Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cdc7-Dbf4 kinaasia tai DDK (Dbf4 riippuva kinaasi) on aloitettava DNA: n replikaatiota fosforyloimalla ja aktivoimalla replikoituvan Mcm2-7 DNA helikaasin. DDK yli-ilmennetään monissa kasvainsoluissa ja on syntymässä kemoterapeuttinen kohde vuodesta DDK esto aiheuttaa apoptoosin erilaisten syöpäsolujen tyyppejä, mutta ei normaalien solujen. PHA-767491 ja XL413 ovat useita voimakkaita DDK estäjiä, joilla on alhainen nanomolaarinen IC

50-arvot vastaan ​​puhdistettua kinaasia. Vaikka XL413 on erittäin selektiivinen DDK, sen aktiivisuus ei ole laajalti tunnettu solulinjoilla. Mittasimme antiproliferatiivisia ja apoptoottisia vaikutuksia XL413 paneelissa kasvainsolulinjoissa verrattuna PHA-767491, jonka toiminta on hyvin tunnettu. Molemmat yhdisteet olivat tehokkaita biokemiallisia DDK estäjiä mutta yllättäen toimintansa solulinjoissa olivat erittäin poikkeavia. Toisin kuin PHA-767491, XL413 oli merkittävää antiproliferatiivista aktiivisuutta vain yksi kymmenestä testatuista solulinjoista. Koska XL413 ei tehokkaasti estää DDK useissa solulinjoissa, tämä yhdiste todennäköisesti on rajoitettu hyötyosuus. Tunnistaa mahdolliset johdot ylimääräisiä DDK estäjiä, testasimme myös ristireaktiivisuus ~400 tunnettujen estäjät vastaan ​​DDK käyttämällä DDK lämpöstabiilius shift määritys (TSA). Havaitsimme 11 yhdisteitä, jotka merkittävästi vakiintunut DDK. Useita esti DDK kanssa verrattavissa teholtaan PHA-767491, mukaan lukien Chk1 ja PKR estäjät, mutta oli eriäviä kemiallisia tukirunkoja tunnetuista DDK estäjiä. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että useita tunnettuja estäjät ristireagoi DDK esiin myös mahdollisuuden suunnitella erityisiä lisävaatimuksia, biologisesti aktiivinen DDK estäjät käytettäväksi kemoterapeuttisia aineita.

Citation: Sasi NK, Tiwari K, Pian FF, Bonte D, Wang T, Melcher K, et al. (2014) voimakas Cdc7-Dbf4 (DDK) Kinase Inhibitor XL413 on rajallinen Aktiivisuus Monet Cancer Cell Lines ja Discovery Mahdollisten New DDK Inhibitor Scaffolds. PLoS ONE 9 (11): e113300. doi: 10,1371 /journal.pone.0113300

Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 23 lokakuu 2014; Julkaistu: 20 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Sasi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Van Andel Institute (KM HEX MW) ja National Institutes of Health (R01-DK071662 HEX). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Yhtään kirjoittajat on kaikki suhteet Dr. Tong Wang tai yrityksen Translational Drug Development, Inc. muuten kuin tohtori Wang apua suunnittelua ja koordinoida synteesin kahden yhdisteen kirjoittajat käytetään tutkimuksessa, josta hän on coauthor tämän käsikirjoituksen. Myös ole rajoituksia tietojen jakamista tai materiaaleja.

Johdanto

aloittamista DNA-replikaation on ajallisesti jaettu kahteen vaiheeseen solusyklin aikana. Ensinnäkin, inaktiivinen muoto replikoituvan MCM (mini-kromosomin ylläpito) helikaasin ladataan alkuperää DNA G1 vaiheessa ja sitten aktivoidaan tullessa ja aikana S-vaiheeseen kaksi sarjaa kinaasien: sykliineistä riippuvaiset kinaasit ja Dbf4 riippuvaisen kinaasin ( DDK) [1]. DDK on kahden alayksikön Ser /Thr-kinaasi, joka koostuu Cdc7 kinaasin ja Dbf4 säätelyalayksiköt. DDK välitteisen fosforylaation kuuden alayksikön Mcm2-7 (MCM) helikaasi uskotaan aikaan konformationaalisen muutoksen rakenteessa johtaa helikaasi aktivointi [2], [3]. MCM aktivointi seuraa lokalisoitu DNA purkautumista, rekrytointi replisome koneiden ja aloittamisesta kaksisuuntaisen DNA-synteesiä [1]. Muut toiminnot DDK kuuluvat helpottaminen kromosomi eriytymistä mitoosin ja meioosin [4], [5], aloittamisesta meioottista rekombinaation [6], [7], ja aktivointi DNA korjaukseen väyliä myös trans-vaurio DNA korjaukseen [8], [9].

Cdc7 kinaasiaktiivisuutta riippuu yhdessä sen säätelyalayksikköä, Dbf4 [10], [11]. Dbf4 on solusyklin säätelemä proteiini, jonka runsaasti piikkejä aikana S-vaiheen ja sitten hajotetaan loppuun mitoosin [12] – [14]. Vuorovaikutus Dbf4 on tarpeen Cdc7 ATP: n sitoutuminen ja substraattitunnistus [15]. Kuten kaikki proteiinikinaasien, The DDK kiderakenne paljastaa aktiivisen syvässä halkeama välillä N- ja C-terminaalista lohkoa [16], [17]. Dbf4 Zn-sormen ( ”motiivi C”) sitoutuu N-terminaaliseen lohkoon DDK ja on välttämätön ihmisen DDK toimintaan, mutta ei ole välttämätöntä jakautumisen ja fission hiivan DDK kinaasiaktiivisuutta [18] – [20]. Dbf4 motiivi M parantaa sen yhdessä Cdc7 alayksikköä ja tarvitaan koko kinaasin hiivassa ja ihmisissä [16], [18], [19], [21]. DDK fosforyloi useita alayksiköitä MCM helikaasin [22] – [24] ja äskettäin tutkimuksen orastava hiiva osoittaa, että Cdc7 ja Dbf4 fyysisesti vuorovaikutuksessa erillistä alayksikköä Mcm2-7 monimutkaisia ​​[25].

DDK on yli ilmaistu useita primaaristen kasvainten ja kasvainsolulinjoissa [26] – [32]. DDK yli ilme on myös yhteydessä huonoon ennusteeseen rintasyöpiä [33], pitkälle vietyyn kliiniseen vaiheeseen munasarjasyöpäpotilailla [34], ja aggressiivisten fenotyypin papillaarinen kilpirauhasen karsinoomat [35]. Säännellään tasot DDK kasvainsoluissa on houkutteleva kasvain terapeuttinen strategia. Käyttämällä neutraloivia vasta-aineita, Hunter ja kollegat olivat ensin osoittaa, että DDK ehtyminen johtaa vakavaan DNA-replikaation HeLa-soluissa [10]. Käyttämällä pieniä häiritseviä RNA: ita, Santocanale ja työtovereiden osoitti lisäksi, että DDK ehtyminen johti p53-riippumattoman apoptoosin HeLa-soluissa, kun taas normaali ihmisen ihon fibroblastisolulinjassa tehtiin palautuva solusyklin pidätyksen [36]. HeLa-solut eivät kyenneet pidättämään on G1-S-vaiheessa siirtyminen, etenemässä tappava S-vaiheessa johtaa solun kuolemaan apoptoosin kautta. Tämä havainto on tukevat useissa eri solulinjoissa [37] – [39]. Tärkeää on, kasvaimen indusoima solukuolema ehtyminen DDK mukana ei ole induktioon tunnettujen tarkistuspiste markkereita. Samanlaisia ​​soluvasteita nähdään, kun väheneminen muiden komponenttien replikaation aloittamista koneen, kuten Cdc6, Cdc45 ja MCM2 alayksiköt [40], [41]. Kasvainsolun tappoa havaitsemien ehtyminen DDK on herättänyt kiinnostusta farmaseuttiseksi kohteena syövän hoidossa. Pyrkimyksiä useita lääkealan yritykset ovat johtaneet useisiin pienimolekyylisiä DDK inhibiittorit (kuvio 1).

Ensimmäinen hyvin tunnettu DDK estäjä oli pyrrolopyridinone molekyyli (PHA-767491, kuvio 1) [42 ], [43]. Se on voimakas DDK estäjän kanssa IC

50 10 nM käyttäen puhdistettua kinaasia. PHA-767491 on myös tehokas solujen kasvun inhibiittori, joiden keskimääräinen IC50 = 3,14 uM joukossa 61 tuumorisolulinjaa [43]. PHA-767491 inhiboi myös puhdistettua CDK9, jossa IC

50 34 nM, mutta on paljon vähemmän tehokas inhibiittori monien muiden kinaasien testattu [43]. Näin ollen PHA-767491 on kaksi DDK /CDK9 estäjä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat viitanneet siihen, että esto CDK9, kinaasi, joka kohdistuu RNA Polymerase II, voisi tehostaa apoptoottista indusoiman PHA-767491 joissakin solulinjoissa [43] – [45]. Muutokset tämän yhdisteen pohjalta yksilöitiin useita muita voimakkaita estäjiä DDK joidenkin esillä ylivoimainen selektiivisyys ja herkkyys [46] – [48]. XL413, rakenteellisesti erillinen DDK estäjä, on benzofuropyrimidinone pohjainen yhdiste, jolla on raportoitu IC

50 3,4 nM puhdistettua DDK ja estää solun lisääntymistä Colo-205-solujen IC

50 2,69 uM [49] . Se oli myös erittäin selektiivinen DDK kun testattiin paneelia 100 kinaasien [49].

lisääntynyt aktiivisuus ja selektiivisyys XL413 yli PHA-767491 järkeistettiin jonka kiderakenne DDK monimutkainen kahden DDK inhibiittorit [16]. Yksi syy XL413 voisi olla tarkempi estäjä on se, että se teki yhteyksiä kolme kaikkein variantin tähteet kinaasi aktiivisessa verrattuna PHA-767491, joka vuorovaikutuksessa kaksi näistä jäämiä. Sen vuoksi oli yllättävää huomata, että XL413 ei ollut erityisen tehokas solujen kasvun inhibiittori useimmissa solulinjoissa testasimme, koska Cdc7 on välttämätön solusyklin etenemisen. XL413 esti lisääntymistä ja indusoi apoptoosia Colo-205-solut, kuten on esitetty aiemmin [49], mutta oli rajoitettu toiminta 9 muissa tuumorisolulinjoissa testattu. Vaikka molemmat yhdisteet ovat vertailukelpoisia biokemiallisia DDK estäjät, PHA-767491 ylivoimaiset aktiivisuus XL413 solulinjoissa. Analyysi DDK-erityisiä MCM2 fosforylaation tasojen viittaa siihen, että XL413 voi olla huono hyötyosuus näissä ja muissa syöpäsolun linjat. Tukea kehittämisessä lisäksi DDK estäjien, testasimme tunnettu proteiinikinaasi-inhibiittorit (toisin sanoen ne, joita ei ole suunniteltu estämään DDK) osoitti rajat reaktio DDK. Me seuloa ~400 yhdisteitä käyttämällä lämpöstabiilisuuden shift määritys (TSA) ja tunnistettiin 12 molekyylejä, jotka siirtynyt lämmönkestävyys DDK useita toisistaan ​​poikkeavia kemiallisia tukirunkoja ja lähes vastaava teho kuten PHA-767491. Nämä yhdisteet ovat siten todennäköisesti erittäin spesifisiä yhdelle kohde. Meidän data esiin mahdollisuuden suunnitella erityisiä lisävaatimuksia, biologisesti aktiivinen DDK estäjät käytettäväksi kemoterapeuttisia aineita.

Materiaalit ja menetelmät

synteesi PHA-767491 ja XL413

DDK estäjät, PHA-767491 ja XL413, syntetisoitiin, kuten on kuvattu aiemmin [42], [49]. HPLC-analyysi ja massaspektrometria suoritettiin sekä yhdisteet, jotka vahvistivat oikea molekyylimassa ja korkea puhtaus ( 99%) sekä.

Solulinjat

HeLa-solut (ATCC ) viljeltiin MEM: ssä, johon on lisätty Earlen suolat, 2 mM glutamiinia, 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (HI FBS), 1,5 g /l natriumbikarbonaattia, 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja, 1 mM natriumpyruvaattia, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. MDA-MB-453 (ATCC) -soluja kasvatettiin DMEM: ssä, johon on lisätty 4,5 g /l D-glukoosia, 4 mM L-glutamiinia, 110 mg /L natriumpyruvaattia, 10% HI FBS, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. HCC1954 (ATCC), HCC1187 (ATCC), BT-549 (NCI-60), MCF-7 (NCI-60), ja Colo-205 (NCI-60-solut) olivat kaikki viljeltiin RPMI 1640-alusta täydennettynä 10% HI FBS, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. HCT-116 p53

+ /+ ja p53

– /- solulinjoja viljeltiin McCoyn 5A-väliaine, johon oli lisätty 10% HI FBS, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kostutetussa inkubaattorissa.

DDK proteiinin induktio

pKT37 on pETDuet-1 (Novagen) -vector, että yhteis- ilmaisee His6-Smt3-HsCdc7 (kodonioptimoidut, Genescript) ja Dbf4 tähteitä 341-674, joka sisältää motiiveja M ja C vaaditaan sitomaan ja aktivoimaan Cdc7.

E. coli

BL21-RIPL transformoitiin pKT37 ja tuore pesäke kasvatettiin yön yli LB, joka sisälsi 150 ug /ml ampisilliinia, 50 ug /ml kloramfenikolia ja 1% glukoosia. Kaksi litraa LB, joka sisälsi 150 ug /ml ampisilliinia ja 50 ug /ml kloramfenikolia ympättiin -60 ml: lla yön yli kasvatettua viljelmää, jolloin saatiin OD

600 0,1. Viljelmää kasvatettiin OD

600 0,8 ja indusoitiin sitten 6 tunnin ajan 0,5 mM IPTG: llä, 25 ° C: ssa. Solupelletti suspendoitiin 20 ml: aan Ni-NTA puskuri A (20 mM HEPES-NaOH: ta (pH 7,4), 250 mM NaCl, 10% glyseroli) ja 1X proteaasiestäjäseostabletit (Roche) ja 1 mM β-merkaptoetanolia. Mikro fluidizer käytettiin solujen hajottamiseksi, mitä seurasi 30 minuutin sentrifugaatiolla (12000 rpm, F13-roottori) 4 ° C: ssa.

DDK puhdistus

DDK puhdistettiin vaiheittainen käyttäen Nickel -NTA, SP Fast Flow, ja S-200 saraketta. Solulysaatti, joka sisälsi 35 mM imidatsolia pantiin 25 ml: n Ni-NTA-pylvääseen, pestiin 20 kolonnin tilavuudella, ja eluoitiin sitten 250 ml: n 35 mM-150 mM imidatsoli-gradienttia. DDK proteiinifraktiot (~115 mM imidatsoli) yhdistettiin ja dialysoitiin yön yli 4 ° C: ssa 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 1 mM EDTA, 10% glyserolia, jossa ei ole imidatsoli. Dialysaatti vietiin sitten kolme 5 ml SP Fast Flow sarakkeet (kytketty peräkkäin), pestiin ja eluoitiin 100 ml: lla 100 mM-0,5 M NaCl-gradientilla. DDK proteiinifraktiot (~0.2 M) yhdistettiin, MgCl

2 lisättiin yhdistetystä proteiinin kelatoimiseksi EDTA, ja inkuboitiin PP2C (6His-GST-Hab1) fosfataasi käytetään vastaavaa milligramman määrä kokonaisproteiinista altaassa ja 1/100 yhtä milligrammaa määrä Ulp1 proteaasin pilkkomiseksi His6-Smt3 (Sumo) tag 16 ° C: ssa yön yli. DDK analysoitiin 15% SDS-geelille tarkistaa määrin defosforylaatioentsyymien ja Sumo pilkkominen (joka oli tavallisesti yli 95%). Proteiini-allas ladattiin toisen Ni-NTA-pylvästä (ei imidatsoli) ja virrata sisältävät fraktiot DDK yhdistettiin, 1 mM EDTA lisättiin kelaatin vapaan Ni

++, ja sitä dialysoitiin yön yli 4 ° C: ssa vasten 20 mM HEPES (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. Proteiini konsentroitiin käyttäen 30000 MWCO spin keskitin (Amicon Ultra, Millipore) 4 ° C: ssa lopulliseen tilavuuteen 10 ml. Konsentroitiin proteiini ladattiin 300 ml: n S-200-geelillä käyttäen poissulkevaa pylvästä (Amersham-Pharmacia). HsCdc7-Dbf4 eluoitui ~150 kDa, lähellä dimeerin arvoa 110 kDa. Kokonaissaanto oli tyypillisesti 6-8 mg.

In vitro

kinaasin aktivaation määritykset

20 ng puhdistettua ihmisen DDK oli esi-inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa kunkin DDK inhibiittorin 5 min. Sitten 10 uCi (γ) –

32P ATP: tä ja 1,5 uM kylmää ATP: tä lisättiin puskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCl

2, ja 1 mM DTT: tä ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 30 ° C: ssa. Proteiinit denaturoitiin 1X Laemmli-puskurissa 100 ° C: ssa ja sen jälkeen SDS-PAGE: lla ja autoradiografialla on HyBlot CL kalvon (Denville Scientific, Inc.). Auto-fosforylaation DDK käytettiin indikaattorina sen kinaasiaktiivisuuden.

32P-leimattua kvantitoitiin käyttäen ImageJ ja IC

50-arvot laskettiin käyttäen GraphPad (Prism 6).

Analyysi solujen elinkelpoisuuden

määrityksiä 96-kuoppalevyille 2500 solua maljattiin kuoppaa kohti. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin pienimolekyylisiä estäjiä ja inkuboitiin 72 tuntia 37 ° C: ssa. Sen jälkeen solut hajotettiin ja ATP-pitoisuus mitattiin indikaattorina metabolisesti aktiivisten solujen käyttämällä CellTiter-Glo määritystä (Promega). IC

50-arvot laskettiin käyttämällä GraphPad ohjelmistoa. Testeissä kuudessa kuoppalevyillä, 100000 solua maljattiin kuoppaa kohti. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin pienimolekyylisiä estäjiä ja inkuboitiin vaihtelevien ajankohtina. Solut trypsinoitiin, ja suspensio valmistettiin 5 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta. 30 ui tätä suspensiota sekoitettiin 30 ul: aan CellTiter-Glo-reagenssia, jota seuraa 10 minuutin inkubaatio huoneen lämpötilassa. Luminenssi mitattiin EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) ja BioTek Synergy Neo Microplate Reader.

Analyysi kaspaasi 3/7 toiminnan

5000 solua kuoppaa kohti maljattiin 96-kuoppaiselle levylle. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin pienimolekyylisiä estäjiä ja inkuboitiin 24 tuntia 37 ° C: ssa. Kaspaasi 3/7 toiminta ja elinkelpoisten solujen määrä mitattiin sitten käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 määritys (Promega) ja CellTiter-Glo määritystä (Promega), tässä järjestyksessä. ”Caspase aktiivisuus per solu” saatiin normalisoimalla yhteensä Caspase aktiivisuus solujen määrä.

immunoblot-analyysi

Koko solu-uutteet valmistettiin uudelleen suspendoimalla pelletit RIPA-puskuria (150 mM NaCl , 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCI, pH 8), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (100 uM PMSF, 1 mM bentsamidi, 2,5 ug /ml Pepstatin A, 10 ug /ml leupeptiiniä, ja 10 ug /ml aprotiniini) ja fosfataasi estäjät (1 mM kutakin NaF, Na

3Vo

4 ja Na

4P

2O

7). Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce) valmistajan protokollan. Yhtä suuret määrät proteiinia tehtiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Millipore). Hyötysuhdetta ja yhtäläinen lastaus varmistettiin Ponceau S värjäys. Sen jälkeen ensimmäisen ja toisen vasta-hoitoja, proteiinit visualisoitiin käyttäen SuperSignal West Pico ratkaisut (Thermo Scientific). Anti-MCM2 ja anti-S53-fosfo-MCM2 vasta-aineet hankittiin Bethyl Laboratories; anti-β-aktiini oli Sigmalta; anti-hiiri ja anti-kanin HRP-aineet olivat peräisin GE Healthcare; ja anti-Cdc7 ja anti-Dbf4 vasta-aineita on kuvattu aikaisemmin [26].

Thermal Stability Shift Assay (TSA) B

Kaikki reaktiot inkuboitiin 10 ul: n lopullisessa tilavuudessa ja määritettiin 96- kuoppalevyille käyttäen 20 x SYPRO Orange (Invitrogen) ja 200 ug /ml puhdistettua DDK [50]. Reaktioita inkuboitiin inhibiittorin kanssa yhdisteiden jäissä 30 minuuttia. Yhdisteet neljästä estäjä kirjastot (Calbiochem I, II, III, Tocriscreen Inhibitor Toolbox) seulottiin 20 uM T

m kasvaa yhteensä DMSO pitoisuus 2% tai vähemmän. Terminen sulamisen kokeet suoritettiin käyttäen StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) sulaa käyrä ohjelman ramppi nopeudella 1 ° C ja lämpötila-alueella 15 ° C-85 ° C. Myöhemmät TSA on 12 osumaa saatu toteutettiin kuin edellä, mutta kolmena kappaleena ja käyttäen 200-kertainen alue inhibiittorikonsentraatioita. Data-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu [50]. Sulamislämpötila (T

m) laskettiin sovittamalla sigmoidisten sulaa käyrä Boltzmannin yhtälö käyttäen GraphPad Prism, jossa R

2 arvot 0,99. Ero T

m Laskettuja reaktioita ja ilman yhdisteiden on AT

m.

Tulokset

DDK estäjät näytteille hyvin erilaisia ​​solujen potencies

seulotaan paneeli 15 rintasyövän solulinjat Cdc7 ja Dbf4 ilmaisua käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita kutakin alayksikköä [26]. Suurin osa näistä ilmaista DDK alayksiköt yhtä suuri tai suurempi kuin MCF10A, kuolemattomaksi mutta ei-tuumorigeenisiä rintaepiteelisolulinja solulinja, joka toimi ei-kasvain-ohjaus (kuvio 2). Käytimme PHA-767491 ja XL413 estää DDK on kuusijäseninen rintasyövän solulinjat, jotka yli-ilmentävät DDK eri tasoilla (merkitty tähdellä kuviossa 2). Molemmat yhdisteet on raportoitu olevan anti-proliferatiivinen toimintaa matalan mikromolaarisella alueella [43], [49]. Kontrolleina, vertasimme näitä tuloksia PHA-767491 hoitoon HeLa-solujen ja XL413 hoito Colo-205-soluja, jotka estävät DDK ja indusoi solukuoleman. Koska Cdc7 kinaasi on olennainen proteiini, estäen sen aktiivisuuden tulisi merkittävästi hidasta tai pysäyttävät solujen lisääntymistä. PHA-767491 esti merkittävästi proliferaatiota kaikissa testatuissa solulinjoissa (kuvio 3A, arvot piirretään suhteessa ajoneuvon hallintalaitteita). PHA-767491 oli tehokkain on HeLa- ja HCC1187 solulinjojen ja oli vähiten vaikutusta MCF-7 [43], ja MDA-MB-453-solulinjat: 2-kertainen ja 2,5-kertainen estyy, vastaavasti. Sen sijaan, XL413 oli anti-proliferatiivinen vain Colo-205-soluja (kuvio 3A).

Immunoblotit osoittavat ilmentymisen tasot Cdc7 ja Dbf4 kasvainsolulinjoissa. β-aktiinin tasot osoittavat yhtä suuri lastaus proteiineja.

(A) Kahdeksan tuumorisolulinjat käsiteltiin 5 uM kutakin DDK estäjän ja solujen elinkelpoisuus mitattiin 72 tunnin lähettää lääkkeen lisäksi. Määrittämään IC

50-arvot, HCC1954 soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla PHA-767491 tai XL413 (B), ja solujen elinkyky mitattiin 72 tuntia post lääkkeen lisäksi. Colo-205-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla PHA-767491 tai XL413 (D), ja solujen elinkyky mitattiin 72 tuntia post lääkkeen lisäksi. Laajuus indusoiman apoptoosin yhdisteitä kustakin solulinjasta suhteessa ajoneuvon ohjaus mitattiin kaspaasi 3/7 aktiivisuus ja on osoitettu (C, E). Kaikki tiedot edustavat keskiarvoa vähintään kolme erillistä mittausta +/- SD ja olivat hyvin toistettavissa eri päivinä.

tutki tehoa profiileja molempien yhdisteiden tarkemmin käyttämällä XL413-herkän ( Colo-205) ja XL413-resistenttejä (HCC1954) solulinjat. Soluja inkuboitiin, kun läsnä on kasvavia pitoisuuksia estäjien 72 tunnin ajan 37 ° C: ssa, jota seuraa solujen elinkelpoisuuden mittausta. PHA-767491 esti proliferaation molemmissa solulinjoissa IC

50 0,64 uM HCC1954 soluissa ja 1,3 uM Colo-205-solut (kuva 3, B ja D), vastattava keskimääräistä 3,17 uM IC

50 arvo lasketaan käyttäen paneelia 61 kasvainsolulinjojen [43]. Sen sijaan, XL413 oli IC

50 22,9 uM HCC1954 soluissa ja 1,1 uM Colo-205-soluja (kuvio 3, B ja D). Vastaten elinkelpoisuuden data, PHA-767491: n indusoiman apoptoosin sekä HCC1954 ja Colo-205-soluissa, mutta XL413 indusoitua apoptoosia vain Colo-205-soluja (kuvio 2, C ja E). XL413 ei ollut erityinen estäjä peräsuolen kasvainlinjojen koska se oli rajallinen vaikutus kaksi peräsuolen kasvainsolulinjoja: XL413 oli 40- 60-kertainen IC

50-arvot kuin PHA-767491 näillä radoilla (Kuva S1 File S1).

PHA-767491 ja Xl413 ovat voimakkaita DDK estäjiä

in vitro

heikko teho XL413 useimmissa kasvainsolulinjoihin voisi johtua siitä, että syntetisoitu yhdiste ei ole tehokas estäjä. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, me puhdistettu rekombinantti DDK ja sitten mitataan IC

50-arvot sekä XL413 ja PHA-767491 on puhdistettu kinaasi. Olemme yhteistyössä ilmaistuna His6-SUMO-Cdc7 ja Dbf4 bakteerisoluissa ja puhdistettiin sitten kompleksi, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Lyhyesti, DDK sidottiin Ni-NTA-kolonniin, jota seuraa eluointi ja erottaminen His6-SUMO tag. Untagged DDK oli sitten fraktioitiin SP Fast Flow -pylvääseen, jota seuraa erotus on S-200 geelisuodatuspylväässä. Kinaasimääritykset suoritettiin puhdistetulla DDK (kuvio 4A), kun läsnä on kasvavia pitoisuuksia kunkin inhibiittorin (kuvio 4, B ja C). Sekä PHA-767491 ja XL413 olivat tehokkaita DDK estäjiä

in vitro

esitetyllä aiemmin [16], [42], [49] kanssa IC

50-arvot 18,6 nM ja 22,7 nM, vastaavasti. Koska molemmat yhdisteet ovat tehokkaita DDK estäjiä, suhteellinen solujen elävyys profiilit osoittavat, että XL413 on puutteellinen toimivat sen kohde solun sisällä.

(A) Coommassie-värjätty geeli, joka esittää 1 ug puhdistettua DDK bakteerisoluista. (Γ) –

32P ATP DDK kinaasimäärityksiä läsnä kasvavien konsentraatioiden PHA-767491 (B) tai XL413 (C). Kinaasiaktiivisuudet edustavat keskiarvoa neljästä riippumatonta mittausta +/- SD eri päivinä.

XL413 on puutteellinen inhiboimaan DDK riippuvaisten MCM2 fosforylaatiota HCC1954 soluissa

Tehokas ottoa solun sisään DDK estäjän pitäisi vaarantaa DDK aktiviteetti

in vivo

. Niistä monet tavoitteet DDK ovat komponentteja replikoituvan Mcm2-7 helikaasin. Seriini 53 MCM2 alayksikkö on hyvin tunnettu kohde sivuston DDK välittämän fosforylaation [24]. Me kvantifioitiin tasot fosforylaation tällä sivustolla mittana DDK aktiviteetti

in vivo

. HCC1954 soluja inkuboitiin, kun läsnä on 1 uM PHA-767491, 2 uM PHA-767491 tai 5 uM XL413. Sitten solut otettiin talteen 0, 24, 48, ja 72 tunnin kuluttua lääkkeen lisäyksen mittaamiseksi elävien solujen ja MCM2 fosforylaatio immunoblottauksella.

2 uM PHA-767491 poistetaan kokonaan MCM2 fosforylaation 24 tuntia HCC1954 soluissa (kuvio 5A), joka vastaa sen vaikutus solujen kasvuun ja elinkykyyn (kuvio 5B). Samassa solulinjassa, 1 uM PHA-767491 johti hyvin vähän jäljellä MCM2 fosforylaation 24-72 tuntia, ja se oli myös tehokas inhiboimaan solujen elinkelpoisuuden ja indusoimalla solukuolemaa. Sen sijaan, XL413 ei estänyt MCM2 fosforylaatiota 24 tuntia, jopa korkeamman pitoisuuden 5 uM (kuvio 5A), ja oli vain vähäinen lasku MCM2 fosforylaatiota 72 tuntia. Tämä vaikutus on nähtävissä myös solunelinkykyisyysmääritys, jossa XL413 käsitellyt solut kasvoivat vain hieman huonompi kuin ajoneuvon käsiteltyjen solujen (kuvio 5B).

(A) immunoblot, joka esittää MCM2 fosforylaation HCC1954 soluissa tai (C) Colo -205 solujen läsnä ollessa DMSO, PHA-767491, tai XL413. (B) Solujen proliferaatio profiili HCC1954 solujen tai (D) Colo-205-solujen läsnä ollessa DMSO, PHA-767491, tai XL413. Solujen elävyys Tulokset edustavat keskiarvoa vähintään kaksi mittausta +/- SD ja olivat hyvin toistettavissa eri päivinä.

Koska molemmat yhdisteet olivat tehokkaita inhibiittoreita Colo-205-soluissa, tutkimme MCM2 fosforylaation näissä soluissa lääkkeen lisäksi. Jälleen, 5 uM PHA-767491 poistetaan kokonaan MCM2 fosforylaation 24 tuntia ja oli erittäin tehokas indusoimaan solukuolemaa (kuvio 5, C ja D). Kuitenkin toisin kuin HCC1954 soluissa, XL413 oli erittäin tehokas estäjä DDK aktiivisuuden Colo-205-soluissa. 5 uM XL413 poistetaan kokonaan MCM2 fosforylaatiota 24 tuntia ja oli myös yhtä tehokas kuin PHA-767491 indusoimiseksi solukuolemaa (kuvio 5, C ja D). Nämä tulokset osoittavat, että kaksi DDK inhibiittorit osoittavat hyvin erilaisia ​​profiileja solulinjoissa huolimatta siitä, että molemmat yhdisteet ovat erittäin tehokkaita estäjät

in vitro

. Tuloksemme viittaavat siihen, että XL413 ei siirretä tehokkaasti moniin solulinjoihin tai metaboloituu nopeasti tai muunnettu inaktiivisessa muodossa.

Screen määrittää ristireaktiivisuutta tunnettuja estäjät kanssa DDK

Tunnistaa muita kemiallisia rakenteita, jotka kykenevät inhiboimaan DDK, testasimme paneeli ~400 estäjät vastaan ​​puhdistettua DDK on lämpöstabiilisuuden shift-määritys (TSA) [50]. Tässä määrityksessä inhibiittorin yhdisteitä inkuboitiin puhdistetulla DDK ja sitten seulottiin yhä lämpötilagradientti määrittää, missä vaiheessa ne denaturoi (suhteessa DDK yksin) seuraamalla fluoresenssin muutoksia väriaineen SYPRO Orange, joka sitoutuu hydrofobisen pinnat avattuna proteiineja. Estäjän yhdisteitä, jotka sitoutuvat sisällä DDK ATP: n sitoutuminen tasku ennustetaan vakauttaa kinaasi, ja AT

m-arvot (katso materiaalit ja menetelmät) 2 ° C tai enemmän pidetään merkittäviä osumia. Kokeelliset tulokset 400 yhdistettä näytön luetellaan kuvassa S2 File S1. Havaitsimme 12 yhdisteitä, jotka aiheuttivat merkittävää lämpötilan muutoksia: 11 yhdisteet lisäsivät T

m, ja 1 yhdiste (Genistein) vähensi T

m (taulukko S1 File S1).

arvioimiseksi affiniteetti kutakin yhdistettä varten DDK mittasimme AT

m arvot näiden 12 yhdisteiden poikki 200-kertainen alue inhibiittorikonsentraatioita ja verrataan näitä arvoja PHA-767491 (tietty DDK estäjä), staurosporiinille (laaja proteiinikinaasin estäjät ), ja DMSO: ajoneuvon ohjaus. Tiedot on esitetty kuviossa 6 ovat keskimäärin kolme riippumatonta mittausta. Yhdiste genisteiini, joka on EGFR estäjä, oli epätavallinen, että se lisäsi AT

m pienemmillä inhibiittorikonsentraatioi- ja laski sitten AT

m 5, 10 ja 20 uM pitoisuuksina. Aloitusnäyttö toteutettiin 20 uM estäjän ja selittää genistein pisteytettiin vähentämällä T

m. Ehkä tämä yhdiste sitoutuu DDK ATP: n sitoutuminen tasku, mutta suurempina pitoisuuksina häiritsee Cdc7-Dbf4 sitova. Kukin muu 11 yhdisteet on positiivinen AT

ms. Tutkiminen yhdisteen titrauksessa paljastaa, että kolme estäjät oli verrattavissa profiileja PHA-767491 että ne indusoi AT

m ~ 2 tai useamman alkavat kaikki 1 uM: Rho estäjät (Rockout), proteiinikinaasin R (PKR) estäjä, ja Chk1 estäjä (SB218078). Neljä uutta yhdisteiden JAK3-inhibiittori VI, PI3-Ka-inhibiittori VIII, UCN-01, ja K-252a saatiin 3-kertainen tai suurempi AT

m 5, 10 ja 20 uM pitoisuuksina.

kasvavia pitoisuuksia 12 osuman yhdisteitä löydettiin 400 yhdisteen näyttö (taulukko S1 File S1) seulottiin vastaan ​​puhdistettua DDK käyttäen TSA. PHA-767491 (DDK erityisiä estäjä), staurosporiinille (laajakirjoinen estäjä) ja DMSO esitetään valvontaa. Tulokset edustavat keskiarvoa kolmesta mittausten +/- SEM.

rakenteet alkuun yhdisteiden TSA näytössä on esitetty kuvassa 7, paljastaen laajan rakenteellisen luokkiin. K-252a on luonnossa esiintyvä alkaloidi, jotka liittyvät staurosporiini, joka estää monenlaisia ​​proteiinikinaasien, kuten seriini /treoniini-kinaasit ja tyrosiinikinaasien ja Trk perheen [51], [52]. Joten, sisällyttäminen K-252a tässä luettelossa (kuten staurosporiinille) ei ehkä ole yllättävää. Koska on hyvin todennäköistä, että inhibiittorit me talteen TSA näytön vakauttaa DDK niiden kyky sitoa ATP sitova tasku ja estävät DDK, suoritimme kinaasimäärityksiä käyttämällä kuuden parhaan yhdisteitä. Kinaasimääritykset osoitti, että ne ovat todellakin DDK estäjiä (kuvio S3 File S1). Chk1 (SB218078) ja PKR inhibiittorit olivat parhaat yhdisteet

in vitro

ja esti DDK IC

50s 19,3 nM ja 67,5 nM, vastaavasti (kuvio 8A ja kuvio S3 File S1). Mielenkiintoista, AT

m profiilit Chk1 ja PKR inhibiittorit näyttävät hämmästyttävän kuten PHA-767491, nostamalla mahdollisuus, että nämä yhdisteet estävät DDK soluissa. Vaikka SB218078 on johdettu staurosporiini, se on voimakas estäjä Chk1 [53]. Rakenteet muiden alkuun osumia, PKR estäjä ja Rockout, eivät ole peräisin staurosporiinille ja myös eroavat tunnetuista DDK estäjät (kuva 1).

rakenteet 7 top yhdisteiden TSA estäjä titrausten ovat näytetään yhdessä PHA-767491 ja XL413 rakenteiden vertailun (katso teksti ja taulukko S1 File S1 lisätietoja). Kolme yhdisteet ovat peräisin staurosporiinille (alin rivi), mutta loput neljä yhdistettä putoavat erillisiin rakenteellisia luokkiin.

IC

50-arvot PKR estäjän (esitetty kuviossa 7) määritettiin vastaan ​​puhdistettua DDK (A) ja HCC1954 soluja (B). (C) kaspaasi 3/7 määritykset osoittavat, että apoptoosi indusoituu voimakkaasti 24 tunnin kuluessa PKR estäjä lisäksi ja tämä eliminoitu yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä z-VAD. PKR estäjä aiheuttaa samanlainen lasku elinkelpoisuuden HCC1954 solujen PHA-767491 ajan (D), ja estää myös MCM2 fosforylaatiota soluissa, tunnettu DDK kohde (E). Mittaukset paneeleissa A-D edustavat keskiarvoja vähintään kaksi mittausta +/- SD ja olivat hyvin toistettavissa.

Testasimme onko PKR ja Chk1 estäjät muuttaisi solujen kasvua ja estävät MCM2 fosforylaatiota HCC1954 rintasyövän solulinjan, joka olisi vahvoja todisteita siitä, että ne estävät DDK soluissa. Yhä enemmän PKR inhibiittoria inkuboitiin HCC1954 solujen yli 72 tuntia, mikä johti suureen vähenemiseen elävien solujen lukumäärä suhteessa ajoneuvon ohjaus (kuvio 8B, IC

50 1,7 uM).