Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on pitkälti parantumaton sairaus, ja yhä enemmän näyttöä tukee strategioita moniosaisia ​​molekyyli- välittäjiä kriittiset toiminnot haiman adenokarsinooma soluissa. Solunsisäinen redoksitilassa moduloi eri signaalitransduktioreaktioteiden ja biologisissa prosesseissa, kuten solujen eloonjäämistä, lääkeresistenssin ja vastata microenvironmental tekijöihin. Viime aikoina on osoitettu, että transkriptiotekijä STAT3 on alle redox ohjaus, mutta mekanismit sen sääntely ovat tuntemattomia. Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että STST3 DNA sitova ja transkription aktiivisuutta suoraan säätelee redox toiminta APE1 /Ref-1 endonukleaasi, käyttäen yli-ilmentyminen ja redox-mutaation strategiat, ja geeni knockdown. Myös farmakologinen salpaus APE1 /Ref-1 redox-estäjä E3330 kumoaa STST3 DNA: ta sitova. Koska APE1 /Ref-1 myös kykenee redox valvonta muiden syöpään liittyvän transkriptiotekijöitä, me vaikutuksia arvioi kahden kohdentamista STAT3 signalointi ja APE1 /Ref-1 redox on haimasyöpä solujen toimintaan. Havaitsimme, että häiriöt APE1 /Ref-1 redox aktiivisuuden synergoi STST3 saarto estävän tehokkaasti leviämisen ja elinkelpoisuutta ihmisen PDAC soluja. Mekanistisesti osoitamme, että STST3-APE1 /Ref-1 dual kohdistaminen edistää merkittävästi tuumorisolujen apoptoosin, jossa sitoutuminen kaspaasi-3 signalointi, jotka ovat merkittävästi lisääntyneet vaikutuksiin verrattuna laukaisi yhden tavoitteen saarto. Lisäksi osoitamme, että STST3-APE1 /Ref-1 dual saarto aiheuttaa huomattavia tuumorin solujen vaeltamiseen. Kaiken kaikkiaan tämä työ osoittaa, että transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3 suoraan säätelee redox toiminta APE1 /Ref-1, ja että samanaikainen salpaus STAT3 ja APE1 /Ref-1 redox synergize estävät tehokkaasti kriittisiä PDAC solujen toimintaan.

Citation: Cardoso AA, Jiang Y, Luo M, Reed AM, Shahda S, hän Y, et ai. (2012) APE1 /Ref-1 Säätelee STAT3 transkriptionaalisen aktiivisuuden ja APE1 /Ref-1-STAT3 Dual-kohdistaminen estää tehokkaasti Haimasyöpä Cell Survival. PLoS ONE 7 (10): e47462. doi: 10,1371 /journal.pone.0047462

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 27 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 17 syyskuu 2012; Julkaistu: 19 lokakuu 2012

Copyright: © Cardoso et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki tämän työn tarjosi National Institutes of Health National Cancer Institute (NCI) CA121168, CA114571, ja CA121168S1 (MRK), CA122298 (MLF), CA113669, CA134292 ja CA134767 (AM) Riley Lasten Foundation (MARK) www.rileykids .org /ja Ralph W. ja Grace M. Showalter Research Trust Fund (MLF). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ilmoittavat, että heillä ei ole eturistiriitoja paitsi Dr. Mark R. Kelley, joka on korkein tieteellinen perustaja ja konsulttina APEX Therapeutics, yritys, joka on lisensoitu IP työstään. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haimasyöpä on yhä suurelta osin parantumaton sairaus, jossa potilaat päin huonoin 5 vuoden pysyvyys nopeudella syöpä. Haasteena on tunnistaa molekyylitasolla effektorit että kriittisesti säätelevät selviytyminen haiman adenokarsinooma (PDAC) soluja, suunnitella tehokkaita molekyylitason kohdistettuja strategioita, jotka voivat estää tai minimoida resistenttien kasvainten varianttien ja poistetaan suojaava rooli kasvainliitteisten fibroosia ja strooman. Lisääntyvä todistusaineisto tukee tarvitaan strategioita moniosaisia ​​molekyyli efektoreina PDAC. Näin ollen strategia on kriittisesti molekyylejä, jotka säätelevät useita signalointi välittäjäaineiden (kuten transkriptiotekijät) ja solunsisäistä mekanismien suoria vaikutuksia useisiin polkuja kriittinen PDAC toimintoihin.

APE1 /Ref-1 (jäljempänä APE1 ) on kaksi tehtävää proteiini, joka lisäksi DNA: n korjaukseen aktiivisuus aiheuttaa myös redox-ohjaus transkriptiotekijöiden, mukaan lukien NF-KB: n, p53, AP-1, HIF-1 ja muut [1], [2]. Hoidon E3330, pieni molekyyli, redox-signalointia estäjä, joka tunnistaa vaihtoehtoisen, redoksiaktiivinen konformaation APE1 [3] selvästi estää DNA: ta sitova ja transkription aktiivisuutta NF-B, AP-1 ja HIF-1 [4], [5 ]. Joka toimii redox tekijä, APE1 stimuloi DNA: ta sitovaa aktiivisuutta transkriptiotekijöiden vähentämällä kysteiinitähteiden DNA: ta sitovan domeenin ”tavoite” transkriptiotekijän. [6] Vaikka organismi hallussaan yleinen vähennys-hapetusjärjestelmät (tioredoksiinista ja glutaredoksiinin /glutationi), [7], [8] APE1 toimii eri tavoin kuin se valikoivasti säätelee tekijöitä suoraan ohjaavat kriittisiä solujen toimintoja, kuten hypoksia, DNA korjaus, tulehdus, ja angiogeneesiä. [4], [9], [10] Aiempi työ perustettu APE1 mahdollisena molekyyli tavoite PDAC, osoittamalla, että ihmisen adenokarsinooma ja peri-haiman etäpesäkkeitä näytteille lisääntynyt APE1 ilmaisun [11], ja että saarto APE1 redox toiminnan viiveet syövän etenemisen ksenograftimalleissa ihmisen PDAC, mukaan lukien potilaasta peräisin tuumorisoluja [4].

STAT3 on transkriptiotekijä, joka säätelee kriittinen solun toimintoja ja sillä on tärkeä rooli useissa syövissä [12] – [15]. STAT3 signalointi on liitetty haimasyövän biologian, eli välittämällä tai säätelemällä solujen eloonjäämistä, kasvainangiogeneesin ja etäpesäkkeiden [16] – [18]. Vaikka STAT3 signalointi voidaan kytkeä ja moduloida eri prosessien vaikutus oksidatiivisen stressin ja sen redox tila ei juuri tunneta. Tuoreessa raportissa osoitettiin, että STST3 aktiivisuus on alle redox valvonta ja tunnistaa kriittiset hapetus-herkkä kysteiiniä STAT3 DNA sitova alue [19], [20]. Kuitenkin muuttimen STAT3, joka muuntaa sen hapetettu osaksi pelkistynyt muoto ei ole tunnistettu. APE1 fyysisesti vuorovaikutuksessa STAT3 VEGF-promoottori [21] ja parantaa IL-6-indusoidun DNA: ta sitovaa aktiivisuutta STAT3: HepG2-soluja [22]. Kuitenkin, ei tiedetä, APE1 on mukana redox valvonta STAT3 aktiivisuuden, ja sen, onko solun hapetus-pelkistys-tila vaikuttaa STAT3 signalointia PDAC soluissa.

Tässä osoitamme, että APE1 redox toimintaa säätelee STAT3 DNA: ta sitova ja transkription aktiivisuus, käytetään geenien yliekspressio WT tai redox-vialliset APE1, ja redox-selektiivinen farmakologinen esto. Blockade of APE1 redox synergoi STST3 selektiivisiä antagonisteja merkittävästi estää proliferaatiota ja eloonjäämistä ihmisen PDAC solujen edistää solujen apoptoosin. Nämä tutkimukset tunnistaa mekanismia, jolla APE1 säätelee STAT3 aktiivisuutta, ja vahvistetaan perustelut kehittämiseksi APE1- STAT3 dual-kohdistusstrategioihin hoitoon PDAC.

Tulokset

Redox valvonta STAT3 aktiivisuus PDAC Solut

Vaikka STST3 DNA: n sitoutuminen on tiettävästi alle redox valvonta [20], molekyylitason mekanismi välittävä tämä asetus ei tunneta. Täällä me tutkimme, APE1 säätelee DNA sitova ja transkription toimintaa STST3 in PDAC. Olemme vahvistaneet aktivointi STAT3 signaloinnin avulla immunoblottaus ja EMSA (kuvio 1A, B). Sekä potilaasta johdettujen ja kuolemattomia solulinjoja ilmentävät APE1and näyttelytila ​​STAT3 fosforylaatiota (jäämien Y705) ja DNA: ta sitovan; kuten odotettua, STAT3 DNA: ta sitova on parannettu stimulaation jälkeen IL-6. Vahvista spesifisyyden STAT3 DNA: ta sitovaa, suoritimme EMSA kompetitiomäärityksin kylmällä DNA-koettimia (WT tai mutantti, STST3 sitovan viallinen sekvenssit). Kuten kuviossa 1C on esitetty, annoksesta riippuvainen väheneminen STAT3 DNA: ta sitovan havaittiin käyttäen WT kilpailija koetin, joka ei havaittu käyttämällä mutantti koetin. Spesifisyys Tämän vuorovaikutuksen osoitettiin myös supersiirtymäanalyysi bändi havaittiin käyttäen STST3-spesifistä vasta-ainetta (kuvio 1 D).

A) immunoblottaus STAT3 (pY705) in PDAC soluissa; yhteensä STST3 tasot esitetään keskellä paneelissa. APE1 proteiinin tasot on esitetty potilaan johdettujen linjat ja tubuliinin on latauskontrollina. B) STST3 EMSA määritystä PaCa-2-solut stimuloidaan IL-6, NE = tumaekstrakti; C) Kilpailukykyinen EMSA on STST3 käyttää ydin- ote PaCa-2-soluissa ja joko 25- tai 50-kertainen kylmä koetin (WT tai STST3 sitovan viallinen mutantti); D) Supershift of STAT3 DNA: ta sitovaa käyttäen tumauutteesta; E) STAT3 EMSA määrityksessä hoidon jälkeen DTT ja diamidi. F) STAT3 EMSA määrityksessä käsittelyn jälkeen DTT tai kasvavilla pitoisuuksilla diamidi, kuten on osoitettu. G) STAT3 EMSA-määritystä vähennetään APE1. DTT (Carry-over) kuvastaa 0,04 mM DTT kuin Reaktiossa käytetyn jälkeen vähentää APE1 proteiinia. Kaikkien EMSA määrityksissä, ydin- ote PaCa-2-soluja käsiteltiin IL-6 (50 ng /ml) 2 tunnin ajan 2% FBS: ää, ellei toisin ole ilmoitettu.

tutkittiin vaikutukset hapettavat ja pelkistävät olosuhteet on STST3 sitoutumiseen DNA: n sekä sen otaksuttu sääntelyä APE1 käyttäen PDAC ydin- tiivisteet ja hoito diamidiyhdisteille tai DTT. Hapettavat olosuhteet (diamidiyhdisteille) kumoaa sitoutuminen STAT3 DNA (kuvio 1 E, F); sen sijaan, tumauutteita käsiteltiin pelkistysaineen DTT osoitti parannettu STAT3 DNA: ta sitova annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1E, 1,4-2-kertainen nousu). Koska redox tilan STAT3 vaikuttaa sen DNA: ta sitova aktiivisuus, me sitten arvioitiin, onko redox funktio APE1 moduloi sen DNA: ta sitova. Lisääminen pienentää APE1 proteiinin PaCa-2 tumaekstrakteilla kasvanut STST3 DNA sitova 1,8-kertaiseksi (kuvio 1G). Kuten valvonta, osoitimme, että pelkistyneiden APE1 ja siirrot DTT vähentyneestä APE1 (0,04 mmol) ei edistä STST3 DNA: ta sitova. Nämä tutkimukset osoittavat, että STST3 signalointi aktivoidaan PDAC, ja että STAT3 sitoutuminen DNA on redox herkkä ja säätelee APE1.

STST3 transkriptioaktiviteettia lisääntyy APE1 Yliekspressio ja estyy APE1 Knockdown

Koska monimuotoisen APE1 sekä DNA: n korjaukseen ja redox toimintaa, suoritimme kokeita osoittavat lisäksi, että APE1 ja sen redox-toiminto vaaditaan STST3 DNA: ta sitova ja toimintaa. Käyttäen lentiviraalinen transkription reportteri vektori, pGreenFire-STAT3-Luc (PGF-STAT3-Luc) ja pGreenFire-mCMV (negatiivinen kontrolli), System Biosciences Inc. (Mountainview, CA), me tuotti stabiilisti ilmentäviä reportteri solulinjat Määrittämään STAT3 toimintaa , samanlainen konstruktioita käytetty aiemmissa tutkimuksissa NF-KB, AP-1 ja HIF-1 [4]. Panc-1-solut transdusoitiin PGF-STAT3-Luc, ja yksittäisiä pesäkkeitä seulottiin pohjapinta STAT3 ja IL-6-stimuloidun STAT3 aktiivisuutta. PDAC solut, jotka ilmentävät STAT3-driven lusiferaasi transfektoitiin ohimenevästi yli-ilmentävät wtAPE1 tai redox-viallisen mutantin C65A-APE1 (C65A). Yliekspressio wtAPE1 stimuloi toimintaa STAT3 sekä kloonia (~ 3-kertainen), vaikutus, joka ei havaittu soluissa, jotka ilmentävät redox-dead APE1 mutantti (kuvio 2A). Yliekspressioon kokeita kuviossa 2A, yksittäisiä pesäkkeitä lusiferaasiaktiivisuus jälkeen ohimenevän transfektion kanssa pcDNA, pcDNA-wt-APE1, ja pcDNA-C65A-APE1, ja normalisointi tehtiin käyttämällä Renilla kuten transfektiolla ohjaus.

A) Panc-1-soluja transfektoitiin ohimenevästi pcDNA3, pcDNA3-wt-APE1 tai pcDNA3-C65A-APE1 määritettiin STAT3 toiminnan kautta lusiferaasireportterigeenin määritys 30 tuntia transfektion jälkeen. ** P 0,01, n = 3 kunkin kloonin vertaamalla paino- ja C65A. B) STAT3 Reporter määritystä Panc-1-soluja, jotka on transfektoitu salattu tai APE1 siRNA (50 nM) ja stimuloitiin IL-6 (50 ng /ml, 6 tuntia). * P 0,05, ** p 0,01, n = 6 verrataan SC siAPE1. C) Western blot kokonaismäärästä STAT3 proteiinin tasot seuraavat APE1 Knockdown PACA-2-soluissa. Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. D) p-STAT3 (Y705) tasoille APE1 Knockdown PACA-2-soluissa. E) Immunoblotit kokonaisten solu-uutteita, jotka osoittavat stimulaatio IL-6 (50 ng /ml, 3 tuntia) lisää p-STAT3 tasoilla sekä SC- ja siAPE1- käsiteltyjä soluja, mutta ei muuta tasoa koko STAT3-proteiinin. F) Western blot hajanaisten PaCa-2-soluja stimuloitiin IL-6 ja transfektoitiin siRNA: ydin- (N) ja sytoplasminen (C) osaan. Tubuliinia hyödynnettiin latauskontrollina varten sytoplasmaan ja Lamin B1 ydin-.

knockdovvn APE1 ei vaikuta Yhteensä STAT3 Protein tasoilla, STAT3 fosforylaatio tai tumaansiirtymiseen

sitten arvioitiin vaikutus APE1 knockdown on STST3 aktiivisuutta PDAC soluissa. Kuten edellä, yksittäisiä pesäkkeitä ja PGF-STAT3-Luc transfektoitiin lyhytaikaisesti APE1 siRNA kokeita varten on esitetty kuviossa 2B. Tulokset PGF-STAT3-Luc kloonien # 3 ja # 9 yhdistettiin kokeissa kuvassa 2B Tyypillisissä kokeissa kunkin kloonin kuvassa S1A, B. Basal tasot STAT3 toiminnan merkittävästi vähentynyt, kun APE1 ilmaisua pudotti käyttäen ohimenevä erityisiä siRNA (kuvio 2B; p 0,001). Väheneminen STST3 aktiivisuuden APE1 Knockdown oli huomattavampi stimuloitu IL-6, mikä edelleen tukee sääntelyn rooli APE1 DNA sitova aktiivisuus STAT3 (kuvio 2B, p 0,05 ja kuviot S1A, B). Vaikutukset STST3 transkriptioaktiviteettia kun APE1 tasot pienenevät eivät johdu kokonaismäärän lisääntymiseen STST3 proteiinin, kuten on esitetty immunoblottauksella täydellistä STAT3 proteiinia (kuvio 2C ja kvantitointi blotteja kuvassa S1C) ja qPCR varten STAT3 mRNA (kuva S1D) . Olemme myös suorittaa tutkimuksia osoittaa, että vaikutus APE1 on STAT3 signalointi rajoitettiin sääntelyyn proteiinin DNA, ja ei vaikuttanut tasoja STAT3 fosforylaation (kuvio 2D ja määrän kuvassa S1E). Lisäksi stimulaatio IL-6 olosuhteissa APE1 Knockdown ei vaikuttanut yhteensä STAT3 proteiinin tasot (kuvio 2E). Kuten odotettua, stimulointia IL-6 lisää tasoja p-STAT3, ja tämä sääntely STAT3 toiminta ei ole riippuvainen APE1 proteiinin tasoja.

Seuraavaksi tutkimme ydinvoiman translokaatiota STAT3 tutkimalla lysaatit ytimet ja solulima PaCa-2 solut transfektoitu APE1 siRNA tai SC-ohjaus; yhteensä STAT3 ja fosfo-STAT3 (Y705) analysoitiin, jossa tubuliinin ja Lamin B käytettiin soluliman ja ydinvoiman valvontaa, vastaavasti. Kuten odotettua, stimulaatio IL-6 johti huomattavasti tasojen nousu p-STAT3 (Fig. 2E, F). Normalisoituminen p-STAT3 lamiiniin B tasolle osoitti, että ei ollut merkittäviä eroja ydin- p-STAT3 että APE1-vaimennettu verrattuna SC-ohjaus (0,83 kertainen muutos). Tämä havainto vahvistettiin sekä kokosoluekstraktien (kuva 2 D, E) ja tumaekstrakteilla (kuvio 2F). Nämä havainnot osoittavat edelleen, että APE1 säätelee STST3 DNA sitova vaikuttamatta muiden mekanismien sääntelyn eli fosforylaatio, tumaansiirtymiseen tai kokonaisvahingoista STAT3 proteiinin pohjapinta tai IL-6-aiheuttama olosuhteissa.

APE1 Redox Inhibitor, E3330 estää STAT3 transkriptionaalinen aktiivisuus

tarkemmin käsitellä roolia redox funktio APE1 on STAT3 transkriptioaktiviteettia, suoritimme kokeita käyttäen pienimolekyylisiä E3330, joka estää selektiivisesti APE1 redox aktiivisuutta vaikuttamatta sen endonukleaasilla toiminto. [3], [5] E3330 selvästi estää STST3 toimintaa niin vakaa linjojen (kuvio 3A, kuviot S2A, B) sekä häiriö- Lusiferaasimäärityksiä (kuvio S2C). Pohjapinta STAT3 aktiivisuus inhiboi merkittävästi E3330 (kuvio 3A; p 0,05), annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi E3330 hoito esti merkitsevästi STAT3 indusoimaa IL-6 stimulaation PDAC soluja (kuvio 3A; p 0,05), joka on kumottu suuremmilla E3330 annoksilla. Tämä esto STAT3 toiminta ei johtunut laskuun yhteensä STST3 proteiinin tasot tai vähenemiseen p-STAT3 tasolle. Tulokset immunoblottauksella kokosolulysaateista osoittivat, että määrä STAT3-proteiinin ja fosforyloidun STAT3-proteiinin (0,95-kertainen verrattuna DMSO-ohjattu) käsittelyn jälkeen APE1 redox-inhibiittorin, E3330 in PaCa-2-soluissa ei ollut muuttunut merkittävästi (kuvio 3B).

A) STST3 reportterimääritystä in Pancin-1-solujen käsittelyn jälkeen E3330 (24 h) ja stimulaatiota IL-6 (6 h). Annokset perustuivat Eloonjääntitulokset aiemmin julkaistuihin tietoihin [4]. * P 0,05 t-testi, n = 6 vertaamalla DMSO-ohjaimen lääkkeellä käsiteltyihin näytteisiin. B) edustaja Western blot PaCa-2-soluja käsiteltiin E3330 (50 uM, 24 h). C) lisäys E3330 että EMSA reaktio estää STAT3 DNA sitoutuminen tumauutteiden stimuloidaan IL-6. Edustaja EMSA imupaperilla esitetty kvantitoimiseksi kolmen erillisen kokeen D. * p 0,05, ** p 0,01, verrattuna DMSO-kontrollin, käyttäen Studentin t-testiä. E) STAT3 DNA: ta sitovan kautta EMSA-määritys käsittelyn jälkeen PaCa-2-solujen E3330 (2 h) ja sitten stimuloitiin IL-6 (50 ng /ml, 2 h), jossa kvantitointi (F), jossa intensiteetti sitoutuminen verrattiin määrä STAT3 DNA sitoutumisen IL-6 stimulaation; G) qPCR analyysi surviviinin ilmaisun seuraavista E3330 hoitoa 24 tuntia potilaan peräisin olevia soluja, Pa02C. Näkyy tieto 2-3 erillisiä kokeita (ka ± SE). Näytteet ajettiin kolmena rinnakkaisena ja normalisoitiin DMSO ajoneuvon hallinnan.

varmistamiseksi edelleen inhibitio STAT3 DNA sitoutumisen APE1 redox salpaus, ydin- otteita PaCa-2-soluja käsiteltiin E3330 ja analysoitiin EMSA for STAT3 sitova; annosriippuvainen väheneminen STAT3 sitoutuminen havaittiin (kuvio 3C), ja IC

50 E3330 noin 30 uM (kuva 3D). Meillä on myös käsitelty PaCa-2-solujen E3330 ja stimuloitiin sitten STAT3 DNA: ta sitovan IL-6 ja analysoitiin STAT3 DNA: ta sitovan käyttäen EMSA-määritystä. Kuten kuviossa 3E ja F, IL-6-indusoidun STAT3 inhiboi dramaattisesti seuraavat E3330 hoidon soluissa. Lisäksi tuetaan lasku STAT3 DNA: ta sitovaa seuraavan inhibitio APE1 redox aktiivisuutta, ilmentymisen STAT3 kohdegeenin, surviviini on vähentynyt annoksesta riippuvaisella tavalla sekä potilaan peräisin olevia soluja (kuvio 3G) ja PaCa-2-soluissa (kuvio S2D) . Nämä tutkimukset osoittavat, että manipulointi APE1 ilmaisun ja häiriöitä sen redox funktion selvästi vaikuttaa STST3 DNA: ta sitova ja transkriptioaktiviteettia.

Farmakologiset piirityksen APE1 ja STAT3 Tulokset synergiavaikutukset ihmisten PDAC Cells

Ensimmäinen osoitamme, että hoito aikaisemmin kuvatut kaksi STAT3-antagonistit, STATTIC [23] ja S3I-201 [24] inhiboi fosforylaatiota STAT3 (kuvio 4 A, B) sekä solujen proliferaatiota PDAC soluissa (kuvio 4C). Tilastollisesti merkitsevä esto fosforylaation Y705 havaitaan annoksilla S3I-201 suurempi kuin 100 uM ja annoksilla STATTIC yli 3,125 uM, joka arvioidaan densitometria (p 0,05). Tällä estävä testattuina annoksina, nämä yhdisteet eivät vaikuta fosforylaation tasoja STAT1 (Y701) tai Stat5: n (Y694) näissä soluissa (kuvio 4A, B). Funktionaaliset tutkimukset käyttäen MTS-määritys osoitti, että STST3 saarto esti merkittävästi proliferaatiota sekä PDAC linjojen (kuvio 4C), jossa ED

50 ~2.5 uM PaCa-2 ja ~ 4 uM Pancin-1 STATTIC, ja ED

50 ~190 uM PaCa-2 ja ~310 uM Pancin-1 S3I-201. Sekä lääkkeet, vahvan yhteyden välillä havaittiin lasku STAT3 fosforylaatiota ja proliferaation estossa PDAC soluja.

immunoblottauksella STAT-proteiinien, p-STAT3 (Y705), p-STAT1 (Y701), ja p- Stat5: n (Y694) in PDAC soluissa, joita käsiteltiin S3I-201 (A) tai STATTIC (B). DMSO käytettiin ajoneuvon hallinnan ja sisältyy kaistaa ilman STAT3 estäjä. Panc-1-soluja käsiteltiin S3I-201 30 tuntia ja STATTIC 30 min. PaCa-2-soluja käsiteltiin S3I-201 ja STATTIC 24 tunnin ajan. C) Annosvastearvot PACA-2 ja Panc-1-soluissa 72 tunnin hoidon S3I-201 tai STATTIC kautta MTS-määritys. D, E) Solulisääntyminen jälkeen E3330 (50 uM kaikilla radoilla, paitsi 40 uM Panc10.05) ja S3I-201 tai STATTIC hoitoon. Määritykset suoritettiin kahtena kappaleena, edustavassa kokeessa, 2-4 itsenäisestä kokeesta. F) Combination (CI) arvot laskettiin CalcuSyn- varten yhdistelmällä APE1 ja STAT3 estäjiä niiden ED

50s MTS määrityksessä. CI arvot 0,1, erittäin voimakas synergia; 0,1-0,3: voimakas synergia; ja 0,3-0,7: synergia.

Lisäksi säätelemällä transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3, APE1 aiheuttaa myös redox valvonta muiden transkriptiotekijöiden, jotka ovat sekaantuneet haimasyövän (esimerkiksi HIF-1α ja NF-KB). [4], [16], [25] Sen jälkeen arvioitiin, onko yhdistetyn saartoon STAT3 ja APE1 redox toiminnan synergize tehokkaammin estää ihmisen PDAC soluja. Solujen eloonjäänti arvioitiin käyttäen xCELLigence järjestelmä, joka valvoo reaaliaikaisia ​​muutoksia solujen kiinnittyminen, morfologia ja elinkelpoisuus; [4], [26] solun indeksi (CI) seurattiin 72 tunnin lääkehoitoa. E3330 käytettiin annoksilla, jotka tehokkaasti estävät APE1 redox aktiivisuutta, ja STAT3 inhibiittorit annoksilla, jotka hyödynnettiin MTS-pohjainen määritys sytotoksisuus (kuvio 4C), ja että esti STST3 fosforylaation PDAC soluissa (kuvio 4A, B ja viite. [24 ]). Yksittäisinä aineina, vähäinen inhibitio PDAC solujen havaittiin E3330 tai annoksilla STATTIC tai S3I-201 käyttää (kuva 4D, E). Havaitsimme, että APE1 redox inhibitio E3330 synergistisesti STAT3 salpauksesta STATTIC tai S3I-201, jolloin voimakas inhibitio Panc-1 ja PaCa-2-soluihin, mutta myös ensisijaisen Pa03C ja Panc10.05 soluja (kuvio 4D, E) . Voimistaminen estovaikutus nähnyt tämän dual kohdistuksen, on optimaalinen annos näitä aineita, havaittiin sekä käyttämällä xCELLigence (kuvio 4) ja MTS määritykset (kuvio S3). Mielenkiintoista on, että potilaasta peräisin solujen Pa03C ja Panc10.05, tämä parannus havaittiin alemmilla annoksilla E3330 kuin havaittu pysyvien solulinjojen (tuloksia ei ole esitetty). Blockade signaloinnin kautta molempien APE1 redox aktiivisuus ja STAT3 on dramaattisia vaikutuksia solujen eloonjäämistä. Osoittaa, että tämä vaikutus ei johtunut yleisestä redox ilmiö, myös yhdistettynä STST3 estäjiä tioredoksiinin estäjä, PX-12 [27] – [29]. Lisäksi on STAT3 estäjä S3I-201 PX-12 hoito ei merkittävästi voimistaa PX-12 (taulukko S1; arvioidaan vertaamalla ED

25, ED

50, ja ED

75).

määrällisesti mahdolliset lääkkeen yhteisvaikutukset, Chou-Talalay menetelmää käytettiin yhä annoksina yhdessä yhden STAT3 antagonisti plus APE1 estäjä E3330. ED

50 kolmen yhdisteiden määritettiin kuten yllä, käyttäen MTS määrityksiä (kuva 4 ja Ref. [4]). Panc-1 tai PaCa-2-soluja käsiteltiin kahden lääkkeen yhdistelmiä kiinteässä suhteessa annokseen, joka vastaa 0,125, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,125 ja 1,25-kertainen niiden yksittäisten ED

50-arvot. Kuten kuviossa 4F, voimakas yhteisvaikutukset havaittiin yhdistelmällä indeksin arvot merkittävästi 1 ED

50 ja ED

75 molemmissa solulinjoissa. Kaiken kaikkiaan nämä tutkimukset osoittavat, että samanaikainen kohdentaminen APE1 redox ja STAT3 signalointi synergoida vaihtelee huomattavasti heikentää selviytymisen ihmisen haimasyövän soluja, jopa optimaalinen annoksia yksilöllisiä tekijöille.

Dual kohdentaminen APE1 Redox Activity ja STAT3 käynnistäjät lisäys apoptotic vaikutukset PDAC Solut

Myöhemmin teimme Mekaaniset tutkimukset tutkia nämä synergiavaikutuksen liittyy normaalia suurempi apoptoottisen solukuoleman ja kytkeytymistä kaspaasi-reitin. Ensimmäinen, käytimme anneksiini-PE /7-AAD määrityksessä arvioimaan solukuoleman ja elinkelpoisuuden PDAC soluissa, joita käsiteltiin lääkkeen, joka esitetään (kuvio 5A, C). Kentät A ja B esittävät palstojen ja virtaussytometrialla analyysit, ja osoittavat, että yhdistelmä E3330 kanssa STST3 estäjän merkittävästi tihentää anneksiini-positiivisia, ei-eläviä soluja; vertailukelpoisia tuloksia saatiin potilaan peräisin olevia soluja (kuvio 5B, D). Tietojen analyysi 4-6 yksittäiset kokeet osoittavat, että yhdistelmä E3330 kanssa STATTIC tai S3I-201 nostaa merkittävästi haimasyöpä solukuolemaa (kuvio 5B). Lisäksi havaitaan samanlaiset tulokset potilaan peräisin oleviin soluihin, joissa ~6-8-kertainen solukuoleman on havaittu yhdistetty kohdentamista APE1 ja STAT3 (kuvio 5B, D).

estäjät olivat lisätään samanaikaisesti (E3330 40, 50 tai 75 uM), ja apoptoosia määritettiin käyttämällä anneksiini-V (x-akseli) ja 7-AAD tai PI (y-akseli) värjäys 24 tunnin kuluttua. Edustaja pistekuvioita on esitetty A ja B, joilla on suuri annos STAT3 inhibiittorin Panc-1 ja PaCa-2 ja 50μMS3I-201 potilaan peräisin olevat solut. Graafinen esitys edustaa 3 riippumattoman kokeen; *, P 0,05, **, p 0,01 kaikki verrattuna STST3 estäjä yksin vastaavalla annoksella (A, C) tai 2 itsenäistä koetta varten (B, D).

arvioitava mahdollisuudet osallistumista kaspaasiriippuvaisen solukuoleman, suoritimme kokeissa mittaamalla kaspaasi 3 PDAC soluissa, joita käsiteltiin saman lääkkeen yhdistelmät käyttäen FITC-konjugoitua kaspaasi-3-estäjällä (FITC-DEVD-FMK) ja virtaussytometria. Kuten kuviossa 6 on esitetty, vaikka yksittäisillä aineilla ei aiheuttanut merkitty kaspaasi 3 aktivointi, kombinatoorista vaikutukset APE1 redox inhibition ja STAT3 salpaus johti merkittäviin kaspaasi 3, sekä PDAC solulinjoissa (kuvio 6A, B, tyypillinen virtauksen histogrammit vasen paneeli). Nämä vaikutukset olivat tilastollisesti merkittäviä (kuvio 6B, oikea paneeli), kun E3330 yhdistettiin STATTIC (A, p 0,05) tai S3I-201 (B, p 0,05). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että yhdistämällä optimaalinen annokset yksittäisten selektiivisiä aineita, samanaikainen kohdentaminen APE1 redox ja STAT3 signalointi aiheuttaa huomattavia solukuolemaa PDAC soluja, sitoutuminen kaspaasi 3 pro-apoptoottisia vaikutuksia.

Panc-1 ja PaCa-2-soluja käsiteltiin E3330 (50, 75 uM) ja yhä enemmän STATTIC (A) tai S3I-201 (B) ja siitä määritettiin kaspaasi 3: n aktiivisuuden. Käyrät edustavat 3 riippumattoman kokeen; *, P 0,05, kaikki verrattuna STST3 estäjä yksin vastaavalla annoksella.

Dual kohdentaminen APE1 Redox ja STAT3 Signaling inhiboi merkittävästi muutto PDAC Cells

Lopuksi koska solu maahanmuutto on tärkeä askel etenemistä ja levittämistä haimasyöpä, arvioimme vaikutuksia APE1 ja STAT3 saarto vasteen PDAC solujen kemotaktinen ärsykkeitä, käyttäen xCELLigence järjestelmää. Seerumideprivaatio Pancin-1-solut sijoitettiin ylempään kammioon CIM levy, ja stimuloidaan alusta täydennettynä seerumia, joka tarjoaa kemotaktinen ärsykkeitä (alahuoneen). Kuten odotettua, seerumin puutteessa Panc-1-solut eivät kulkeudu ilman kemotaktisen ärsykkeen ja fibronektiinin pinnoite auttaa kiinnitys vaeltavien solujen (kuvio S4A). Treatment of Panc-1-solujen kanssa E3330, STATTIC tai S3I-201 yksittäisinä aineina tuloksena oli vain vähäisiä inhibitio Panc-1 solumigraatio, jopa suhteellisen suurilla annoksilla nämä yhdisteet (kuvio 7). Kuitenkin yhdistelmä E3330 kanssa S3I-201 (50 uM ja 100 uM, Fig. S4d) tai STATTIC johti merkittävästi vähentynyt solujen vaeltamiseen (kuvio 7D, E), sekä S3I-201 /E3330 ja STATTIC /E3330 yhdistelmien tuloksena merkittäviä estäviä vaikutuksia in Pancin-1 solumigraation (Kuva 7F, Kuva S4d, p 0,01, kuvio 6G, p 0,05 verrattuna E3330 yksin ja p 0,01 verrattuna STATTIC yksin). Mikä tärkeintä, nämä lääkkeet tai yhdistelmiä ei osoittanut merkittäviä vaikutuksia elinkelpoisuudesta Pancin-1 solut ajankohtina ja annokset arvioidaan siirtyminen määrityksissä (kuvio S4 B, C). Nämä tulokset osoittavat, että samanaikainen salpaus APE1 redox ja STAT3 signaloinnin toimii myös estää migraation ominaisuuksia PDAC soluja.

Migration määritettiin kautta xCELLigence järjestelmä, hoidon kasvavia määriä S3I-201 (A), STATTIC (B ), tai E3330 (C). Yhdistelmä E3330 (75 uM) kanssa STAT3 estäjä S3I-201 (D), 50 uM tai STATTIC (E), 10 uM vähentää dramaattisesti solun vaeltavien kyky. Kvantitointi kolmesta erillisestä kokeissa 8 tuntia on esitetty F ja G. * p 0,05, ** p 0,01 käyttäen parillista t testiä vertaamalla estäjää yksinään vs. yhdistelmähoitoon.

Keskustelu

tässä raportissa osoitamme ensimmäistä kertaa, että STST3 DNA sitova on alle redox ohjaus, joka välittyy redox aktiivisuutta APE1. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että hapetus kriittisten kysteiinin jäämiä STST3 proteiinin kautta roksidikäsittelyä voisi vähentää STAT3 (mutta ei STAT1) DNA: ta sitovan ja transkriptioaktiviteettia [20]. Käyttämällä ydinvoiman otteita PDAC soluista, me systemaattisesti luokitella vaikutuksia vähennetään ja hapettavat olosuhteet STST3 DNA: ta sitova. On selvää, STAT3 sitoutuu DNA: han tehokkaammin, kun on vähennetty, ja redox-aktiivisuus APE1 kykenee stimuloimaan STAT3: n DNA: ta sitovan. Lisäksi manipulointi APE1 tasoilla vaikuttaa DNA: ta sitovaa aktiivisuutta STAT3. Samanaikainen salpaus STAT3 ja APE1 redox aktiivisuus vaikuttaa synergistisesti häiritä PDAC solujen elinkelpoisuus sekä niiden muuttoliike ominaisuuksia.

Tämä on ensimmäinen osoitus myös, että APE1 säätelee STAT3 DNA sitova ja transkriptionaalista aktiivisuutta PDAC soluissa. Tämä havainto viittaa vuorovaikutusta APE1 ja STAT3 osana selviytymisen signaloinnin PDAC sijaan ei-spesifinen vaikutus yleisen redox sääntelyviranomaisten. Yliekspressio redox-puutteellinen APE1 proteiini ei ole edistää STAT3 transaktivaatiota PDAC soluissa, ja salpaus redox funktio APE1 kautta E3330 dramaattisesti inhiboivat transkriptionaalista aktiivisuutta STAT3, sekä perus- tasolla sekä IL-6-indusoidun aktiivisuuden. Kuitenkin knockdovvn APE1 pienenee STAT3 aktiivisuutta vaikuttamatta sen fosforylaatio tai tumaansiirtymiseen. Yhdessä nämä tiedot tukevat hypoteesia, että APE1 ohjaa suoraan DNA: ta sitovaa aktiivisuutta STAT3. Kun korkeita APE1 ilmentymisen PDAC kasvaimissa (kuvio 1A, Ref. [11]), stimulaatio STAT3 signaloinnin kautta APE1 n redox toiminta voi osaltaan kynnystä STAT3 toiminnan kasvain johtaa aggressiivisemman fenotyypin. Kasvu STAT3 signaali kunto kautta onkogeeninen tapahtumien ja /tai kasvaimeen liittyvää ulkoisten signaalien, kuten IL-6 voi olla osittain ajetaan APE1.

Sisällä STAT perheen transkriptiotekijöiden, STAT3 on ensimmäinen STAT jäsenen olevan osoitettu säänneltävä APE1. Työ Li et al elegantisti osoittaa käyttäen chimera STAT1 /STST3 proteiineja STAT3, mutta ei STAT1, on alle redox valvonta. [20] ROS voi aktivoida STAT signalointi ja antioksidantteja voi estää tätä aktivointia.