Lab Vision Corporation, Fremont, CA) 10 minuutin ajan, vasta-aine-laimennuspuskuriin (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) 10 minuutin ajan, ja lopuksi fosforyloidun GSK3p (Soluviestintä, Danvers, MA), vasta-aine 6 tuntia huoneen lämpötilassa tai polyklonaalinen anti-LCRMP-1-vasta-aine (C2; 1:300 laimennus) yön yli 4 ° C: ssa. Havaitseminen Immunovärjäyksen määritettiin käyttäen Super Sensitive Non-Biotin Polymer HRP Detection System (BioGenex, San Ramon, CA) valmistajan protokollan.

Modified Boyden kammion invaasiomääritys

Modified Boyden kammiot polykarbonaattia-kalvoinserteille (huokoskoko 8 pm; Falcon, Becton Dickinson) päällystettiin 30 ug matrigeelin (BD) suoritettiin soluinvaasiota määrityksissä. 2,5 x 10

4-solut suspendoitiin RPMI-alustassa, joka sisälsi 10% NuSerum (Invitrogen, Eugene, OR) maljattiin yläkammiot, ja 1 ml alustaa lisättiin kattamaan alakammioissa. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 24 tuntia 37 ° C: ssa, solut kiinnitettiin metanolissa huoneenlämpötilassa 10 minuuttia. Kiinnityksen jälkeen näytteet värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia (Sigma, St. Louis, MO) huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Kukin kalvo kuvattiin ja laskettiin solujen lukumäärä mikroskoopilla suurennuksella x 50 käyttäen Analytical Imaging Station-ohjelmisto (Imaging Research Inc., St. Catharines, ON, Kanada). Kukin koe määritettiin kolmena kappaleena.

immunofluoresenssi havainnointiin filopodia muodostumisen

Transfektoidut tai lentivirus-infektoidut solut kiinnitettiin 3,7% kylmällä paraformaldehydillä, pestiin PBS: llä, seuraavat mukaan läpäiseväksi 0,1% Triton X-100. Sitten solut värjättiin rodamiinikonjugoitu phalloidin (punainen, Molecular Probes, Eugene, OR). Solut kiinnitettiin mikroskoopin kanssa ProLong® Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää reagenssia DAPI (Molecular Probes) ja sitten tutkittiin ja valokuvattiin käyttäen LSM 700 laserkeilauksen -konfokaalimikroskoopilla Carl Zeiss.

Cell muuttoliike analyysi

liikkuva kappaleet vaeltavia solujen suoritettiin video nopeutus mikroskopialla kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, soluja pidettiin kasvualustassa 37 ° C /5% CO

2 ja time-lapse kuvia havaittiin alle AF 6000 LX mikroskooppi (Meyer Instruments, Inc.) Ajanjaksolle 20 tuntia. Kuvat on otettu kanssa CoolSNAP HQ CCD-kamera (Roper Scientific, NJ) 5 minuutin välein ja prosessoidaan MetaMorph 5,0 ohjelmisto (Universal Imaging, Downingtown, PA).

Soluviljely ja transfektio

ihmisen keuhkon adenokarsinooma solulinjoissa (CL1-0 solut) eristettiin 64-vuotiaan miespotilas huonosti eriytetty adenokarsinooma ja valitaan laboratoriossamme in vitro TranswellTM invaasio päästä 5 alilinjat progressiivinen invasiivisuus, joilla on samanlaiset genotyypin tausta (nimetty CL1-1, CL1-2, CL1-3, CL1-4, ja CL1-5), kuten aiemmin on kuvattu [25]. HEK293T solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, USA). CL1-0 ja HEK293T-soluja kasvatettiin RPMI ja DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 2 mM L-glutamiinia (kaikki Invitrogen, Eugene, OR) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2- 95% ilmaa, vastaavasti. Kaikki solulinjat Tässä tutkimuksessa testattiin Mycoplasma-free kunnossa. Kaikki transfektio kokeet suoritettiin käyttäen Lipofectamine tai Lipofectamine 2000 reagenssit (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Proteiini sekvenssejä kohdistus ja Plasmidit

aminohapposekvenssit rinnastus CRMP-2, CRMP-1 ja LCRMP-1 perustuvat niiden Gene pankin hakunumero NP_001377, NP_001304, ja NP_001014809, vastaavasti. LCRMP-1-ekspressioplasmidin pCMV-Tag2A-LCRMP-1 (WT) ja pEGFP-LCRMP-1 (WT) on kuvattu aiemmin [10]. Aminohappojen korvaaminen mutantit LCRMP-1 muodostettiin PCR-pohjainen mutageneesin kanssa QuikChange (Stratagene, Santa Clara, CA) ja varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. FLAG-merkitty GSK3p (WT, CA ja KD muoto) ilmentymisplasmideja subkloonattiin pCMV-5A-GSK3p (WT, CA ja KD muodossa lahja M.-C. Hung) osaksi pFLAG -CMV-5a vektorin (Sigma) .

vasta-aineet

Ensisijainen vasta-immunoblottauksella olivat seuraavat: monoklonaalinen anti-Flag (M2, Sigma), anti-Myc: llä (9E11; Millipore, Billerica, MA), anti-β-aktiini (Sigma) ja polyklonaalisia anti-LCRMP-1-vasta-aine. HRP konjugoitua vuohen anti-hiiri ja vuohen anti-kani-vasta-aineita ostettiin (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA).

lentivirustartunnat tuotanto ja transduktio

GFP-koodattu, tunnisteettomat LCRMP-1 (WT, T628A ja T628D), ja myc-tagged GSK3p (WT, CA ja KD muoto) rakennettiin kloonaamalla niiden cDNA pTYEF lentivirusvektorilla.