Krooninen sairaus

tiivistelmä

lysosomifuusio kaupan merkittävä rooli kasvaimen invaasio, keskeinen tapahtuma kehittämiseen etäpesäke. Aikaisemmat tutkimukset meidän laboratorio on osoittanut, että anterogradista (ulospäin) liikkeen lysosomeihin solun pinnan vastauksena tiettyihin kasvaimen mikroympäristössä ärsyke, kuten hepatosyyttikasvutekijän (HGF) tai happamia solunulkoisen pH: n (pHe), lisää katepsiini B: n erityksen ja kasvaimen soluinvaasiota. Anterogradinen lysosomifuusio ihmiskaupan riippuu natrium-protoni vaihtoaktiivisuutta ja se voidaan kääntää estämällä näiden ioni pumput Troglitatsoni tai EIPAn. Koska näitä lääkkeitä ei voida edistää klinikalle haittavaikutusten vuoksi olemme suunnitelleet korkean pitoisuus määrityksessä löytää lääkkeitä, jotka estävät reuna-lysosomifuusio ihmiskauppa, jonka tavoitteena on tunnistaa uusia lääkkeitä, jotka estävät kasvainsolun invaasiota. Automatisoitu high-content kuvantamisjärjestelmä (Cellomics) käytettiin mittaamaan asemaa lysosomeihin suhteessa tumaan. Niistä yhteensä 2210 repurposed ja luonnontuote huumeet seulotaan, 18 ”osumia” tunnistettiin. Yksi yhdisteistä identifioitiin anterogradista lysosomiin kaupan estäjä oli niclosamide, joka on kaupan ihmisen anti-madon lääkettä. Lisätutkimukset paljastivat, että niclosamide tukossa hapan pHe, HGF, ja epidermaalista kasvutekijää (EGF) aiheuttama anterogradista lysosomifuusio uudelleenjako, proteaasin erityksen, liikkuvuuteen, ja hyökkäys DU145 castrate resistenttien syöpäsolujen kliinisesti merkittävinä pitoisuuksina. Yrittäessään tunnistaa mekanismia, jolla niclosamide esti anterogradista lysosomifuusio liikettä, huomasimme, että tämä lääke ei osoittanut merkittävää vaikutusta tasoon ATP, mikrotubulusten tai aktiinisäikeiden, ja oli vain vähäinen vaikutus PI3K ja MAPK polkuja. Niclosamide romahtanut intralysosomal pH ilman häiriöitä lysosomin kalvon, kun taas bafilomysiini, aine, joka heikentää lysosomifuusio happamoituminen, havaittiin myös aiheuttavan JLA mallissamme. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että niclosamide edistää juxtanuclear lysosomifuusio yhdistäminen (JLA) kautta modulaatio reittejä mukana lysosomissa happamoitumista. Lopuksi olemme suunnitelleet validoitu toistettavissa korkea-pitoisuus määrityksessä seulomiseksi estävien lääkkeiden lysosomifuusio ihmiskauppaa ja vähentää kasvaimen invaasion ja kiteytämme toiminta näistä huumeita.

Citation: Circu ML, Dykes SS, Carroll J, Kelly K, Galiano F, Greer A, et al. (2016) romaani Korkea Content Imaging-Based Screen Osoittaa Anti-madon Niclosamide estäjänä lysosomifuusio Anterogradista Ihmiskauppa ja Eturauhassyöpä Cell Invasion. PLoS ONE 11 (1): e0146931. doi: 10,1371 /journal.pone.0146931

Editor: Sidney Yu, Kiinan University of Hong Kong, HONGKONG

vastaanotettu: 20 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 23 joulukuu 2015; Julkaistu: 19 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Circu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: Tämä tutkimusta rahoittivat, osittain avustusta Pfizer, ja rahoitusta Feist-WEILLER Cancer Center. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat julistaa ole eturistiriitoja.

Lyhenteet: ( EGF), epidermaalisen kasvutekijän; (HGF), hepatosyyttikasvutekijä; (PHe), solunulkoinen pH; (JLA), Juxtanuclear lysosomifuusio yhdistäminen; (LMP), lysosomifuusio kalvo läpäiseväksi; (ECM), soluväliaineen; (RILP), Rab vuorovaikutuksessa lysosomaalisen proteiinin; (Tro), Troglitatsoni; (EIPA), 5- (N-etyyli-N-isopropyyli) -amiloride; (LAMP1), lysosomiin liittyvä kalvoproteiini-1; (MAPK), mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasi

Johdanto

lysosomeihin ovat monipuolisia solunsisäisiä organelles sisältävä hydrolyyttinen entsyymejä, jotka hajottavat makromolekyylien ja solukomponenttien [1]. Lysosomeihin oli klassisesti ajateltiin vain toimivat solun taloutta, mutta viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että nämä organelles myös osaltaan patologian monien kliinisesti merkityksellisiä sairauksia, kuten pahanlaatuisia kasvaimia. Lysosomeihin ovat mukana kasvainten synnyssä useiden eri mekanismien kautta, kuten säädeltyyn autophagy, poikkeava lysosomaalisen kaupan ja eksosytoosilla, ja lisääntynyt lysosomifuusio kalvon läpäiseväksi (LMP) [2,3]. Koska monenlaisia ​​lysosomifuusio välittämän toimintoja, joilla on rooli kasvaimen selviytymisen, lysosomeihin on viime aikoina saada huomiota houkuttelevana kohteena syöpähoitojen.

muodostaminen metastasoituneen pesäkkeiden johtuvat invasiivisia primäärikasvain on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien. Valitettavasti ei ole olemassa saatavilla lääkkeitä, jotka estävät tämän prosessin. Siksi ymmärtämystä invaasion tarvitaan kiireesti, jotta voidaan kehittää tehokkaita hoitoja estämään kasvaimen etenemistä. Aikaisemmat tutkimukset osoittavat, että lysosomifuusio ihmiskauppa on tärkeä rooli säätelyssä syöpäsoluinvaasiota, jolloin kasvainsolut lysosomeihin lähellä plasmamembraanin erittämään enemmän proteaasit ja ovat invasiivisia kuin solujen lysosomeihin ryhmittyneet perinuclear alueella [4-7]. Erityisesti olemme osoittaneet, että useita yhteisiä piirteitä kiinteän kasvaimen microenvironment, maksan kasvutekijä (HGF), ja hapan solunulkoinen (pHe) trigger lysosomifuusio ulospäin liikettä, liittyy lisääntynyt katepsiini B: n erityksen ja kasvainsolun invaasiota.

todellakin, katepsiini B on lysosomaalisen kysteiiniproteaasi että on rooli proteiinin liikevaihdostaan ​​lysosomeihin [8]. Pahanlaatuisissa soluissa, ilmaus katepsiini B on erittäin jopa säännelty verrattuna normaaliin kudokseen, ja entsyymi löytyy aktiini rikas invasiivisia ulokkeita kutsutaan invadopodia [9,10]. Näyttö tukee käsitystä, että lysosomaalisen proteaasit, mukaan lukien katepsiini B, eritetään solun ulkopuolelle, jossa nämä proteaasit osallistuvat hajoamista soluväliaineen (ECM), joka on välttämätön tapahtuma syöpäsoluinvaasiota [9,10].

lysosomeihin liikkuvat mikrotubuleiksi ja aktiinisäikeiden kautta yhdessä molekyyli moottori proteiineja, kuten dyneins, kinesiinin ja myosiinin [11-13]. Lisäksi useat GTPaaseja lukien RhoA, Rab7, ja Rab27 rekrytoida moottori proteiineja lysosomeihin, mikä tarjoaa tiukkaa sääntelyä lysosomifuusio liikkuvuuden koko solun [14-16]. On huomattava, että miinus-end-suunnatun liikkeen lysosomeihin pitkin mikrotubulusten riippuu Rab7 ja Rab vuorovaikutuksessa lysosomaalisen proteiinin (RILP), joka rekrytoida dynein moottorit lysosomeihin ja edistää taaksepäin liikenne [12]. Tältä osin estämällä anterogradista lysosomifuusio kaupan yliekspressiolla RILP johtaa alhaisempia erittyy katepsiini B ja kasvainsolun invaasiota [4]. Mielenkiintoista on, että troglitatsoni (Vian) ja 5- (N-etyyli-N-isopropyyli) -amiloride (EIPA), natrium-protoni lämmönvaihdin estäjät, edistää taaksepäin kaupan perifeeristen lysosomeihin eturauhassyöpäsoluissa, mikä vähentää proteaasin erityksen ja kasvainsolun invaasiota [ ,,,0],4]. EIPAn ja Tro välittämä juxtanuclear lysosomifuusio aggregaatiota (JLA) on Rab7 /RILP riippuvainen.

Toinen tekijä, joka voi osaltaan lysosomiin kaupan on vakuolaarisen tyyppi protoni-ATPase pumppu (V-ATPaasi). Tämä suuri entsymaattinen kompleksi muuttaa energiaa ATP hydrolyysiin liikkumista protonien poikki lysosomaalisen kalvon. Lisäksi tuottaville lysosomaalisen happamoitumista, V-ATPaasi on myös osallisena muita solun toimintoja kuten vesicular kaupan. Itse asiassa, c-alayksikön on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa Arf6, pieni GTPaasia, joka ohjaa kalvokuljetuksessa ja solun tukirangan dynamiikka [17]. Vuonna osteoklastien ATP6AP1 (alayksikköä V-ATPaasin tunnetaan myös Ac45) toimii yhdessä pienen GTPaasi Rab7, joka säätelee vesicular kaupan [18]. A-alayksikkö isoformi uskotaan myös olevan ratkaiseva vesicular kaupan [19].

Kuten aiemmin tunnettu estäjiä anterogradista lysosomifuusio kaupan, kuten Vian ja EIPAn ei voida edistää osaksi kliinisen areenalle [20], me pyrittiin tunnistamaan muita uusia repurposed ja luonnontuote yhdisteitä, joista monet ovat jo kliinisessä käytössä ei syöpäindikaatioissa. Tavoitteena oli löytää uusia estäjiä anterogradista lysosomifuusio ihmiskaupan hyvän turvallisuusprofiili. Tämä edustaa uutta lähestymistapaa translaatiotutkimuksessa syöpätutkimuksessa, joka voi mahdollisesti löytää uusia tehokkaita anti-hyökkäyksen ja antimetastaattisia huumeita.

Tässä käsikirjoitus, esitämme tulokset näytön 4 yhdisteiden kirjastoja, joista jotkut ovat jo kaupan muuhun kuin syöpäindikaatioissa hyödyntäen uutta korkea pitoisuus lähestymistapa, jossa yhdistetään fluoresenssimikroskopia ja multi-parametri kuva-analyysi. Olemme tunnistaneet useita estävien lääkkeiden anterogradista lysosomifuusio kaupan, mukaan lukien niclosamide. Niclosamide (C13H8Cl2N2O4, MW 327) on FDA-hyväksytty suun anti-madon agentti, laajalti saatavilla Yhdysvaltojen ulkopuolella hoitoon suoliston heisimato. Se on edullinen, yleensä hyvin siedetty ja liittyy vähän haittavaikutuksia [21]. Niclosamide kykenee sen myrkyllinen vaikutus vastaan ​​loismadoista irrottamalla oksidatiivinen fosforylaatio [22,23] ja on viime aikoina osoitettu olevan lupaava vaikutus syöpää vastaan. Tässä raportissa selvitettiin niclosamide n vaikutusmekanismi ja vaikutus lysosomeihin proteaasin eritykseen, syöpä solun liikkuvuus, ja hyökkäystä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

ihmisen eturauhassyövän solulinjaa DU145 ja ihmisen glioomasolulinjaa A172 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). DU145-soluja ylläpidettiin RPMI-1640 (Mediatech, Corning, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. A172 glioomasolulinjoja ylläpidettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) (Mediatech), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Molemmat solulinjat pidettiin 37 ° C: ssa inkubaattorissa 5% CO 2 ja siirrostettiin heti saavuttaa yli 75% konfluenssiin. Puskuroitu RPMI-1640 valmistettiin RPMI-1640-aine lisättiin 10 mM: NaHCO

3 ja 20 mM NaCl ja säädettiin pHe 6.4.

korkea pitoisuus näytön estäjiä oheislaitteiden lysosomifuusio kaupan

DU145 -solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille 4500 solua per kuoppa. RPMI puskuroitu media titrattiin pH 6,4-6,8 lisättiin kolonniin 12 sen jälkeen, kun väliaine poistettiin ja se toimii negatiivisena kontrollina. Yhdisteitä voidaan seuloa lisättiin kolonniin 2-11 laimentamisen jälkeen alhaisen pH-puskuroitu media lopulliseen konsentraatioon 5 um. 4 yhdiste kirjastot sisältyvät nykyisestä näytöstä kuuluvat NIH Clinical Collection (450 huumeet), Prestwick (1200 huumeet), phytochemical (320 huumeet) ja GreenPharma (240 huumeet). 25 uM EIPAn toimi positiivisena kontrollina. Sen jälkeen, kun 16 tunnin inkubaation jälkeen solut kiinnitettiin 4% kylmällä paraformaldehydillä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 20 minuutin ajan. Solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja sitten lysosomeihin värjättiin inkuboimalla kanssa H4A3 LAMP-1-vasta-aine laimennettiin 1: 200 0,25% BSA: ta ja 0,1% saponiinia PBS: ssä (BSP) 1 tunnin ajan. Sitten solut pestiin PBS: llä 3 kertaa, ja niitä inkuboitiin 1 tunti Dylight aasi anti-hiiri laimennetaan 1: 200 BSP. Sitten solut pestiin PBS: llä 3 kertaa, ja niitä inkuboitiin 20 minuuttia DAPI (Sigma-Aldrich), joka oli laimennettu 1: 1000 PBS: ssä. DAPI pestiin pois PBS: llä, ja soluja ylläpidettiin PBS ajaksi seulontamenettely. Levyt asennetaan ja lue on Cellomics Arrayscan (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) automatisoitu fluoresenssikuvaajalla (kuvio 1A). Solut valokuvattiin käyttäen 20X tavoite 2 loisteputki kanavaa. Kaikkiaan 15 eri alojen kussakin kuopassa, ja enintään 300 solua oli kuvattu kuoppaa kohti. Biocompartmental analyysialgoritmi käytettiin tunnistamaan kunkin solun sen ydin ja soveltaa soluliman maskin (rengas) ja määrä lasketaan lysosomeihin kehässä. Rengas oli 12 pikseliä leveä, ja sen sisäreuna oli 6 pikseliä pois ydin. Keskimäärin lysosomeihin sisällä nimetyn rengas alue hankittiin nimellä ”tarkoittaa renkaan päällä count kanava 3”, joka edustaa jakelua lysosomeihin suhteessa tumaan. Kun lysosomeihin siirtyä pois tumaan ja hajottamaan koko soluliman määrä paikkoja, jotka edustavat lysosomeihin sisällä sytoplasminen maskin kasvaa. Sen sijaan lysosomeihin klusterin lähellä ytimen pilkkuja sisällä soluliman rengas alenee (kuvio 1 B). Z ”tekijä määrityksen määritettiin EIPAn (positiivinen kontrolli) ja matalassa pH: ssa (negatiivinen kontrolli) [24]. Kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Vain levyt positiivinen Z ”tekijä käytettiin analyysiin.

(A) Menetelmä on cellomics-pohjainen korkea pitoisuus seulontaan. (B) DAPI-värjäyksellä on käyttää cellomics kuvantamisen alustan tunnistaa yksittäisiä soluja. Virtuaalinen maski vedetään koneen (esittämä vihreä rengas), jossa on ennalta määrätty leveys ja etäisyys ydin. Määrä lysosomeihin sisällä maski lasketaan koneen (jota edustaa violetti paikalla sisällä rengas). Käsittelemällä soluja hapanta pHe, lysosomeihin muuttavat pois ja määrän paikkoja sisällä rengas kasvaa. Estämällä lysosomifuusio liikkeen määrä paikkoja tuman ympärillä kasvaa taas täplien määränä sisällä rengas maskin pienenee. Tämä ominaisuus on käytetty laskemaan suhteellinen lysosomiin jakeluun. (C) Toiminnallinen voimaan kunkin yhdisteen kontrolliin verrattuna laskettiin ”normalisoitu prosenttia esto” (NPI). Tilastollinen merkitys välillä yhdisteitä ja negatiivisen kontrollin mitattiin Z pisteet. Sirontakuvaajan edustaa NPI (X-akseli) ja Z pisteet (Y-akseli) kunkin yhdisteen piirretään. Lääkkeet, joiden avulla saadaan NPI pistemäärä on yli 50% ja Z pisteet alle -4 (oikea alempaan neljännekseen osoittamalla tavalla punainen nuoli) on nimetty ”osuma” yhdisteitä.

Reagenssit ja vasta-aineet

LY294002, U0126, bafilomysiini A ja nokodatsoli hankittiin Calbiochem (San Diego, CA), ja niitä käytettiin 10 uM, 10 uM, 100 nM ja 10 uM, vastaavasti. Falloidiinia 1: 200 hankittiin Life Technologies (Grand Island, NY). Α-tubuliinin vasta-aine, 1: 1000, ostettiin Neomarkers (Fremont, CA). LAMP1 vasta-aine (H4A3), 1: 200, hankittiin Kehittämisopinnot Hybridomaviljelmät pankki Iowan yliopistossa. DyLight 594 tai FITC, aasin anti-hiiri- tai anti-kani-hankittiin Jackson Immunoresearch (West Grove, PA). Pakt ja pMet käytettiin 1/1000 ja ostettiin Cell Signaling (Beverly, MA). EIPAn (25 uM), sytokalasiini D (1 uM), Rab7 vasta-ainetta (1: 1000), ja klorokiinin (50 uM) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Toissijainen HRP-konjugoitua anti-kani-anti-hiiri-ostettiin GE Healthcare (Pittsburgh, PA).

Immunofluoresenssi

Solut ympättiin 50-70% konfluenssiin lasipeitinlevyille. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA) 20 minuuttia. Sitten solut pestiin PBS: llä ja niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineella (1: 200 laimennettuna BSP) yhden tunnin ajan. Sitten solut pestiin jälleen PBS: llä ennen inkubointia fluoresoivasti konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1: 200 laimennettuna BSP) yhden tunnin ajan. Aktiinin värjäytyminen, soluja inkuboitiin phalloidin laimennettu 1: 200 BSP: ssa 20 minuuttia. Objektilasit kiinnitettiin käyttämällä Slowfade Anti-Fade Gold reagenssia DAPI (Life Technologies, Grand Island, NY). Kuvat otettiin käyttäen Olympus UPlanFL 40X /0,75 tavoite ja Olympus BX50 mikroskooppi MetaMorph ohjelmisto. Kuvat yhdistettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Sillä confocal kuvat sekä HCX Plan Apo 63x /+1,4-0,6 öljy tavoite Leica TCS SP5 mikroskoopilla ja Leica LAS AF ohjelmistoa käytettiin.

akridiinioranssivärjäyksellä

Solut kasvatetaan lasipeitelevyihin ladattiin 10 ug /ml akridiinioranssia (Sigma Aldrich) 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja pestiin sitten PBS: llä. Yön yli inkubaation erilaisia ​​yhdisteitä, solut kiinnitettiin kylmällä 4% PFA: ssa 20 minuutin ajan ja sitten Levyjä asennettu Slowfade Anti-Fade Gold Reagent DAPI, ennen visualisointia immunofluoresenssimikroskopialla.

Proliferaatiomääritys

solut ympättiin 96-kuoppalevylle 4500 solua kuoppaa kohti ja kasvatettiin 16 tunnin ajan. Elinkykyisten solujen kolmena rinnakkaisena määritettiin sen jälkeen, kun CellTiter-Blue

® (Promega, Madison, WI) reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan 1/5 tilavuuden suhde, mukaan valmistajan protokollaa. Levyä inkuboitiin 37 asteessa 1 tunti, ja sitten asennettu loisteputki lukija, jossa fluoresenssia määrättyyn ajankohtaan tallennetaan 560 eksitaatio /590 emissio.

ATP määritys

Solut ympättiin 96-kuoppalevylle 4500 solua kuoppaa kohti ja kasvatettiin 16 tunnin ajan. CellTiter-Glo

® (Promega, Madison, WI) lisättiin kuhunkin kuoppaan mukaan valmistajan protokollaa ja levyä asennettu luminenssi lukija. Määrä luminesenssin kussakin kuopassa on verrannollinen ATP: n määrä.

Western Blot

Koko solulysaateista otettiin talteen kiehuvaan Laemmli-puskuria (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS: ää, 0,13 mM bromifenolisinistä, 1 M sakkaroosi) sekoitetaan beeta-merkaptoetanolia (suhteessa 50: 1). Lysaatit ajettiin 10% polyakryyliamidigeelillä, siirrettiin PVDF (Millipore, Billerica, MA), estetty 10% maidon TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,5) ja tutkittiin sopivilla vasta-aineilla 16 tunnin ajan. Sitten kalvoja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (1: 5000) ja yksi tunti ennen kehittää käyttäen ECL-plus (Pierce, Waltham, MA). Kodak BioMax XAR kalvoa käytettiin kemiluminesenssidetektiolla.

katepsiini B-määritys

Tämä määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [7]. Lyhyesti, solut maljattiin 80% konfluenssiin, jolloin täydellinen elatusaine korvattiin seerumivapaassa ja ilmoitetaan ehdot. Inkubaation jälkeen, väliaine poistettiin ja solujäte otettiin talteen sentrifugoimalla lyhyen aikaa. Media konsentroitiin sitten Amiconilla suodatus kokoamiseen 10000 daltonia (Millipore). Sitten näytteet titrattiin pH-arvoon 5,0-5,5 ja aktiivinen katepsiini B havaittiin sitten kautta fluorogeenisen katepsiini B aktiivisuuden määritys (Calbiochem, San Diego, CA) valmistajan protokollan. Samalla, solulysaatit uutettiin RIPA-puskurilla 4 °. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen kolorimetristä Pierce BCA-määrityksellä (Thermo Fisher Scientific). Katepsiini B aktiivisuus normalisoitiin solun kokonaisproteiinia tasolla laskemalla suhde katepsiini B aktiivisuuden yli-proteiinin taso kussakin tilassa.

Lentivirusvektorikonstruktit toimitus shRNA

shRNA suunnattu Rab7 (CCGGGCCACAATAGGAGCT GACTTTCTCGAGAAAGTCAGCTCCTATTGTGGCTTTTT) annettiin osaksi DU145 eturauhasen syöpäsolu käyttää Mission

™ Lentivirusvektorikonstruktit transduktiopartikkeleilla (Sigma-Aldrich) valmistajan protokollan ja kuten aikaisemmin on kuvattu [6,7]. shRNA ilmentyminen ylläpidetään puromysiiniä (1,8 ug /ml) valinta. Ei Target (NT) shRNA kohdistaminen ei ole tunnettua nisäkkäiden geenit, käytettiin negatiivisena kontrollina (Sigma-Aldrich, shc202V).

transfektio solut koodaavat plasmidit LC3-GFP-mCherry

retroviral- pohjainen pBabe-mCherry-EGFP-LC3B plasmidi (plasmidi # 22418) hankittiin Addgene (Cambridge, MA). Virus oli pseudotyypittää käyttäen pPAM3 pakkaus vektori kotransfektion jälkeen otetaan HEK293T-solujen ja virusten supernatantit suodatettiin (0,2 mikronin), jaettiin eriin ja säilytettiin -80 ° C. Transfektio suoritettiin kokeita käyttäen Lipofectamine-transfektioreagenssia (Life Technologies) valmistajan protokollan mukaisesti.

Liikkuvuus ja invaasiota määritykset (IncuCyte) B

96 hyvin ImageLock Microplate (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI) päällystettiin tyypin I kollageenia (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Solut maljattiin ja kasvatettiin 90% konfluenssiin. Identtiset haavat tehtiin kussakin kuopassa kanssa 96 hyvin haavan parantaja (Essen Bioscience). Solut pestiin poistamiseksi kelluvat solut ja roskia. 20% Matrigel (Corning) pantiin kuoppiin nimetty hyökkäystä tutkimuksiin. Käsittelyolosuhteet sovellettiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä asennettu IncuCyte Zoom kuvantamisen alustan (Essen Bioscience), jota pidetään 37 ° 5% CO2 ja hankkii reaaliaikaisia ​​kuvia samalla alueella kussakin kuopassa 4 tunnin välein. Maski luotiin määrittämiseksi haavan paranemista jokaisen hyvin. Suhteellinen Haavan tiheys (RWD) käytettiin määrittämään kasvainsolun invaasiota ja liikkuvuuteen.

DQ-kollageeni IV hajoamista määrityksessä

DU145 soluja kasvatettiin 2 päivän coverslip jotka kerrostettiin 100% matrigeeliä (Corning) ja DQ-kollageeni IV (Invitrogen Life Technologies, laimennettiin lopulliseen konsentraatioon 25 ug /ml). Käsittelyn jälkeen yli yön lääkeaineen läsnä ollessa tai ilman HGF, solut kiinnitettiin 4% (w /v) paraformaldehydillä 30 minuutin ajan. Seuraavaksi solut pestiin 2 kertaa PBS: llä ja inkuboitiin Alexa Fluor 635 phalloidin (Life Technologies), laimennettu 1: 200 BSP 30 minuutin värjätä aktiinitukirankaan. Sitten solut pestiin 2 kertaa PBS: llä ja peitinlasit kiinnitettiin. Pesäkkeistä ja pilkottu DQ-kollageeni IV tehtiin näkyviksi Leica TCS SP5 Laserkeilaus -konfokaalimikroskoopilla ja kuvien otettiin käyttäen LAS AF ohjelmistoa.

Tilastot

GraphPad Prism 5.0 ja Microsoft Excel-ohjelmiston käytettiin suorittamaan tilastoihin. Yksi tai kaksi-tailed t-testiä käytettiin analysoimaan tilastollisia eroja. Kaikki kaaviot osoittavat keskiarvo ja keskihajonta (SD). Erot p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. IC

50 huumeiden laskettiin käyttäen epälineaarista regressio yhtälö GraphPad Prism. Drug seulonta suoritettiin 2 rinnakkaista. Luja Z ”tekijä laskettiin mediaani ja mediaani absoluuttinen poikkeama valvontaa positiivisia ja negatiivisia jokaisen levyn ja ainoastaan ​​levyjä, joilla on positiivinen arvo todensi [24-27]. Z ’kerroin = 1 – {3 (SDN + sd) /(Mn-Mp)} [20], jossa Mp, Mn, SDP, SDN ovat keskiarvo ja keskihajonta positiivisen kontrollin (EIPA) tai negatiivinen kontrolli (happo yksin) . Koko vaikutus kunkin yhdisteen laskettiin käyttämällä normalisoitua inhibitioprosentti (NPI). NPI = (H-xi) /(H-L) ajan 100; jossa H = keskiarvo negatiivinen kontrolli ja L = keskimääräinen positiivisen kontrollin ja xi arvo vastaavan yhdisteen. Tilastollinen ero yhdisteen vaikutus verrattuna negatiiviseen kontrolli laskettiin Z pisteet, joka on arvo kunkin yhdisteen normalisoidaan negatiiviseen kontrolliin. Z pisteet = (xi-H /SDN, missä xi on arvo vastaavan yhdisteen, H ja SDN ovat keskiarvo ja keskihajonta negatiivisen kontrollin jokaiseen levyyn vastaavasti. Vain huumeet esittää Z pisteet alle miinus 4 ja NPI yli 50% tutkittiin uudelleen tulevia tutkimuksia.

tulokset

A novel kuvantamisen-pohjainen korkea pitoisuus seulontaan yksilöidään estävien lääkkeiden anterogradista lysosomifuusio kaupan

jotta voitaisiin tunnistaa kliinisesti saatavissa olevia yhdisteitä, jotka estävät hapanta pHe välittämää anterogradista lysosomifuusio kaupan, olemme kehittäneet korkea pitoisuus -näytöstä Cellomics Array Scan IV kuvantaminen alusta (Kuva 1A). DU145 eturauhassyövän solut ympättiin 96-kuoppalevyille. matalan pH seerumivapaassa ja EIPAn käytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina vastaavasti. yhdisteet neljästä toisistaan ​​riippumattomasta kemiallisten kirjastojen levitettiin noin 5 uM käsiteltyihin soluihin pH 6,4 seerumitonta RPMI: ssa yön yli. solut kiinnitettiin ja lysosomeihin tunnistettiin lysosomiin liittyvä kalvon proteiini-1 ( LAMP1) vasta, vakiintunut lysosomaalinen merkki, kun taas ytimet visualisoitiin DAPI. Cellomics Arrayscan alusta käytettiin visualisoimaan immunofluoresenssilla kussakin kuopassa käyttäen 20x tavoite ja analyysillä ohjelmisto määrällisesti lysosomifuusio jakautuminen jokaisessa solussa. Lysosomifuusio jakelu määritettiin analysoimalla määrän LAMP-1 positiivisia puncta nimettyjen ”rengas” alueella (kuvio 1 B).

Solut kanssa lysosomeihin näyttämällä JLA (EIPA käsitelty) oli vähemmän lysosomeihin sisällä renkaan alueella verrattuna soluihin, joissa lysosomeihin sijaitsevat diffuusi ympäri solulimaan. Kokeet kelpoisuus laskemalla Z ”tekijä, joka mittaa kykyä testin erottamaan positiiviset ja negatiiviset kontrollit [24]. Toiminnallinen voimaan kunkin yhdisteen suhteessa kontrolleihin laskettiin käyttäen ”normalisoitu prosenttia esto” pistemäärä (NPI). Vahvempi esto anterogradista lysosomifuusio ihmiskaupan annetaan suurempi NPI arvo. Tilastollisesti merkittävä ”tarkoittaa renkaan spot” ero yhdisteen ja negatiivinen kontrolli mitattiin käyttämällä Z pisteet lähestymistapa (kuvio 1 C). Yhdisteet, joilla on NPI pisteet yli 50% ja Z pisteet alle -4 valittiin (oikea alempaan neljännekseen osoittamalla tavalla punainen nuoli) ja tutki uudelleen visuaalisesti poistaa vääriä positiivisia. Niistä 2210 tutkittujen yhdisteiden, kahdeksantoista lääkkeet tunnistettiin osumia ja varmistettiin toissijainen seulonta. Monet näistä yhdisteistä ovat jo tiedetään olevan mikrotubulus häiritseviä aineita, ja ennustettavasti ne estävät liikkumista ulospäin lysosomeihin.

Niclosamide, anti-madon aine, määriteltiin myös yhdeksi osumia. Koska niclosamide on osoitettu olevan syövän vaikutukset glioblastoma [28], ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [29], paksusuolen ja peräsuolen syövän [30], ja rintasyövän [31], päätimme tutkia tarkemmin rooli niclosamide on lysosomifuusio liikkeen eturauhassyövän soluissa.

niclosamide on myrkyllistä pitoisuuksissa 1,0 mikromolaarinen

Ensimmäinen testasimme solun myrkyllisyyttä niclosamide tunnistamiseksi Pitoisuusalueen jolla tämä lääke voisi käytetään kokeellisiin tutkimuksiin. Niclosamide levitettiin DU145 eturauhassyövän soluissa eri pitoisuuksina ajan. Solujen elinkelpoisuus mitattiin fluoresenssiin perustuva solujen määrityksessä (S1A kuvio). Niclosamide hoito johti pienentyneeseen leviämisen pitoisuuksina 0,6 uM ja edellä 24 ja 48 tunnin kuluttua hoidon. Lasku solujen elinkelpoisuuden tuli ilmeiseksi 48 tuntia ja annoksena 1 uM, ja edellä kun heiketä elinkykyisten solujen 48 tunnin vs. 24 tuntia. Puolen maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) laskettiin 1,01 uM (S2 Kuva). Siksi jäljellä Kokeiden teimme päätimme pitoisuutena, joka ei ylitä 1 uM ja kokeita, jotka eivät saa ylittää 24 tuntia.

Niclosamide estää anterogradista lysosomifuusio kaupan syöpäsoluissa

edelleen luonnehtia niclosamide kuin lysosomiin kaupan estäjä, DU145 eturauhassyövän soluja käsiteltiin yli yön DMSO: ssa tai niclosamide ja altistettiin hapan pH 6,4 media, 33 ng /ml HGF: llä tai 100 ng /ml EGF: ää 16 tunnin ajan. Sitten solut kiinnitettiin ja värjättiin DAPI (sininen), LAMP1 (punainen), ja phalloidin (vihreä) (kuvio 2A). Solut käsiteltiin DMSO näkyvissä anterogradista lysosomifuusio kaupan vastauksena happamissa pHe, HGF ja EGF. Kuitenkin solut, joita käsiteltiin niclosamide ei suoriteta anterogradista lysosomifuusio kaupan vastauksena happamissa pHe, HGF tai EGF; sen sijaan, lysosomeihin edelleen ryhmittyneet perinuclear alueella. Tämä vahvistaa tulokset korkea-pitoisuus huume-näyttö, joka tunnistaa niclosamide estäjänä lysosomien kaupan.

(A) DU145 soluja käsiteltiin pHe 6,4, 33 ng /ml HGF tai 100 ng /ml EGF läsnäolon tai puuttumisen 0,5 uM niclosamide. Solut kiinnitettiin ja värjättiin DAPI (sininen), aktiini (vihreä), ja LAMP-1 (punainen). Hallinnassa ja EGF: n tai HGF-käsiteltyjä soluja lysosomeihin sijaitsevat kehällä (valkoiset nuolet), kun taas niclosamide-käsitellyissä soluissa lysosomeihin ovat tuman ympärillä (valkoinen nuolenpäät). Mittaviivat: 10 um. DU145-soluja käsiteltiin yli yön vaihtelevilla niclosamide laimennettu (B) matalassa pH: ssa media (pH 6,4), (C) väliaineessa, joka sisälsi 33 ng /ml HGF, tai (D), jotka sisälsivät 100 ng /ml EGF: ää ja suhteellinen lysosomi jakelu oli lasketaan käyttämällä cellomics lämpökamera. Kvantifiointi lysosomifuusio asema näkyy keskiarvoa laskettuna ”tarkoittaa renkaan päällä count kanava 3”. Virhepalkit edustavat SD vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. * Merkitsee tilastollista merkitsevyyttä (p 0,01) vs. niclosamide. (E) DU145-soluja käsiteltiin 1 uM Niclosamide ajan ja suhteellisen lysosomiin jakelu laskettiin cellomics lämpökamera. Kvantifiointi lysosomifuusio asema näkyy keskiarvoa laskettuna ”tarkoittaa renkaan päällä count kanava 3”. Virhe palkit edustavat SD vähintään 3 itsenäisen kokeen.

annosvastetutkimuksessa oli määrittää pienin tehokas annos niclosamide aloitettava JLA. DU145-soluja käsiteltiin vaihtelevilla niclosamide 16 tuntia, kun läsnä tai poissa happamien pHe (kuvio 2B), HGF (kuvio 2C), tai EGF: n (kuvio 2D). Solut immunovärjättiin havaita LAMP1 ja DAPI käytettiin tunnistamaan ytimiä. Suhteellinen lysosomifuusio jakauma analysoitiin käyttämällä Cellomics Imager. Niclosamide merkittävästi estänyt uusjakoa lysosomeihin pitoisuutena niin alhainen kuin 312 nM stimulaation jälkeen HGF tai EGF, ja 625 nM stimulaation jälkeen happamien pHe.

Seuraavaksi toteutimme aikaa kurssin analyysi tunnistaa vähimmäismäärä aikaa, joka vaaditaan ennen niclosamide oli tehokas asiakkuutta JLA. DU145 solut altistettiin niclosamide ajan, kun läsnä happamassa väliaineessa (pH 6,4). Kuvio 2E osoittaa, että lysosomifuusio paikannus muutettiin klo pian 2-4 tuntia altistuksen jälkeen niclosamide, ja JLA lisääntynyt. Ei muutosta lysosomissa paikannus havaittiin ajoneuvon hallinnan käsitellyissä soluissa. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että niclosamide muuttaa asemaa lysosomiin annoksella niinkin alhainen kuin 312 nM, ja niin aikaisin kuin 2 tuntia.

Niclosamide aiheuttama JLA ei liity inhibitio ATP-tuottamista

Aiempi työ on sekaantunut kinesiiniin, ATPaasi moottori proteiinia, plus-end-suunnattu lysosomifuusio liikkeen (ulospäin lysosomaalisen liike) [32-34]. Koska niclosamide on tunnettu kyvystään kohdistaa oksidatiivisen fosforylaation loisten [22,23], pyrimme määrittämään, onko niclosamide aiheuttaman JLA johtui ATP ehtyminen, joka on seurausta inhiboitu oksidatiivinen fosforylaatio, ja näin ollen muuttaminen aktiivisuuden ATP käyttöinen proteiineja, kuten kinesiiniin. Näin ollen, DU145 eturauhassyövän solut käsiteltiin ajoneuvon hallintaan tai niclosamide yli 4 tunnin ajan ja solunsisäisen ATP-tasot, korvike oksidatiivisen fosforylaation, mitattiin käyttäen luminesenssia perustuva määritys (S1B kuvio). Vaikka vaikutus niclosamide on lysosomiin paikannus on havaittu niinkin aikaisin kuin 2 tuntia altistuksen jälkeen lääkkeen, ei merkittävää eroa ATP: n tason välillä havaittiin soluissa, joita käsiteltiin ajoneuvon ohjaus- tai niclosamide. Virhepalkit edustavat SD vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Virhepalkit edustavat SD vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Virhepalkit edustavat SD vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Virhepalkit edustavat SD vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Yang et ai. Sytokalasiini D käytettiin kontrollina depolymeroida aktiinisäikeiden. Solut kiinnitettiin ja värjättiin aktiini (vihreä) ja DAPI (sininen). Nuolet osoittavat, että sama solukomponenttien (rihmamaisia ​​aktiini-nuolenkärki, aivokuoren actin- suljettu nuoli, polttoväli adhesion- avoin nuoli) on samankaltainen ohjaus ja niclosamide. Mittaviivat: 20 pm. Nokodatsoli käytettiin kontrollina depolymeroida mikrotubulusten. PI3kinase ja MAPK ei tarvita niclosamide estämiseksi happamassa indusoi ulospäin lysosomiin liikettä.

(A) Soluja stimuloitiin 33 ng /ml HGF: n läsnä tai poissa ollessa 0,5 uM niclosamide ajan. Solulysaatit otettiin talteen ja Western blot-analyysi suoritettiin osoitettujen proteiinien. (B) DU145-soluja esi-käsiteltiin PI3K: n estäjä, LY294002, tai MAPK-inhibiittori, U0126, ennen lisäämistä niclosamide 1 uM 16 tuntia. Solut kiinnitettiin ja värjättiin LAMP-1 ja tarkoittaa lysosomifuusio jakelu suhteessa tumaan laskettiin Cellomics lämpökamera. Kvantifiointi lysosomiin jakelu on esitetty keskiarvona suhteellisen aseman tumaan. * Merkitsee tilastollista merkitsevyyttä (p 0,05) suhteessa sama kohtelu seerumivapaassa. Niclosamide estää kasvutekijän indusoiman motiliteettia ja invasiivisuus riippumatta Rab7 tila.

DU145 NT ja Rab7 KD-soluja kasvatettiin 96-kuoppaisilla levyillä ja loukkaantuneiden kanssa 96 sekä haavan parantaja ennen lisäämistä Matrigel kuopissa suunniteltu hyökkäystä. Solujen annettiin (A) siirtää tai (B) hyökätä läsnä ollessa 33 ng /ml HGF: llä tai 100 ng /ml EGF: n läsnä tai poissa ollessa 0,3 uM niclosamide. Liikkuvuus ja hyökkäys laskettiin käyttäen IncuCyte alustan ja suhteellinen haava tiheys prosentteina 24 tuntia haavan tekemisen. Virhepalkit edustavat SD vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen.