Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka yksikerrosviljelyissä laajalti käytetty syöpälääkkeen kehittämiseen ja testaamiseen, 2D viljelmät ovat yleensä yliherkkiä kemoterapiaa ja ovat suhteellisen köyhiä ennustavat, onko lääkkeen antaa kliinistä hyötyä. Vaikka yleensä monimutkaisempi, kolmiulotteinen (3D) kulttuuri järjestelmät usein parempi kerrata totta syövän arkkitehtuuria ja antaa tarkemman huume vastausta. Koska askel kohti 3D syöpä kulttuureissa helpommin, olemme kehittäneet mikrokaivoisella alustan ja pinnan muutos protokolla mahdollistaa korkean kapasiteetin valmistukseen 3D syövän aggregaatteja. Tässä käytämme tätä uutta järjestelmää luonnehtia eturauhasen syöpäsolun microaggregates, mukaan lukien kasvun kinetiikka ja huumeiden herkkyys. Tuloksemme osoittavat, että eturauhassyövän solut ovat elinkelpoisia tässä järjestelmässä, on kuitenkin joitakin ei-syöpä eturauhasen solulinjoissa eivät ole. Tämä järjestelmä mahdollistaa jatkuvasti valvoa läsnäolon tai puuttumisen apoptoottista ytimen 3D syövän mikroaggregaatteja. Samanlaisia ​​tuumorikudoksia, 3D mikroaggregaatteja näyttää huono napaisuus. Kriittisesti vaste 3D mikroaggregaattien on kemoterapeuttinen lääkeaine, doketakseli, on enemmän sopusoinnussa

in vivo

tuloksia kuin vastaava 2D valvontaa. Kumulatiivisesti tuloksemme osoittavat, että nämä eturauhassyövän microaggregates parempi kerrata morfologiaa eturauhasen kasvaimia verrattuna 2D ja voidaan käyttää suuren läpimenon huumetestit.

Citation: Chambers KF, Mosaad EMO, Russell PJ, Clements JA , Doran MR (2014) 3D Cultures eturauhassyöpäsolujen viljellään Novel suuren tuotantotehon Culture Platform ovat vastustuskykyisempiä Chemotherapeutics verrattuna viljeltyjen solujen Yksikerroksinen. PLoS ONE 9 (11): e111029. doi: 10,1371 /journal.pone.0111029

Toimittaja: Wendy J. Huss, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 5. kesäkuuta, 2014; Hyväksytty: 26 syyskuu 2014; Julkaistu: 07 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Chambers et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: MRD rahoitetaan jonka Movember New Concept Grant (NCG 3212) myönnetyn Eturauhassyöpä säätiön Australian Research Program (http: //www. prostate.org.au). JAC tukee National Health ja Medical Research Council of Australia Principal Research Fellowship (https://www.nhmrc.gov.au). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kolmiulotteinen (3D) soluviljelmässä taustalla on tarpeen suorittaa kokeita, jotka paremmin kerrata fysiologinen microenvironment. Perinteiset kaksiulotteinen (2D) soluviljelmissä useinkaan matkimaan solutoiminnoille ja signalointireittejä läsnä kudoksessa. Näin 2D soluviljelmissä voivat johtaa vinoon ja vähäisten tietojen [1], [2]. Microarray profilointi 2D vs. 3D kulttuureissa on osoittanut, että 50% geenien muutos ilmaisun upon 3D kulttuuri [3]. Jotkut näistä eroista voidaan selittää eroilla, mekaanisen jännityksen matriisin. Esimerkiksi, soluja viljeltiin 2D on kudosviljelymuoviin kokemus kohonnut vetojännitys, miljoona kertaa suurempi kuin pehmeiden kudosten [4], ja tämä on tunnettua muuttaa solun fysiologiaan [5]. Keinotekoisen korkea vetojännityksiä voi syvällisesti vaikuttaa solujen morfologiaan, solun tukirangan järjestely, solu-soluadheesion ja muuttoliike. 3D-viljelmät paremmin matkivat luonnollisen kudoksen mekaanista rasitusta ja siten tarjota entistä edustavan pathophysiological kunnossa kuin perinteisillä kudosviljelmälevyille [6], [7]. Tämä suhteellinen vaikutus on ilmeinen aikana

in vitro

kemoterapiaa testaus, jossa 2D kulttuurit ovat tyypillisesti yliherkkiä huumeita ja 3D kulttuuri huumeiden herkkyys useammin rinnasteinen vastaava

in vivo

skenaariossa [8], [9 ].

huolimatta siitä, että 3D-viljelmät toimivat vankempi

in vitro

syöpälääkkeen testaus malleja, useimmat laboratoriot edelleen luottaa 2D kulttuureissa niiden ensisijainen väline. Tämä johtuu osittain lisääntyneestä työ- ja kustannukset perustamisesta 3D-malleja ja koska ei ole sopimusta yhden standardin malli, jota voitaisiin käyttää poikki kentän. Useita 3D kulttuurin järjestelmien eri edut ja sudenkuopat, toimivat tällä hetkellä. Natural solunulkoisen matriisin (ECM) geelejä, kuten tyypin I kollageenin ja laminiinin-rikas matrigeeliä voi muodostaa mekaaninen ja kemiallinen vihjeitä kudoksen morphogenesis, mutta ne sisältävät useita määrittelemättömiä kasvutekijöiden ja ECM proteiineja, jotka eroavat toisistaan ​​erien muuttaminen mekaaniset ominaisuudet geelin. Synteettinen geelejä muodostuu peptidi-funktionalisoidun synteettiset polymeerit on suunniteltu jäljittelemään erityisiä ECM ominaisuuksia ja sen vuoksi ne tarjoavat vaihtoehtoisen [10]. Kuitenkin rakennustelineet ja geeli pohjaiset järjestelmät voivat olla kalliita skaalata ylöspäin suuriksi suurikapasiteettisten tutkimuksia ja vaikea analysoida. Tekniikoita, kuten neste-agar-kerros ja polyhema tarjota halvempi vaihtoehto, mutta koko ja yhtenäisyys aggregaattien voi olla tiukasti säänneltyä ja tämä johtaisi erilaisiin lääkkeen penetraatioaste [11], [12]. Olemme sovitettu suurikapasiteettisten mikrokaivoiselle järjestelmä kulttuurin eturauhasen solujen mikroaggregaatteihin hallitusti koko. Tämä järjestelmä tarjoaa etua muihin 3D viljelysysteemejä että mitat mikroaggregaattien voidaan säänneltävä tiukasti ja aggregaatit määritellyn koon tuotetaan skaalattavan luonteeltaan korkean suoritustehon huumetestit. Tässä osoitamme, että syöpäsolujen kokoontuvat itsestään aggregaatteja, jotka vastaavat lääkehoidon tavalla sopusoinnussa odotettavissa

in vivo

herkkyyttä.

Materiaalit ja menetelmät

Fabrication ja multi-kerrostumisen mikrokuoppia

fabrication polydimetyylisiloksaania (PDMS) mikrokaivo paneelit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [13]. Tässä tapauksessa käytettiin pehmeä litografia muodostavat paneelit 360 x 360 x 180 um mikrokuopissa tai 800 x 800 x 800 um PDMS-levyjä, jotka asennetaan sitten kuoppiin 48-kuoppaisella kudosviljelylevyllä. Lyhyesti, silika kiekkojen käytettiin muodostamaan PDMS muottiin, josta käänteinen polystyreeniä muotin luotiin. PDMS mikrokaivo pinta luotiin levyjen jälkimmäisessä multaa ja Arkin stanssattu levyjen (kuvio 1A). Lyöntejä erikokoisista voidaan käyttää luomaan insertit tahansa kokoinen kudosviljelymuoviin alus. Tämän tekniikan avulla tuhansia mikrokuoppia voidaan tuottaa

massoittain

(600 microaggregates /cm

2 tai 150 mikroaggregaatteja /cm

2 pienten ja suurempien mikrokuoppia, vastaavasti). PDMS pinta joko päällystettiin 5% Pluronic /fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) tai monikerroksinen kitosaanin kanssa (CHI) ja hyaluronihappoa (HA), jotka molemmat estää solun tarttumista PDMS pintaan. Kuten aiemmin on kuvattu [13] Kerrostus- alkaa elektropositiivisen polylysiini kerros tukea lisäkerros tarttuvuus ja viisi kerrosta CHI ja HA peräkkäin inkuboidaan 15 minuutin välein. Olemme aiemmin osoittaneet, että ylemmän HA kerros estää solujen kiinnittymistä PDMS mikrokuoppiin ja että tämä edistää solujen aggregaatiota [14]. Päällystyksen jälkeen insertit steriloitiin 70% etanolilla ja pestiin yön yli PBS: llä käyttövalmis.

(A) polystyreeniä muotti [13], käytettiin heittää PDMS arkkia mikro-kuvioitu pinta. Levyt stanssattiin PDMS arkin muodostamiseksi insertit monikuoppalevyihin, ja nämä pinnat päällystettiin joko 5% Pluronic tai monikerroksista kanssa CHI ja HA. LNCaP-soluja (50000) ympättiin joko (B) Pluronic päällystetty (3D Pluronic) tai (C) monitasoinen (3D multi) mikrokuoppia ja Alamar Blue määritystä käytettiin mittaamaan aineenvaihduntaa 3D vs. 2D soluja. Molemmat valmistetut päällysteet toteuttamiskelpoinen aggregaatteja että lisääntynyt metabolia yli 7 päivää samaa tahtia soluihin kasvatettu 2D kulttuuriin. Kolme tekninen rinnakkaista tehtiin per aika-pisteen.

Solut ja eturauhasen mikroaggregaatti- kulttuuri

eturauhassyövän solulinjoissa, RWPE-2 [15] ja LNCaP [16], ja ei-syöpäsolujen line RWPE-1 [15], saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Soluja viljeltiin RPMI 1640, 5% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco) plus 1% penisilliini /streptomysiiniä (P /S) (Gibco), 5% CO

2 37 ° C: ssa. Keskisuurten optimointi tutkimuksia, keratinosyyttispesifisestä SFM, 2% naudan aivolisäkeuutteella (BPE), plus epidermaalinen kasvutekijä (EGF) täydennys (Gibco) käytettiin myös. Joko 50000 tai 100000 solua siirrostettiin hyvin 1 ml viljelyalustaa. Microaggregates ovat muodostuneet pakko yhdistäminen; levyt sentrifugoitiin 1000 rpm 5 minuutin helpottamiseksi pelletointi solujen osaksi mikrokuopissa. Pakotetun aggregaatiota prosessi, solut suspendoitiin väliaineessa tasaisesti pelletoidaan sisällä olevista mikrokuoppia juuressa hyvin. Medium vaihdettiin päivinä 3, 6, 8, 10, ja 13. Aikana väliaineen vaihdon, huolellisuutta ei imeä Mikroaggregaatteja. Alustaa lisättiin ja vähennettiin samasta kohdasta hyvin jokaisella vaihdon. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2. Vaihekontrasti kuvat otettiin käyttäen Nikon Eclipse-Ti käänteismikroskooppi ja Keski halkaisija jokaisen mikroaggregaatti- mitattiin käyttämällä Image-J ohjelmisto (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Vähintään 50 mikroaggregaattien mitattiin per aika-pisteen.

Leikkaus, immunofluoresenssilla ja konfokaali kuvantamisen

Mikroaggregaatit kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA) 30 minuuttia ja joko upotettu Tissue-Tek optimaalinen leikkaamiseen lämpötila (MMA) yhdiste (VWR International) leikkaamista varten tai immuno- suoraan. Näytteet tehtiin läpäiseviksi 0,5% Triton-X-100: ssa 20 min ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla E-kadheriini (Invitrogen, AB_86564), β-kateniinin (Santa-Cruz, AB_626807) (laimennettu 1:200), α6-integriini (Millipore , AB_10834933), laminiini-5 (Abcam, AB_2133782), pilkottiin kaspaasi-3 (Cell Signalling Technology, AB_331440) (laimennettu 1:100) ja Ki67 (Abcam, AB_443209) (1:400) yön yli 4 ° C: ssa. Vastaavat sekundäärinen vasta-aine on konjugoitu Alexa-488 (Invitrogen), lisättiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä; 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI, Sigma-Aldrich) käytettiin värjäämään ytimet ja rodamiinifalloidiinia (Invitrogen) käytettiin värjäämään F-aktiini. Mikroaggregaatteja asennettiin käyttämällä Prolong kulta (Invitrogen) ja kuvaamisen käyttämällä Leica TCS SP5 -konfokaalimikroskoopilla tai Nikon Eclipse-Ti käännettyä mikroskooppia.

Live /dead värjäytymistä

Soluja inkuboitiin 2 ug /ml fluoreseiinidiasetaattia (FDA) (Sigma-Aldrich) 15 min ja 20 ug /ml propidiumjodidia (PI) (Sigma-Aldrich) ja 2 min 37 ° C: tahra elävien ja kuolleiden solujen osalta. FDA on solun läpäisevä esteraasin substraatti, joka mittaa sekä entsyymiaktiivisuuden ja solukalvon eheyden. Propidiumjodidia sitoutuu DNA, mutta on vain pystyvät tunkeutumaan vaarantunut kalvoja kuolleiden tai kuolevien solujen. Solut kuvattiin käyttämällä Leica TCS SP5 -konfokaalimikroskoopilla ja prosentuaalinen alue kuolleita soluja kohti mikroaggregaatti- kvantifioitiin käyttäen Image-J ohjelmisto (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Vähintään 10 mikroaggregaattien analysoitiin per aika-pisteen.

Alamar Blue ja WST-1 solujen elinkelpoisuuden määritykset

Muodosta solujen aineenvaihduntaa yli 14 päivän mikroaggregaatti- kasvun Alamar Blue (Invitrogen) määritystä käytettiin kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Päivinä 1, 3, 7 ja 14 3% tilavuus Alamar blue lisättiin kuoppaa kohti. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan ja 100 ui väliaineessa siirrettiin 96-kuoppaiselle musta levy. Fluoresenssi (eksitaatio 544 nm, emissio 590 nm) havaittiin käyttäen levylukijaa (BMG Omega, BMG LABTECH). WST-1 (Roche) käytettiin määrittämään elinkelpoisuuden RWPE-1 ja RWPE-2-soluja viljeltiin eri väliaineessa tyyppejä. Soluja viljeltiin 3 päivää, minkä jälkeen lisättiin 10% WST-1 1 tunnin ajan, ennen kuin lukemalla absorbanssi 450 nm: ssä Bio-Rad Benchmark Plus levylukijalla.

PicoGreen määrityksessä.

PicoGreen määritys (Invitrogen), jota käytetään mittana elävien solujen ilmaisemalla yhteensä kaksijuosteista DNA: ta, suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, DNA uutettiin 0,5 mg /ml proteinaasi K: n (Roche), fosfaattipuskuroitu EDTA (PBE). Näytteet laimennettiin (1:10) in RNaasiA liuos (Invitrogen) ja inkuboitiin PicoGreen määritysreagenssikoostumusta ennen luetaan fluoresenssilevylukijaa (BMG Omega, BMG LABTECH; eksitaatio 485 nm emissio 520 nm).

Drug hoitoja

LNCaP-solut ympättiin 48-kuoppaisille levyille tai ilman PDMS insertit ja viljeltiin kaksi vuorokautta ennen käsittelyä laimennoksilla 0,01-1000 nM dosetakselin (Sigma-Aldrich) 72 h, joita verrattiin DMSO ajoneuvon hallinnan. Protokolla Alamar Blue oli sovitettu lukemaan sisällä levyn läpi kirkas PDMS lisätä käyttämällä 10% Alamar sinistä ja inkuboimalla 2 tuntia. Laimennossarjaa solut osoittivat, että fluoresenssi oli suhteessa solujen määrä (R-squared arvo 0,99; tuloksia ei ole esitetty). IC 50 laskettiin käyttäen CalcuSyn-tilastot paketti (Biosoft, UK) kuten on raportoitu aiemmin [17].

3D-viljelmä RWPE-1-solujen Matrigel tyvikalvon matriisin

RWPE-1-soluja viljeltiin in Matrigel (BD Biosciences) 7 päivän arvioida napaisuus. Tätä menetelmää on käytetty aiemmin [18], [19]; lyhyesti, RWPE-1-solut ympättiin joko 1% tai 8% Matrigel: n läsnä ollessa Keratinosyyttien-SFM väliaineessa, jota oli täydennetty 2%: BPE (Gibco). Napaisuus soluja kasvatettiin Matrigel plus tai miinus mikrokaivo insertti verrattiin.

Tulokset ja keskustelu

PDMS mikrokaivo järjestelmä tuottaa eturauhassyövän mikroaggregaatteihin yhtenäinen ja ohjata koko

tämän työn tarkoituksena oli tuottaa korkean suoritustehon PDMS mikroaggregaatti- testaus- terapeuttisten lääkkeiden eturauhasen syöpä. Aluksi, pyrimme luonnehtia kasvua eturauhasen syöpäsolujen mikrokaivoisella järjestelmän ja vertaa morfologia, ja kasvuvauhti normaalin solun kanssa. PDMS on inertti polymeeri, joka käytetään yhä kudosviljelmässä sovelluksissa [20]. Se sopii, koska se on edullinen ja yhteensopiva nopea valmistus menetelmiä kuten pehmeä litografia [21]. PDMS pinnat on valettu ja hyödynnetään viljelmässä sovelluksissa hallita muodon ja koon yksittäisten solujen [22], ja erityisesti mikrokuoppia muodostettu PDMS on käytetty valmistuksessa solun aggregaatit parantaa erilaistumista ihmisen alkion kantasolujen hermosolujen [23 ], [24] ja mesenkymaalisten kantasolujen osteoblasteiksi tai kondrosyyteiksi [13], [24], [25]. Tämä tutkimus on ensimmäinen, kulttuuriin eturauhasen solujen PDMS mikrokaivoiselle pinnan ohjata raekoko. Eturauhassyöpä-soluja viljeltiin, kuten 3D-aggregaattien tarkasti valvottua mitat käyttäen PDMS mikro-pinta, joka koostuu 600 mikro-kuoppiin /cm

2, joista kukin on 360 um 360 um (kuvio 1A). Mikrokaivo pinta on modifioitu joko 5% pluronic tai monikerroksisten (kuviot 1 B ja C). Molemmat pinnoitteita tukossa pinta soluadheesiota ja edistettävä mikroaggregaatti- muodostumista. Aggregaatit muodostuvat LNCaP pysyi elinkelpoisia ja lisääntynyt aineenvaihdunnan yli 7 päivää hinnat verrattavissa soluja kasvatettiin 2D kulttuuri (kuviot 1 B ja C). Päivänä yksi, kun 50000-solut ympättiin, LNCaP-solut muodostivat yhtenäisen mikroaggregaattien 70 um halkaisijaltaan (kuvio 2A). Yli 7 päivää kulttuuri aggregaattien tasaisesti kasvoi olla 120 um halkaisijaltaan. Tämä näytti olevan rajoittava halkaisija ja koko eivät merkittävästi kasvaa edelleen kulttuuri (kuvio 2A). RWPE-2 solut muodostivat huomattavasti pienempiä aggregaatteja 60 mikrometriä päivänä yksi, ja mikroaggregaatteja ei kasvanut halkaisijaltaan yli 14 päivää (kuvio 2A). Halkaisija RWPE-1-soluissa ei mitattu, koska aggregaatit olivat epästabiileja, disassociating löysään soluryppäitä kolmen päivän viljelyn. RWPE-1 ja RWPE-2-soluja viljeltiin RPMI 5% FBS + PS niiden sijasta suositellaan kasvualustaa, Keratinosyyttien-SFM, jotta voidaan optimoida mikroaggregaatti- muodostumista. Jälkimmäisessä väliaineessa RWPE-1 ja RWPE-2 solut muodostivat dispergoidun klustereita solujen osuus on suuri kuolleiden solujen jälkeen 7 päivää (kuvio S1A). Muuttaminen kasvualustan ei ollut merkittäviä kielteisiä vaikutuksia solujen aineenvaihduntaa verrattuna suositeltuun keskipitkän (kuvio S1B). Näin ollen, RPMI 1640, 5% FBS + P /S käytettiin kaikissa lisäkokeita.

(A) halkaisijat LNCaP ja RWPE-2 soluaggregaatteja mitattiin yli 14 päivää; keskiarvo +/- SD, n = 50 alkaen * p 0,05, pariksi opiskelijat t-testiä käytettiin merkittäviä eroja halkaisijaltaan päivänä 7 ja 14 (B) FDA /PI tahra käytettiin värjäämään elävää solua vihreän ja kuolleita soluja punainen päivinä esitetty ja prosentuaalinen alue kuolleita soluja kohti mikroaggregaatti- on määrällisesti osoittaa, että ei-syöpä eturauhasen solut (RWPE-1) on suurempi solukuolemaa (prosentteina punainen pikseleiden) mikrokaivoisille insertit verrattuna eturauhasen syöpäsolujen (LNCaP ja RWPE-2); keskiarvo +/- SD, n = 10. pariksi opiskelijoiden t-testiä käytettiin laskettaessa merkitystä * p 0,05. (C) Konfokaalinen kuvia ja vaihe kontrasti kuvia (päivä 14 Phase) osoittavat, että eturauhassyöpäsolulinjoissa (RWPE-2 ja LNCaP) kasvaa kompakti sileä mikroaggregaatteja päivään 14. Toisaalta, ei-syöpäsolujen (RWPE-1) muodossa, hajallaan löysä klustereita, jotka eivät ole elinkelpoisia ja ilman määriteltävissä halkaisija päivänä 14. Mittakaava on 100 pm.

Eturauhassyöpä solut ovat elinkelpoisia PDMS mikrokaivoisella järjestelmään ja on pienempi proliferaationopeus suhteessa yksikerroksista

elinkelpoisuus eturauhasen mikroaggregaattien arvioitiin 14 päivän aikana laskemalla prosenttiosuus kuolleita soluja suhteessa elävät solut (kuvio 2B) FDA /PI värjätään mikroaggregaatti- confocal kuvia (kuvio 2C). FDA väriaine Tulokset osoittavat, että eturauhassyövän solutyyppejä, LNCaP ja RWPE-2, on ehjä solukalvo yli 14 päivää. Sitä vastoin ei-syöpä-solulinjasta, RWPE-1 on esitetty suhteellinen kasvu hajotettiin solukalvojen yli 14 päivää ja näyttää löysä organisaatio (päivä 14 vaihe). Vastaavasti, LNCaP-mikroaggregaattien osoittavat kasvua aineenvaihdunnan yli 14 päivää (kuvio 3A) ja DNA-pitoisuuden nousua (kuvio 3B). Kuitenkin RWPE-2 mikroaggregaatteja osoittavat selvää vähenemistä aineenvaihdunnassa (kuvio 3C) ja lasku DNA-pitoisuus (kuvio 3D) huolimatta ehjät solukalvoissa mukaan FDA värjäyksen (kuvio 2B). Siksi RWPE-2-solut ovat todennäköisemmin lepotilassa solussa tilassa ilman solunjakautumisen tai solukuolemaan. Tämä tukee mikroaggregaatti- mitoitus data, joka osoittaa, että RWPE-2-mikroaggregaatteja ei lisännyt merkittävästi halkaisija (kuvio 2A). Jotta RWPE-2 cell 2D tietoja, oli heikko korrelaatio määrityksiä, vaikka selvää korrelaatiota määrityksiä varten 3D-tietoja; 2D aineenvaihduntaan laski jälkeen päivänä 3 (kuvio 3C), mutta DNA-pitoisuus lisääntyi edelleen, kunnes päivä 14 (kuvio 3D). Tämä osoittaa, että solut olivat vielä pystytä jakamaan, joten niistä ei ravinteiden ravintoa, mutta osoittaa huonoa korrelaatio näiden määritykset, jotka on aikaisemmin dokumentoitu [26]. Kuitenkin, LNCaP PicoGreen tiedot eivät korreloi hyvin Alamar Blue metabolisen tiedot (kuvio 3A ja B). Kaiken aineenvaihduntaa ja leviämisen kaikki solut oli pienempi 3D kuin yksikerroksista (kuvio 3), mikä on sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten [9]. 2D pinta tarjoaa suuren pinta-alan liitetiedoston, joka on edellytys onnistuneelle solunjakautumisen eli fokaalisen adheesion ankkuripisteitä ovat säädetty jakautuvat solut, jotka ovat tarpeen lisääntymistä [27]. Kuitenkin tämä antaa väärän esitys jako korko kudoksessa ja alemman 3D replikointi nopeus on enemmän analoginen leviämisen hinnat kasvaimissa.

elinkelpoisuutta LNCaP (A ja B) ja RWPE-2 (C ja D) microaggreagtes verrattuna sama määrä soluja viljeltiin 2D arvioitiin kautta Alamar blue (A ja C) ja PicoGreen määrityksessä (B ja D). LNCaP-mikroaggregaattien osoittavat kasvua aineenvaihdunnan yli 14 päivää (A) ja DNA-pitoisuuden nousua (B). Kuitenkin RWPE-2-mikroaggregaatteja vähentyneet aineenvaihduntaa (C) ja vähentää DNA-pitoisuus (D). Mean +/- SD; n = 4. Data edustaa kolmea koetta. * P 0,05, pariksi opiskelijat t-testiä käytettiin merkitsevyyden määrittämiseen 2D- ja 3D.

Eturauhasen solulinjoja viljellään microaggregates näyttää huono napaisuus samanlaisia ​​kasvaimia

mikroaggregaatteja vahvistettu päivä 7 ja immunovärjättiin apikaaliseen (E-kadheriinin ja β-kateniinin) ja pohjapinta (α6-integriini ja laminiini-5) merkkiaineiden 3D päin (kuva 4). Näillä merkeillä valittiin mukaan edellisen käyttöä apikaalisella ja pohjapinta merkkiaineiden 3D matriisijärjestelmiä [18], [28] – [30]. Näistä tiedoista on selvää, että kaikki microaggregates ei ollut ontelo ja eivät muodosta polaarisia rakenteita, joissa vain Laminin-5 havaitaan asemassa odotetaan polaarinen aggregaatin, joka oli pohjapinta pinnalle ulkoreunasta mikroaggregaatti- (kuvio 4 LM-5). Sen tarkistamiseksi, että vasta-aineet työskentelevät solulinjoja viljeltiin yksikerroksisessa immunovärjättiin myös saman napaisuuden markkereita ja kuvataan useilla konfokaali Z-leikkuun (kuva S2). Kuten odotettua, Laminin 5 ja α6-integriini tahrata pohjapinta pinta kaikissa solutyypeissä kasvanut yksikerroksisessa, joidenkin sytoplasman värjäytymistä (kuvio S2B mustat nuolet). ja E-Cad ja β-kateniinin ovat pääasiassa ilmennetään solun soluliitos (kuva S2B valkoiset nuolet). Polar 3D mikroaggregaatit tai pallosia on määritelty apikaalinen pinta, joka ympäröi onton ontelon, ja pohjapinta, joka liittää ympäröivään matriisiin [18]. Mikrokaivo järjestelmä on vailla matriisin, lukuun ottamatta mitä tahansa solua erittyy liukoisen matriisin proteiineja eikä tukirakenteen kiinnittämistä varten ja siten ei ole selvää pohjapinta. Näin ollen, on ennustettavissa, että mikroaggregaatteja puuttuu ontelo ja siten apikaalisella pinnalla matriisin jännitys vaikuttaa kudoksen organisaation [31], mutta jonkin verran solun organisaation exsists. Esimerkiksi LNCaP, RWPE-1 ja 2-solut ilmentävät Laminin-5 ulommalle yhteenlaskettu pinta, mutta eivät ilmennä α6-integriiniä. Lisäksi, E-kadheriinin ja β-kateniinin havaittiin ilmaistiin välillä solun kiinnikkeistä LNCaP ja RWPE-2-mikroaggregaattien (kuvio 4), mutta ei ole ontelon pintaan ja näin ollen ei ole ilmoittanut näitä markkereita apikaalinen pinta. Näin ollen, solut pystyvät ilmentämään nämä fenotyyppisiä markkereita, mutta vaativat muita vihjeitä, todennäköisesti peräisin soluväliaineen tai ympäröivistä soluista, kuten on läsnä kasvaimessa mikroympäristössä, järjestäytyneen kudoksen muodostamiseksi acini [32]. Vaikka ei ole selkeitä eroja syövän ja ei-syöpäsolujen linjat, fenotyyppi havaittu on enemmän osoitus de-eriytetty syöpäsolun havaittiin korkealaatuista eturauhassyövän osoittaa, että määritys on edelleen sopiva suurikapasiteettisten huumetestejä eturauhassyövän solut. Kuitenkin, tämä järjestelmä ei ole kannattavaa kulttuurin ei-neoplastisen solu- linjoja, koska ei ole matriisin. Mutta lisäämällä matrigeelin että PDMS microwell järjestelmän normaalin eturauhasen solulinja, RWPE-1, muodostuu aggregaatteja että näyttöön päin (kuva S3A ja S3B). Lisäämällä 8% matrigeelin RWPE-1 aggregaatit näkyy napa-järjestö, jonka perusilmennystä α6-integriini (kuvio S3B) ja tämä napaisuuden ylläpidettiin 1% matrigeelin (kuvio S3A). Kuitenkin Mikroaggregaatteja kasvatettu PDMS työntää kanssa matrigeelin olivat suurempia verrattuna kasvatetaan insertit yksinään (kuvio S3C) tai 8% Matrigel yksinään (kuvio S3D). Siksi lisäämällä matrigeelin tarjoaa matriisin aikaansaamiseksi α6-integriini polariteetti, joka hävisi RWPE-1 soluja viljellään muutettu PDMS yksin. Alfa-6-integriinin on osoitettu olevan tärkeä acinus muodostumista RWPE-1-soluissa [33], sieltä puute α6-integriini voi myötävaikuttaa huono mikroaggregaatti- muodostumista näytetään normaali RWPE-1-soluissa.

mikroaggregaatteja kiinnitettiin päivänä 7 ja immunovärjättiin apikaalisella ja pohjapinta napaisuus markkereita (vihreä). E-kadheriinin (E-Cad) ja β-kateniinin käytettiin apikaalisella markkereita ja pohjapinta merkkiaineet olivat α6-integriini (α6-INT) ja Laminin 5 (LM5). Tumat värjättiin DAPI (magenta) ja Mittakaavapalkki on 100 pm.

PDMS mikrokaivo järjestelmää voidaan ohjata apoptoottista ydin

LNCaP viljellään mikrokuoppa järjestelmässä ( 360 x 360 um), joka on enimmillään koko 120 um eivät muodosta apoptoottisen ytimessä tunnistetaan katkaistun kaspaasi-3-värjäys päivänä 7 (kuvio 5A). Kuitenkin apoptoottista ydin voidaan ohjata kasvattamalla mikro-ja 800 um, ja lisäämällä kylvö solujen määrä 2000 solua per aggregaatti. Tämä loi aggregaatit -300 um yli 7 päivää, jonka keskellä on ydin pilkottiin kaspaasi-3-värjäyksellä (kuvio 5B). Apoptoottisen ydin on yleensä todetaan 3D kulttuureissa suurempi kuin 500-600 um halkaisija [34] – [36] kuitenkin apoptoottisia ytimiä on havaittu jopa LNCaP soluaggregaatteja 200 um halkaisija [37]. Vaihtelu havainnot kuvastavat sitä, että tehokas hapen toimitus on funktio monista muuttujista, mukaan lukien koko kulttuuri solujen määrä, ja korkeus väliaineen sekä yhteenlaskettu halkaisija [38]. Tutkimusten tavoitteena ympättiin suurempi halkaisija aggregaatit 6 kertaa suurempi solujen määrä kuin pienempi aggregaatteja, ja koska kuutio suhde volyymin säde yhtälö (V = 4 /3πr

3) Tämä johti vain alle kaksinkertaistamista kiviaineksen halkaisija (kuvio 5C). Lisääntyvät solut on aiemmin osoitettu keskitetään kehälle LNCaP aggregaattien 200 pm kasvatettu käyttäen agar neste overlay tekniikkaa [36]. Meidän tutkimuksessa käytimme Ki67-värjäys paljastaa, että lisääntyvät solut voidaan löytää tasaisesti koko kokooma- ja että nämä solut eivät keskittyneet jokin tietty pinta-ala (kuvio 5D), ehkä johtuen ilman pohjapinta, jonka matriisin pinta- . Siksi olemme osoittaneet, että voimme kontrolloida apoptoottisia ydin käyttämällä eri kokoisia mikrokuoppia ja leviämisen tasaisesti koko Mikroaggregaatteja.

(A) katkaistiin kaspaasi-3 (CASP3, vihreä), apoptoosin markkeri, oli käytetään tahraa osa RWPE-1, RWPE-2 ja LNCaP mikroaggregaatteja. (B) Koska ei ole katkaistun kaspaasi-3: pieni LNCaP aggregaatit, suuri mikrokuoppalevyn (800 um x 800 um x 800 um) käytettiin luoda suuria LNCaP mikroaggregaatteja apoptoottisen ydin (CASP3 Kotimaan). (C) halkaisija LNCaP mikroaggregaattien (SML) verrattiin LNCaP-mikroaggregaatteja kasvanut suuren mikrokuoppiin (Kotimaan). Vähintään 50 aggregaattien mitattiin kohti kunnossa. (D) Ki67 (vihreä) käytettiin myös värjäämään lisääntyvien solujen sisällä suuri LNCaP aggregaatin. Tumat värjättiin DAPI (magenta); mittakaavajana on 100 pm.

Culture eturauhassyöpäsolujen kuten 3D microaggregates lisää lääkeresistenssi, mikä johtuu eroista leviämisen

LNCaP-soluja viljeltiin 2D tai PDMS mikrokuoppia 2 päivää ennen lääkehoitoa. 1000 nM dosetakselin lisättiin ja verrattiin DMSO ajoneuvon hallinnan. Doketakselia käytettiin edustavana syöpälääkkeen tässä tutkimuksessa, koska sen rutiinikäyttöön eturauhasen syövän hoidossa [39]. Se estää sukkularihmaston kokoonpano ja mitoosissa, mikä johtaa apoptoosin, vähentämällä määrä vapaan tubuliinin tarvitaan mikrotubulusten muodostumista [39]. Soluja viljeltiin 3D olivat resistenttejä kaikille annoksia doketakselin kuin viljeltiin 2D jälkeen 48 tuntia (kuvio 6A). Klo 72 h eroja havaittiin vasta korkea lääkeannoksia on 10 ja 100 nM doketakselin (kuvio 6B). Pidemmän lääkkeen inkubointiaika IC50 lisääntynyt sekä 2D- ja 3D. Esimerkiksi 2D 48 tunnin IC50 oli 11 nM ja tämä nousi 51,3 nM yli 72 tuntia. 3D IC50 poikkeuksellisen korkea osoittaa, että 3D mikroaggregaatteja kestävät hyvin doketakseli lasketut IC50 48 tuntia oli 4,3 x 10

8 ja 426 nM 72 tuntia. Kasvavia annoksia doketakselin solujen 3D säilyttivät yhdistäminen, mutta tuli löysästi liittyvien, mutta 2D soluissa irrottaa (kuvio 6C). Se on raportoitu useiden syöpätyyppien että 3D kulttuureissa näyttää enemmän vastustuskykyä kemoterapeuttisia [9], [40] ja että 3D, LNCaP-solut ovat resistenttejä doketakselin kuin niiden yksikerroksista kollegansa [9]. Lisäksi olemme osoittaneet, että LNCaP kasvatettu 3D on alhaisempi replikointi verrattuna niiden 2D kollegansa (kuvio 3B) ja ovat siten vastustuskykyisempiä dosetakselia, joka kohdistuu lisääntyviä soluja [41]. Olemme osoittaneet, että nämä vaikutukset ovat väliaikaisia ​​ja että kun 7 päivää vanhoja mikroaggregaatit palautetaan 2D muovipinnoille, kuten yksittäisten solujen suspensio niillä on sama annos-vaste-profiilin soluja viljeltiin 2D (kuvio S4). Tämä lääke levinneisyys 3D-järjestelmissä on hitaampi verrattuna yksittäiseen yksikerroksista solujen, mikä tekee siitä verrattavissa kiinteitä kasvaimia [42]. Itse lääke tunkeutuminen kiinteitä kasvaimia on tyypillisesti 5- 10-kertainen hitaammin kuin yksikerrosviljelmissä [43].

LNCaP-soluja (50000 solua /kuoppa) hoidettiin dosetakselilla yli 48 tuntia (A) tai 72 h (B) päivänä 2 kasvun joko 2D- ja 3D. Alamar Blue käytettiin arvioimaan solujen elinkykyä. Mean +/- SE, n = 4 biologisten rinnakkaista * P 0,05; data esitetään edustaa kolmen erillisen kokeen. (C) Faasikontrasti- kuvat osoittavat vaikutuksia dosetakselin jälkeen 72 tunnin morfologiasta Mikroaggregaatteja (3D) verrattuna kasvatettujen solujen yksikerroksisessa (2D).

Yhteenveto

Yhteenvetona, PDMS järjestelmää voidaan käyttää säätelemään mitat syöpäsolujen mikroaggregaattien jäljitellä eri vaiheissa kasvaimen kasvua. Mikrokaivo järjestelmä tuottaa eturauhassyövän mikroaggregaatteihin tiukasti kontrolloitua mitat käyttäen PDMS mikro-pinta koostuu 600 mikro-kuoppiin /cm

2, kunkin ollessa 360 um 360 um. Pintamodifiointi joko 5% Pluronic tai usean tasoilla lohkoja proteiinin adsorptiota ja solujen kiinnittymistä päälle PDMS, ja tämä edistää mikroaggregaatti- muodostumista. LNCaP aggregaatit olivat elinkelpoisia ja solun numero aggregaattien lisääntynyt. Apoptotic core LNCaP aggregaatteja voidaan ohjata käyttämällä joko pieniä (360 x 360 um) tai suuri (800 x 800 um) ulottuvuus mikrokuoppia. Syöpä mikroaggregaattien, joka on muodostettu LNCaP ja RWPE-2-soluja puuttuu polaarisuus olisi havaittu kasvain, kun taas normaali RWPE-1-soluissa muodostaa pohjapinta yksilöidyt α6-integriinin ilmentymisen lisäämisen jälkeen Matrigel matriisin mikrokaivo levyt. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.