Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kolkisiini, luonnollinen tuote

Colchicum autumnae

nykyään käytetään kihti hoitoa, on tubuliinin kohdistaminen yhdistettä, joka estää mikrotubulusten muodostumista kohdistamalla nopeasti jakautuvien solujen. Tämä tubuliinia kohdistaminen ominaisuus on johtaa tutkijat tutkia mahdollisuuksia kolkisiinin ja analogien mahdollisimman syöpähoitojen. Yksi merkittävä tutkimus suoritetaan analogi allocolchicine, ZD 6126, keskeytettiin vaiheen 2 kliinisissä kokeissa aiheuttamien vakavien sydän- myrkyllisyys liittyy hoitoon. Tämä tutkimus liittyy kehittämiseen ja testaamiseen uusien allocolchicine analogien, jotka pitävät myrkytön syövän ominaisuuksia. Tällä hetkellä meillä on syntetisoitu ja arvioitu syövän toimintaa kaksi analogit; N-asetyyli-O-methylcolchinol (NSC 51046 tai NCME), joka on rakenteellisesti samanlainen kuin ZD 6126, ja (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1), joka on novel johdannainen allocolchicine joka on isomeerinen A-rengas. NSC 51046: n havaittiin olevan ei-valikoiva, sillä se aiheutti apoptoosia sekä BxPC-3 ja PANC-1 haima- syöpäsoluja ja normaaleissa ihmisen fibroblasteissa. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että Green 1 pystyi hieman indusoimaan pro-syöttämällä autophagy näissä haiman syöpäsoluissa ja E6-1 leukemia soluissa, mutta ei normaaleissa ihmisen fibroblasteissa. Toisin kuin kolkisiini ja NSC 51046, Green 1 ei näytä vaikuttavan tubuliinin polymerisaatiota osoittaa, että se on eri molekyyli- kohde. Green 1 aiheutti myös lisääntynyt reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto eristettyjä mitokondrioita haiman syöpäsoluja. Lisäksi

in vivo

tutkimukset osoittivat, että vihreä 1 oli hyvin siedetty hiirillä. Tulosten perusteella näyttää, että pieni muutos rakenteessa kolkisiinia on ilmeisesti muuttanut vaikutusmekanismi ja johtaa parempaan selektiivisyyteen. Tämä voi johtaa parempaan valikoiva hoitoja syövän hoidossa.

Citation: Larocque K, Ovadje P, Djurdjevic S, Mehdi M, Green J, Pandey S (2014) Novel analoginen Kolkisiini indusoi Valikoiva Pro-Death Autophagy ja nekroosi ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 9 (1): e87064. doi: 10,1371 /journal.pone.0087064

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 elokuu 2013; Hyväksytty: 19 joulukuu 2013; Julkaistu: 23 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Larocque et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Windsor ja Essex County Cancer Center säätiön Seeds4Hope Grant ja NSERC Discovery -apurahaohjelman. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Siyaram Pandey on PLoS One toimituksellisen hallituksen jäsenenä. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Kanadassa on arvioitu, että 187, 600 ihmiset ovat diagnosoitu syöpä ja 75, 500 ihmistä kuolee syöpään vuonna 2013 [1]. Niistä valtava määrä erilaisia, haimasyöpä on yksi tappavan, koska se on hyvin aggressiivinen, vastaa hoitoon, etenee nopeasti ja on selkeiden oireita; Näin ollen, se liittyy huonoon ennusteeseen, ja myöhäisen vaiheen diagnoosi [2], [3]. Nykyiset hoitokeinot haimasyöpä ovat leikkaus, säteily, ja useita chemotherapies, mukaan lukien 5-fluorourasiili ja gemsitabiinin [4]. Valitettavasti tehokkuus näiden hoitovaihtoehtoja ei ole pitkäikäinen ja ne liittyvät vakavia haitallisia sivuvaikutuksia, koska ei-selektiivisiä kohdentamista ei-syöpäsolujen [5]. Vaikka paljon on edistytty monissa syövän tyypit, haimasyövän tapaukset ja kuolemat ovat edelleen kasvussa [6]. On erittäin tärkeää, että selektiivinen, turvallisempi ja myrkytön vaihtoehto nykyisille hoitovaihtoehtoja on kehitetty niille, jotka kärsivät haimasyöpä. Leukemia on toinen tappava syöpäsairaus, joka syntyy, kun veren kantasoluja luuytimen kehittyä poikkeavia soluja. On arvioitu, että diagnosoidaan 5800 kanadalaisten vuonna 2013, tappaminen 2600. Vaikka hoitovaihtoehdot ovat käytettävissä, on edelleen tarve kehittää tehokkaampi ja turvallisempi vaihtoehto.

Erityisen tärkeää selviytymiselle syöpäsolut on niiden kyky kiertää ohjelmoidun solukuoleman (PCD). Erityisesti syöpäsolut pystyvät kiertämään apoptoosin, PCD tyypin I, mukana säätelyyn ja kehitystä. Apoptosis pyrkii estämään vaurioituneen ja mutatoitunut solujen lisääntyvissä ja keräämällä [7]. Autophagy, PCD tyypin II, joka on catabolic prosessi, johon liittyy hajoamista vaurioituneiden solujen komponentteja ja voi myös tarjota energiaa aikoina stressiä, on myös liitetty selviytymisen syöpäsoluja. Tämä prosessi hajottaa vahingoittuneiden solu- komponenteista tarjoaa solujen materiaaleja, joita voidaan käyttää energian tuottamiseksi, kunnes stressitekijöiden on poistettu [8], [9]. Tästä prosessista johtuen, autophagy on pidettävä ainoastaan ​​pro-selviytymismekanismi; Viime aikoina on kuitenkin tutkijat ovat havainneet, että jatkuva altistuminen stressitekijöitä voi johtaa pitkäaikaiseen autophagy ja myöhemmin, solukuolemaa [10], [11]. Tämän vuoksi kaksi tarkoitusta, on kysymys siitä, onko se on edullisempaa estävän tai indusoivan autophagy jotta aiheuttaa syöpää solukuoleman, ja tutkijat tutkivat parhaillaan molempia keinoja. Lopuksi kuolion on eräänlaista patologinen solukuolema, joka aiheutuu altistumisesta infektio, toksiineja tai trauma [12], [13]. Äskettäin on havaittu, että nekroosia, kuten apoptoosi, voidaan myös ohjelmoida ja sen induktio voi olla toinen strategia syövän hoidossa [14], [15]. Jossa tutkimus solukuoleman induktio, tutkijat ovat yhä keskittyneet löytää yhdisteitä ja tuotteita, joilla on syöpä erityisiä tavoitteita, jotka voivat johtaa solukuoleman induktioon ohjelmien syöpäsoluissa selektiivisesti, ilman induktio solukuoleman muihin soluihin, jolloin ohittaen joitakin toksisuuksien liittyy nykyiseen syövän hoitomuotoja.

Kolkisiini on luonnollinen yhdiste, joka voidaan eristää joko

syysmyrkkylilja

(niitty sahrami) tai

Gloriosa superba

( kunniaa lilja), jotka molemmat kuuluvat lilja perheen [16]. Kolkisiini ei tunne lääketieteen maailma, kun se on hyödynnetty kihdin hoitoon ja on tutkittu monissa muissa olosuhteissa, kuten familiaalinen Välimeren kuume [17], maksakirroosi [18] ja Makea oireyhtymä [19]. Viime aikoina allocolchicines (johdannaisia ​​kolkisiinia) ja muut analogit ovat osoittaneet jännittäviä vaikutuksia syöpäsoluissa. Tämä johtuu suurelta osin allocolchicine kyky pysäyttää mitoosin estämällä tubuliinin polymerisaatiota mikrotubuluksiksi [16], estää etenemistä solujen solusyklin läpi ja johtaa apoptoosin induktioon. Tämä inhibitio mikroputkien muodostuminen on erityisen hyödyllinen syövän hoidossa, koska syövän solut lisääntyvät nopeasti ja hallitsemattomasti. Yksi allocolchicine johdannainen, ZD 6126 joka on pro-drug N-asetyylikolkinoli, oli joitakin mielenkiintoisia tuloksia, koska se pystyi häiritä solun tukirangan kasvain endoteelisolujen ja aiheuttaa apoptoosia (kuvio. 1) [20], [21]. ZD 6126 aiheutti kasvainsolujen kuolio

in vivo

hiirimalleissa ihmisen keuhkojen (Calu-6), peräsuolen (LoVo ja HT-29), eturauhasen (PC-3), munasarjojen (SKOV-3), ja rinta (MDA-MB-231) kasvaimia [22]. Valitettavasti tämä yhdiste pysähtyi vaiheen 2 kliinisten tutkimusten seurauksena liittyvän sydän- ja ihmisissä [23]. Ei ole yllättävää, että tämä johdannainen ja muut johdannaiset olivat myrkyllisiä, koska tubuliinia ja mikrotubuluksia ovat välttämättömiä solusyklin ei ainoastaan ​​syöpäsoluissa, mutta myös ei-syöpäsoluja; Näin ollen, tämä ei-selektiivinen tavoite on yksi syy siihen, että ei-syöpäsolujen ovat alttiita indusoiman apoptoosin tubuliinia kohdentamisaineita, mikä Haittavaikutukset [24].

Tässä raportoimaan syövän vastaista aktiivisuutta synteettisten johdannaisten allocolchicine; N-asetyyli-O-methylcolchinol (NSC 51046 tai NCME), joka on rakenteellisesti samanlainen kuin ZD 6126, ja (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1), joka on novel johdannainen allocolchicine joka on isomeerinen A-rengas (Fig. 1). Tässä tutkimuksessa olemme raportoivat ero mekanismeja kahden allocolchicine johdannaisten leukemiaa ja haimasyöpäsoluissa aiheuttamia pieniä muutoksia niiden kemiallisen rakenteen. NSC 51046 selkeästi indusoi ei-selektiivisten apoptoosin haimasyövän soluja (PANC-1 ja BxPC-3) ja ei-syöpä sikiön fibroblasteja (NFF), kun taas vihreä 1 aiheutti pro-syöttämällä autophagy ja nekroosia selektiivisesti haiman syöpäsoluissa (PANC-1 ) ja akuutin T-solujen leukemian (E6-1 tai Jurkat), sillä on vain vähän vaikutusta ei-syöpä ihmisen fibroblasteja (NHF). Lisäksi toisin kuin kolkisiini, ZD 6126 ja NSC 51046, Green 1 ei ole kohdistaa tubuliinia ja on eri molekyyli- kohde. On hyvin mielenkiintoista, että pieni muutos rakenteessa allocolchicine on muuttanut vaikutusmekanismi ja johtaa parempaan syövän valikoivuus. Nämä havainnot voivat johtaa kehitetään parempia, valikoivampi kemoterapia syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen syöpä solulinjoja, joita käytettiin tässä tutkimuksessa oli haiman epiteloidikarsinooman (PANC-1, Cat. No. CRL-1469), haiman adenokarsinooma (BxPC-3, Cat. No. CRL-1687) ja akuutin T-solujen leukemian, klooni E6-1 (Jurkat; TIB-152 ), jotka kaikki hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Normaalit solulinjat käytetty tässä tutkimuksessa olivat normaalit ihmisen fibroblastit (NHF, Cat. No. AG09309) ja normaalin sikiön fibroblasteja (NFF; Cat. No. AG0443), jotka molemmat ostettiin Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ . PANC-1-soluja kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), (Gibco BRL, Mississauga, ON, Kanada) ja 10 mg /ml gentamysiini ( Gibco BRL, Mississauga, ON, Kanada). BxPC-3 ja Jurkat-soluja kasvatettiin RPMI-1640-alustassa (Sigma-Aldrich, ON, Kanada), johon on lisätty 10% FBS: ää (Gibco BRL, Mississauga, ON, Kanada) ja 10 mg /ml gentamysiini (Gibco BRL, Mississauga, ON, Kanada). NHF ja NFF-soluja kasvatettiin Minimal Essential Earlen Balanced Salts (MEM /EBSS), (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) täydennettynä 15% FBS Non-välttämättömiä aminohappoja (Gibco BRL, Mississauga, ON, Kanada) ja 10 mg /ml gentamysiini (Gibco BRL, Mississauga, ON, Kanada). Kaikkia solulinjoja kasvatettiin ja ylläpidetään Forma Scientific CO

2 yrityshautomo varustettu HEPA-suodatin (Forma Scientific Inc, Marietta, Ohio) 37 ° C: ssa, 95% kosteus ja 5% CO

2

Cell hoito

Allocolchicine johdannaiset, N-asetyyli-O-methylcolchinol (NSC 51046) ja (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1) käytettiin avain yhdisteet tässä tutkimuksessa [25]. Soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla ja kestot NSC 51046 ja Green 1, rekonstruoitu dimetyylisulfoksidiin (Me

2SO). Ennen käsittelyä, varastossa konsentroitiin yhdisteet laimennettiin edelleen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Lisäksi allocolchicine johdannaiset, kolkisiinia (Sigma-Aldrich, ON, Kanada) käytettiin vertaamaan vaikutuksia allocolchicine johdannaisia ​​on jo tiedossa mekanistinen tehoa colchicines. Paklitakseli (Sigma-Aldrich, ON, Kanada) ja Parakvatti (PQ), (Sigma-Aldrich, ON, Kanada) käytettiin positiivisina kontrolleina erilaisia ​​kokeiluja.

Arvio tehokkuus Green 1 ja NSC 51046

WST-1-määritystä.

mittaa solujen elinkykyä, WST-1 väriaine ([2- (4-jodifenoli) -3- (4-nitrofenyyli) -5- (2,4- disulfofenyyli) -2

H

-tetrazolium, Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) käytettiin. Tämä väriaine pelkistetään formatsaaniksi läsnä ollessa metabolisia entsyymejä, jotka osoittavat aktiivisen metabolisen aktiivisuuden eläviin soluihin. Formatsaanituotteen määrän voidaan mitata absorbanssi 450 nm: ssä. Sama määrä soluja ympättiin 96-kuoppaisille levyille (PANC-1:4,000 solua /kuoppa; NHFs: 4000 solua /kuoppa), kokonaistilavuus 100 ui. Seuraavat kiinnitys, soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla Green 1 tai NSC 51046. Kun haluttu aika kohta, WST-1 väriaine lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Käyttäen Wallac Victor

3 ™ 1420 -monileimalukijaa (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Kanada), absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä. Absorbanssiarvot käsiteltyjen solujen ilmaistiin prosentteina absorbanssiarvot valvonnan.

trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä.

määrällisesti prosenttiosuus kuolleita soluja, trypaanisinisen cell läpäisemätöntä väriainetta inkuboitiin käsiteltyjä soluja [26]. 01:01 seos solususpensiota ja trypaanisinivärin (Sigma-Aldrich, ON, Kanada) pipetoitiin hemasytometriä (Hausser Scientific, Horsham, PA) ja solujen lukumäärä (kuolleita soluja värjättiin sininen ja elävät solut jätetään värjäämättä) manuaalisesti määrällisesti. Kuolleiden solujen ilmaistiin prosentteina solujen lukumäärä. Tulokset analysoitiin käyttäen GraphPad Prism 6.0 ja ilmoitetaan keskiarvona ± SD kahden itsenäisen kokeen.

Hoechst Värjäys

Jotta visualisoida ydin- morfologia ja apoptoosin induktio, Hoechst 33342 väriainetta (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) käytettiin värjäämään ytimet. Hoidon jälkeen joko Green 1 tai NSC 51046, soluja inkuboitiin 10 uM Hoechst 33342 värin 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Kuvat saatiin käyttäen Leica DM IRB käänteinen fluoresenssimikroskoopilla (Wetzlar, Saksa) on suurennos 400X.

anneksiini V-sitoutumismääritys

Sen määrittämiseksi, mikäli NSC 51046 ja kolkisiini ovat aiheuttamaan apoptoosin, joka on anneksiini V: n sitoutumisen määritystä käytettiin. Hoidon jälkeen, PANC-1-solut kerättiin, pestiin PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen 50 ui anneksiini V: n sitoutumisen-puskuria (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl

2, pH 7,4). Soluja inkuboitiin sitten anneksiini V AlexaFluor-488-konjugaattia (1:20) (Invitrogen, Kanada), 10 uM Hoechst 33342 väriä (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ja 1 ug /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich, ON , Kanada) 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Kuvat otettiin 400X suurennoksella käyttäen Leica DMI6000 fluoresenssimikroskoopilla (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa).

MDC Pitoisuus

havaitsemiseksi autophagy, monodansylcadaverine (MDC, Sigma-Aldrich, ON, Kanada ) käytettiin. MDC on sisällytetty autophagic vacuoles tuottaen pistemäinen tahra, joka on havaittavissa kautta fluoresenssimikroskopiaan. Soluja kasvatettiin peitinlaseilla ja jälkeen yli yön inkubaation, käsiteltiin vaihtelevilla annoksilla Green 1. jälkeen hoidon, soluja inkuboitiin lopulliseen pitoisuuteen 0,1 mM MDC (laimennettu PBS: ssä) 35 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Edelleen vahvistuksen menetykseen solukalvon eheyden ja solukuoleman induktioon, solut vasta-värjättiin solukalvon läpäisemätön tumaväriä, propidiumjodidia 1 ug /ml (Sigma-Aldrich, ON, Kanada) vahvistaa induktion solukuolemaa. Kuvat saatiin käyttämällä Leica DM IRB käänteinen fluoresenssimikroskoopilla (Wetzlar, Saksa) on suurennos 400X.

solulysaatille valmistus

hoidon jälkeen 5 uM Green 1 eri aikaväleillä, soluja kerätään, pestään PBS: ssä ja inkuboitiin 0,1% NP40-puskuria (20 mM Tris-HCI, 100 mM NaCI, 5 mM EDTA), 25 minuutin ajan jäillä (vorteksoimalla 5 minuutin välein, 15 sekuntia). Sitten näyte sentrifugoidaan nopeudella 3000 rpm 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti (joka sisältää hajotettiin huokoisen materiaalin), säilytetään -20 ° C: ssa käyttöön asti.

Western Blot

Proteiininäytteet erotettiin käyttämällä SDS-PAGE: lla. Elektroforeesi Proteiinit siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle ja salvattiin 5% w /v maidon TBST (Tris-puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa Tween-20) liuosta. Sitten membraanit tutkittiin ensisijainen vasta-aineita 2% w /v maidon TBST yön yli 4 ° C: ssa mikrotubuluksiin liittyvä protein1 kevytketjun 3 (LC3) esitetty kanin (1:500) (Novus Biologicals, Cat. No. NB100- 2220, Littleton, CO, USA); β-Actin esiin hiiren (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat. No. sc-81178, CA, USA); Beclin-1 esiin kanin (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat. No. sc-11427, CA, USA). Inkuboinnin jälkeen kalvot pestiin TBST: ssä ja niitä inkuboitiin anti-hiiri (1:2000) tai anti-kani (1:2000) piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Abcam, Cat. No. ab6728 ab6802, Cambridge, MA , USA) 2% w /v maidon TBST 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen pesujen TBST, bändit visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi reagenssia (Sigma-Aldrich, ON, Kanada) ja tiheysmittaus suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Tubuliinipolymerisaatio Pitoisuus

tarkkailla vaikutuksen allocolchicine johdannaisiin tubuliinin polymerisaatiota, tubuliinin polymerisaatiota määrityskittiä (Cytoskeleton Inc. Cat. No. BK006P) käytettiin. 96-kuoppalevy esilämmitetty 37 ° C: ssa 30 minuuttia ennen aloittamista määritystä. Kontrollikuopat saanut yleistä tubuliinin puskuriin (80 mM PIPES, pH 6,9, 2 mM MgCI

2, 0,5 mM EGTA: ta), ja muuhun kuoppaan laitettiin yleisen tubuliinia puskuria ja joko Green 1, NSC 51046 tai kolkisiinia (Sigma-Aldrich, ON, Kanada). Kaikki kuopat (mukaan lukien valvontajärjestelmät), inkuboitiin sitten 3 mg /ml tubuliinin tubuliinin polymerisaatiota puskurissa (80 mM PIPES, pH 6,9, 2 mM MgCI

2, 0,5 mM EGTA, 1 mM GTP: tä ja 10,2% glyserolia). OD

340 mitattiin minuutin välein yhden tunnin ajan. Polymerointi käyrät muodostettiin käyttäen GraphPad Prism 6.0. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

Mitokondrioiden eristäminen ja mittaus reaktiivisen hapen (ROS) tuotanto

mitokondrioita eristettiin käsittelemättömän PANC-1-solujen vaikutuksen tutkimiseksi Green 1 ROS tuotanto ja mahdollisuus mitokondrioiden tavoitteeksi Green 1. Solut pestään ensin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä, suspendoitiin uudelleen hypotoniseen puskuriin (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCI, 210 mM mannitolia, 70 mM sakkaroosia, 10 uM Leu pep, 10 uM Pep-A, 100 uM PMSF), homogenisoitiin ja sitten sentrifugoitiin 3000 rpm: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa pelletoimiseksi tumafraktios-. Supernatantti sentrifugoitiin 12000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sytosolin Supernatantti hävittää ja pelletti (joka sisältää mitokondrioita) suspendoitiin uudelleen kylmään reaktiopuskuria ja käsiteltiin 250 uM parakvatti (PQ) positiivisena kontrollina, 2,5 uM Green 1 tai 10 uM kolkisiinia. Amplex Red (Molecular Probes, Eugene, OR), yhdessä piparjuuriperoksidaasiin käytettiin mittaamaan mitokondrioiden ROS tuotanto. Mitokondriot, jotka eristettiin kuten edellä on mainittu suspendoitiin uudelleen kylmään hypotoniseen puskuriin ja 20 ug proteiinia lisättiin kuhunkin kuoppaan mustalla 96-läpinäkymätön levy. Fluoresenssi mitattiin (Esim. 560 nm ja Em. 590 nm) 5 minuutin välein 5 tuntia käyttäen spektrofluorometri (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Lukemat analysoitiin käyttämällä GraphPad Prism 6.0 ja ilmaistaan ​​suhteellisina fluoresenssiyksikköinä (RFU) per mikrogrammaa proteiinia ja edustavat saatuja tietoja kolmesta itsenäisestä kokeesta.

In Vivo

arviointi (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Green 1) B

Kaikki toimenpiteet, joissa eläimet tehtiin mukaisesti Kanadan neuvoston eläinten hoito -suosituksia ja hyväksymiä University of Windsor Animal Care komitea. Kuusiviikkoisia male CD-1 nu /nu-hiiriä saatiin Charles River Laboratories ja sijoitettu vakio laboratorio-olosuhteissa 12-tunnin valo /pimeä sykli mukaisesti eläimen protokollien hahmoteltu University of Windsor Research Ethics Board-AUPP #: 10-17. Sen jälkeen sopeuttamiseen, hiiret jaettiin kahteen ryhmään, joista toinen ryhmä ihonalaisesti oikeaan ja vasempaan takajalan kupeet Me

2SO PBS (10 ui 200 ul PBS), kun taas toinen ryhmä sai ihonalaisen injektioita Green 1 (10 mg /kg /päivä yhteensä 10 ui Green 1/200 ui PBS) kolme kertaa viikossa yhden kuukauden ajan. Myrkyllisyyden arvioimiseksi, kun hiiret olivat elossa, ruumiinpaino mitattiin kolme kertaa viikossa tutkimuksen keston ajan. Sen jälkeen ajan tutkimuksen, eläimet tapettiin ja niiden elimet ja kudokset (maksa, munuaiset ja sydän) on vastaanotettu ja tallennettu 10% formaldehydiä immunohistokemiallista ja toksikologisessa analyysissa.

hematoksyliinillä Eosiini (H E-protokollaa [27].

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona (SD). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen 2-tie ANOVA testi GraphPad Prism 6.0 -ohjelmisto.

Tulokset

vaikutus Allocolchicine johdannaisten elinkelpoisuuden syöpäsolujen

varten tässä tutkimuksessa, elinkelpoisuuden haimasyövän soluja (PANC-1) mitattiin, käsittelyn jälkeen Green 1 tai NSC 51046, käyttämällä WST-1-solunelinkykyisyysmääritys. Jälkeen 4 tunnin inkubaation, WST-1 väriaine, absorbanssi luettiin 450 nm: ssä. Samanaikaisesti, ei-syöpä normaaleissa ihmisen fibroblasteissa (NHFs) käytettiin normaalin solun vastine tässä tutkimuksessa selvittämään yhdisteiden selektiivisyys syöpäsoluihin. Tuloksemme osoittavat, että sekä NSC 51046 ja Green 1 pystyivät vähentämään elinkelpoisuutta PANC-1-soluissa. Kuitenkin havaittiin, että vihreän 1 oli selektiivinen syöpäsoluja, kuten elinkelpoisuutta PANC-1-soluissa oli hieman pienenee ja elinkelpoisuuden NHFs pysyi ennallaan. Toisaalta, hoito NSC 51046 johti vähenemiseen elinkelpoisuuden sekä syövän ja ei-syöpäsolujen (Fig. 2A). Lisäksi Green 1 käsittely laski proliferaatiota ihmisen T-solujen leukemian soluja ja laski solukalvon eheyden, minkä osoittaa lisääntyminen trypaanisinisellä positiivisissa soluissa havaittiin käsittelyn jälkeen (Fig. 2B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että Green 1 on selektiivisiä syöpäsoluja.

(A) Haiman syöpäsolujen (PANC-1) ja normaalin ihmisen fibroblasteissa (NHFs) käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla Green 1 ja NSC 51046 ja käsittelyn jälkeen on ilmoitettuina ajankohtina, soluja inkuboitiin WST-1 solujen elinkelpoisuus väriaine 4 tuntia. Absorbanssi luettiin 450 nm: ssä ja tulokset ilmaistiin prosentteina kontrolliin. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta nelinkertaisesti; (I) PANC-1 käsiteltiin NSC 51046 (vuorovaikutus kunkin pitoisuus: **** p 0,0001; Ohjaus vs. sarake tekijä: **** p 0,0001); (Ii) NHF käsiteltiin NSC 51046 (vuorovaikutus kunkin pitoisuus: **** p 0,0001; Ohjaus vs. sarake tekijä: **** p 0,0001); (Iii) PANC-1 käsiteltiin Green 1 (vuorovaikutus kunkin pitoisuus: p = 0,9955; Ohjaus vs. sarake tekijä: **** p 0,0001); (Iv) NHF käsiteltiin Green 1 (vuorovaikutus kunkin pitoisuus: p = 0,3642; Ohjaus vs. sarake tekijä: * p = 0,0370) (B) hoidon jälkeen ihmisen akuutin T-solujen leukemian soluja (Jurkat) Green 1, joka on trypaanisinistä lukuun määritys suoritettiin. Solut värjättiin trypaanisinisellä solukalvon läpäisemätöntä väriainetta ja numerot trypaanisinisellä positiivisten solujen saatiin käyttäen hemosytometriä. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina trypaanisinistä positiivisten solujen, mikä osoittaa kuolleiden solujen ei-ehjät solukalvot. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

erilaisuudeen aiheuttaman solu- kuoleman induktion Allocolchicine johdannaiset

roolin tutkimiseksi allocolchicine johdannaisten solukuoleman induktioon syöpäsoluissa , tumiin solut värjättiin 10 uM Hoechst 33342 väriainetta 10 minuuttia käsittelyn jälkeen joko Green 1 tai NSC 51046 joko 48 tai 96 tuntia. Tuloksena kuvia (Fig. 3A), havaittiin, että NSC 51046 käsittely johti ytimien jolla oli apoptoottinen morfologia, mukaan lukien solun kupliminen, kutistuminen ja kondensoitiin ytimiä sekä haimasyövän solutyyppejä ja ei-syöpä normaalin sikiön fibroblasteja (NFFs) , joka vastaa elinkelpoisuuden tietoja. Kuitenkin, syöpä ja ei-syöpäsolujen käsitelty Green 1 ei näytä tätä apoptoottinen morfologia, mikä viittaa siihen, että vihreä 1 ei indusoi apoptoosia haiman syöpäsoluja. Apoptoottiset induktio NSC 51046 varmistettiin käyttämällä anneksiini V: n sitoutumisen määrityksessä. Anneksiini V sitoutuu externalized fosfatidyyliseriini, joka on merkki varhaisen apoptoosin [28]. Vuonna tuloksena kuvien (Fig. 3B), todettiin, että potilaille, joiden hoito annoksilla NSC 51046 johtavat ulkoistamisen fosfatidyyliseriinin mikä näkyy vihreä fluoresenssivärjäys. Lisäksi havaittiin myös, että hoito kolkisiinin indusoi apoptoottista solukuolemaa koska se johti ydinaseiden pirstoutumista, ulkoistamista fosfatidyyliseriinin ja solukuoleman. Puute apoptoottinen morfologia ja väheneminen elinkelpoisuutta haimasyöpäsoluissa käsitelty Green 1 sai meidät tutkimaan muita tiloja solukuoleman. Käsittelyn jälkeen soluja inkuboitiin sitten monodansylcadaverine (MDC), sen määrittämiseksi, oliko autophagic induktio. Havaitsimme induktio autophagy 48 tuntia kaikissa syöpäsoluissa testattu, verrattavissa autophagic induktion meidän positiivisena kontrollina pro-selviytymisen autophagy, Tamoxifen [10] (Fig. 4A). Lisäksi propidiumjodidilla (PI) paljasti, että, toisin kuin tamoksifeeni, Green 1 käsitellään syöpäsolujen olivat positiivisia propidiumjodidia ja ilmensivät pro-kuoleman muodossa autophagy (Fig. 4A). Tämä aktiivisuus Green 1 oli spesifinen syöpäsoluja, kuten NHFs käsiteltiin Green 1 ei värjäytynyt positiiviseksi läsnäolo autophagic vakuolit MDC tai nekroottisen solukuoleman PI, vahvistetaan selektiivisyys Green 1 syöpäsoluja. Jotta voitaisiin vahvistaa induktion autophagy aiheuttaman Green 1, Beclin-1 ilmentymisen ja LC3-I LC3-II konversio arvioitiin western blot analyysit PANC-1-solut käsiteltiin 5,0 uM Green 1 eri aikavälein (Fig. 4B). β-aktiini mitattiin sisäisenä latauskontrollina. Densitometria tehtiin ja näytteet käsiteltiin 3 ja 6 tuntia verrattiin alussa ohjaus, kun taas näyte käsiteltiin 48 tunnin verrattiin 48-tunnin kontrolli. Tuloksena kaaviot osoittavat, että vihreä 1 hoito aiheutti kasvu Beclin-1 tasot kaikkina ajankohtina hoidon jälkeen. LC3-II tasot olivat kohtalaisesti lisääntynyt 6 tuntia hoidon jälkeen Green 1.

hoidon jälkeen joko Green 1 (A) Haiman syöpäsolujen (BxPC-3 ja PANC-1) ja normaalin ihmisen ja sikiön fibroblasteja ( NHFs ja NFFs) inkuboitiin Hoechst 33342 -värillä luonnehtia ydin- morfologia ja tunnistaa apoptoosin induktion. Brightly värjätään, tiivistetty ytimeksi apoptoottiset kappaleet ovat ohjeellisia apoptoosin. (B) PANC-1-soluja inkuboitiin anneksiini V väriaineen tarkistaa apoptoottinen induktion aiheuttama NSC 51046. Solut vastavärjättiin Hoechst 33342 väriainetta ja propidiumjodidilla (PI) visualisoida ydin- morfologia ja solukuolemaa. Kuvissa edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta 48 tuntia hoidon jälkeen NSC 51046 ja kolkisiinia.

(A) haimasyöpäsoluissa, ihmisen leukemiasolujen (Jurkat) ja NHFs inkuboitiin Monodansylcadaverine (MDC) tahraa autophagic vacuoles ja propidiumjodidilla (PI) solukuolemaan onko autophagic induktio johti solukuoleman. Kirkas, pistemäinen värjäytyminen osoittaa autophagy katsottuna meidän positiivisen kontrollin (tamoksifeeni käsiteltyihin soluihin). Kuvat on otettu 400-kertaisella suurennoksella suurennoksella fluoresenssimikroskoopilla. (B) Western blot analyysit Beclin-1 ilmentymisen ja LC3 konversio suoritettiin PANC-1-solut käsiteltiin 5,0 uM Green 1 eri ajankohtina. β-aktiini mitattiin sisäisenä kontrollina. Näytteet käsiteltiin 3 ja 6 tuntia verrattiin alussa ohjaus, kun taas näyte käsiteltiin 48 tunnin verrattiin 48-tunnin kontrolli. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta sekä Western-blotit.

solunsisäinen tavoitteet Green 1

Kolkisiini ja eräät sen johdannaiset ovat tiedetään indusoivan apoptoosia syöpäsoluissa estämällä tubuliinin polymerisaatiota ja johtavat DNA-vaurioita, joka toimii signaalin aloittamisen prosessi apoptoosin [29]. Kuten tarkkailla ero vaikutuksia Green 1 ja NSC 51046 solukuolemaan induktio, halusimme tutkia tarkemmin mahdollisia solunsisäistä tavoitteet Green 1, verrattuna NSC 51046 ja kolkisiinia. Erityisesti vaikutukset kolkisiinin ja sen johdannaiset tubuliinin polymerisaatiota arvioitiin. Green 1, NSC 51046 tai kolkisiinia inkuboitiin tubuliinin puhdistettu sian aivoista. OD

340 mitattiin minuutin välein yhden tunnin ajan ja tuloksena kuvaaja on esitetty kuviossa 5A. Tuloksemme osoittavat, että NSC 51046 aiheuttama lievä tubuliinin esto pienemmällä annoksella, mikä vastaa aiempien tutkimusten [31], [32]; kuitenkin, havaitsimme, että suurempi annos NSC 51046 aiheutti nopean tubuliinin polymerisaatiota, mikä oli odottamatonta. Kuten odotettua, kolkisiini esti tubuliinin polymerisaatiota. Käsittely Green 1 suuremmilla annoksilla johti lievään nousuun tubuliinin polymerisaatiota, kun taas alempi Green 1 annos pysyi suhteellisen lähellä kontrollinäyte (Kuva. 5A). Tämä vahvistaa, että Green 1 ja NSC 51046 on erilaiset biokemialliset mekanismit, NSC 51046 tavoitteita tubuliinin polymeroitumisen paljon suuremmassa määrin kuin Green 1. Nämä tulokset viittaavat siihen, että yksinkertainen muutos rakenteisiin näiden allocolchicine analogien on johtanut hyvin erilaisia ​​biologisia toimintoja normaalit solut syöpäsoluista.

(A) Kolkisiini johdannaiset (Green 1 ja NSC 51046) inkuboitiin sian tubuliinin tunnin 96-kuoppalevylle. Absorbanssi (OD

340 nm), saatiin aikana joka minuutti yhden tunnin inkubaation jälkeen. Kolkisiini käytettiin verrattuna johdannaisia. (B) eristetty mitokondrioita PANC-1-soluja käsiteltiin Green 1 ja ROS-tuotanto mitattiin käyttäen Amplex Red substraatin läsnäollessa piparjuuriperoksidaasi (HRP). Tuloksia verrattiin hallita käsittelemättömiin mitokondrioita, kolkisiini käsiteltiin mitokondrioita ja positiivisena kontrollina, parakvatti (PQ). Fluoresenssilukemat otettiin 5 minuutin välein 4 tunnin ajan Ex. 560 nm ja Em.590 nm ja ilmaistaan ​​suhteellinen fluoresenssi (RFU).