Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Regulatory T-lymfosyyttien (Treg) tunkeutua ihmisen glioblastooma (GBM); ovat mukana kasvaimen etenemistä ja korreloi kasvaimen. Ohimenevä poistaminen Tregs käyttäen CD25 heikentäviä aineita (PC61) on todettu välittävän GBM regressio kokeellisissa malleissa aivokasvainten. Kliiniset tutkimukset, jotka yhdistävät Treg ehtyminen kasvaimen rokotukset ovat käynnissä, onko ohimenevä Treg ehtyminen voi parantaa anti-kasvain immuunivasteen ja parantaa pitkän aikavälin selviytyminen syöpäpotilailla.

Havainnot

Käyttäen syngeeninen intracrabial glioblastooma (GBM) hiirimallissa osoitamme, että systeeminen ehtyminen Tregs 15 päivän kuluttua kasvaimen istutuksen käyttämällä PC61 johti vähenemiseen Tregs läsnä kasvaimissa, tyhjennys imusolmukkeet ja perna sekä parantaa pysyvyyttä (50% hiiristä selvisi 150 päivää). Ei parannusta selviytyminen havaittiin, kun Tregs loppuivat 24 päivää kasvaimen istuttamisen jälkeen, mikä viittaa siihen, että kasvain taakka on tärkeä tekijä määritettäessä tehoa Treg ehtyminen kliinisissä tutkimuksissa. T-soluista riippuva malli aivokasvain regression aikaansaama kasvaimeen toimittamisen adenovirusvektoreiden (Ad), joka ilmaisee Fms kaltainen tyrosiinikinaasi 3-ligandi (Flt3L) ja Herpes simplex tyyppi 1-tymidiinikinaasi (TK), jossa on gansikloviiri (GCV), me osoitamme että anto PC61 24 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen (7 päivää käsittelyn jälkeen) esti T-soluista riippuvainen kasvaimen regressio ja pitkän aikavälin elinkelpoisuuden. Edelleen, ehtyminen kanssa PC61 estivät täysin kloonilaajenemisen vasta kasvaimen antigeeni-spesifisten T-lymfosyyttien vastetta hoitoon.

Päätelmät

tiedot osoittavat ensimmäistä kertaa, että vaikka Treg ehtyminen estää etenemistä /eliminoi GBM kasvaimia, sen tehokkuus riippuu kasvaintaakkaa. Voimme päätellä, että tämä lähestymistapa on hyödyllinen asetus minimaalinen jäljellä tauti. Edelleen, me osoittavat myös, että Treg ehtyminen, käyttäen PC61 yhdessä immunoterapian, estää kloonilaajenemisen vasta kasvaimen antigeeni-spesifisten T-solujen, viittaa siihen, että uusia, erityisiä tavoitteita estää Tregs on tarpeen silloin, kun sitä käytetään yhdessä hoitoja, jotka aktivoivat anti kasvainimmuniteetin.

Citation: Curtin JF, Candolfi M, Fakhouri TM, Liu C, Alden A, Edwards M, et al. (2008) Treg väheneminen Estää tehokkuus Cancer immunoterapia: Implications for Clinical Trials. PLoS ONE 3 (4): e1983. doi: 10,1371 /journal.pone.0001983

Toimittaja: Karen S. Aboody, City of Hope Medical Center ja Beckman tutkimuslaitos, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2008; Hyväksytty: 10 maaliskuu 2008; Julkaistu 23. huhtikuuta 2008

Copyright: © 2008 Curtin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat National Institutes of Health /National Institute of neurologiset häiriöt Stroke (NIH /NINDS) Grant 1R01 NS44556.01, Minority Supplement NS445561.01; 1R21-NSO54143.01; 1UO1 NS052465.01, 1 RO3 TW006273-01 ja M.G.C .; NIH /NINDS Avustukset 1 RO1 NS 054193,01; RO1 NS 42893,01, U54 NS045309-01 ja 1R21 NS047298-01 jotta P.R.L. Bram ja Elaine Goldsmith ja Medallions ryhmä omistetun tuolit Gene Therapeutics on PRL ja MGC vastaavasti Linda Tallen David Paul Kane Foundation Varsinainen Fellowship ja hallintoneuvoston klo CSMC. MC tukevat NIH /NINDS 1F32 NS058156.01.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

glioblastoma multiforme (GBM) on tappava primäärisen aivokasvaimen, joka on erittäin invasiivinen, jossa kasvainsolujen tunkeutuminen ympäröiviin tervettä aivokudosta [1]. Mediaanielossaolosta potilaiden diagnosoitu GBM on vuosi (4-6 kuukautta uusiutumisen), jossa on vähemmän kuin 5%: lla potilaista jäljellä elossa 5 vuotta diagnoosin [2]. Parannukset leikkaus, kemoterapiaa ja sädehoitoa ei ole käännetty merkittävästi parannettu ennustetta potilaille, joilla GBM; pitkän aikavälin selviytyminen (5 vuotta diagnoosin jälkeen) ei ole parantunut vuodesta 1950 [3]. Uusiutunut lähes aina tapahtuu, vaikka leikkaus onnistuneesti poistaa suurimman osan primaarikasvaimen massa. Uusien hoitomuotojen ennaltaehkäisyyn tai hoitoon kasvaimen uusiutumisen tarvitaan pikaisesti hoitamaan potilaita diagnosoitu GBM.

immunoterapia on ehdotettu tehokas lähestymistapa estämään kasvaimen uusiutumisen poistamalla kasvainsolut säästäen normaalin ympäröivien terveitä soluja [4], [5]. Useat kliiniset tutkimukset ovat nyt käynnissä testata onko immunoterapia on turvallinen ja tehokas hoitamaan GBM [6], [7]. GBM yli express kasvaimen antigeenejä, kuten MAGE, Her2 /neu, tyrosinaasiksi Trp-1, Trp-2, gp100, IL13Rα2, surviviinia (tarkistetaan [8]) ja EphA2 [9]. Immuunijärjestelmä tavallisesti sculpts kasvaimia johtaa menetykseen vasta kasvaimen antigeeni-ilmentymisen [10], [11], kuitenkin, sijainti GBM aivoissa, sivuston immuuni etuoikeus [12], [13], tai kun läsnä on erittäin immunosuppressiiviset ympäristön aivokasvaimia [14], [15] voi olla syitä, miksi GBM yleisesti yli express kasvain antigeenejä potilailla. Autologisia dendriittisoluja (DC) ladattu GBM kasvain peptidit [16] tai autologisia lysaatin [17] on käytetty rokottamiseen potilaalla kahdessa viime vaiheen I kliinisissä tutkimuksissa. Ei merkittävää kasvua eloonjäämistä havaittiin käyttäen autologisia lysaatit [17]. Kuitenkin mediaani aika taudin etenemiseen ja eloonjäämismediaani saaneista potilaista peptidi rokotteita oli lisääntynyt verrattuna potilaisiin, jotka hoidettiin samana ajanjaksona kanssa hoitomuotojen [16]. Mielenkiintoista, alapopulaatio vaste hoitoon tunnistettiin ilmentymistä alhaisia ​​pitoisuuksia TGFp aivoissa. Kasvaimensisäistä ilmaus TGFp voi tukahduttaa mukautuva immuunivaste antigeenia [4], [5] ja oli ennustettavissa kliinisen lopputuloksen rokotuksen jälkeen [16]. Lisäksi verenkierrossa kasvaimen antigeeni CD8

+ T-lymfosyyttien on tunnistettu GBM potilailla [18], mutta immunosuppressiivinen ympäristön kasvaimen estää poistamista GBM näistä potilaista.

T-solu- vasteita kasvain antigeeni mitattuna tetrameereja ja ELISPOT eivät aina korreloi kasvaimen taantumiseen kliinisissä tutkimuksissa testaus immunoterapioiden ihmisen GBM [19]. Tämä viittaa siihen, että tukahduttaminen tehokkaiden immuunivasteiden kasvain antigeenejä voi häiritä immuunijärjestelmän riippuvainen kasvaimen regressio. Viime aikoina tutkijat ovat tutkineet, onko ehtyminen osajoukko T-lymfosyyttien nimeltään säätelijä-T-lymfosyyttien (Tregs) voi voimistaa immunoterapioiden syöpää vastaan. Tregs ovat alapopulaatio CD4

+ T-lymfosyyttien, jotka ekspressoivat konstitutiivisesti transkriptiotekijän Foxp3, korkean affiniteetin IL2-reseptori CD25 ja B7-ligandi CTLA4 [20]. Tregs tarvitaan ylläpitoon toleranssi koko elinajan organismin [21] ja mutaatiot Foxp3 tiedetään aiheuttavan akuutteja autoimmuunisairauksiin ihmisillä [22]. Foxp3

+ Tregs kerääntyä ihmisen gliooma aikana syövän etenemistä [23] ja on todettu korreloivan kasvaimen [24]. Survival parani, kun Tregs depletoitiin GL261 kasvaimen hiirille käyttäen CD25-vasta-aineita annetaan 7 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen ja kolme kertaa viikossa 3 viikkoa sen jälkeen [25]. Myös anto CD25 heikentävien vasta-aineiden osoitettiin myös parantaa selviytymistä, kun sitä annetaan yhdessä DC transfektoitu kasvain mRNA: GBM malli [26].

Olemme viime aikoina kehitetty yhdistetty geeni terapeuttinen lähestymistapa, jolla pyritään engineering kasvain mikroympäristön mahdollisuuden siirtää kasvaimeen massa APC: iden ja saada kasvainsolun kuoleman [27]. Lähestymistapamme koostuu ilmentävien Fms kaltaisen tyrosiinikinaasin 3 ligandi (Flt3L), joka indusoi dendriittisolujen (DC) tunkeutumista aivoparenkyymissä [28] yhdessä ehdollisen sytotoksisen geenin tymidiinikinaasi (TK) [27], [29], joka läsnä ollessa GCV indusoi kasvainsolun kuoleman. Tämä yhdistetty lähestymistapa indusoi T-soluista riippuvainen kasvaimen regressio [27]. Halusimme vaikutusten arvioimiseksi aikaansaamaa ehtyminen Tregs; kasvaimen etenemiseen hoitamattomilla GBM kantavien hiirten ja T-solujen riippuvia aivokasvain regressio aikaansaama Ad-Flt3L ja Ad-TK hoitoa. Tuloksemme osoittivat, että ehtyminen Tregs käyttäen CD25 erityinen hybridooma PC61 indusoi kasvaimen regressiota ja säilymistä pitkällä aikavälillä, kun se annettiin 15 päivää tuumorin implantaation jälkeen, riippumatta kasvaimen antigeenispesifisen T-lymfosyytit. Yhdessä kasvaimensisäisenä toimituksen Ad-Flt3L ja Ad-TK kuitenkin huomasimme, että PC61 hallinto 24 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen (7 päivää käsittelyn jälkeen) täysin tukahdutetaan mukautuva immuunivaste GL26 kasvaimen antigeenejä. Lisäksi Tregs, CD25 ilmentyy myös solun pinnalla prekursori B- ja T-lymfosyyttien ja kypsä alapopulaatio DC [30], ja se on myös säädelty solun pinnalla aktivoituneiden T-solujen ja B-lymfosyytit [31]. Mallissa anto CD25-vasta-aineita on myös poistamatta aktivoitu, CD25

+ T-lymfosyytit ja esti kloonilaajenemisen vasta kasvaimen antigeeni-spesifisten T-solujen. Tuloksemme viittaavat siihen, että käyttö PC61 joilla pyritään Treg ehtyminen voisi vähentää tehoa immuuniterapeuttista järjestelmien tukahduttamalla aktivointia ja kloonilaajenemisen kasvaimen antigeenispesifisen T-lymfosyytit.

Tulokset

Syngeeninen kallonsisäinen GBM kasvaimet ovat tiheään soluttautunut Immuunijärjestelmän solujen, myös Tregs

kasaantuminen Foxp3

+ Tregs ihmisen gliooma korreloi luokan kasvain ja potilaan eloonjääminen [24]. Kertyminen Foxp3

+ Tregs syngeenisissä hiiren gliooma on myös kuvattu ja ehtyminen Tregs kanssa CD25-spesifisten immunoglobuliinien voi aiheuttaa kasvaimen regression ja parantaa selviytymistä näissä kokeellisissa malleissa [25], [32], [33]. Sen tutkimiseksi, onko Treg ehtyminen voisi parantaa hoitotulokseen yhdistettynä immunoterapian /geeniterapiaan, ensin selvitettävä Tregs tunkeutui syngeenisen hiiren gliooma johtuvat kallonsisäinen kiinnittymisestä GL26 soluista aivojuoviosta. Istuttaminen Syngeenisten GL26 solujen toistettavasti johti lineaarista kasvainten kasvua (R

2 0,99), jonka keskimääräinen kasvaimen tilavuus on noin 0,5 mm

3 päivänä 15 ja 30 kertaa suurempi (15 mm

3) at päivä 24 (Fig. 1A). Nämä kasvaimet esiintyy runsasta suodattumista CD45

+ ja F4 /80

+ soluja, jotka ovat esiintynyt koko kasvain massa ja myös rajoilla (kuvio 1 B). Immuunijärjestelmän solujen infiltraatio kasvaimissa arvioitiin myös virtaussytometrialla 24 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen (Fig. 1 C). Olemme havainneet kasvainta soluttautua MDC (CD11 c

+ CD45

+ IA

b +, Fig. 1Ci) ja MO (CD11

+ CD45

+ IA

b +, Fig. 1Cii) että edusti 3,5% ja 19% kokonaismäärästä CD45 + immuunisolujen läsnä kasvaimen vastaavasti. Lymfosyytit tunnistettiin myös ja muodosti -80% koko määrä CD45 + immuunisolujen tunkeutuu kasvaimia (Fig. 1 C iii-vi). Näihin sisältyvät CD4

+ T-solut (CD3ε

+ CD4

+ CD8a

-, 26%), CD8a

+ T-solut (CD3ε

+ CD4

– CD8a

+, 18%), Foxp3

+ Tregs (CD3ε

+ CD4

+ Foxp3

+, 8,4%), NK-solut (CD3ε

– NK1.1

+ CD45

+, 18%), NK-T-solujen (CD3ε

+ NK1.1

+ CD45

+, 7%) ja B-soluja (CD3ε

– CD19

+ CD45

+, 5%). Läsnäolo CD4

+, CD8a

+, CD19

+ lymfosyyttien sekä CD205 MDC havaittiin myös immunofluoresenssilla (Fig. 1 D). Lisäksi suuri määrä lymfosyyttejä, jotka olivat immunoreaktiivisia CD25 havaittiin kasvaimeen käyttäen konfokaalimikroskopialla (Fig. 1 D) ja virtaussytometria (CD3ε

+ CD25

+ CD45

+) (Fig. 1 E, F). Lisäksi prosenttiosuus CD3ε

+ T-soluja, jotka ilmensivät solun pinnan CD25 oli -40% kokonaismäärästä tuumoreihin tunkeutuvia T-solujen ja suuresti koholla tyhjennys (kohdunkaulan) imusolmuke (DLN) (p 0,05) ja kasvaimen (p 0,01) verrattuna perna kasvaimen kantavien hiirten (Fig. 1 E).

(A) GL26 kasvaimen tilavuus 7, 14 ja 21 päivää sen jälkeen, kun implantion aivoihin striatumissa C57BL /6-hiirten määritettiin. Reaktiivinen astrocytic värjäytymistä (GFAP +) käytettiin määrittämään rajan kasvaimen ei-pahanlaatuinen aivokudokseen. Edustavia osat Hiiren aivot kasvaimia istutettu 7, 14 ja 21 vuorokautta aikaisemmin ja värjättiin GFAP näkyvät vasemmalla. Kasvaimen kasvu kinetiikka olivat olennaisesti eksponentiaalisesti ajanjaksona analysoitiin kaksinkertaistaa ajan noin 1,8 päivää. 5-hiiriä käytettiin määrittämään kasvaimen kunakin ajankohtana. (B) immuunisolujen infiltraatio kallonsisäisen GL26 kasvaimia. Brain osastoja syöpäkasvaimia sisältävistä hiiristä värjättiin vasta-aineita CD45 (leukosyyttien) tai F4 /80 (makrofagit /aktivoitu microglia). Edustavia Konfokaaliset kuvat osoittavat immuunisolujen (vihreä) sisällä kasvain massa ja kasvaimen rajojen. DAPI (sininen) käytettiin tahraa ytimiä. Keltainen nuolet osoittavat immunoreaktii- soluja. T: kasvain. (C) Kasvaimen infiltroivien immuunisolujen eristettiin kasvaimia 24 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen ja analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä. (I) pistekuvaajan CD11 c vastaan ​​I-Ab, joka on ensimmäiseksi aidatulla live CD45 + valkosoluja. DC (CD 11 c + CD45 + I-Ab +) näkyvät punainen laatikko. (Ii) Makrofageilla (MO) arvioitiin avaintamalla live leukosyyttien kanssa CD45, sitten piirtämistä CD11 vastaan ​​I-Ab. Punainen ruutu hahmotellaan väestöstä kasvaimen soluttautua makrofageja (CD11 + CD45 + I-Ab +). (Iii) T-solut värjättiin CD3ε-PE, CD4-PerCP ja CD8a-FITC. Juoni näyttää CD4 vastaan ​​CD8a kun soluja ensin aidatulla CD3ε + live valkosoluja. CD4 + T-solujen ja CD8a + T-solujen on esitetty punaisessa. (Iv) Kasvaimen soluttautua Tregs havaittiin värjäämällä CD3ε-PE, CD4-PerCP ja Foxp3-FITC. CD3ε + live leukosyytit aidatulla ja pistekuvioita näyttää Foxp3 vastaan ​​CD4 värjäystä. Väestö Tregs (CD4 + Foxp3 + CD3ε +) näkyvät punainen laatikko. (V) NK ja NK-T-soluja tarkasteltiin gating elävien CD45 + leukosyyttien, niin näytetään NK1.1 vastaan ​​CD3ε. Väestön tuumoreihin tunkeutuvia NK-solujen (CD3ε- CD45 + NK1.1 +) ja NK-T-solujen (CD3ε + CD45 + NK1.1 +) näkyvät punaisella laatikoihin. (Vi) Kasvaimen soluttautua B-solujen visualisoidaan avaintamalla live valkosoluja, sitten piirtämistä CD45 vastaan ​​CD19. Väestön B-solujen (CD19 + CD45 +) näkyy punainen ruutu. Prosenttiosuudet kunkin immuunisolujen populaation tunkeutumisatmosfäärin kasvaimen suhteen kokonaismäärä kasvaimen CD45 + -solujen on osoitettu edustavan pistekuvioita. (D) Nissl värjäys visualisoida kasvaimia aivoissa. Kasvaimet ovat tiheä Nissl aine, joten tahrata tummempi kuin normaali aivokudokseen. Edustaja Konfokaalinen kuvat osoittavat kasvaimeen infiltroivien CD4 + T-solut, CD8 + T-solut, CD205 + MDC: t, CD19 + B-soluja ja CD25 + immuunijärjestelmän solut (nähtävissä vihreä) ja DAPI (sininen) käytettiin visualisoimaan ytimet. Keltainen nuolet osoittavat immunoreaktii- soluja. (E) virtaussytometrinen analyysi prosenttiosuus T-soluja, jotka ilmentävät CD25 pernassa, DLN ja kasvaimia hiirissä, jotka kantoivat kallonsisäistä GL26 aivokasvainten 24 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen. (F) edustaja pistekuvioita CD25 vs CD3ε immuunisoluissa eristettiin pernan LN ja kasvain. Prosenttiosuudet CD25 + solujen väestö suhteessa kokonaismäärään CD3ε + solujen kasvain, tyhjennys imusolmukkeet tai perna osoitetaan edustava piste tontteja.

ehtyminen Tregs käyttäen PC61 indusoi aivokasvain regressio mutta myös vähentää T-solujen kasvain ja DLN

Koska havaitsimme laajaa suodattumista T regs sisällä kallonsisäinen GL26 kasvaimia, pyrimme heikentävistä tämä immuuni solupopulaation, jotta voidaan määrittää niiden vaikutuksen kasvainsolun etenemiseen sekä anti-kasvain indusoiman immuunivasteen T-solusta riippuvaisen immunoterapeuttinen lähestymistapa eli Ad-Flt3L /TK. Rotan IgG1 hybridooma PC61 havaittiin sitoutuvan hiiren korkean affiniteetin IL-2-reseptori (CD25) [34] ja

in vivo

anto PC61 hiirille aiheuttaa ehtyminen Tregs yli viikon [33] , [35]. Siten käytimme tätä vasta-indusoivan T reg ehtyminen

in vivo

syngeenisessä hiiren kallonsisäinen glioomamallissa. Ensin määritetään, onko PC61 vaikuttaisi kasvainsolujen elinkelpoisuuden ja kasvun

in vitro

ja

in vivo

. Inkubointi GL26 solujen PC61 ei vaikuttanut GL26 solujen elinkykyä (Fig. 2A) tai proliferaation

in vitro

(Fig. 2B). Sitten annetaan PC61 tai isotyypin kontrolli-IgG on kasvain, joilta puuttuu kateenkorva nu /nu-hiiriä, joiden on osoitettu olevan puutteellinen T regs [26], [36]. Ovat oikeassa suhteessa muiden raporttien [26], huomasimme, että kasvaimen kasvu T reg puutteellinen

nu /nu

immuuni hiirillä eivät vaikuttaneet PC61; sekä isotyyppikontrolli tai PC61-ruiskutetaan hiiret menehtyivät johtuen kasvaimen taakkaa 18-22 päivää kasvaimen istuttamisen jälkeen.

(A) GL26-soluja inkuboitiin 48 h 100 ug /ml PC61 tai 100 ug /ml rotan lgG1 isotyyppikontrolli. Sitten solut otettiin talteen ja värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidia tunnistaa apoptoottiset solut. Ei merkittävää apoptoosin lisääntymistä todettiin, kun soluja inkuboitiin PC61 tai isotyyppikontrollilla immunoglobuliineja vertaa käsittelemättömiin kontrolleihin (p 0,05). Suuri apoptoosin lisääntyminen havaittiin, kun soluja inkuboitiin 4 tuntia H2O2 (p 0,001). Virhepylväät edustavat keskivirhe 3 rinnakkaisnäytettä ja määritys toistettiin 3 kertaa. Yksisuuntainen ANOVA Tukeyn kokeen avulla laskettiin merkittäviä eroja (*** p 0,001). (B) Leviämisen GL26 solujen mitattiin havaitsemalla BrdU DNA: han. Ei merkittävää eroa lisääntymistä havaittiin (p 0,05), kun soluja inkuboitiin PC61 (rotan IgG1αCD25) verrattuna isotyyppikontrolleja (rotan lgG1) tai käsittelemättömät solut (*** p 0,001 verrattuna negatiiviseen (ei soluja) ohjaus, ns = ei merkitsevä). (C) Kateenkorvattomia nu /nu -hiirten (Balb /c tausta) altistettiin yhden kallonsisäisen injektion GL26 soluja ja käsiteltiin 15 vrk myöhemmin 1 mg joko PC61 tai isotyyppikontrollia immunoglobuliinien ruiskutettiin i.p. Survival seurattiin ja hiiret lopetettiin, kun kuolemaisillaan. Ei ole merkittävää eroa eloonjäämisen havaittiin käyttäen log rank -testi (p 0,05) (n = 5).

Kun sulkematta pois mitään suoraa vaikutusta PC61 kasvaimen solujen kasvua tutkittiin vaikutusta T reg heikkeni villityypin C57 /B6 hiirillä kallonsisäinen GL26 gliooma. Kokeellinen paradigma käyttää on kuvattu kuviossa. 3A. Ehtyminen Tregs 15 päivän kuluttua kasvainsolujen istutuksen lisännyt huomattavasti pitkän aikavälin jälkeenjääneen 40% hiiristä oli elossa 150 päivää myöhemmin (p 0,05, Fig. 3B). Tämä oli enemmän kuin 5 kertaa pidempi kuin keskimääräinen säilyminen ohjaus kasvaimen kantavien hiirten (Fig. 3B). Ei merkittävää kasvua pitkällä aikavälillä selviytymisen havaittiin, kun Tregs depletoitiin suuremmissa kasvaimia (24 päivää) (p 0,05) ja vain 10% hiiristä selvisi pitkällä aikavälillä tästä ryhmästä (Fig. 3B). Mielenkiintoista, emme noudata mitään DTH vasteita, kun me pistetään säteilytetty GL26 solujen käpälään pitkäaikaisen eloonjääneitä Treg köyhdytettyä hiiriä (Kuva. 3C). Jotta voitaisiin arvioida vaikutuksia hoidon PC61

in vivo

, analysoimme läsnäolo Foxp3

+ CD4

+ Tregs tunkeutuu GBM massa sekä tyhjennys imusolmukkeet ja perna intraperitoneaalisen injektion jälkeen PC61 (päivät 15 ja 24) tai rotan lgG1 isotyyppikontrolli (päivä 15 päivää) osaksi kasvaimen hiirille. PC61 injektio päivänä 15 johti 9-kertainen vähennys (p 0,001) määrä kasvaimeen infiltroivien Tregs, kun mitattiin käyttämällä virtaussytometriaa 12 päivää myöhemmin (päivä 27), ja injektio PC61 24. päivänä johti lähes täydellinen ehtyminen Tregs (p 0,001) kasvaimen 3 päivää myöhemmin (päivä 27) (Fig. 3d). Kuten odotettua, perifeerinen Treg populaatioita tyhjennys imusolmukkeet (Fig. 3E) ja pernat (Fig. 3F) vähenivät merkittävästi verrattuna isotyypin käsiteltyihin kontrolleihin (p 0,001). Mielenkiintoista on, havaitsimme 3-kertainen pieneneminen absoluuttinen prosenttiosuus CD4

+ T-solut (Fig. 4A) ja CD8a

+ T-solut (Fig. 4B) tunkeutumisatmosfäärin kasvaimeen annon jälkeen PC61. Lisäksi PC61 merkittävästi köyhdytettyä populaatiot CD4

+ T-solujen (p 0,05, Fig. 4C) ja CD8

+ T-solujen (p 0,01, Fig. 4D) kasvaimen tyhjennys imusolmukkeet. Ei ollut mitään muutosta totesi prosenttiosuudet CD4

+ T-solujen ja CD8a

+ T-solut pernassa (p 0,05, Fig. 4E-F) ja MO: ssä ja DC pysyi ennallaan kasvaimia ja tyhjennys imusolmukkeet vaikka kasvoi hieman pernassa (Fig. 5).

(A) kaavio kuvaa erilaisia ​​hoitoja annetaan 4 ikäluokat kasvaimen omaavien hiirten. GL26-soluja istutettiin aivoissa kaikki hiiret päivänä 0 ja käsiteltiin, että kasvaimeen toimittamisen suolaliuosta päivänä 17 kanssa ehtyminen CD25

+ soluihin käyttäen PC61 päivänä 15 (vihreä) tai päivänä 24 (punainen). Kontrolliryhmille kasvaimen omaavien hiirten saivat rotan lgG1 isotyyppikontrolli päivänä 15 (sininen), tai ei systeemisesti immunoglobuliineja (musta), kuten. Hiiriä käytetään joko selviytymisen tutkimuksia, tai lopetetaan päivänä 27 tuumorin implantaation analysoimiseksi immuunijärjestelmän solupopulaatioiden virtaussytometrialla. (B) Kaplan-Meier-käyrä näyttää selviytymisen 4 hiiriryhmää kuvattu (A). Kymmenen hiirtä käytettiin kussakin ryhmässä ja log-rank-testi käytettiin laskettaessa merkitystä välillä käsittelemättömässä ryhmässä ja PC61 käsiteltyjen ryhmien. * P 0,05 verrattuna käsittelemättömiin hiiriin ja isotyyppikontrolli käsiteltyihin hiiriin. (C) DTH koe suoritettiin pitkäaikainen perhe hiirillä 100 d kasvaimen istutuksen jälkeen. Hiiret olivat alun perin käsitelty PC61 päivänä 15 (vihreä riviä). Säteilytetyt GL26 solut PBS oikeaan taka footpad (täytetty laatikko) tai PBS valvonta vasemmalla takana footpad (avoin laatikko) hiirillä. Paksuus polkuanturan määritettiin 0 h, 4 h, 24 h ja 48 h injektion jälkeen säteilytettyjä soluja tai PBS: ää. Kaksisuuntainen ANOVA kanssa Tukeyn kokeen avulla laskettiin merkittäviä eroja. (D-F) Tregs (CD3ε

+ CD4

+ Foxp3

+) infiltroivien kasvaimet (D), imusolmukkeet (E) tai pernoissa (F) määrä määritettiin hiirillä, joille annettiin rotan lgG1 isotyyppikontrolli ( iso) tai PC61 päivänä 15 (15) tai päivä 24 (24) kuten kuvaajat (vasemmalla). Pistekuvioita (oikealla) näyttää edustavan datan 5 hiirtä ryhmää kohti. Prosenttiosuudet T regs suhteessa kokonaismäärään CD45 + solujen kasvaimet, tyhjennys imusolmukkeet (DLN) tai pernan on esitetty tyypillinen pistekuvioita. Yksisuuntainen ANOVA Tukeyn kokeen käytettiin määrittämään merkittäviä eroja (*** p 0,001).

C57BL /6 hiiret altistettiin kasvainsolujen päivänä 0, ja käsiteltiin päivänä 17 kasvaimensisäistä toimitus suolaliuosta. Tregs oli köyhdytetty joko päivänä 15 tai päivänä 24 ip-injektion PC61. Immuunijärjestelmän solut eristettiin perna, kohdunkaulan LN ja kallonsisäisen kasvaimen päivänä 27 tuumorin implantaation prosenttiosuuden määrittämiseksi CD4 + T-solujen ja CD8a + T-solut kussakin kudoksessa. Prosenttiosuus ja tuumoria infiltroivien immuunisolujen, jotka olivat CD4 + T-soluja (CD3ε + CD4 + CD8a-) (A) ja CD8a + T-solujen (CD3ε + CD4- CD8a +) (B); prosenttiosuus immuunijärjestelmän solujen tyhjennys imusolmukkeet, jotka olivat CD4 + T-soluja (CD3ε + CD4 + CD8a-) (C) ja CD8a + T-solujen (CD3ε + CD4- CD8a +) (D); ja prosenttiosuus immuunisolujen pernassa, jotka olivat CD4 + T-soluja (CD3ε + CD4 + CD8a-) (E) ja CD8a + T-solujen (CD3ε + CD4- CD8a +) (F) on esitetty kaavioissa (vasemmalla). Edustavia pistekuvioita kussakin testiryhmässä näkyvät oikealla (aidatulla live leukosyyttien FSC vs. SSC ja CD3ε + T-lymfosyytit). Prosenttiosuudet kunkin immuunisolujen populaation suhteen kokonaismäärä CD45 + solujen kasvaimet, tyhjennys imusolmukkeet (DLN) tai pernan on esitetty tyypillinen pistekuvioita. Yksisuuntainen ANOVA Tukeyn kokeen laskemiseen käytettiin merkittäviä eroja. (* P 0,05, ** p 0,01).

GL26-soluja istutettiin aivojen striatumissa C57BL /6-hiirissä. Rat IgG1 isotyyppikontrolli immunoglobuliineja (-) annettiin päivänä 15 ja PC61 annettiin päivänä 15 tai päivänä 24 kuten on osoitettu. Prosenttiosuus tuumoreihin tunkeutuvia makrofageja (MO, CD11 + CD45 + I-Ab +) (A, C, E) ja myelooinen Dendriittisolut (MDC, CD 11 c + CD45 + I-Ab +) (B, D, F) kvantitoitiin päivänä 27 tuumorin implantaation virtaussytometriaa käyttämällä kasvaimessa (A, B) DLN (C, D) ja pernassa (E, F). Prosenttiosuudet kunkin immuunisolujen populaation suhteen kokonaismäärä CD45 + solujen kasvaimet, tyhjennys imusolmukkeet (DLN) tai pernan on esitetty tyypillinen pistekuvioita. 5 ja 10 hiiret analysoitiin ryhmää kohti. Yksisuuntainen ANOVA Tukeyn kokeen määrittämiseen käytettiin tilastollista merkittävyyttä.

Hoito PC61 estää aktivoinnin adaptiivisen kasvaimen vastaisen immuunivasteen ja estää kasvaimen regressio, kun sitä käytetään yhdessä Ad-Flt3L ja Ad TK

pyrittiin myös vaikutusten tutkiminen ehtyminen Tregs käyttämällä anti-CD25 immunoglobuliini tehosta T-solun riippuvaista immunoterapian välittämä kasvaimensisäisiä toimituksen Ad-Flt3L ja Ad-TK [27], [37]. Aktivoidut CD4

+ ja CD8

+ T-lymfosyyttejä upregulate solun pinnalla CD25 jälkeen alustavan sitoutumisen TCR antigeenillä näytetään MHC [30], [31] ja tämä saattaa selittää näennäinen väheneminen T-soluissa, jotka havaittiin kasvaimet (Fig. 4A-B) ja DLN (Fig. 4C-D) antamisen jälkeen PC61. Tämän tutkimiseksi edelleen ja päättää, onko poistaminen Tregs käyttäen PC61 voivat vaikuttaa haitallisesti T-soluista riippuvainen immunoterapian GBM, me istutetaan kasvaimia striatumissa päivänä 0 ja hiiriä käsiteltiin Ad-Flt3L ja Ad-TK 17 päivää myöhemmin, kun taas PC61 tai isotyyppikontrolli immunoglobuliineja annettiin ryhmille päivänä 15 tai päivänä 24 (Fig. 6A). Kun pistetään Ad-Flt3L ja Ad-TK kasvaimeen päivänä 17 (kun kasvain oli 1 mm

3 koko (Fig. 1A) havaitsimme vahva kasvu selviytymisen 50% hiiristä elossa 150 vrk myöhemmin ( p 0,01, Fig. 6B), joka ei vaikuta kielteisesti anto rotan lgG1 isotyyppikontrolli (p 0,05). PC61 annettiin 2 päivää ennen injektiota Ad-Flt3L ja Ad-TK alennetaan eloonjääminen 30%, vaikka tämä ei ollut tilastollisesti erilainen isotyypin käsiteltyihin kontrolleihin (p 0,05, Fig. 6B). kun kuitenkin käsitellyistä hiiristä Ad-Flt3L ja Ad-TK päivänä 17 ja köyhdytettyä Tregs 24. päivänä, huomasimme, että pitkän aikavälin selviytyminen oli merkittävästi vähentynyt verrattuna hiirillä, jotka eivät saaneet PC61 (p 0,05, Fig. 6B). Vain 10% kasvaimen omaavien hiirten selviytyi 150 päivää myöhemmin, mikä viittaa siihen, että hallinto PC6 17 d kuluttua kasvaimensisäisenä toimituksen Ad-Flt3L ja Ad-TK vaikuttaa haitallisesti T soluista riippuvan aivokasvain regressio. pitkällä aikavälillä eloonjääneiden hoidon jälkeen Ad-Flt3L ja Ad-TK, DTH vastaus säteilytettyjä GL26 solujen jalkatyynyyn havaittiin kun hiiret oli annettu joko PC61 (p 0,01) tai isotyyppikontrolleja (p 0,001, Fig. 6D ). Mielenkiintoista emme noudata mitään lisäystä IFNy erittävät T-lymfosyyttien vastauksena BMDC ladattu GL26 solu-uutteiden kun PC61 ruiskutettiin joko ennen (15 päivää) tai postitse (24 päivää) hoitoon käytetään Ad-Flt3L ja Ad-TK (p 0,05, Fig. 6D). Määrä kasvaimeen infiltroituvien Tregs aleni jälkeen systeemistä kuljettamista PC61 (p 0,001, Fig. 6E) ja prosenttiosuus Tregs väheni myös merkitsevästi vuonna DLN ja pernassa, (p 0,001, Fig. 6F-G) riippumatta siitä, onko hiiret hoidettiin suolaliuoksella tai Ad-Flt3L ja Ad-TK.

(A) C57BL /6 hiiret altistettiin kasvainsolujen päivänä 0, ja käsiteltiin päivänä 17 kasvaimensisäisiä toimituksen Ad-Flt3L ja Ad-TK tai suolaliuosta kuten on osoitettu. Tregs oli köyhdytetty joko päivänä 15 (vihreä) tai päivänä 24 (punainen) ip-injektio PC61 tai päivänä 15 isotyyppikontrollilla (sininen). Immuunijärjestelmän solut eristettiin perna, kohdunkaulan LN ja kasvain. Hiiriä joko käytettiin selviytymisen tutkimuksia tai tapettiin päivänä 27 analysointia varten immuunijärjestelmän solupopulaatioiden virtaussytometrialla ja ELISPOT. (B) Kaplan-Meier käyrä näyttää Eloonjääntitulokset 10 hiirtä ryhmässä. Tilastollisesti merkitseviä eroja Ad-Flt3L ja Ad-TK käsiteltyihin hiiriin vain (musta viiva, ei PC61 ehtyminen) laskettiin käyttäen log-rank-testiä (* p 0,05, ** p 0,01). Anto PC61 hiirille 24 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen (7 päivää käsittelyn jälkeen Ad-Flt3L ja Ad-TK) vähensi merkittävästi pitkän aikavälin elinkelpoisuuden. (C) Kasvaimen kantavia hiiriä hoidettiin Ad-Flt3L ja Ad-TK yksinään (mustat viivat) tai Ad-Flt3L ja Ad-TK kanssa PC61 ehtyminen päivänä 15 (vihreä riviä). Pitkäaikainen eloonjääneet (60 d kasvaimen istutuksen jälkeen) arvioitiin varten DTH vastaus säteilytetty GL26 soluja ruiskutetaan oikeaan polkuanturaan (verrattuna PBS vain vasemmassa jalkatyynyyn). Kaksisuuntainen ANOVA kanssa Tukeyn kokeen avulla laskettiin merkittäviä eroja ryhmien välillä (*** p 0,001 hiiriä hoidettiin Ad-Flt3L ja Ad-TK ei ehtyminen, p 0,01 Ad-Flt3L ja Ad-TK käsitellyistä hiiristä köyhtynyt PC61 päivänä 15). (D) IFNy-ELISPOT osoittaa kokonaismäärä tuottavan IFNy T-lymfosyyttejä, jotka oli stimuloitu DC täynnä GL26 kasvainuutteiden. T-lymfosyytit puhdistettiin hiirillä 10 d hoidon jälkeen joko Ad-Flt3L ja Ad-TK (+) tai suolaliuoksen (-), kuten on ilmoitettu. Mustat palkit ovat T-lymfosyyttejä hiiristä, jotka eivät saaneet CD25 heikentäviä immunoglobuliineja. Vihreät palkit ovat T-lymfosyyttejä puhdistaa hiiristä köyhtynyt PC61 2 vrk ennen hoidon Ad-Flt3L ja Ad-TK (päivä 15 kasvaimen istutuksen jälkeen) ja punaiset palkit ovat T-lymfosyyttejä puhdistetaan hiiristä köyhtynyt PC61 7 päivän hoidon Ad-Flt3L ja Ad-TK (päivä 24 kasvaimen istutuksen jälkeen). (E-G) Tregs (CD3ε

+ CD4

+ Foxp3

+) infiltroivien kasvaimet (E), imusolmukkeet (F) tai pernoissa (G) määrä määritettiin hiirillä, joille annettiin rotan lgG1 isotyyppikontrolli ( iso) tai PC61 päivänä 15 (15) tai päivä 24 (24) kuten kuvaajat (vasemmalla). Anto PC61 hiirille johti pitkäaikaiseen ehtymiseen Tregs reuna sivustoja (perna ja imusolmukkeet) ja kasvain. Pistekuvioita (oikealla) näyttö edustaja tarkoittaa ± SEM FOXP3

+ Tregs määrällisesti 5 hiirtä ryhmää kohti. Kokonaismäärä T regs kasvaimissa (E) ja prosenttiosuudet T regs suhteessa kokonaismäärään CD45 + solujen tyhjennys imusolmukkeet (DLN) tai pernan (F ja G) on ilmoitettu edustava piste tontteja. Kaksisuuntainen ANOVA kanssa Tukeyn kokeen käytettiin määrittämään merkittäviä eroja (*** p 0,001).

Hoito PC61 estää korotukset kasvaimen soluttautua T-soluissa ja MO: ssä, mutta ei DC-hoidon jälkeen Ad