Krooninen sairaus

tiivistelmä

Transmembraaniset musiinien, MUC4 ja MUC16 liittyy kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeiden mahdollisuus ihmisen haiman adenokarsinooma. Olemme havainneet, että miR-200c on vuorovaikutuksessa erityisten sekvenssien koodaavan sekvenssin MUC4 ja MUC16 mRNA: t, ja arvioidaan sääntely luonne -alueella. Haimasyövän solulinjoissa S2.028 ja T3M-4 transfektoitu miR-200c osoitti 4,18 ja 8,50 taittaa alas säätely MUC4 mRNA, ja 4,68 ja 4,82 taittaa alas säätely MUC16 mRNA verrattuna mock-transfektoituja soluja, tässä järjestyksessä. Merkittävä väheneminen glykoproteiinin ilmentyminen havaittiin myös. Nämä tulokset osoittavat, että miR-200c yli-ilmentymisen säätelee MUC4 ja MUC16 musiineja haiman syöpäsoluissa kohdistamalla suoraan mRNA koodaavan sekvenssin kunkin, mikä vähentää tasoilla MUC4 ja MUC16 mRNA: ta ja proteiinia. Nämä tiedot viittaavat siihen, että sen lisäksi sääntelemiseksi proteiineja, jotka moduloivat EMT, miR-200c vaikutteita ilmentyminen solun pinnan musiineja haimasyövän.

Citation: Radhakrishnan P, Mohr AM, Grandgenett PM, Steele MM, Batra SK, Hollingsworth MA (2013) MicroRNA-200C moduloi ilmentäminen MUC4 ja MUC16 suoraan kohdistavat koodaussekvenssit Human Haimasyöpä. PLoS ONE 8 (10): e73356. doi: 10,1371 /journal.pone.0073356

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: toukokuu 31, 2013; Hyväksytty: 19 heinäkuu 2013; Julkaistu: 25 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Radhakrishnan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat seuraavat avustusta National Cancer Institute: SPORE (1P50CA127297), Early Detection Research Network (5U01CA111294), liiton Glycobiologist Detection of Cancer ja syöpäriski (5U01CA128437), kasvain mikroympäristölle Network (U54 CA163120), ja R01CA57362 . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä (~ 20-22 nukleotidia) ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geeniekspressiota vuorovaikutuksessa joko 3′-alueen (3 ’UTR) tai koodausalue kohde-mRNA: iden. Expression kohdennettujen geenituotteet vaikuttavat miRNA aiheuttamaa mRNA: n hajoamisen tai esto käännös [1]. Altered ilmentymistä miRNA syövän aiheuttaa kasvaimen edistämisessä ja kasvaimen tukahduttaa toimintoja. Esimerkiksi miR-155, miR-17-5p ja miR-21 ovat tunnettuja kasvaimia synnyttävän toiminnan [2,3], kun taas, miR-15a, miR-16-1, anna-7 ja miR-145 toimivat tuumorisuppressoreilla [ ,,,0],4-9]. On osoitettu, että miR-200c ilmentyy differentiaalisesti haimasyövän, jossa korkea ekspressio liittyi parempi eloonjääminen ja alhainen ilmentyminen liittyy elinajan [10]. Yli-ilmentymisen miR-200c estää syöpäsolujen invaasiota moduloimalla tekijät tärkeitä EMT [10]. Ektooppinen ilmentyminen miR-200c indusoi korkeampia E-kadheriinin rintasyövän ja haimasyövän soluja kautta kohdistaminen suoraan transkriptiotekijän 8 (TCF8 /ZEB1), negatiivinen säätelijä E-kadheriinin [11-14]. Siksi soluja korkea miR-200c on enemmän epiteelin ja vähemmän mesenkymaaliset fenotyypin, joka saattaa vaikuttaa etäpesäke. Äskettäin yliekspressio miR-200c on osoitettu estävän melanooma kasvaimen etenemistä ja lääkeresistenssin [15].

Poikkeava ilmentyminen musiiniglykoproteiinien liittyy haiman syövän etenemisessä etäpesäkkeiden. Transmembraaninen musiinien, MUC4 ja MUC16 ovat poikkeavasti yliekspressoituu monissa adenokarsinoomat, kuten ihmisen haimasyövän [16-18]. MUC4 musiinin on suuri glykoproteiini ilmaistaan ​​epiteelisolujen erilaisissa kudoksissa. MUC4 ei ilmenny normaali haima, mutta on poikkeavasti ilmaistaan ​​suuri osa pahanlaatuista edeltävien ja pahanlaatuisten haiman leesioiden [16,19]. MUC4 edistää syövän kasvua ja etäpesäkkeiden osittain vuorovaikutuksessa HER2 onkoproteiinia [20,21]. MUC16 (CA125) on molekyylipainoltaan suuri musiinituoton glykoproteiini normaalisti ilmaistu silmän pinnalla, hengitysteiden ja sukupuolielimiin sisältäviä epiteelisolujen [22]. CA125, epitoopin MUC16, käytetään tuumorimarkkeri havaitsemiseksi munasarjasyövän potilaiden seerumeista [23] ja MUC16 vaikuttaa munasarjasyövän kasvuun ja etäpesäkkeiden [24]. Lisääntynyt ilmentyminen MUC16 havaitaan myös ihmisen haimasyövän [17,18], ja olemme hiljattain osoittaneet, että on lisääntynyt ilmentyminen etäpesäkeleesioita haimasyövän potilaille [25].

Tässä raportoidaan että asennuspalveli- 200c vuorovaikutuksessa erityisten sekvenssien koodaavan sekvenssin MUC4 ja MUC16 mRNA: iden ja säätelee niiden ekspressiotasot. Korkeampi ilmentymä transmembraanisen musiinien ja menetys miR-200c erittäin liittyy metastasoituneen ominaisuuksiin syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

Ihmisen haimasyöpäsoluissa Capan-1 (American Type Culture Collection, ATCC), S2.007, S2.013, S2.020, S2.028 [26], HPAF (Antelias lahja RS Metzgar, Department of Microbiology ja immunologian, Duke University Medical Center, Durham. North Carolina), ja T3M-4 (Kind lahja Tetsuro Okabe, University of Tokyo, Japan), kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM) (Hyclone, Logan, UT, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Valley Biomedical Inc., Winchester, VA, USA), 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä (Mediatech Inc., Manassas, VA, USA) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 kosteutetussa inkubaattorissa.

microRNA eristäminen ja Reaaliaikainen-PCR (RT-PCR) analyysi miR-200c

miRNA uutettiin haimasyövän soluja käyttäen Mirvana miRNA eristyspakkausta (Ambion, Carlsbad, CA, USA). Expression of miR-200c kvantifioitiin käyttäen TaqMan MicroRNA iinianalyysikitissä (ABI, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan.

miRNA-200c yliekspressio S2.028 ja T3M-4 haimasyövän solulinjoissa

oligonukleotidit ensisijainen transkriptio miR-200c kloonattiin p

Äänenvaimennin

4.1-CMV-plasmidin (Ambion, Carlsbad, CA, USA) (taulukko S1) luoda vakaa ekspressiovektoriin. Solut ympättiin 75 x10

3 solua per kuoppa (12-kuoppaisen levyn) päivä ennen transfektiota, ja 1 ug plasmidia transfektoitiin soluihin seuraavana päivänä käyttäen Lipofectamine LTX kanssa PLUS-reagenssia (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. Solut asetettiin valinta G418 (200 ug /ml) 48 tuntia transfektion jälkeen. Kloonit alkavat sen jälkeen ja analysoitiin miR-200C ilmentymistä S2.028 solulinjassa (klooni 7), kun taas polyklonaalinen valitun väestö hyödynnetty T3M-4 solulinjassa. Solut, jotka on transfektoitu sekoitetun sekvenssin sisältävän vektorin sarjasta (Ambion, Carlsbad, CA, USA) toimi negatiivisena kontrollina. Expression of miR-200c kvantitoitiin käyttäen TaqMan MicroRNA iinianalyysikitissä (ABI, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. U6 rRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. Kertamuutoksen ilmentymisessä laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmä [27].

metyleenisini- proliferaatiomääritystä

Solun lisäkasvua tutkittiin käyttämällä metyleenisinistä solu väriainetta aikaisemmin kuvatulla tavalla [28]. S2.028 ja T3M-4-ohjaus ja miR-200c ilmentävät solut laskettiin ja maljattiin 2000 solua per kuoppa 96-kuoppaiselle levylle ja kokonais- tilavuus 200 ui, kahdeksan rinnakkaista kunkin aikakehyksen. Kunakin ajankohtana (24, 48, 72 ja 96 tuntia), väliaine poistettiin ja solut pestiin kerran 150 ul: Dulbeccon PBS: llä ja kiinnitettiin 150 ul: 10% formaliinilla 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Formaliini poistettiin ja solut värjättiin 2 tuntia 80 ul: n 1% metyleenisinisellä (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), laimennettiin 0,01 M boraatti- puskurissa, pH 8,5. Solut pestiin 150 ui 0,01 boraattipuskuria, pH 8,5, neljä kertaa. Metyleenisininen uutettiin 100 ul: lla 0,1 N HCl /etanoli (1: 1) ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Absorbanssi 650 nm: ssä määritettiin spektrofotometrisellä analyysillä. Kaksisuuntainen ANOVA käytettiin analysoimaan tilastollista eroa ryhmien välillä. P-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Reaaliaikainen PCR (RT-PCR) analyysi musiiniekspressiota

Kokonais-RNA eristettiin S2.028 ja T3M-4-soluja käyttäen TRI Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. cDNA syntetisoitiin käyttämällä Verso cDNA Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Analyysi MUC1, MUC4, MUC16 ja GAPDH mRNA tehtiin SYBR Green PCR Master Mix (ABI, Carlsbad, CA, USA). Seuraavia alukkeita käytettiin RT-PCR: MUC1, F-5-CTGCTCCTCACAGTGCTTACAGTTG-3; R-5- TGAACCGGGGCTGTGG CTGG-3; MUC4, F-5-GCCCAAGCTACAGTGTGACTCA-3; R-5-ATGGTGCCGTTGTAATT TGTTGT-3; MUC16, F-5-ACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAA-3; R-5-ACCAGTGGGCAT TCCAGAAAGAGA-3; GAPDH, F-5-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3; R-5-ACCAA ATCCGTTGACTCCGACCTT-3. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Erot musiinigeeniekspressiolle, ilmaistuna fold-muutoksia, laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä käyttämällä GAPDH sisäisenä kontrollina.

immunoblot-analyysi Musiinit

SDS-agaroosigeelielektroforeesi käytettiin analysoimaan musiiniekspressiota kuten aiemmin on kuvattu [29]. Solut, jotka ilmentävät miR-200c tai sekoitetun ohjaus kerättiin ja proteiini uutettiin käyttäen NP-40-solujen hajotuspuskuria (150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCl: a, 1% NP-40, pH 8,0), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoreita (Promega, Madison, WI, USA). Solulysaateista (50-100 ug proteiineja) erotettiin SDS (0,1%) – agaroosi (2%) geelielektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl), jossa oli 0,1% Tween 20, pH 7,4. Kalvot inkuboitiin seuraavan ensisijaisen vasta: MUC1 (AR20.5-hiiri IgG, Quest Pharmatech Inc, Edmonton, Alberta, CA), MUC4 (8G7- hiiri IgG, ystävällinen lahjoitus tri Surinder K Batra, Biokemian ja Molecular biology, UNMC), MUC16 (AR9.6R333 hiiri IgG, Quest Pharmatech Inc, Edmonton, Alberta, CA) ja α-tubuliinin (Mouse IgG, Developmental tutkimukset hybridoma pankki, Iowa, USA) (1: 1000 laimennosta 5% ei -fat kuivamaitojauhetta TBS-T), yön yli huoneenlämpötilassa. Membraanit pestiin sen jälkeen (3 x 10 min) ja TBS-T huoneenlämpötilassa ja tutkittiin 1: 5000 laimennettua vuohen anti-hiiri-HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin 3 x 10 min TBS-T. Signaali havaittiin Super signaali

® West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo tieteellinen, Rockford, IL, USA). Densitometristä kvantifiointi MUC4 ja MUC16 Proteiinivyöhykkeet suoritettiin käyttäen ImageJ (NIH-). Kansi muutos proteiinin kaistan intensiteetti (prosenttia mielivaltaisina yksikköinä) laskettiin jakamalla proteiinin tiheys miR-200c ilmentävien solujen proteiini tiheys vektorisäädön soluja. Detection of alpha tubuliinin käytettiin latauskontrollina.

Vector rakentaa

ORF alueilla MUC16 ja MUC4 mRNA, joka ennustettiin vuorovaikutuksessa miR-200c syntetisoitiin ja insertoitiin pMIR-REPORT

TM miRNA Expression Reporter Vector-järjestelmä (ABI, Carlsbad, CA, USA) käyttäen Spel ja Hindlll restriktiokohdat (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA). Villityypin ja mutantti-MUC4 ja MUC16 /miR-200c vuorovaikutukset sekvenssit syntetisoitiin ja käytettiin tässä tutkimuksessa (taulukko S1). Mutaatiot mahdollisia miR-200c sitoutumiskohtia luotiin nukleotidin korvaaminen villityyppisen sekvenssin estävän miR-200c sitova. Lisäyskohta ja fragmentin orientaatio varmistettiin sekvenssianalyysillä. Plasmidit nimettiin pMIR-REPORT

TM-villi (MUC16 ja MUC4 paino) ja pMIR-REPORT

TM-mutantti (MUC16 ja MUC4 mt) (taulukko S1).

Transfektio ja Lusiferaasimäärityksiä

haimasyöpä (S2.028 ja T3M-4) soluja viljeltiin 6-kuoppaisella levyllä ja transfektoitiin ohimenevästi 60-80% yhtymäkohdassa plasmideilla edellä on esitetty käyttäen Lipofectamine

TM 2000-reagenssia (Invitrogen life Technologies, Carlsbad, CA, USA) kohti valmistajan ohjeiden. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen Luciferase Reporter Assay järjestelmät (Promega, Madison, WI, USA), 48 h transfektion jälkeen. Lusiferaasimäärityksiä suoritettiin mukaan valmistajan ohjeita 96-kuoppaisen levyn lukijaa (Polar Star Optima Microplate Reader, Offenburg, Saksa). Kaikki arvot esitetään keskiarvona ± SEM suhteellisen lusiferaasiyksiköt (RLU) kolmesta itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Parittomalla t-testillä (kaksisuuntainen) suoritettiin tilastollista analyysiä käyttäen GraphPad PRISM® Version 5.0 ohjelman. Erot joiden p-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

miR-200c: ilmentymisen profilointi ja yli-ilmentymisen haimasyövän solulinjoissa

Tutkimme ilmaisua miR-200c 7 haimasyövän solulinjojen kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä. Kuten kuviossa 1A on esitetty, 5 haimasyövän solulinjoissa, mukaan lukien Capan-1, S2.007, S2.013, S2.028, ja T3M-4, ilmaista korkeampi miR-200c kuin S2.020 ja HPAF soluja.

(A) ilmentyminen miR-200c seitsemässä haimasyöpäsoluissa määritettiin Reaaliaikainen PCR. Kukin näyte ajettiin neljänä kappaleena ja virhepalkkeja edustavat SD. S2.028 (B) ja T3M-4-solut (C), jotka ilmentävät stabiilisti ensisijainen transkriptio miR-200c arvioitiin miR-200c ekspression reaaliaikainen PCR. Kukin mittaus suoritettiin kolmena kappaleena. Nämä arvot normalisoitiin sisäisen valvonnan U6 rRNA. Taitteen nousu transkriptipitoisuuksissa yli vektorisäätö ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. P-arvo määritettiin käyttämällä Studentin t-testiä. Erot joiden p-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi.

kypsän sekvenssin miR-200c syntetisoitiin ja kloonattiin ekspressiovektoriin, kuten edellä on kuvattu (p

Äänenvaimennin

4,1-CMV-miR-200c) ja stabiilisti ilmaistu S2.028 soluissa ja T3M-4. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi miR-200c ilmentymisen S2.028-miR-200c soluista osoitti 3,68 kertainen lisäys ja T3M-4-miR-200c soluista osoitti 2,6 kertainen lisäys kypsän miR-200C tasot verrattuna vektorisäätö transfektoitujen solujen (Kuvio 1B ja 1C). Olemme vahvisti, että yhdistelmä-DNA-kypsän muodon miR-200c oli aktiivinen tarkkailemalla downregulation in ilmentymisen ZEB1, tunnettu tavoite miR-200c, sekä S2.028 ja T3M-4-soluja (kuvio S1).

Tutkimme myös muutoksia solujen lisääntymisen ominaisuudet miR-200c ilmentävät S2.028 ja T3M-4 haimasyöpä soluja. Merkittävä väheneminen kasvuvauhti S2.028 miR-200C havaittiin 72 ja 96 tuntia (*** p 0,0001) verrattuna S2.028 vektorisäädön soluja (kuvio S2A). Kuitenkin, ei havaittu mitään muutosta, kun T3M-4 miR-200c verrattiin vektorisäädön solujen tahansa ajankohtana testattiin (kuvio S2B).

MUC4 ja MUC16 ilmentyminen on tukahdutettu miR-200c

Arvioimme kykyä miR-200C säädellä kalvoon sitoutunut musiineilla ilmaisemalla miR-200c (p

Äänenvaimennin

4.1-CMV-miR-200C) haimasyövän solulinjoissa S2.028 ja T3M-4. Oli dramaattinen väheneminen MUC4 proteiinin S2.028-miR200c (1,7-kertainen) ja T3M-4-miR-200c (4,46-kertainen) solujen suhteessa kontrollisoluihin (kuvio 2A ja 2B). Samoin oli merkittävä väheneminen MUC16 proteiinia (korkea ja matala molekyylipaino isoformit) in S2.028-miR200c (18,1 ja 5,9 kertaiseksi) ja T3M-4-miR-200c (5,2 ja 6,1 kertaiseksi) soluihin verrattuna kontrollisolut (kuvio 3A ja 3B).

Lysaatit (A) S2.028 ja (B) T3M-4-miR-200c ja vastaavan vektorin kontrolli transfektoidut solut erotettiin SDS-agaroosigeelielektroforeesi, suoritettiin Länsi blot käyttäen anti-MUC4 vasta-aine (vasemmanpuoleiset paneelit) ja signaalit kvantitoitiin densitometrillä ja analysoitiin käyttämällä ImageJ ohjelmaa (oikea paneeli). MIR-200c ilmentäviä soluja oli merkittävä väheneminen MUC4 proteiinin verrattuna kontrolliin soluja (A) S2.028 ja (B) T3M-4-soluja. Detection of alpha tubuliinin käytettiin latauskontrollina.

(A) S2.028 ja (B) T3M-4-miR200c ja vastaavan vektorin ohjaus transfektoituja solu- lysaatit erotettiin SDS-agaroosigeelielektroforeesi ja alistettiin western blot käyttäen anti-MUC16 vasta-aine (vasemmanpuoleiset paneelit). Band intensiteetti kvantifioitiin densitometrialla ja analysoitiin käyttämällä ImageJ ohjelmaa (oikea paneeli). Merkittäviä vähennyksiä sekä korkean ja matalan molekyylipainon MUC16 proteiini-isoformit havaittiin miR-200c ilmentävät S2.028 (A) ja T3M-4-solut (B) kuin verrattuna vektorisäädön soluihin. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina.

miR-200c tavoitteet kopiointia kalvoon sitoutunut musiinien MUC4 ja MUC16

Havaitsimme myös merkittävä väheneminen sekä MUC4 ja MUC16 mRNA tasot miR200c ilmentäviä solulinjoja. MUC4 transkriptien vähenivät 4,18 ja 8,50-kertaisesti S2.028-miR200c ja T3M-4-miR200c (kuvio 4A ja 4B) verrattuna kontrollisoluihin. MUC16 transkriptien vähenivät 4,68 ja 4,82-kertaisesti S2.028-miR200c ja T3M-4-miR200c vastaavasti, verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 4C ja 4D). Nämä havainnot osoittavat, että miR-200c säätelee ilmentymistä onkogeenisten MUC4 ja MUC16 transkription ja translaation.

qRT-PCR-analyysi MUC4 (A ja B) ja MUC16 (C ja D) suoritettiin vektorisäädön ja miR -200c transfektoitu S2.028 (A ja C) ja T3M-4-soluja (B ja D). Suhteellinen ekspressio MUC4 ja MUC16 arvioitiin 2

-ΔΔCt menetelmällä käyttäen GAPDH sisäisenä kontrollina. MIR-200c ilmentäviä soluja (S2.028 ja T3M-4) osoitti merkitsevästi alhaisempia MUC4 mRNA: iden verrattuna vektorisäädön soluja (A ja B). Expression of MUC16 transkriptin väheni miR-200c ilmentävät S2.028 ja T3M-4-soluja (C ja D). Kaikki mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Taitteen nousu transkriptipitoisuuksissa yli vektorisäätö ilmaistiin keskiarvona ± S.D. P-arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

ennustaminen miR-200c sitovat sekvenssit MUC4 ja MUC16

Mahdolliset miR-200c kohdistaminen alueiden MUC4 ja MUC16 selostukset tunnistettiin käyttämällä RegRNA MicroRNA tavoite ennustus web-palvelimen (https://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). RegRNA miRNA tavoite ennustaminen tunnistaa korkea todennäköisyys miR-200c sitoutumisen koodaussekvenssit MUC4 välillä emäsparien 820-842 (eksoni-1) (kuvio 5A) (kuvio S3) ja kymmenen eri alueilla, mukaan luettuna yhdeksän eri eksonien MUC16 mRNA-sekvenssin (kuvio 5B) (kuvio S3). Nämä tiedot johtivat meidät onko miR-200c voi suoraan kohdistaa MUC4 ja MUC16 selostukset sisällä luetut alueet.

Mahdolliset miR-200c kohdistaminen alueisiin MUC4 ja MUC16 tunnistettiin käyttämällä RegRNA MicroRNA tavoite ennustus web-palvelin ( https://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). A, RegRNA miRNA tavoite ennustus osoittaa, että miR-200c sitoo välillä emäsparia 820-842 ensimmäisessä eksonissa MUC4. B, MUC16 mRNA, MIR-200C ennustetaan sitoutuvan yhdeksän eri eksonit lukien E1, E3, E19, E39, E44, E49, E54, E64 ja E73. Numerot osoittavat alueen mRNA: iden, jotka ovat vuorovaikutuksessa miR-200c.

miR-200c suoraan kohdistuu koodaavat sekvenssit MUC4 ja MUC16

arvioitiin sitoutuminen miR-200c, että oletetun kohdesekvenssi kloonaamalla alueet sisältävät ihmisen MUC4 ja MUC16 koodaavat sekvenssit osaksi pMIR-lusiferaasireporttiterilla vektori (pMIR-MUC4 ja MUC16 painosta). Negatiiviset kontrollit valmistettiin jossa pMIR-MUC4 ja MUC16 sekvenssit mutatoitiin oletetun sitoutumiskohtia miR-200c ja musiinit (pMIR-MUC4 ja MUC16 mt) (kuvio 6A). S2.028 ja T3M-4 /miR-200c-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti plasmidi-DNA, joka koodaa pelkästään vektorilla, villityypin MUC4 ja MUC16 sekvenssit vektorissa, ja mutantin tyyppi MUC4 ja MUC16 sekvenssit vektoriin. Havaitsimme, että lusiferaasireportterista aktiivisuus merkittävästi tukahdutti sekä MUC4 ja MUC16 vuonna S2.028 ja T3M-4 miR-200c, jotka on transfektoitu villin tyypin sekvenssin vektorit verrattuna vektorisäädön transfektoituja soluja (*** p 0,0001, MUC4-p- , MUC16-wt vs vektorisäätö) (kuvio 6B-E). Kuitenkin solut, jotka oli transfektoitu mutantti-sekvenssi, joka sisältää vektoreita, osoittivat huomattavasti lusiferaasireportteri- aktiivisuus (*** p 0,0001, MUC4-wt vs MUC4-mt, MUC16-wt vs MUC16-mt), (kuvio 6B-E).

(A) villityypin ja mutatoiduista sekvensseistä MUC4 ja MUC16 kloonattiin pMIR-Luciferase vektori (pMIR-MUC4 paino- ja MUC16 paino) ja (pMIR-MUC4 mt ja MUC16 mt), vastaavasti. Ekspressoivien pMIR-Luc, pMIR-MUC4 wt, pMIR-MUC16 wt, pMIR-MUC4 mt ja pMIR-MUC16 mt transfektoitiin S2.028miR-200c (B ja D) ja T3M-4miR-200c-soluja (C ja E) ja lusiferaasin aktiivisuus kvantitoitiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Tulokset ilmaistaan ​​suhteellisina lusiferaasiaktiivisuutta (keskiarvo ± SEM kolmen itsenäisen määrityksen). P-arvo määritettiin käyttämällä Studentin t-testiä (

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että MIRR-200C tavoitteet korkea molekyylipaino musiiniglykoproteiinien by kohdistaminen niiden koodaavat sekvenssin hajoamisen tai translaation inhibition. Erityisesti miR-200c tavoitteet MUC4 ja MUC16 eksonisekvenssejä säädellä mRNA: n ja proteiinin tasot kullekin näistä musiinien. Olemme osoittaneet, että miR-200c ilmentyy differentiaalisesti haiman syöpäsoluissa. Yu et al havaittiin merkittävästi suurempi eloonjäämisaste haimasyövän potilaille, joilla on korkeampi miR-200C verrattuna alemmilla miR-200C [10]. Aiemmissa tutkimuksissa on myös osoittanut, että haiman syöpäsoluja yli-ilmentävät miR-200C näytteille vähensi hyökkäyksen ja lisääntynyt tasot E-kadheriinin mRNA, mikä viittaa siihen, että miR-200c näyttelee estävä rooli haimasyövän kasvua ja invaasiota [10]. yliekspressio miR-200C korotettiin leviämisen puku-2, PANC-1 ja KP-3 haimasyöpä soluihin [10], mutta havaitsimme alentunut solujen lisääntymistä S2.028 miR-200c ilmentävien solujen, mikä viittaa siihen, että solujen kasvu ominaisuudet differentiaalisesti säätelee miR-200c ovat yhteydessä riippuvaisia. MiR-200c on kuvattu voimakas master säädin epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon rinta- ja munasarjasyövän solujen läpi muuttamalla ilmentymä ZEB1 ja E-kadheriinin sitoutumalla 3 ’UTR: t ja ajo hajoamista tai estämällä translaation kohde-mRNA: [11-14]. Palauttaminen miR-200c ilmentymistä erittäin aggressiivinen rinta- ja munasarjasyövän solujen vähensi hyökkäyksen, muuttoliike ja lääkeresistenssin näiden kasvaintyypeille [30,31]. Nämä raportit viittaavat siihen, että käyttöönotto miR-200c syöpäsoluiksi voisi kääntää kasvainprogression ja aikaan uudenlainen hoitostrategia.

Suurin osa raportit osoittavat, että miRNA kohdistaa koodaamattoman 3’UTR mRNA; Kuitenkin viime aikoina raportit ovat osoittaneet, että miRNA myös kohdistaa koodaussekvenssit nisäkkäiden geenien. Me raportoimme tässä, että miR-200c tavoitteet eksoni koodaavat sekvenssit selostukset korkean molekyylipainon musiiniglykoproteiinien MUC4 ja MUC16 ja vähentää mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen. Vastaavasti, Huang et ai, on raportoitu, että miR-181 on kohdistettu suuri määrä sinkkisormi geenien sitoutumalla niiden koodaavat sekvenssit [32] ja Duursma et ai raportoi, että miR-148 tavoitteet ihmisen DNA metyylitransferaasi 3b (DNMT3b) aminohapon koodaavan alueen [ ,,,0],33]. Let-7 miRNA kohdistuu koodaavan alueen miRNA käsittely entsyymin, Dicer [34]. Hiiren Nanog, Oct4 ja Sox2 geenit sisältävät useita sitoutumiskohtia eksonissa koodaussekvenssit luonnossa esiintyvien miRNA [35]. Nämä raportit viittaavat siihen, että miRNA kohdistaa tiettyihin geeni perheitä koodaavat alueet.

asetukseen MUC4 ja MUC16 by miR-200c voi olla kautta vaikutuksia joko transkription tai translaation. Sekä solulinjat tutkittiin tässä, MUC16 proteiinin tasot alenivat suuremmassa määrin kuin MUC4. Tämä lisääntynyt kohdentuminen MUC16 by miR-200c voi johtua läsnäolon kymmenen eri miR-200c sitovat alueet MUC16 mRNA verrattuna yksittäinen sitova alue MUC4 koodaavan sekvenssin, nostaa sitä mahdollisuutta, että määrä kohdistaminen sivustoja transkriptio vaikuttaa herkkyys, joka tekstityksen miRNA sääntelyä.

Äskettäin Ponnusamy ym raportoitu, että yliekspressio MUC4 johtaa epiteelin ja mesenkymaalitransitioon kautta alas säätely E-kadheriinin ja lisäsi syöpäsolujen muuttoliikkeen ja hyökkäyksen munasarjasyövän soluihin [36]. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​Tutkimuksessamme joka osoittaa, että yli-ilmentyminen mesenkymaalisten epiteeli- edistämiseen miR-200c alas säätelee ZEB1 ja MUC4 haiman syöpäsoluja.

MUC16 on erittäin yli-ilmennetään munasarjasyövän ja kohtalaisen yli-ilmentynyt haimasyövän , mutta rooli MUC16 haimasyövän etenemisessä ei ole laajasti tutkittu. Merkittävästi alentunutta MUC16 havaittu miR-200c yliekspressoivia soluja, yhdessä hyvin dokumentoitu rooli miR-200c monissa vaiheissa syövän etenemistä viittaa siihen, että MUC16 voi olla rooli haimasyövän solujen kasvua ja etäpesäkkeitä. Nämä tutkimukset osoittavat, että säätely ylöspäin musiineja ja downregulation miR-200C parantaa syöpäsolun pahanlaatuinen ominaisuudet ja siten aiheuttaa haimasyövän kasvua ja etäpesäkkeiden.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava ja lisääntyneen ilmentymisen MUC4 ja MUC16 tapahtuu aikana haimasyövän etenemisen etäpesäkkeiden [17-19,25]. Äskettäin Mohr et al osoittivat miR-200c ilmentyminen väheni ensisijaisen haiman kasvain kudosten verrattuna joihinkin metastaasien [37]. Nämä tulokset yleisesti tukevat olettamusta, että vaihtelut miR-200C edistää sääntelyn ilmentymisen MUC4 ja MUC16 aikana haiman syövän etenemiseen ja etäpesäkkeitä.

Yhteenvetona Tutkimuksemme esittelee ensimmäisen näyttöä siitä MUC4 ja MUC16 säännellään transkription jälkeisellä tasolla sellaisen miRNA, miR-200c, jotka suoraan suunnattu MUC4 ja MUC16 niiden aminohappoa koodaavat alueet. Nämä tulokset osoittavat, että miR-200c voi olla potentiaalinen estävä rooli haimasyövän kasvua ja etäpesäkkeiden ja lisätutkimuksia tarvitaan rajata sääntelyn välinen suhde kalvoon sitoutunut musiinien ja miR-200c.

tukeminen Information

Kuva S1.

qRT-PCR-analyysi ZEB1. Yliekspressio miR-200c vähensi merkittävästi ekspressiota ZEB1 sekä (A) S2.028 ja (B) T3M-4-soluja. Taitteen nousu transkriptipitoisuuksissa yli vektorisäätö ilmaistiin keskiarvona ± S.D. P-arvo on alle 0,05 katsotaan olevan tilastollisesti merkitsevä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0073356.s001

(EPS)

Kuva S2.

Soluproliferaatiomääritys. S2.028 (A) ja T3M-4 (B) (miR-200c ja vektorisäätö) solujen lisääntymistä eri ajankohtina mitattiin metyleenisineä määrityksessä. Kaksisuuntainen ANOVA saamiseksi käytettiin tilastollista merkittävyyttä (***, p 0,001; NS, ei-merkitsevä).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0073356.s002

(EPS) B Kuva S3 .

ennustaminen miR-200c sitoutumiskohtiin in musiineja. Mahdolliset miR-200c sitoutumiskohdat kalvoon sitoutunut musiinien (MUC4 ja MUC16) transkriptien tunnistettiin käyttämällä RegRNA MicroRNA tavoite ennustajan web-palvelin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0073356.s003

(EPS)

Taulukko S1.

Luettelo käytetyt oligonukleotidit miR-200c ilmaisun ja lusiferaasimäärityssysteamiä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0073356.s004

(DOCX) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori David Kelly asiantuntija teknistä apua lusiferaasianalyysissä.