Krooninen sairaus

tiivistelmä

TIP60 (KAT5) on histoni liasetyylitransferaasi (HAT entsyymi) osallistuu useisiin solun prosesseihin kuten transkription säätelyyn, DNA-vaurioiden korjaus ja solujen signalointi. Eturauhassyövän, aggressiivinen tapauksissa jopa express TIP60 joka toimii androgeenireseptorin koaktivaattoria suoralla asetylaatio lysiinitähteiden sisällä KLKK motiivi reseptorin sarana-alueen. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ja karakterisoida TIP60 acetylase estäjä. Korkea seulontaan paljasti isotiatsoli joka esti sekä TIP60 ja p300 HAT toimintaa. Tämä aine (alun perin tunnistettu 4-metyyli-5-bromoisothiazole) ja muut isotiatsolit syntetisoitiin ja testattiin vasten TIP60. Vaikka autenttisen näytteen 4-metyyli-5-bromoisothiazole oli inaktiivinen TIP60, käytettäessä

in vitro

HAT määritys, 1,2-bis (isotiatsol-5-yyli) disulfane (NU9056) tunnistettiin suhteellisen estäjä (IC

50 2 uM). Solujen toimintaa vahvistettiin analyysillä asetylaatio histoni ja ei-histoni-proteiinien eturauhassyövän solulinja malli. NU9056 hoito inhiboi soluproliferaatiota paneeli eturauhassyövän solulinjoissa (50% kasvun inhibitio, 8-27 uM) ja indusoi apoptoosin kautta kaspaasi 3 ja kaspaasi 9 on pitoisuudesta ja ajasta riippuvalla tavalla. Lisäksi, vähentynyt androgeenireseptorin, prostataspesifisen antigeenin, p53 ja p21-proteiinin tasot osoitettu hoitovasteen kanssa NU9056. Lisäksi esikäsittely NU9056 esti sekä ATM fosforylaatiota ja TIP60 vakauttaminen vastauksena ionisoivan säteilyn. Perustuen toimintaa NU9056 ja spesifisyyden yhdistettä kohti TIP60 suhteessa muihin HAT entsyymejä, nämä kemiallisen biologian tutkimukset ovat tunnistettu TIP60 potentiaaliseksi terapeuttiseksi tavoite eturauhassyövän hoitoon.

Citation: Coffey K, Blackburn TJ, Cook S, Golding BT, Griffin RJ, Hardcastle IR, et al. (2012) karakterisointi on TIP60 Erityiset Inhibitor, NU9056, eturauhassyövässä. PLoS ONE 7 (10): e45539. doi: 10,1371 /journal.pone.0045539

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 18 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 21 elokuu 2012; Julkaistu: 08 lokakuu 2012

Copyright: © Coffey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamat Cancer Research UK (CRUK) (C240 /A7409; C29821 /A10348) (www.cancerresearchuk.org) ja Medical Research Council (MRC) KEHOTE (G0100100 /64424) (www.mrc.ac.uk). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: KH työskenteli OSI Pharmaceuticals, Inc. yhdisteet Tässä artikkelissa ei patentoitu , kehitteillä tai tuoneet markkinoille tämän yrityksen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

histoni asetylaatio ja deasetylaatiolla ovat keskeisiä tapahtumia säätelyssä kromatiinirakenteeseen. Histoni ase- tyylitransferaaseja (HAT) katalysoivat lisäys asetyyliryhmiä on ε-aminopäässä lysiini- tähteiden histonien. Asetylointi johtaa avoimessa kromatiinirakenteeseen poistamalla positiivinen veloituksia histones, mikä asiakkuutta proteiini konformaatiomuutoksia, joka mahdollistaa transkription kone käyttää DNA ja edistää transkriptioaktiviteettia. Histonideasetylaaseja (HDAC) vastustaa tätä prosessia edistämällä suljetun kromatiinirakenteeseen, joka on kopiointia ajatellen tukahdutettu. Lisäksi histoni asetylaatio merkit voivat toimia telakointikohtina muita proteiineja tulkita ”histoni koodi”; esimerkiksi kolmen osapuolen motiivi sisältävät 24 (TRIM24) hiljattain kuvattu ”lukija” proteiinia, joka tunnistaa sekä modifioimaton histoni H3 lysiinin 4 ja histoni H3 asetyloitu lysiiniä 23 samana histoni häntää mikä lisää geeniekspression [1] . Lisäksi, ei-histoni-proteiinien, kuten p53: n [2], [3], ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) [4], ja androgeenireseptorin (AR) [5], [6], voidaan myös asetyloida johtaa muuttuneeseen-proteiinin aktiivisuutta. Täten proteiini asetylointi ja deasetylaatiolla voi olla merkittäviä vaikutuksia solujen toimintaa, ja soluja ylläpitää normaalia kasvua ja erilaistumista on tärkeää, että nämä kaksi tehtävää ylläpitää tasapainoa. Tämän tueksi käsitettä, HDAC-inhibiittorit on todettu olevan laaja cellular vaikutuksia ja kliinistä aktiivisuutta leukemia [7], [8], jossa Vorinostat (SAHA) on hyväksytty kliiniseen käyttöön tässä sairaudessa. Modulaatio histonien asetylointi selvästi on terapeuttinen potentiaali.

TIP60, äskettäin nimetty uudelleen KAT5, on jäsen MYST perheen HAT entsyymien ensimmäinen tunnistettu vuonna 1996 [9]. Koska niin monet solun toimintoja on todettu käyttää tätä proteiinia. Menetys TIP60 johtaa heikentyneeseen DNA korjaukseen, sillä tämä HAT aktivoituu vasteena ionisoivalle säteilylle (IR), joka aiheuttaa asetylaatio histonien ja aktivointi p53 ja ATM [4]. Esto TIP60 olisi siksi herkistää soluja DNA: ta vaurioittavat aineet, joita käytetään, kuten syöpähoitojen. TIP60 toimii myös NF-KB-reitin kautta vuorovaikutus B-solujen KLL /lymfooma 3 (BCL-3) [10] ja cAMP-riippuvainen signalointi [11]. Lisäksi TIP60 voi toimia koaktivaattori useita steroidihormonireseptoreihin myös AR, joka on mukana kehittymistä ja etenemistä eturauhassyövän (CaP). Tutkimukset ovat osoittaneet, että AR voidaan asetyloitiin useita HAT entsyymejä, mukaan lukien p300, p300 /CBP-liittyvä tekijä (PCAF) ja TIP60, lisätä sen transkriptionaalista aktiivisuutta [6], [12]. AR asetylointi sen ajatellaan säätelevän rekrytointi yhteistyössä aktivaattorien transkription koneisto androgeeniresponsiivinen geenien [13]. Lisäksi TIP60 on toiminnallisesti säädelty kliinisissä CaP yksilöiden ja ilmaisun korreloi taudin etenemiseen [14]. Sen sijaan yksi raportissa ehdotettiin, että TIP60 tarvitaan ilmaisemaan kasvaimen etäpesäke vaimennin KAI1 Cap solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että TIP60 on tuumorisuppressorina [15]. Samoin TIP60 geeni tyrmäys tutkimus ehdotti TIP60 kuin HAPLO-riittämätön tuumorisuppressoriproteiinia ennalta ja varhaisessa kasvaimen vaiheissa lymfooma, rinta- ja pään ja kaulan alueen syövät [16]. Kuitenkin tutkimukset kliinisistä eturauhasnäytteissä ristiriidassa tämän ehdotuksen ja tukevat TIP60 kuten onkogeenin Cap [13], [17]. Siten kohdistaminen acetylase aktiivisuutta TIP60 voisi olla hyödyllinen terapeuttinen strategia korkki.

Muutamat HAT estäjien on raportoitu. Kytkimen histoni H3 peptidin CoA muodostaa bisubstrate estäjä HAT toimintaa on kuvattu; kuitenkin, yhdisteellä on huono solukalvon läpäisevyys [18]. Luonnollinen tuotteet anacardic happo ja garcinol ovat HAT estäjiä, jotka ovat solun läpäisevä; ne herkistää soluja IR, joka voisi olla käyttökelpoinen yhdistelmä hoidon syövän hoitoon. Muut inhibiittorit HAT-toiminto ovat α-metyleeni butyrolaktonit [19], bentsylideeni acetones [20], ja alkylideeni malonaatit [21]. Viime aikoina, isotiatsolonit, jotka kovalenttisesti sitoutuvat HAT aktiivisen tioli, on kuvattu tehokkaana lähtökohtana molekyylimallitus lähestymistavat tuottaa tehokkaampia ja spesifisiä inhibiittoreita [22] – [24]. Nykyisessä tutkimuksessa käytimme tehoseulonnan lähestymistapa tunnistaa selektiivisiä TIP60. Perustuen johtomolekyylin, rakenteellisesti samankaltaisia ​​yhdisteitä syntyy ja testattiin HAT eston ja TIP60 spesifisyys tunnistamiseksi molekyyli- työkalu tutkimusten solulinjassa malleja korkki.

Tulokset

korkea suoritusteho screen (HTS) ja Hit Validation

tehoseulonnan kampanja TIP60 estäjien suoritettiin OSI Pharmaceuticals Ltd. määritykset perustuvat ALPHA ™ näytön ja DELFIA ™ muotoja kehitettiin ja käytettiin seulomaan rakenteellisesti monipuolinen yhdiste kokoelma (~80,000 jäsentä). Useita osumia tunnistettiin ensisijaisen ALPHA ™ -näyttö. Kuitenkin suurin osa näistä ei osoittanut merkittävää aktiivisuutta toisen näytön. Yksi yhdiste, OXA-10 (alun perin tunnistettu 4-metyyli-5-bromoisothiazole, 1), tunnistettiin osuma molempia näyttöjä ja aktiivisuus toistettu hankitaan materiaalia. Takaisinostetut oksa-10 osoittivat aktiivisuutta TIP60 (IC

50 1,1 uM – kuvio 1) ja p300 (IC

50 2,7 uM) (taulukko 1), mutta ei muita histoni ase- tyylitransferaaseja esim PCAF ja GCN5 (IC

50 100 uM). LC-MS-analyysi on hankkia näytteen oksa-10 osoitti, että läsnä -80% 4-metyyli-5-bromoisothiazole 1, mutta osoitti, että se sisälsi -20% tuntemattoman epäpuhtauden. Voidakseen vahvistaa 1 aktiiviseksi estäjä TIP60 in oksa-10, synteesi 1 tehtiin yhdessä analogit, jotta voitaisiin kehittää rakenneaktiivisuuden. Tiedot kemiallisen synteesin (kuvio 2) löytyy Täydentäviä tietoja.

arvioimiseksi aktiivisuus TIP60 HAT,

in vitro

HAT joissa käytetään

3H asetyyli-CoA tehtiin käyttäen histonit substraatteina. Määritykset suoritettiin neljänä rinnakkaisena ja toistettiin kahdesti. Yhdisteille tuottaa 50% inhibitio 100 uM, IC

50-arvot laskettiin. Yksittäiset IC

50 arvot esitetään. Muista yhdisteistä että% inhibitio 100 uM on esitetty.

erityisyys NU9056 varten TIP60 asetyylitransferaasin

NU9056 (7), sekä yhdisteet 5 ja 6, testattiin

in vitro

tehoavan paneeli yhdistelmä-HAT entsyymien, kuten p300, PCAF ja GCN5, onko ne osoittavat suurempaa spesifisyyttä TIP60 kuin yhdiste 1. ICR CCT129182, joka on osoitettu on estävä vaikutus p300 ja PCAF, testattiin myös [24]. Monien yhdisteiden, jotka havaittiin inhiboivan TIP60 alhaisissa mikromolaarisella pitoisuuksilla (kuvio 1; Supplemental kuvio S1). Kuitenkin spesifisyys kohti TIP60 muihin HAT entsyymien testattu todettiin olevan suurimmillaan yhdisteen 7 (NU9056) kuten taulukosta 1 (16.5-, 29- ja 50-kertainen selektiivisyys TIP60 yli PCAF, p300 ja GCN5, vastaavasti ).

NU9056 estää proteiinisynteesiä asetylointi in eturauhassyöpäsolulinjat

TIP60 acetylates histoniproteiineista, erityisesti histonien H4 ja H2A, joka nukleosomi- yhteydessä [25]. Lisäksi

in vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että TIP60 voi myös acetylate ydinhistonien H2A (Lys 5), H3 (Lys 14) ja H4 (Lys 5, Lys 8, Lys 12 ja Lys 16) [26], [27]. Sen testaamiseksi NU9056 voisi estää asetylaatio endogeenisen proteiinien kohteena TIP60, LNCaP-soluja käytettiin, koska ne ovat mallihissin androgeeniriippuvaisessa korkki. Asetylointi tila histoni H4 lysiinin 8 (H4K8) ja 16 (H4K16) ja histoni H3 lysiinin 14 (H3K14) tutkittiin näissä soluissa Western-blottauksella. Lisäksi taso TIP60 arvioitiin seuraavan hoidon NU9056 ja ohjaus yhdistettä, 1,2-bis (4-pyridyyli) etaani (kuvio 3A), jotka osoittavat, että TIP60 tasot ovat itse vaikuta. Koska pohjapinta määriä näitä asetyloitua histonimerkkien ovat melko alhaiset, HDAC estäjä trikostatiini A (TSA) tuotiin poistamiseksi vaikutuksen HDAC toimintaa asetylointi solu määrityksessä. Läsnä ollessa TSA yksin, asetylointi nostettiin H4K8, H4K16 ja H3K14 (kuvio 3B), mikä on yhdenmukaista aikaisempien raporttien [28] – [30]. Kasvavia pitoisuuksia NU9056 johti alentuneet asetyloitua histoni H4K16, H3K14 ja H4K8, tavoitteet TIP60-välitteisen asetylointi (kuvio 3C). Lisäksi ohjaus yhdistettä, 1,2-bis (4-pyridyyli) etaani, ei vaikuta mihinkään histonimodifikaation tutkittu.

Osa 1 – mukaisten yhdisteiden synteesi 4-7. Osa 2 – yhdisteiden synteesi 1 ja 11.

LNCaP-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla NU9056 tai ohjaus yhdistettä, 1,2-bis (4-pyridyyli) -etaani 24 tuntia. (A) tasot TIP60 arvioitiin Western-blottauksella. (B) LNCaP-soluja käsiteltiin 2 uM TSA: ssa 6 tuntia ja tasot histoni H4 asetyloitua-lysiini 16, histoni H4 asetyloitu-lysiini 8 ja histoni-H3-asetyloitu lysiiniä 14 arvioitiin Western-blottauksella. LNCaP-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla NU9056 tai ohjaus yhdistettä 2 tuntia, sitten käsiteltiin HDAC-inhibiittori TSA (2 uM) vielä 4 tuntia. (C) tasot histoni H4 asetyloitua-lysiiniä 16, histoni H4 asetyloitu-lysiiniä 8 ja histoni H3 asetyloidut lysiiniä 14 arvioitiin Western-blottauksella. (D) LNCaP-soluja käsiteltiin 24 uM NU9056 yli 4 päivää, ja tasot asetyloitu tubuliinin arvioitiin Western-blottauksella. (E) LNCaP-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla NU9056 tai ohjaus yhdistettä 2 tuntia, sitten käsiteltiin HDAC-inhibiittori TSA (2 uM) vielä 4 tuntia. Tasot asetyloitua tubuliinin arvioitiin Western-blottauksella. Alfa-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. Edustavia blots näkyvät kahtena kokeita.

Jos haluat määrittää tarkemmin HAT estoaktiivisuus NU9056, asetylointi ei-histoni proteiinin α-tubuliinin tutkittiin myös. Kun LNCaP-soluja inkuboitiin NU9056 (24 uM) 24 tunnin ajan väheneminen asetyloitu tubuliinia havaittiin. Kuitenkin, 72 tuntia asetylaatio oli palannut perustasoille (kuvio 3D). Sen vahvistamiseksi, että tämä vaikutus johtui NU9056, asetyloitua tubuliinia seurattiin mutta mitään muutosta tasojen havaittiin 6 tunnin toisin muutoksia histonimodifikaation (kuvio 3E). Densitometria kaikille Länsi-blotit esitetään Supplemental kuvassa S2.

NU9056 Estää Cell Growth

Havaitsimme, että knockdovvn TIP60 LNCaP-soluissa johti soluproliferaation inhibointi noin 33% (p -arvo = 0,0019) (kuvio 4A). Tehokas knockdovvn TIP60 mRNA näissä soluissa vahvistettiin reaaliaikainen PCR (kuvio 4B, 70% pudotus, p-arvo = 0,0313) ja Western-blottauksella (kuvio 4C). Jos NU9056 kanteen välittämä estämällä TIP60 entsymaattista aktiivisuutta, soluproliferaation inhibointi, jonka NU9056 olisi odotettavissa. Itse asiassa, proliferaatio havaittiin vähennetään läsnä NU9056 kaikissa CaP testatuissa solulinjoissa mitattuna sulforodamiini B (SRB) määrityksessä (taulukko 2, Täydennyskuvio S3, S4). Mielenkiintoista LNCaP-solut, jotka ovat androgeeniresponsiivinen ja ilmaista mutatoitunut mutta toimiva AR sekä villityypin p53, ja luun etäpesäke peräisin PC3-solut, jotka eivät ilmennä funktionaalista AR ja ovat p53 null, näytetään samankaltainen GI

50 pitoisuuksia (24 uM ± 2 ja 27 uM ± 2 LNCaP ja PC3-soluissa, vastaavasti). Kuitenkin LNCaP-AI-solut, osa-linja LNCaP sarjamuotoisesti ylläpidetään steroidi-tyhjennetty kasvualusta, joka edelleen ilmentävät funktionaalista AR ja ovat malliesimerkki kastraatiotason korkilla post androgeeniablaatio hoito, on alhaisempi GI

50 ( 24 uM ± 2 ja 16 uM ± 1 LNCaP ja LNCaP-AI, vastaavasti). Muut solulinja malleja androgeeniriippumattomuuteen, esim. LNCaP-CdxR, joka on sarjatuotannossa säilytetään läsnä bikalutamidin ja CWR22rv1, osoittavat merkittävästi suurempaa herkkyyttä NU9056 kuin vanhempien LNCaP-solulinjasta (GI

50-arvot 12 uM ± 2,5 ja 7,5 uM ± 0,2 (p 0,05 ja p 0,0005 vastaavasti)). TIP60 mitattiin Western blottauksella näissä solulinjoissa (kuvio 4D) paljastaa, että kaikkein herkimmät solulinjaa, CWR22rv1, oikeastaan ​​ilmaisee kaikkein TIP60.

(A) Sen varmistamiseksi, että esto TIP60 voi vähentää solujen leviämisen 2,5 nM siRNA suunnattu erityisesti TIP60 LNCaP soluja tai ei-äänenvaimennusjärjestelmiä kontrolli käytettiin. Proliferaatio määritettiin sulforodamiini B (SRB) määritykset 3 ohjaus leviämisen kaksinkertaistumisaikaa jälkeen siRNA transfektion normaalissa kasvualustojen. Vahvista TIP60 Knockdown, RNA kerättiin 96 tuntia Rinnakkaiskokeessa ja arvioitiin TIP60 ilmentymisen avulla (B) reaaliaikainen PCR ja (C) Western blotting. (D) TIP60 tasoilla eturauhassyövän solulinjoissa arvioitiin Western-blottauksella. (E) Eturauhassyöpä solujen eloonjäämistä arvioitiin käsittelemällä LNCaP 24 uM NU9056 24 tuntia sitten päällystämällä vaihtelevin solutihe- (3 x 10

3, 1,6 x 10

4 ja 3 x 10

4 ) ja antamalla pesäkkeiden muodostamiseksi yli 2 viikkoa. Pesäkkeet kiinnitettiin sitten Carnoy fiksatiivi ja värjättiin kristallivioletilla. Pesäkkeet laskettiin sitten ja pesäkkeitä muodostavien tehokkuus lasketaan. Keskimääräinen 3 kokeen ± keskihajonta esitetään pylväsdiagrammein. * P-arvo 0,05.

Voit testata, onko NU9056 voi vähentää eloonjäämisen CaP solujen pesäkkeenmuodostuskyvyn arvioitiin altistuksen jälkeen LNCaP 24 uM (GI

50) NU9056 24 tunnin ajan. Pesäkkeenmuodostuskyvyn pienensi NU9056 altistuksen, joka oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,05) (kuvio 4E).

NU9056 hoito aiheuttaa apoptoosin kautta Caspase Activation

Vaikutukset NU9056 solusyklin vaiheesta jakelu ja apoptoosin induktion testattiin myös LNCaP. Arvioida apoptoottiset vaikutukset, FACS-analyysi aktivoiduille kaspaasi 3 ja aktivoitu kaspaasi 9 käytettiin. NU9056 johti sekä kaspaasi 3 ja kaspaasi 9 aktivointi on ajasta ja pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 5A, täydentävä kuviot S5 ja S6). Tasot apoptoosin verrattiin myös muihin HAT estäjien osoittavat, että NU9056, jossa on suurempi spesifisyys TIP60, voivat aiheuttaa apoptoosin samalla tasolla kuin enemmän siveetön estäjät (Täydennyskuvio S7). Analyysi sub-G1 väestön LNCaP-soluissa (kuvio 5B) vahvisti apoptoosin induktio on ajasta ja pitoisuudesta riippuvainen tavalla NU9056. Ei kuitenkaan missään olosuhteissa altistua NU9056 ei havaitsemme mitään G1 tai G2M solukierron pysähtymisen LNCaP-soluissa; vain kertymistä osa-G1 vaihe nähtiin (kuvio 5C, D). Sen määrittämiseksi, ovatko kastraatiotason resistenttejä solulinjoja ovat herkempiä NU9056 ehdottivat GI

50 määrittämisen vertailun LNCaP-solujen LNCaP-AI ja LNCaP-CdxR soluista hoidon jälkeen NU9056 24 tuntia tehtiin. Todellakin, LNCaP-AI ja LNCaP-CdxR solut näyttävät olevan herkempiä NU9056 kuin LNCaP mikä näkyy suuremman populaation ollessa Sub-G1 vaiheeseen solusyklin (kuvio 5E). Kun käytetään LNCaP GI

75 annosta (36 uM) merkittävä kasvu Sub-G1 nähtiin LNCaP-AI-solujen (p = 0,036) verrattuna LNCaP-soluja. Samanlaisia ​​suuntauksia havaittiin varten LNCaP-CdxR, vaikka tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,1679).

(A) LNCaP-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia, sitten lisäämällä annosta NU9056 haettiin ( i) 24 tuntia, (ii) 96 tuntia tai (iii) GI

25 (17 uM) tai (iv) GI

50 (24 uM) levitettiin 4 päivää. Kaikki solut kerättiin ja kiinnitettiin Cytofix /Cytoperm (BD) jälkeen kaspaasi 3 ja kaspaasi 9 määritys sarjat (BD) arviointiin käytettiin toimintaansa virtaussytometrialla. Fluoresenssi havaittiin FL-1 kanavan FACSCAN. (B) analyysi SubG1 väestöstä suoritettiin näissä samoissa soluissa käyttäen propidiumjodidin tahra solujen DNA. LNCaP-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia, sitten NU9056 on haettu (C) 1 tai (D) 4 päivää. (E) LNCaP, LNCaP-AI ja LNCaP-CdxR solut ympättiin ulos 6 kuoppalevyille ja NU9056 haettiin 24 tuntia. Analyysi SubG1 suoritettiin kuten edellä on kuvattu. Kaikki solut kerättiin ja kiinnitettiin Cytofix /Cytoperm (BD), sitten solusyklin analyysi suoritettiin käyttäen propidiumjodidin tahra solujen DNA. Kaikki FACS Aineisto analysoitiin WinMDI. Kaikki kokeet suoritettiin 3 kertaa, ja keskiarvo ± keskivirhe on esitetty. * P-arvo 0,05; ** P-arvo 0,005; *** P-arvo 0,001.

NU9056 hoito vähentää PSA ilmentäminen LNCaP

TIP60 on ilmoitettu AR koaktivaattoria [31], jolla on rooli korkki kehittämisessä. Vahvista roolin TIP60 PSA ilmaisun, siRNA käytettiin pudotus TIP60 tasot LNCaP ja PSA-mRNA-tasot seurattava vastauksena androgeenireseptorin (dihydrotestosteroniksi (DHT)) stimulaatiota. Kun läsnä on ei-hiljentäminen siRNA PSA indusoitiin noin 10-kertaisesti vasteena DHT (kuvio 6A). Kuitenkin, kun pudotus on TIP60 (kuvio 6B) on vain 2,5-kertainen lisäys havaittiin (kuvio 6A). Tutkia vaikutuksia NU9056 on AR-toiminto, LNCaP-soluja käsiteltiin 24 uM NU9056 yli 48 tunnin ajan, minkä jälkeen tasot AR ja PSA-proteiinin arvioitiin Western-blottauksella. Lisäksi olemme tutkineet tasoja p53 ja sen kohdegeenin p21, kuten p53 on myös kohde TIP60. Havaitsimme, että tasot sekä AR ja p53 vähenivät 24 tunnin kuluttua 2- ja 3-kertaiseksi, ja että tuotteet kohdegeenien, p21 ja PSA, vähensi myös 3- ja 2-kertaiseksi (kuva 6C, D). Tämä tulos viittaa siihen, että todellakin TIP60 osallistuu AR ja p53 signalointi tässä solulinjassa ja että NU9056 voi moduloimalla TIP60 asetylaatio aktiivisuutta, vaikuttavat nämä tärkeät loppupään tavoitteet.

Vahvista vaikutusten TIP60 on androgeenireseptorin aktiivisuutta käytimme 2,5 nM siRNA suunnattu erityisesti TIP60 LNCaP-soluissa, tai ei-hiljentäminen ohjaus. Knockdown saavutettiin 48 tunnin kuluttua steroidi tyhjentynyt väliaineessa, minkä ajan jälkeen 10 nM DHT sovellettiin aiheuttavan androgeenireseptorin aktiivisuutta ja PSA ilme. RNA kerättiin 24 tunnin kuluttua DHT stimulaatio, käänteistranskriptio ja reaaliaikaisen PCR suoritettiin. Expression of (A) PSA ja (B) TIP60 normalisoitiin suhteessa HPRT1 ilmaisua. (C) LNCaP-soluja käsiteltiin 24 uM NU9056 yli 48 tuntia, ja proteiini kerättiin SDS-näytepuskurissa. Proteiini analyysi suoritettiin SDS-PAGE ja Western blotting p53, p21, AR, PSA ja alfa tubuliinia. (D) Densitometria suoritettiin Western blot. Kaikki kokeet suoritettiin kaksi kertaa ja keskiarvo ± keskihajonta esitetään.

NU9056 Estää DNA Damage Response eturauhassyöpäsoluissa

TIP60 tiedetään olevan rooli DNA vaurioita vastaus [25]. Altistettaessa IR TIP60 on aktivoitu, mikä johtaa asetylaatioon histoniproteiinien ja aktivointi ATM ja p53 [4]. Sen testaamiseksi NU9056 voi estää DNA-vaurioita vastaus eston kautta TIP60 acetylase toiminnan aktivointi ATM arvioitiin Western blotting vastauksena IR jälkeen esikäsittely NU9056. Vastauksena IR, Patm kohoamiseen dramaattisesti 10 minuutissa. Ajan Patm tasot vähitellen laski. Kuitenkin, kun läsnä on NU9056 tämä lasku oli paljon nopeammin (kuvio 7A). Lisäksi vastauksena IR tasot TIP60 proteiinia vakiintui tuloksena kertymistä. Solut, jotka oli aiemmin käsitelty NU9056 ei osoittanut TIP60 kertymistä (kuvio 7B), mikä saattaa selittää korkeamman liikevaihdon Patm tasoilla.

osoittamiseksi inhibitio TIP60 aktiivisuuden NU9056, tasot Patm, TIP60 ja γH2AX tutkittiin vasteena IR: n läsnä ja poissa ollessa lääkkeen. LNCaP-soluja käsiteltiin 24 uM NU9056 tai ajoneuvon hallinnan 1 tunti ennen 0,5 Gy IR. Proteiini lysaatit kerättiin eri ajankohtina post-IR ja analysoitiin Western blotting varten (A) Patm ja (B) TIP60 tasoilla. (C) 293T, (D) LNCaP ja (E) LNCaP-CdxR soluja esikäsiteltiin NU9056 (24 uM) tai ajoneuvon hallinnan 1 tunnin ajan ennen 2 Gy IR. Solut kiinnitettiin ja värjättiin γH2AX pesäkkeet ajan ja pesäkkeet määritettiin immunofluoresenssilla varten 293T ja virtaussytometrialla varten LNCaP ja LNCaP-CdxR. Kokeet toistettiin 3 kertaa edustava kuvissa ja määrällisten tietojen näytetään keskimääräisenä% soluista värjättiin γH2AX ± keskihajonta.

TIP60 acetylase toimintaa tarvitaan helpottamaan ubikitiinipromoottori ligaasilla UBC13 välittämää ubikinaation ja hävittämistä ja γH2AX [32]. Siksi esto TIP60 acetylase toiminta estää alas-sääntelyn γH2AX signaalin. Tämän testaamiseksi 293T-soluja käsiteltiin NU9056 (24 uM) tai ajoneuvon hallinnan 1 tunti ennen IR (2 Gy) altistumista. Solut kiinnitettiin sitten ja γH2AX pesäkkeet visualisoitiin immunofluoresenssilla. Verrattuna auton hallinnan γH2AX muodostuminen oli vielä selvästi rikastunut jopa 24 tunnin kuluttua IR stimulaation (kuvio 7C) viittaa siihen, että korjaus DNA-vaurio heikentynyt. Tämä näkyy myös LNCaP ja LNCaP-CdxR soluja, jotka arvioitiin virtaussytometrialla γH2AX. LNCaP-solut, määrä pesäkkeitä olivat huomattavasti korkeammat 24 tunnin palautumisen, kun läsnä on estäjää (p = 0,0277) (kuvio 7D), kun taas LNCaP-CdxR solujen merkitsevä ero on nähtävissä sen jälkeen, kun 4 tunnin palautumisen (p = 0,0324) ( Kuva 7E). Lisääntyminen γH2AX nähdään myös 24 tunnin palautumisen mutta ei havaittu olevan tilastollisesti merkitsevä.

Keskustelu

Protein asetylaatio, sääntelymekanismina, on osoittautunut olevan tärkeä monissa solureiteillä , ei vain geenin transkription kautta histonimodifikaation. Molemmat entsyymit sääntelee asetylointi, hattuja ja HDAC, ovat de-säädellään tautitiloissa. Siksi kohdistaminen molemmat entsyymeistä pienmolekyylisalpaajien terapeuttisena strategiana on pätevä. Inhibiittorit vastaan ​​HDAC todettu olevan menestyksekäs kliinisissä tutkimuksissa; kuitenkin, HAT-inhibiittorit ovat varhaisemmassa kehitysvaiheessa. Viime aikoina on ollut joitakin otaksuttu HAT estäjiä kuvataan, vaikka kukaan näyttävät voitava erottaa huomattavasti eri HAT perheenjäsenet ja kukaan on kehitetty erityisesti vastaan ​​TIP60, HAT entsyymiä, joka näyttää on erityinen tehtävä Cap kehittymistä ja etenemistä. Tilanteen korjaamiseksi Tässä vaiheessa meidän tunnistaneet HAT estäjä, käyttäen HTS ja kohdennettuja yhdisteen synteesi, joka estää TIP60 muihin HAT entsyymejä.

Vaatimus täysin vahvistaa HTS osuu kautta resynthesis hyväksytään laajasti aineistoa kaupallisessa yhdiste kokoelmista voi sisältää tunnistamattomia epäpuhtauksia, tai ne voivat hajota varastoinnin, tyypillisesti jäädytetyt DMSO ratkaisuja, antaa vääriä positiivisia. Tässä tapauksessa kirjallisuuden synteesi 1 ei ollut saatavilla, ja reitti oli kehitettävä. Ensimmäinen järjestelmä yrittänyt (osa 1) ei antanut kohdeyhdisteet, 1, tai sen desmetyyli analogi; kuitenkin isosyanato ja disulfidi analogit 4-7 valmistettiin. Yhdiste 1 valmistettiin onnistuneesti kautta vaihtoehtoista reittiä (osa 2).

biologista aktiivisuutta tarkkailtiin Disulfidien 5 ja 7 (NU9056), sai meidät tutkimaan aktiivisuuden muita yksinkertaisia ​​aromaattisia ja heteroaromaattisia disulfidia. Mielenkiintoista on, että nämä yhdisteet olivat vailla TIP60 inhiboivan aktiivisuuden, mikä osoittaa, että TIP60 inhibitio ei johdu pelkästään läsnäolo disulfidiryhmän. Samoin bromitiofeeni analoginen isotiatsoli 1 oli aktiivinen.

Isotiatsoloneja on aiemmin raportoitu kohdistaa acetylase aktiivisuus monia HAT entsyymien kuten p300 ja PCAF [24]. Kuitenkin, tietyn inhibiittorin TIP60 ei ole kuvattu. On olemassa monia etuja voidaan saavuttaa kohdistamalla tätä proteiinia johtuen erilaiset solujen prosesseihin, joissa TIP60 on osallisena. Esimerkiksi ei ainoastaan ​​tämän proteiinin toiminnon lisätä transkriptionaalista aktiivisuutta AR ja p53, mutta se voi myös olla tärkeä rooli DNA: n korjaukseen, jossa se voi acetylate histoniproteiineista merkitä sivustoja DNA-vaurion ja aktivoida ATM [25].

tässä raportissa olemme laatineet isotiatsoloniyhdisteen, NU9056 (7), joka kohdistuu TIP60 HAT aktiivisuus valikoivasti mikä vähentää asetylaatioon histoniproteiineista

in vitro

. TIP60 on havaittu olevan poikkeavasti ilmentää useita syöpiä, mukaan lukien eturauhas- ja ihosyöpä. Erityisesti TIP60 voi asetyloimaan AR, keskeinen transkriptiotekijä korkki, edistää lisääntynyt AR transkriptioaktiviteettia [6] ja TIP60 ilme on myös osoitettu korreloivan taudin etenemiseen [14]. Siten kohdistaminen acetylase tämän proteiinin voisi olla hyötyä potilaille, jotka kärsivät kastraatiotason korkilla, joka ei enää vastaa androgeenien puute hoitoa. Näin ollen testata kykyä NU9056 estää HAT aktiivisuutta soluissa, olemme käyttäneet CaP solulinja malleja. Näissä solulinjoissa olemme osoittaneet inhiboiva vaikutus NU9056 vastaan ​​HAT toimintaa TIP60. Lisäksi asetylointi ei-histoni-proteiinien, kuten tubuliinia havaittiin vähennetään näissä solulinjoissa vasteena NU9056. Mielenkiintoista, tasot AR ja p53 laski hieman jälkeen NU9056 hoidon LNCaP tukevat aiemmissa raporteissa, että asetylointi parantaa vakautta näiden proteiinien [33], [34]. Koska tärkeyttä AR ja p53 ja niiden läsnäolo LNCaP, tämä saattaa selittää miksi sekä apoptoosin lisääntyy ja lisääntymistä on vähentynyt vastauksena NU9056 pitoisuutena ja ajasta riippuva tavalla. On kuitenkin olemassa eroja herkkyydessä eri CaP solulinjoista, joita ei voida selittää pelkästään AR tai p53 tila. Tämä jälkimmäinen havainto viittaa siihen, että aktiivisuus TIP60 kohti AR ja p53 ei ole vaikuttava tekijä soluvastetta lääkkeen. Kuitenkin vasteena DNA vahingoittamatta IR, joka aktivoi acetylase aktiivisuus TIP60, huomaamme, että NU9056 estää kehitystä Patm signaalin ja vaikeuttaa vakauttamiseen TIP60 itse mahdollisesti estämällä auto-asetylointi. Lisäksi NU9056 heikentää solujen selviytymistä vastauksena IR- ja heikentää poistaminen γH2AX tavaramerkin mahdollisesti haittaa DNA korjaukseen.

Mielenkiintoista, solulinja malleja kastraatiotason kestävyys näyttävät olevan herkempiä NU9056. Kohonnut ja vakauden TIP60 androgeeni erottelua soluja, johtuu kroonisesta kasvusta androgeenien ablatoitu olosuhteissa, on raportoitu muissa vastaavissa solulinjassa mallit [35], ihmisen CaP ksenografteissa ja otetuissa kastraatiotason resistenttien potilaiden [14]. On mahdollista, että androgeeni-tunteettomia solut ovat riippuvaisempia TIP60 tasoilla niiden kasvua verrattuna niiden androgeeniresponsiivinen kollegansa, mikä lisää herkkyyttä NU9056. Itse asiassa alustavat tutkimukset osoittavat, että tasot TIP60 proteiinin vaihtelevat testatuissa solulinjoissa, jossa enemmän NU9056 herkkiä solulinjoja, CWR22rv1 ja LNCaP-CdxR osoittaa korkeimman TIP60. Erot entsyymiaktiivisuus TIP60 välillä solulinjojen voi myös olla tärkeä. Tämä hypoteesi on täysin testattu tulevissa tutkimuksissa useissa solulinjoissa ja

in vivo

malli järjestelmien lopullisesti määrittää mekanismi herkkyyttä. Siitä, onko NU9056 on yleensä myrkyllistä soluille; uskomme, että tämä on epätodennäköistä suurimmaksi osaksi. Ensinnäkin, ei ole muutosta γH2AX värjäytymistä, kun NU9056 laitettiin soluihin viittaa siihen, ei induktion DNA-vaurioita. Toiseksi ero vaikutuksia nähtiin riippuen solulinjasta viittaa yleensä myrkyllisyys ei ollut syynä haitallisia solujen vaikutuksia.