Krooninen sairaus

tiivistelmä

hotspot AKT1

E17K mutaatio pleckstrin homologiadomeeni of AKT1 esiintyy noin 0,6-2% ihmisen keuhkosyövässä. Viime aikoina olemme osoittaneet, että AKT1

E17K muuttuu kuolemattomaksi ihmisen keuhkoputken solujen. Täällä käyttämällä siirtogeenisiä Cre-indusoituvaa hiiren -kannan villityypin Rosa26 (R26) lokukseen (

R26-AKT1

E17K

hiiret) osoitamme, että AKT1

E17K on

rehellisistä

onkogeenin ja on rooli kehittämisessä keuhkosyövän

in vivo

. Itse asiassa, me raportoimme että mutantti AKT1

E17K indusoi keuhkoputken ja /tai keuhkoputkien hyperplastista solumuutoksia hiiren keuhkon epiteelin, joka edistystä Frank kohdunkaulan hyvin matalilla taajuuksilla, ja kiihdyttää kasvaimen muodostumisen aiheuttama kemiallinen karsinogeenien. Lopuksi AKT1

E17K indusoi liikakasvu hiiren keuhkon epiteelin

in vivo

ja yhteistyössä uretaani aiheuttamaan täysin pahanlaatuinen fenotyyppi.

Citation: Malanga D, Belmonte S, Colelli F, Scarfò M, De Marco C, Oliveira DM, et al. (2016) AKT1

E17K Onko onkogeeninen Hiiren Lung ja yhteistyössä Chemical Syöpää indusoimisessa Lung Cancer. PLoS ONE 11 (2): e0147334. doi: 10,1371 /journal.pone.0147334

Editor: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), ESPANJA

vastaanotettu: 30 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 01 tammikuu 2016; Julkaistu: 09 helmikuu 2016

Copyright: © 2016 Malanga et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC 2012-14, IG_12969) ja Ministero Istruzione Università e Ricerca (MIUR PRIN, prot. 2010W4J4RM_001 , PONa3_00239, PON01_02782) ja GV. HF tukivat Västra Götalandsregionen alla LUA /ALF sopimuksessa sekä toisaalta Assar Gabrielssons ja Magnus Bergvalls Foundations.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien, liittyessä 5 vuoden maailmanlaajuinen eloonjäämisaste alle 15% [1,2]. Mutaatiotapahtumaa aktivointi kasvutekijän reseptorin (EGFR) koulutusjakso on tärkeä patogeeninen tapahtuma kuin tupakan aiheuttama adenokarsinooma (ADC), kun taas reitin ohjaavat v-Ki-ras2 /Kirsten rat sarkooma viruksen onkogeenin homologi (KRAS) osallistuu tupakka-välitteisen keuhko syövän synnyn [3-6]. Valitettavasti aktivoivat mutaatiot EGFR eivät tyypillisesti ole läsnä keuhkojen okasolusyöpä (SCC), toiseksi yleisin NSCLC [7], ja näin kohdennettu hoito on tehotonta. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat 2-4% osuus p110 α-katalyyttisen alayksikön PI3K (PIK3CA) mutaatiot [8-10] ja 1% osuus AKT1 mutaatioiden [11,12] SCC ovat ehdottaneet, että kohdistaminen nämä geenit voivat osoittautua onnistunut terapeuttinen vaihtoehto [7,13-15].

AKT kinaasien (AKT1, AKT2, AKT3) edustaa ensisijaista alavirran päätepiste fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) reitin, säännellään lisääntymistä, eloonjääntiä, aineenvaihduntaa ja invaasio. AKT1 ja AKT2 usein aktivoituvat ihmisen syövässä [16-18] Seuraavat menetys rasva fosfataasin PTEN, aktivoivat mutaatiot ja /tai kopioida numeron vaihtelua EGFR tai HER2 tyrosiinikinaasireseptorit, aktivoivat mutaatiot KRAS, vuonna PIK3CA [19,20]

, [21] tai AKT1 itse [22]. Vuonna keuhkosyöpä somaattisen mutaation pleckstrin homologia (PH) verkkotunnus AKT1 joka aiheuttaa glutamiinihappoa ja lysiiniä tähteessä 17 (E17K) oli raportoitu yleinen esiintyvyys 0,6-2% [7,11,12,23-25 ].

AKT1

E17K osoittaa lisääntynyt affiniteetti PI (4,5) P2, parannettu solukalvon rekrytointi ja konstitutiivisen aktivaation [22,26]. Endogeeninen AKT1

E17K mutantti proteiini havaitaan keuhkosyöpäsoluissa esittää parannettu membraanilokalisaatiota [11], joka johtaa aktivaatioon alavirran signalointia [11,22].

rooli mutantin AKT1

E17K epiteeli- kasvainten synnyssä on epäselvä, koska tutkimukset solujen malleja rinta- ja keuhkojen solut ovat tuottaneet ristiriitaisia ​​tuloksia [27-30]. Lisäksi mitään hiiren kanta, joka mallintaa AKT1

E17K mutaatio on tuotettu toistaiseksi.

Nämä seikat sai meidät puuttumaan rooliin AKT1

E17K muutoksessa keuhkon epiteelisolujen

in vivo

. Tässä osoitamme, että AKT1

E17K edistää liikakasvua hiiren keuhkoissa ja tekee yhteistyötä muiden geneettisten vaurioiden aiheuttamaan koko maligniteetti.

Materiaalit ja menetelmät

vektori suunnittelu ja tuottaminen siirtogeenisiä hiiriä

tuottaa

R26-AKT1

E17K

siirtogeenisiä hiiriä ihmisen AKT1 cDNA monistettiin PCR: llä ihmisen veren mononukleaaristen solujen PCR: llä käyttäen alukkeita 5′-ATGAGCGACGTGGCTATT- 3 ’ja 5′-TCAGGCCGTGCCGCTGGC-3’. PCR-tuote kloonattiin sukkula plasmidiin (pBluescript) käyttämällä standardeja kloonaus- tekniikoita. Mutant AKT1

E17K cDNA syntyy Quick Change Site-Direct mutageneesi (Stratagene) ja osa-kloonattiin pROSA26 vektoriin [31-33] saamiseksi kohdennuskonstruktissa pR26-AKT1

E17K, joka koostui 5 ’ ja 3 ’homologia käsivarret ROSA26 lokuksen, FRT /FRT-reunustavat neomysiiniresistenssin (Neo) kasetti ja loxP /loxP-reunustavat kolminkertainen polyadenylaatio- (TPA) järjestyksessä. Katso kuva 1 lisätietoja.

. Kaaviokuva kohdennuskonstruktissa käytetään ehdollisen knock-in

R26

lokuksessa. Ihmisen

AKT1

E17K

cDNA edeltää loxP-reunustavat transkription stop-kasetti, rekombinoitiin R26 lokukseen. Cre-välitteinen poistaminen lopettaa kasetin yhdistää Rosa26 eksonin 1 eksogeeninen cDNA mahdollistaa siirtogeenin ekspressiota. B. Southern blot EcoRV pilkottu genomista DNA johdettu mESCs transfektoitu kohdennuskonstruktissa kuljettavat mutantti AKT1. Kaista 1: DNA kohdentamattomaan mESCs, kaista 2 ja 3: DNA DNA kahdesta eri

R26-AKT1

E17K

mESCs kantoja. Endogeeninen alleeli vastaa 11,5 kb: n vyöhyke (

WT

); mutantti alleeli vastaa 4,3 kb: n vyöhyke (

REC

). C. suhteellinen mRNA-ekspressiota ihmisen AKT1

E17K Q-RT-PCR: llä kohdistettujen mESCs ja vastaavien solujen, jotka oli transfektoitu Flp (pFlpE-IRES-Puro) tai Cre-rekombinaasin (Pcre-IRES-Puro). Tiedot ovat rinnakkaisia ​​kokeita keskiarvona ± SD. *** P 0,001. D. Genotype analyysi PCR hännän kärki DNA muuntogeenisten hiirten kuten.

30 ug ja R26-AKT1

E17K plasmidia linearisoitiin SfilAlä restriktioentsyymillä (New England, Biolabs) ja elektroporaatiolla hiiren alkion kantasoluja (mESC). G418-resistenttejä mESC kloonia eristettiin ja seulottiin oikea kohdentaminen lokuksen PCR (alukkeet F1 ja R1, vastaavasti: 5′-AGGGAACGCAGGGAGACTGAGGTGACCCTTCTTT-3 ’, 5′-GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGC-3) monistetaan 3,9 kb: n fragmentti. PCR-positiivinen G418-resistentit kloonit seulottiin tämän jälkeen Southern blot koettimena 5’rekombinaation risteyksessä. Kun tunnistaminen, kohdennettu mESC kloonit transfektoitiin Fip ekspressoivan plasmidin (pFlpE-IRES-Puro) varten leikkaamalla Neo kasetin. Sen jälkeen, Neo-poistetaan mESC kloonit eristettiin, seulottiin PCR (alukkeet F2 ja R2, vastaavasti: 5’-CGGCCTCGACTCTACGATACCGTCGATCC-3 ’, R2 5′-GGATCGAGATCTGATAACTTCGTA-3’) ja injektoidaan B6 blastokysteihin, jotka myöhemmin siirrettiin pseudo -pregnant naaraat kimeeristen eläinten alkion kantasoluilla Facility IRGS (Ariano Irpino, Avellino, Italia). Syntyvä -kimeeriä kasvatettu perustaa iturataan siirto ihmisen alleelin. Genotyyppien

R26-AKT1

E17K

hiirissä määritettiin PCR: llä käyttäen genomista DNA: ta eristettiin hännän vihjeitä seuraavilla alukkeilla: 5’ARMF, 5′-AACTGCAGACTTGTGGGATAC-3 ’ ; 3’ARMR, 5’-ATATTAGTCCACCTCACTCCT-3 ’; mE17KR5 5’-GCCAACCCTCCTTCACAATA-3 ’.

R26-AKT1

E17K

linja astutettiin

Ttf1-Cre

linja (lahja Dr. Mario De Felice, IRGS, Ariano Irpino, Italia ), tuottaa

R26-AKT1

E17K

; Ttf1-Cre;

hiirillä.

Ttf1

-Cre hiiret genotyyppi käyttäen seuraavia alukkeita: FP, 5′-CCTGATGGACATGTTCAGGGACA-3 ’: RP, 5′-GCCAGATCTCCTGTGCAGCATGT-3’.

R26-AKT1

E17K

hiiriä back-ristissä B6 pohjalla. Kaikissa kokeissa littermates käytettiin verrokkeina.

Eläinkokeet hyväksyi paikallinen eettinen komitea ”Comitato Etico per la Sperimentazione animale” (CESA) sekä IRSG ja täyttävät määräykset ja ohjeet Italian ja Euroopan unionin. Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimyksen (S1 ARRIVE tarkistuslista). Hiiriä pidettiin hyvin valvotulla mikrobiologinen ympäristö takaamiseksi SPF olosuhteissa. Ne pidettiin IVC häkeissä, jatkuvasti lämpötila- (22 ± 2 ° C), kosteutta (55% ± 10 UR) ja valo /pimeä sykli 12/12 tuntia. Eläimillä oli vapaa pääsy säteilytetty standardin ruokaan ja juomaan. Hiiret genotyypattiin PCR hännän DNA [34]. Poistamista loxP-reunustavat transkription stop-sekvenssit määritettiin PCR: llä käyttäen seuraavia alukkeita:

TRF, 5′-GGATCGACGGTATCGTAGAGTCGAGGCCG-3 ’;

L2R 5′-GCCAATGAAGGTGCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3′.

Expression of AKT1

E17K in mESCs transfektoitu Pcre-IRES-Puro määritettiin kvantitatiivisen RT-PCR.

Southern blot

vakioprotokolla Southern blot oli käyttää. Genomi-DNA (30 ug) pilkottiin EcoRV: llä. 500bp luotain 5 ’puolen kohdennetun insertion sivuston (alkaen CTTGAAAGTGGAGTAACTAC ja TCAGAAGCTTTGAACTAGAA että ROSA26 lokuksessa) leimattiin DIG-dUTP, käyttäen PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Sveitsi). Tämä koetin havaitsee 11,5 kb: n fragmentti villityypin ROSA26 lokuksen ja 4.3kb fragmentti kohdennettuja ROSA26 lokukseen.

Western Blot ja vasta-aineet

Koko kudosproteiinia uutteet valmistettiin NP-40-puskurilla ( 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40), joka sisältää proteaasi-inhibiittoreita (SigmaFast, Sigma-Aldrich). Western blot analyysi suoritettiin standardimenetelmillä [11]. Anti-fosfo-AKT (Ser473) (# 4058), anti-AKT1 (# 2938), anti-fosfo-FoxO1 (Ser256) (# 9461), anti-FoxO1 (# 2880), anti-fosfo-GSK3-α /β (Ser21 /9) (# 9331), anti-GSK3-α (# 9338), anti-GSK3-β (# 9332) ostettiin Cell Signaling Technology (Danver, MA).

Quantitative käänteinen transkriptio reaaliaikainen PCR (Q-RT-PCR) B

Kokonais-RNA valmistettiin, kuten on kuvattu [35]. RT-PCR suoritettiin RNA uutettiin Trizol (Invitrogen) ja retro-transkriptoidaan SuperScript II (Invitrogen). Q-RT-PCR suoritettiin käyttäen Power SYBR Green PCR Master Mix in ABI Prism 7900 lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems, Foster City, CA). Geenien ilmentyminen normalisoitiin GAPDH mRNA sisältöä. Suhteellisia määriä mRNA: n tai DNA: n laskettiin vertaileva syklin kynnys (CT) menetelmän [36]. Seuraavia alukkeita käytetään Q-RT-PCR

AKT1R26 eteenpäin 5′-CACACCACCTGACCAAGATG-3 ’;

AKT1R26 reverse 5′-AATCAAGGGTCCCCAAACTC-3′.

Virus infektio hiirillä

ohjaus

R26

nd

R26-AKT1

E17K

hiiret infektoitiin 10

6 tai 10

7 pfu adenovirusten ilmentävien Cre (Ad-Cre) (Vector Biolabs, Philadelphia, PA). Hiiret välillä 6 ja 12 viikon iässä nukutettiin isofluraanilla ja Ad-Cre annettiin intranasaalisesti. Hiiret saivat 120 ui Ad-Cre, kahtena annoksena 60 gl, tauko kahden annoksen, jotta hiiret perimään normaalin hengityksen. Ohjaus hiiret saivat yhtä paljon puskurifosfaatin suolaliuosta (S1 ARRIVE tarkistuslista).

Kokeellinen Karsinogeneesi

R26 tai R26-AKT1

E17K

poikueen jälkeläiset joko tartunnan Ad-Cre (10

6-10

7 PFU) tai käsitelty liuottimella yksin ennen kuin saa vatsaonteloon injektio kerta-annos 1 mg /g kehon paino uretaania, joka on etyyliesteri karbamiinihapon laajasti käytetty hiiren malleissa syövän [37], liuotetaan steriiliin 0,9% suolaliuosta. Hiiriä seurattiin viikoittain ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Ei hiiri jouduttiin lopetettiin ennen erityisiä kokeellisia päätepisteen (6, 9 ja 18 kuukauden vastaavasti) terveydellisistä syistä. Hiiret tapettiin sen jälkeen, kun 6, 9 ja 18 kuukautta niskavenytyksellä (S1 ARRIVE tarkistuslista). Keuhkot poistettiin ja täytetään 10% neutraaleja puskuroituun formaliiniin. Keuhkojen kudokset kerättiin ja kiinnitettiin 10% formaliinilla, ja upotettiin parafiiniin standardimenetelmiä käyttäen. Lung leikkuun tehtiin kattamaan 1,5 mm keuhkojen parenchyme; frontaalileikkeitä kerättiin 15 tasoilla 100 pm etäisyys) on päälaen etäisyyttä niin, että siinä sekä reuna-ja keskiosissa. Leikkeet kiinnitettiin objektilaseille ja värjättiin hematoksyliinillä mainos eosiinilla ja tutkittiin valomikroskoopilla eläinlääkärin patologit ja ihmisen patologi (OP, HF ja CM). Kutakin kasvain dia mahdollisimman vaurio halkaisija oli tunnistettu ja tallennettu alla.

Histologinen analyysi ja immunohistokemia

Lung kudokset kerättiin ja kiinnitettiin 10% formaliinilla, ja upotettiin parafiiniin käyttäen normaaleja menettelyjä. Pääluokat (5pm) kiinnitettiin objektilaseille ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla arvioitava valomikroskoopilla eläinlääkärin (OP ja HF) tai ihmisen (CM) patologia. Yhdistetty pisteet hyperplastisten vaurioiden laskettiin lisäämällä pisteet mitataan useissa epiteelikerrosten (Layer pisteet) ja pisteet mittaus prosenttiosuus liikakasvun läsnä koko jakson (Global hyperplasia pisteet). Tason pisteet määriteltiin seuraavasti: pisteet 1, läsnäolo 1-2 kerroksen (s), pisteet 2, läsnäolo 2-3 kerrosta, pisteet 3, läsnäolo 4 kerrosta. Global liikakasvu pisteet määriteltiin seuraavasti: pisteet 1, kun liikakasvu oli läsnä 1-20% kaikista kohdissa analysoitu (3 leikesarjojen /hiiri); pisteet 2, kun liikakasvu oli ihastunut vuonna 21-60% koko kohdissa analysoitu (3 leikesarjojen /hiiri); Pisteet: 3, jolloin liikakasvu löydettiin 61-100% kaikista kohdissa analysoitu (3 leikesarjojen /hiiri).

immuunivärjäytyminen anti-fosfo-AKT suoritettiin vakioprotokollia käyttäen Vectastain Universal Nopea Kit ja DAB Peroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories, Burlingame) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Antigeeni haku suoritettiin mikroaaltouuni hoito antigeenin paljastumista liuokseen (VectorLaboratory, Burlingame, CA) 10 min. Kanin anti-fosfo-AKT (Ser473) (1: 1000, # 4058) ostettiin Cell Signaling Technology.

immuunivärjäytyminen Ki67 suoritettiin vakioprotokollia käyttäen Bond ™ Polymer Tarkenna Detection (Leica Biosystem, Buffalo Grove , IL) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kanin anti-Ki67 (1: 100, PA5-19462) hankittiin Fisher Scientific (Thermo Fisher Sientific, Pittsburgh, PA). Immuunivärjäykseen p21 suoritettiin vakioprotokollia käyttäen EnVision ™ Detection Systems Dako, mukaan valmistajan ohjeiden. Kanin polyklonaalista Ab-5; anti-p21 /WAF1 antiseerumia (01:50) hankittiin Oncogene Research Products (Cambridge, MA). Ki67 ja p21 positiivisuus määritettiin laskemalla positiivinen ytimien 10 pelloilla X400 suurennuksella.

Laser capture mikrodissektion (LCM) B

Mikrodissektiomenetelmiä suoritettiin käyttäen Laser Microdissector Leica LMD6 LMD7 (Leica Microsystem, Milano). 5 um kasvainkudossektioista lasilevyille insertoitiin Laser Microdissector leikkelemiseksi keuhkokasvaimet. Valitut alueet otettiin kiinni infrapuna laserpulssien päälle CapSure Macro LCM Caps.

Direct

Kras

sekvensointi

mikropaloitelluista näytteet hajotettiin SB LysePrep Kit (Silicon Biosystem, Bologna) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alikvootit lyysiliuosta (2,5 ui) käytettiin templaattina DNA-monistuksella seuraavia alukkeita: mKrasF-TCCTAC AGGAAACAAGTA ja mKras R-TTATTTATGGCAAATACA. Monistamiseen käytetty ohjelma oli: 95 ° C /5 min; 35x (95 ° C /30 s, 52 ° C /30 s 72 ° C /30 s) ja denaturointi-, ja laajennus; 72 ° C /7 min lopettaa laajentamista, mitä seuraa jäähdytys 15 ° C: ssa. PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeeleillä ja puhdistettiin QIAquick PCR-puhdistuskittiä (Qiagen). Puhdistettu PCR-tuotteet analysoitiin 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Kaikissa analyyseissä, tiedot linjattu konsensussekvenssin saatu BLAST GenBank-tietokannasta.

immunofluoresenssi

parafiini leikkeet hydratoitiin laskeva etanolin gradientilla ratkaisuja ja huuhdeltiin pesuliuosta (TBST, 0,05 mol /l Tris puskuroidussa suolaliuos kanssa Tween20). Antigeeni haku suoritettiin sitraattipuskurilla, pH 6: ssa 30 minuutin ajan 98 ° C: ssa, jota seuraa pesu fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS, pH 7,4). Leikkeitä inkuboitiin vasta-aineiden SP-C (vuohen polyklonaalinen vasta-aine anti-SP-C, 1: 200 laimennettua, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) tai CC-10 (vuohen polyklonaalinen vasta-aine anti-CC-10, 1 : 200 laimennettua, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) 60 minuutin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin sekundaarisen Alexa Fluor 488-konjugoitu anti-vuohi-IgG-vasta-aineiden (1: 400 laimennos, Santa Cruz Biotechnology) ja 60 min. Solut vastavärjättiin DAPI (2 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), asennetaan käyttäen anti-fade kiinnitysväliaine (DakoEnvision System, Inc, CA, USA) ja havaittiin fluoresenssimikroskopiaan (Leica).

tilastollinen analyysi

Data esitettiin ovat keskiarvoja ± SD

n

riippumattomia määrityksiä tai replikoituu kuten tekstissä. Jatkuva muuttujat analysoitiin Studentin t-testiä tai ANOVA testi, kun taas kategorinen muuttujat analysoitiin χ

2 tai Fisherin tarkkaa testeissä. Merkittävyys laskettiin Log-rank (Mantel-Cox) testi (GraphPad Prizm 5 Software, San Diego, CA).

Tulokset

Mutant AKT1

E17K edistää liikakasvu keuhkoputkien ja bronkioliin

syntyy siirtogeenisen hiiren kanta (

R26-AKT1

E17K

) että ehdollisesti ilmentää ihmisen mutantti AKT1 keuhkoissa käyttämällä knock-in-järjestelmä (Cre ehdollinen

Rosa26

,

R26

), jossa sijaitsee loxP-reunustavat transkription stop-sekvenssit ylävirtaan mutantti AKT1 cDNA (kuvio 1A). Hiiren talous- ja sosiaalineuvostot oli suunnattu ja seulottiin Southern blot kloonien tunnistamiseksi, jotka suoritetaan rekombinantti-alleelin (kuvio 1 B) ja Cre-indusoidun ilmentyminen (kuvio 1C). Cre-reagoiva

R26-AKT1

E17K

mESCs käytettiin sitten tuottamaan kimeerisiä hiiriä. Ituradan lähetys tippuu-in alleeli varmistettiin PCR: llä (kuvio 1 D).

ilmaista mutantin AKT1 keuhkojen epiteelin käytimme kahta eri järjestelmää: intranasaalisesti tiputtamisen adenoviruksen kuljettaa Cre rekombinaasia (Ad-Cre) tai pariutumisen

R26-AKT1

E17K

hiiriä

Ttf1-Cre

hiirillä [38,39]. Käyttö

Ttf1-Cre

hiiriä annettiin siirtogeenin ekspressiota keuhkoputkien epiteelin [39]

, [40], kun taas tiputtamisen Ad-Cre esittelee etuja, jotka mahdollistavat somaattisen aktivointi siirtogeeniä tasoitetut kohdat ja ei valitsemalla etukäteen solutyyppi, jossa siirtogeeni ekspressoidaan.

Ensimmäisessä koesarjassa ylitimme

R26-AKT1

E17K

hiiriä

Ttf1-Cre

. Kuvio 2A esittää poistamista loxP kasetin keuhkoissa

R26-AKT

E17K

; Ttf1-Cre

hiirillä; Kuvio 2B näyttää reaaliaikaisesti RT-PCR ilmentymistä mutantti AKT1 keuhkoissa ja kuvio 2C esittää kohonneeseen fosforyloidun AKT ja /tai AKT substraattien (GSK3α /β, FOXO1) keuhkoissa alkaen

R26-AKT

E17K

; Ttf1-Cre

hiirissä verrattuna

R26-Ttf1-Cre

littermates. Mittasimme AKT1 ilmentymisen RT-PCR: llä viisi muita kudoksia (tail, lihas, munuaiset, perna, sydän ja maksa) johdetut R26-AKTE17K; Ttf1-Cre ja R26-Ttf1-Cre poikueesta hiirillä ja tulokset esitetään S1 kuvassa. Kuten on esitetty, ei ilmentymistä havaitaan sellaisissa kudoksissa eri keuhkoihin.

. PCR-analyysi keuhkojen DNA

R26-AKT1

E17K

; Ttf1-Cre

ja poikuekumppaniverrokista. ΔStop TPA: lox-P reunustavat transkription lopetus- pysäytyssignaalin. B. suhteellinen mRNA-ekspressiota ihmisen AKT1 Q-RT-PCR RNA keuhkot

R26; Ttf1-Cre

,

R26-AKT1

E17K

; Ttf1-Cre

. Tulokset esitetään rinnakkaiskokeista analyysin keskiarvona ± SD. C. edustaja immunoblottaus analyysi Pakt yhteensä AKT1 ja loppupään signalointi proteiineja yhteensä proteiiniuutoksia kokonaisista keuhkoista

R26; Ttf1-Cre

ja

R26-AKT1

E17K

; Ttf1-Cre

hiirissä, vastaavasti. D-E. Edustavia H Ttf1-Cre

ja

R26-AKT1

E17K

; Ttf1-Cre

, vastaavasti. Suurennus kuten. F-G. Edustavia Pakt värjäystä keuhkot

R26; Nkx2

.

1-Cre

ja

R26-AKT1

E17K

; Nkx2

.

1-Cre

, vastaavasti. Suurennus kuten on osoitettu.

Hiiret 2 (n = 10), 6 (n = 8) ja 12 (n = 11) kuukauden iässä tapettiin lopun pistettä.

Ttf1-Cre

hiirillä ei esiintynyt sairauden enintään 12 kuukauden iässä (n = 7). Kääntäen, histo-patologinen analyysi paljasti hyperplastista vaurioita keuhkoissa on kaikki 12 kuukautta vanhan

R26-AKT1

E17K

; Ttf1-Cre

hiiret (kuvio 2D ja 2E). Nämä hiiret osoittivat kohtalaista liikakasvu keuhkoputkien ja /tai päätelaitteen keuhkoepiteeliverrokkiin kanssa polarisoitunut ytimiä. Alveolaarinen epiteelin oli normaali vaikka atelektaasi havaittiin joissakin hiirissä. Immunovärjäys anti-pS473 osoitti kohonneita AKT aktivoitumista hyperplastista keuhkoihin

R26-AKT1

E17K

; Ttf1-Cre

hiirissä verrattuna valvontaa tai

Ttf1-Cre

hiirillä (kuvio 2F ja 2G).

aktivoidaan myös mutantti AKT1

E17K siirtogeenin nenään Ad-Cre (10

6, 10

7 pfu) 6-12 viikkoa-old

R26-AKT1

E17K

hiirillä. Kun 6, 9 ja 18 kuukautta (n = 8, 8 ja 7, tässä järjestyksessä), hiiret lopetettiin ja keuhkot analysoitiin. Emme havainneet keuhkojen poikkeavuuksien

R26-AKT1

E17K

hiiriä hoidettiin pelkkää liuotinta (PBS) (n = 7) (kuvio 3A). Toisaalta lähes kaikki

R26-AKT1

E17K

hiirille kehittyi kohtalainen keuhkoputken ja /tai terminaaliin bronkiolaarinen liikakasvu 9 kuukautta Ad-Cre hallinto (kuvio 3B ja 3C).

AD. Edustavia H 4 kerrosta epiteelisolujen (n = 6 hiirtä /ryhmä; 3 leikesarjojen /hiiri ). Arvio laajuus liikakasvun, pisteet 1: liikakasvun 1-20% kaikista kohdissa analysoidaan; pisteet 2: liikakasvun 21-60% kaikista kohdissa analysoidaan; Pisteet: 3: liikakasvun 61-100% kaikista osien analysoitu (n = 6 hiirtä /ryhmä; 3 leikesarjojen /hiiri). Vauriot luokiteltiin yhdistelmähankkeeksi saaduilla tuloksilla summa pisteet kerrosten ja pisteet prosenttiosuus liikakasvun havaittu (p 0,05, t-Student).

Niistä kontrollihiirissä Layer pisteet oli 1 4 ulos 6 hiirtä ja 2 2 out of 6 hiirtä. Global liikakasvun tilanne oli 1 5/6 ja 2 1/6 hiirillä. Sitä vastoin on

R26-AKT1

E17K

hiiriä Layer tilanne oli 1 1/6 hiirille ja 2 5/6 hiirille ja Global liikakasvun tilanne oli 1 2/6 , 2 2/6 ja 3 2/6 hiirillä. Lopulta huomasimme, että

R26-AKT1

E17K

hiiret esitteli yhdistetyn pisteet liikakasvun 3,8 ± 0,4, joka oli huomattavasti korkeampi kuin ohjaus hiirillä (2,5 ± 0,3) ( n = 6 /ryhmä; p 0,05).

Myöhemmin tutkimme onko hyperplasic havaittujen vaurioiden olivat proliferatiivinen tai vanhenemista-kertoneet immonostaining of Ki67 ja p21. Tulokset on esitetty taulukossa 2 ja edustavat kuvat värjäytymistä Ki67 ja p21 hiiren keuhkoissa on esitetty S3 kuviossa. Olemme havainneet, että keskimääräinen lukumäärä Ki67-positiivisten tumien siirtogeenisiä R26-AKTE17K hiirillä (11,1 ± 1,2, n = 5) oli yli 2-kertaa suurempi verrattuna kontrollihiiriin (4,6 ± 0,49, n = 3). Toisaalta, mitään merkittävää eroa p21 värjäytymistä havaittiin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että hyperplastista vauriot aiheuttama AKT1

E17K keuhkoissa siirtogeenisten hiiret ovat lisääntyneen solujen lisääntymisen.

On huomionarvoista, että kun 18 kuukauden hoidon, kaksi seitsemästä

R26-AKT1

+ /E17K

hiiriä hoidettiin Ad-Cre kehittänyt yhden kyhmy jokainen, joka oli diagnosoitu bronchio-alveolaarinen adenokarsinooma kanssa papillaarisen kuvio koostuu johdot ja pesiä epiteelisolujen ympäröi harva fibrovaskulaarisen stroman (kuvio 3D). Immunovärjäys analyysi osoitti korkeita Pakt vuonna hyperplastic ja uudisvaurioiden on

R26-AKT1

E17K

hiiriä infektoitiin Ad-Cre verrattuna keuhkojen ei-tartunnan hiirillä (kuvio 4A -4C).

Pakt immunovärjäyty- keuhkojen kudokset

R26-AKT1

E17K

hiiriä hoidettiin pelkkää liuotinta (A) tai tartunnan Ad-Cre jälkeen 9 ja 18 kuukauden infektio, vastaavasti (B, C).

Yhteenvetona näyttää siltä, ​​että mutantti AKT1

E17K alleeli indusoi kohtalaisesti liikakasvu keuhkoputkien ja /tai päätelaitteen ilmatiehyeeseen että pitkäaikainen ja matalilla taajuuksilla, voi edetä avointa syöpä.

Mutant AKT1

E17K yhteistyötä kemiallisten karsinogeenien

ihmisen soluja, AKT1

E17K edistää proliferaatio ja migraatio kun ilmaistu keuhkoputken solujen kuolemattomiksi adeno 12 /SV0 hybridi virus [30]. Tutkia AKT1 mutaatiot voivat tehdä yhteistyötä muiden kasvaimia synnyttävän osumia myös

in vivo

, olemme käyttäneet etyylikarbamaatin (uretaani), kemiallisen yhdisteen läsnä savua, joka on laajasti käytetty kokeellisesti mallintaa monivaiheinen keuhko syövän synnyn [41].

R26 tai R26-AKT1

E17K

littermates olivat joko tartutettiin Ad-Cre (10

6-10

7 PFU) tai käsitellä liuottimella yksin ennen kuin altistuvat uretaani (1 mg /g) ja analysoitiin sen jälkeen, kun 6 tai 9 kuukautta. Moninaisuus ja koko kasvaimia /keuhkojen todettiin olevan merkittävästi suurempi

R26-AKT1

E17K

hiiriä infektoitiin Ad-Cre. Ovat suhteellisen resistenttejä uretaani,

R26-AKT1

E17K

hiirillä, jotka eivät olleet aiemmin altistuneet Ad-Cre kehitetty kyhmyt 1 ulos 6 hiirillä 6 kuukauden ja 1 out of 4 hiirtä 9 kuukautta uretaani annostelun (kuvio 5A). Toisaalta lähes kaikki

R26-AKT1

E17K

hiiriä, jotka oli infektoitu Ad-Cre ennen uretaania antoa esitteli keuhkojen kyhmyt molempien jälkeen 6 (n = 4) ja 9 (n = 6) kuukauden hoidon. Keskimäärin kasvainten kehittämä mutanttihiirien hoidettu uretaania ja tartunnan Ad-Cre oli 3 /hiiri 6 kuukauden ja 7 /hiiri 9 kuukautta päinvastoin, hiiriä käsiteltiin vain uretaanilla kehittynyt 0,15 kasvain /hiiri 6 kuukauden ja 1,6 kasvainten /hiiri 9 kk (Kuva 5A). On huomattava, että koko kasvainten kehittämä mutantti hiiriin infektiota Ad-Cre oli riippuvainen annoksen Ad-Cre annetaan (kuvio 5B).

. Lung kasvainten lukumäärää

R26-AKT1

E17K

tartunnan Ad-Cre (6 ja 9 kuukauden kuluttua hoidon, vastaavasti). Jokainen piste edustaa yhtä hiirtä; pylväät edustavat keskiarvoja ± SD. ** P 0,01, * p 0,05. B. halkaisija keuhkotuumoreiden tuottaman uretaania

R26-AKT1

E17K

hiiriä hoidettiin kasvavia annoksia Ad-Cre. Bars edustavat keskiarvoa halkaisija kasvaimen ± SD. * P 0,05. C, D. edustaja H G siirtyminen kodonissa 61 johtaa Q61 korvaaminen R. Katso S4 kuvassa edustavien kromatogrammit. Nämä tulokset osoittavat, että AKT1

E17K voi toimia yhteistyössä onkogeenisel- tapahtumien aiheuttama uretaania hiiren keuhkoissa (eli

Kras

voitto toiminto mutaatioita), mikä nopeuttaa etenemistä avointa kasvaimia.

hiiri, Clara solujen rivi keuhkoputkien epiteelin ja ilmaista Clara soluun liittyvä proteiini 10 (CC10) taas keuhkorakkuloiden tyypin II (AT2) soluja oleskella keuhkorakkuloihin ja ilmaista surfaktanttiproteiinin C (SPC) [42-44].

Näin ollen luonnehtia solut, jotka muodostavat keuhkomuutoksia aiheuttama AKT1

E17K hiiren teimme epäsuoralla immunofluoresenssilla SP-C ja CC10 on FFPE keuhkoleikkeissä johdettu

R26-AKT1