Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Vaikka multimodaalisuutta hoito voi aiheuttaa korkea remission monissa alatyyppejä non-Hodgkin-lymfooman (NHL), merkittävä osuus potilaiden relapsi kanssa parantumaton sairaus. Vaikutus ihmisen luuytimen (BM) mesenkymaaliset kantasolut (MSC) kasvainsolujen kasvu on kiistanalainen, eikä erityisiä tietoja vaikutuksista BM-MSC NHL.

Menetelmät /Principal Havainnot

The effect of BM-MSC analysoitiin kahtena

in vivo

malleja levitetään non-Hodgkin-lymfoomat, jossa on veltto (EBV

– Burkittin-tyyppinen BJAB-, eloonjäämismediaani = 46 päivää) ja aggressiivista (EBV

+ B lymfoblastoidisten SKW6.4, eloonjäämismediaani = 27 päivää) käyttäytymistä nude-SCID hiiriin. Intraperitoneaalitestissä (ip) injektion MSC (4 päivää ip-injektion lymfooman soluissa) lisäsi merkitsevästi eloonjäämisaste optimaalisella MSC:lymphoma 1:10 molemmissa ksenograftimalleissa (BJAB- + MSC, eloonjäämismediaani = 58,5 päivää; SKW6.4 + MSC, eloonjäämismediaani = 40 päivää). Kun MSC injektio i.p. kasvain massat kehittyi hitaammin ja kello histopatologinen havainto, esillä massiivinen strooman tunkeutumisen kytketty laajan sisäisen tuumorinekroosi. Vuonna

in vitro

kokeissa olemme huomanneet, että: i) MSC /lymfooma yhteistyössä kulttuureissa vaatimattomasti vaikuttaa lymfooma solujen eloonjäämistä ja oli tyypillistä lisääntynyt vapautuminen angiogeneesiä sytokiinien suhteen MSC, tai lymfooma, kulttuurien ii) MSC aiheuttaa kulkeutumista endoteelisolujen siirtokuoppaan määrityksissä, mutta edistänyt endoteelisolujen apoptoosin suoraan MSC /endoteelisolujen co-viljelmiä.

Johtopäätökset /merkitys

Tuloksemme osoittavat, että BM-MSC niillä on anti-lymfooman aktiivisuus kahdessa eri SCID-hiiren malleissa levittää NHL.

Citation: Secchiero P, Zorzet S, Tripodo C, Corallini F, Melloni E, Caruso L, et ai. (2010) ihmisen luuytimen mesenkyymikantasoluista Näyttö syövän vastaista aktiivisuutta in SCID hiirillä Disseminated Non-Hodgkinin lymfooma ksenoqraftit. PLoS ONE 5 (6): e11140. doi: 10,1371 /journal.pone.0011140

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 23 helmikuu 2010; Hyväksytty: 24. toukokuuta 2010 Julkaistu: 16 kesäkuu 2010

Copyright: © 2010 Secchiero et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Associazione Italiana per la Ricerca contro il Cancro (AIRC) avustus ja CariFe Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta siitä, että multimodaalisuutta hoito, mukaan lukien yhdistelmä kemoterapia, säteily, ja kohde-monoklonaalisia vasta-aineita, kuten rituksimabi, voi aiheuttaa korkea remission monissa alatyyppejä non-Hodgkin-lymfooman (NHL), merkittävät mittasuhteet potilaiden relapsi kanssa parantumaton sairaus. Siten tehokkaita hoitoja NHL edelleen vakava lääketieteellinen tarve, ottaen huomioon myös, että esiintyvyys NHL jatkaa nousuaan [1]. Yleisimpiä muotoja NHL ovat B-solujen maligniteetteja, joista follikulaarinen lymfooma (FL) ja diffuusi suuri B-solulymfooma (DLBCL) muodostavat enemmistön [2]. Burkittin lymfooma on harvinaisempaa muotoa NHL tunnettu siitä, translokaatio c-myc-onkogeenin Ig: n raskaan ketjun promoottori /tehostaja-alue, [3]. Kertyvät näyttö on osoittanut, että, kuten kiinteitä kasvaimia, peruskudoksen solujen komponentti NHL ei muodostu viattomia sivullisia neoplastisen prosessissa, mutta se koostuu solutyyppejä, jotka saattavat aktiivisesti vaikuttaa ja kasvun edistämiseksi viereisen transformoitujen solujen [4 ] – [9]. Kuitenkin vaikutus ihmisen luuytimen (BM) mesenkymaaliset kantasolut (MSC), joita pidetään strooman progenitorisolujen kantasolujen BM, kasvuun kasvainsolujen on kiistanalainen.

MSC yleensä eristetään kiinnittyvä mononukleaaristen osa BM aspirates, voi lisääntyä monia kohtia kulttuuriin ja on useita ominaisuuksia, jotka tekevät niistä houkutteleva vaihtoehto kuin solun terapeuttisia aineita. Itse asiassa ne ovat suhteellisen immunogeenisiä, vaikka mekanismi niiden immuunijärjestelmä etuoikeus ei ole hyvin ymmärretty ja on kiivasta tutkimuksen [10] – [12]. Koska nämä ominaisuudet, MSC osoittavat huomattavaa terapeuttista potentiaalia rappeuttavia sairauksia [13], [14]. Toisaalta, kun tarkastellaan niiden potentiaalisesti terapeuttiseen käyttöön neoplastiset sairaudet, jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että adoptiivisesti siirrettyjen MSC voisi suosia kasvaimen siirteen ja eteneminen

in vivo

[9], [12], [15]. Haitalliset vaikutukset voivat johtua eri MSC ominaisuuksista. Todellakin, MSC nimenomaan vaeltavat kohti sivustoja aktiivista tumorigeneesin, jossa he voisivat yhdistää erikoistunut kasvain kapealla, edistää kasvaimeen liittyvien fibroblasteja ja myofibroblasteja [16] – [18], stimuloida angiogeneesiä [18] – [20], ja edistää kasvua ja lääkeresistenssin sekä kiinteitä kasvaimia ja hematologisia maligniteetteja [18], [21] – [26].

Tältä pohjalta olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutusta BM johdettujen MSC hallinto kaksi mallia on levitetty NHL, perustettu intraperitoneaalitestissä (ip) injektion nude-SCID-hiirissä EBV

– Burkittin-tyyppinen BJAB- ja EBV

+ B lymfoblastoi- SKW6.4 solulinjoissa, tunnettu veltto ( BJAB) ja aggressiivinen (SKW6.4) käyttäytyminen. Vastoin odotuksia, huomasimme, että BM-MSC merkittävästi lisäsi elinaikaa lymfooma varustettujen ksenograftien.

Tulokset

karakterisointi BJAB- ja SKW6.4 ksenograftimalleja

SCID hiiret olivat ip ruiskutetaan ennalta määrätty optimaalinen määrä (2 x 10

6) lymfooman (BJAB tai SKW6.4) soluja. BJAB -ksenografteja ominaista vatsakalvon kasvaimia, joka alkoi tulla kouraantuntuva ja mitattavissa ulkopuolisten havainto 18-20 päivää injektion jälkeen ja tasaisesti edennyt saakka hiiriä kuolemasta (kuvio 1A). Toisaalta, in SKW6.4 ksenografteissa, kasvainsolu massa tuskin palpoitavissa tahansa vaiheessa tutkittiin. Histopatologinen tutkimus vatsakalvon massojen osoitti, että sekä BJAB- ja SKW6.4-johdettu kasvaimet ovat kiinteä kuvio kasvun CD20

+ lymfoblastoidisoluja (kuvio 1A). Variable levittäminen CD20

+ lymfoblastoidisoluilla havaittiin imusolmukkeet ja perna, kun luuydin ja munuaiset olivat tavallisesti muuttumattomina (kuvio 1 B). Lisäksi sekä lymfooma kantavien ksenograftien, ja erityisesti SKW6.4 ksenografteissa, usein esillä eristetty tai massiivista infiltraatiota CD20

+ lymfoblastoidisoluilla maksassa (kuvio 1 B).

SCID-hiirissä olivat i.p. ruiskutetaan BJAB tai SKW6.4 soluja (2 x 10

6). A, BJAB mutta ei SKW6.4 -ksenografteja tyypillistä vatsakalvon kasvaimet mitattavissa ulkoisten havainto. Nuoli osoittaa ulkorajan kasvaimen massan. Vuonna takkakasetti makroskooppinen ulkonäkö vatsakalvon massojen ja histologiset H 0,01.

Huomattavaa on, että huolimatta isompi vatsakalvon massat BJAB- suhteen SKW6.4 ksenograftin hiiriä, mediaanielossaolosta SKW6.4 ksenografteja oli merkitsevästi (p 0,01) lyhyempi (27 päivää) verrattuna BJAB ksenograftien (47 päivää; kuvio 1C).

injektio BM-johdettujen MSC pidentää merkittävästi selviytymistä sekä BJAB ja SKW6.4 ksenografteja

vaikutuksen määrittämiseksi ihmisen BM-MSC selviytymisen lymfooma ksenograftien, ryhmät SCID-hiirten olivat ip injektoitiin joko BJAB tai SKW6.4-solujen, ja sen jälkeen 4 päivää, MSC, jonka lymphoma:MSC suhteessa 10:01. Ryhmä hiiriä injektoitiin MSC yksin, kontrollina. -ksenografti Hiirissä, joita hoidettiin BJAB + MSC: n ja SKW6.4 + MSC osoittivat merkittävää (p 0,01) lisäystä eloonjäämisessä verrattuna vastaaviin BJAB (kuvio 2A) tai SKW6.4 (kuvio 2B) ksenograftit. Huomattavaa on, että määrä kasvaa pistetään MSC on lymphoma:MSC suhde 02:01 ei parantaa yleistä eloonjäämistä BJAB- ksenograftien (kuvio 2A). Lisäksi siinä BJAB- ksenograftimallia, joka mahdollisti tarkan mittauksen kasvaimen massan ulkoinen tarkastus, huomasimme, että paraneminen selviytymisen rinnastettiin merkittävä (p 0,05) viive kasvaimen kasvua hiirissä injektoitiin BJAB- + MSC suhteen hiiriin injektoitiin BJAB- yksinään (kuvio 2C).

SCID olivat ip injektoitiin joko BJAB (n = 10) tai SKW6.4 (n = 10) soluja, ja sen jälkeen 4 päivää, MSC, jonka lymphoma:MSC suhteessa 10:01. Kontrollina, ryhmä hiiriä (n = 10) sai injektiona MSC yksin. Kaplan-Meier-analyysi NHL ksenograftimalleissa, vertaamalla hiirten eloonjääntiin injektoitiin BJAB ± MSC (A) tai SKW6.4 ± MSC: n (B). Vuonna BJAB ksenografti hiirissä, tulokset on saatu ryhmä hiiriä (n = 10) injektoitiin MSC, jonka lymphoma:MSC suhteessa 02:01, on myös esitetty (A). Eloonjäämisen prosenttiosuus mitattiin päivänä lymfoomasolun injektion saakka kuoleman. Asterisk,

p

0,05 suhteessa BJAB- tai SKW hiirillä. C, Peritoneaalisille kasvaimet mitataan joka viikko, kunnes eläin kuolemaan, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät section.Results ovat keskiarvoja ± SD. Asterisk,

p

0,05.

histopatologinen tutkimus tuumo- kudosta SCID hiirillä osoittivat silmiinpistävän erityispiirteitä välillä vatsakalvon massojen kehitetty injektion joko lymfooma solujen tai lymfooman soluissa + MSC. Nämä analyysit käytti enimmäkseen suoritettiin BJAB- ksenograftimallia takia isomman koon massojen, mutta samanlaisia ​​histopatologiset ominaisuudet havaittiin myös SKW6.4 ksenografteissa. Kuten kuviossa 3A, BJAB- kasvaimia esiintyi kiinteän kasvumallin kanssa huomaamaton strooman meshwork, vahvistettu Masson kolmivärimenetelmä värjäystä, ja harvat sisäinen kasvain alukset, havaittuna CD31 immunohistokemiallisella värjäyksellä, joka on histopatologinen tilanne muistuttaa, että havaittiin suurimmalla ihmisen NHL [27]. Toisaalta, kasvainten massat kehitetty hiirillä yhteistyössä injektoitu BJAB ja MSC-solut osoittivat täysin erilainen näkökulma, tunnettu: alueet sisältävän strooman siltoja sekoittaa BJAB- solulevyt, kuten selvästi dokumentoitu sekä H 0,05), joka on kytketty apoptoosin, kun BJAB olivat viljellään yhdessä läsnä MSC-solujen, klo lymphoma:MSC suhde ja 10:01 (kuvio 4A). Toisaalta, solujen elinkelpoisuus ja apoptoosin tasot SKW6.4 viljelmiä, olivat täysin läsnäolo ei vaikuta MSC (kuvio 4A). Lisäksi, jotta voidaan verrata julkaisun angiogeneesiä sytokiinien (taulukko S1), teimme vasta-aine-pohjainen proteiini erilaisia ​​analyysi viljelysupernatanteista: i) SKW6.4 lymfooma-soluja, ii) MSC, iii) SKW6.4 /MSC viljellään yhdessä suorassa kosketuksessa; iv) SKW6.4 /MSC viljellään yhdessä transwell levyillä. Kuten odotettua, MSC tuotetaan merkittäviä määriä useita angiogeneesiä sytokiinit, joista osa (angiogeniini, IL-8, CCL2: n ja VEGF) olivat merkittävästi säädelty samanaikainen läsnäolo SKW6.4-solujen (kuvio 4B). Sekä suorat ja siirtokuoppaan lymfooma /MSC co-viljelmät olivat yhtä tehokkaita edistämään sytokiinien vapautumisen. Määriä IL-8: n ja VEGF lisättiin edelleen mitattiin ELISA: lla (kuvio 4C), ja tulokset olivat yhdenmukaisia ​​niiden kanssa proteiinin erilaisia ​​analyysi (kuvio 4B). Kuten on esitetty kuviossa 4C, on myös huomattava, että merkittävä (p 0,05) lisäystä vapautumisen IL-8: n ja VEGF, suhteessa MSC yksin, havaittiin sekä MSC /SKW6.4 sekä MSC /BJAB co-viljelmissä.

BJAB ja SKW6.4 soluja viljeltiin puuttuessa tai läsnä MSC kello lymphoma:MSC suhteessa 10:01. A, 96 tunnin kuluttua viljelyn, lymfooma apoptoosia analysoitiin double anneksiini V /PI värjäystä. B, Viljelysupernatantit kerättiin: SKW6.4 lymfoomasoluilla yksin, MSC yksin, SKW6.4 /MSC suoraan yhteistyöhön kulttuureissa ja SKW6.4 /MSC siirtokuoppaan co-kulttuureissa. Vapautuminen angiogeneesiä sytokiinien arvioitiin Viljelysupernatanteissa käyttämällä proteomiin profiloija ihmisen angiogeneesiä array. Ympyrät kalvoilla esiin neljä sytokiineja (angiogeniini, IL-8, CCL2 ja VEGF) vapautuu MSC, jotka ovat merkittävästi säädelty samanaikainen esiintyminen SKW6.4 soluja. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta ja tulokset yksi niistä on esitetty. Pylväskaaviolla raportoi tuloksista densitometristä analyysien kalvoja. Lyhenteitä analysoitiin sytokiinien on määritelty taulukossa S1. Asterisk, p 0,05. C, tasot IL-8: n ja VEGF mitattiin viljelysupernatanteista ilmoitettu viljelmät ELISA: lla. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritetaan kahtena kappaleena. Asterisk, p 0,01.

MSC indusoida endoteelisolujen migraation ja edistää endoteelisolujen apoptoosia suorasta MSC /endoteelisolujen yhteyshenkilö

Koska MSC vapauttaa cocktail voimakas angiogeneesiä tekijät [28] – [30], olemme seuraavassa lähemmin tarkastelemaan kyky MSC ajaa endoteelisolujen migraation. Kuten on esitetty kuviossa 5A, MSC viljelmät kohdistuu voimakas (p 0,01) pro-muuttavien aktiivisuutta endoteelisoluihin, kuten arvioitiin transwell määrityksissä. Näiden havaintojen perusteella, viimeisen ryhmän kokeiluja olemme tutkineet vaikutusta välillä on suora vuorovaikutus MSC ja endoteelisoluissa. Tätä tarkoitusta varten subkonfluenteista HUVEC ympättiin 6-kuoppaisille levyille, ja seuraavana päivänä, MSC lisättiin endoteelin cell:MSC suhde 05:01. Eräässä koesarjassa, ennen kuin lisättiin MSC, HUVEC ladattu carbocyanine fluorichrome Dil [31], kun otetaan huomioon, että Dil siirto erilaisia ​​solutyyppejä on kuvattu. MSC /HUVEC o-viljelmää seurattiin päivittäin morfologinen tutkimus (alle käänteisen vaihekontrasti ja fluoresenssimikroskooppiin) ja kvantifiointi koko fluoresenssi verrattuna kulttuureissa vain HUVEC (kuvio 5B). Kuten odotettua, päivänä 1, fluoresenssi rajoittuu endoteelisoluihin, kun taas MSC olivat täysin negatiivisia. Ajan havaitsimme tapahtumien fluoresenssivärjäyksellä hajanainen MSC, joka osoittaa, että MSC oli yhdistyivät endoteelisolujen verkon (kuvio 5B). Samanaikaisesti, MSC /HUVEC co-kulttuureissa, me dokumentoitu progressiivinen romahtaminen endoteelisolujen yksikerroksista, jossa esiintyvyys kuolleiden endoteelisolujen lähellä MSC ja merkittävä kasvu apoptoottisten solujen määrä mitataan anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäys ( Kuvio 5B-C). Valitettavasti näissä sarjaa kokeita emme pystyneet suorittamaan kolmikantainen kokeiluja lisäämällä myös lymfoomasolujen teknisistä ongelmista johtuu lähinnä eroista elatusaineissa vaatimukset.

A HUVEC muuttoliike arvioitiin transwell levyille kohti MSC, kylvetään (72 h ennen) alemmassa kammiossa Transvvell- levyjen, kontrolliryhmään verrattuna välineellä. 10-kertainen suurennus valokuvia edustajan värjätä suodattimien esitetään; tummat alueet johtuvat korkeammat solutiheyteen. Keskimääräinen määrä vaeltavia solua per kenttä arvioitiin laskemalla vähintään neljä suuritehoisia random kenttää per suodatin. Tulokset ovat keskiarvo ± SD kolmesta kokeesta kukin suoritettiin kaksinkertaisina. B ja C, subkonfluenteista HUVEC ympättiin puuttuessa tai läsnä MSC: n (endoteelin cell:MSC suhde 05:01). Kuvat fluoresenssilla ja faasikontrastimikroskopiassa osoittavat merkittävää laskua endoteelisolujen tiheys lisättäessä MSC viljelmiin. B, Kuvat ovat näyttää punaista Dil-leimattuja endoteelisolujen kuin ne näkyvät HUVEC kulttuureissa (upotus), ja MSC, joka hankkii värjäyksen jälkeen 4päivää yhteistyössä kulttuurien leimatun HUVEC. Alkuperäinen suurennus 20 x. Kaiken kulttuuri fluoresenssi HUVEC ja HUVEC + MSC määrä määritettiin fluoresenssilevylukijaa. C, läsnäolo kuolleiden solujen edustavat kuvat faasikontrastimikroskopiassa on merkitty tähdellä. Alkuperäinen suurennus 20 x. Kaiken apoptoosia arvioitiin anneksiini V /PI värjäystä. Tiedot B ja C ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritetaan kahtena kappaleena. Asterisck,

p

0,05.

Keskustelu

Edellinen

in vivo

tutkimukset ovat arvioineet vaikutusta MSC eläinmalleissa hematological maligniteetit eristetään ihonalainen geeli laitteista [14], [15], [32]. Kun otetaan huomioon, että suurin osa NHL lähinnä etenee systeeminen maligniteetti, tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet ja kuvattu kaksi eläinmalleissa joka antoi meille tutkinnan aktiivisuuden MSC vastaan ​​NHL ksenografteissa joissa levitetään kasvaimia. Todellakin, i.p. injektio, pahanlaatuinen BJAB- ja SKW6.4 lymfoomasoluja muodostunut kasvain massoja, jossa usein levittäminen maksan ja vatsaontelon imusolmukkeiden.

Suurin havainto Tämän tutkimuksen on, että yksi MSC injektio, kello MSC:tumor solusuhteen niinkin alhainen kuin 01:10, pidensi merkittävästi eläinten eloonjäämistä kanssa veltto (BJAB-) ja aggressiivinen (SKW6.4) lymfoomat. Tämä havainto oli erityisen rohkaisevaa, koska se saatiin levitetty NHL joissa ksenografteja, että meidän mielestämme, ovat tärkeämpiä kuin ihonalainen NHL malleja käytetty aiemmissa tutkimuksissa [14], [15], [32]. Huomattavaa on, että määrän lisääminen MSC, jopa MSC:tumor solujen suhde 01:02, ei johtanut merkittävään parannukseen terapeuttista tehoa MSC. Injektio MSC viivästynyt kehityksen vatsakalvon kasvaimen massojen NHL ksenografteista, ja necroscopic analyysi, Tuumorinäytteet kehitetty puuttuessa tai läsnä MSC osoitti merkittäviä histologisia eroja, jotka voidaan toisteta seuraavat: kun BJAB- ja /tai SKW6.4 johdettuja vatsakalvon massat osoitti tyypillinen heikko kapillaariverkon myös kuvattu ihmisen NHL [27], kun läsnä MSC edisti hajanaisen kasvua α-SMA

+ solu sisällyttäminen koko strooman lokeroon varianssi niukka SMA

+ verisuonia kuvio todettu pääasiassa ilman MSC. Lisäksi massiivinen alueita sisäisen kasvaimen nekroosi olivat etupäässä havaittiin lymfooma + MSC ruiskutettiin eläimiin ja todennäköisesti huomioon alennettua kasvain massat luonteenomaiset hiirissä suhteessa eläimiin ruiskutettiin lymfooma solujen yksin.

yrittää valaista mekanismi (t), johon MSC käyttää lymfoomahoidon aktiviteetti

in vivo

, olemme suorittaneet useita

in vitro

kokeiluja yhteistyössä kulttuuri järjestelmiä. Tulokset on johdettu näistä kokeista on taipumus sulkea merkittävää suoraa sytotoksista vaikutusta MSC lymfoomasoluilla koska MSC kohtalaisen esti elinkelpoisuutta BJAB- mutta eivät osoittaneet mitään merkittävää vaikutusta SKW6.4 solujen selviytymistä /kasvua. Kohteisiin, kyky MSC viljelmistä, jotka erittävät suuria määriä angiogeenisten sytokiinien, kuten VEGF, IL-8, angiogeniini ja CCL2, oli merkitsevästi (p 0,01) tehostaa samanaikainen läsnäolo lymfoomasoluja. Johdonmukaisesti niiden kyky vapauttaa useita angiogeneesiä sytokiineja, MSC voimakkaasti edistänyt kulkeutumista endoteelisolujen Transvvell- määrityksissä. Kuitenkin, kun MSC olivat suoraan viljeltiin yhdessä endoteelisolujen, havaitsimme merkittävää induktio endoteelisolujen apoptoosin. Tässä suhteessa meidän nykyiset havainnot ovat yhtäpitäviä muiden Tekijät, jotka ovat osoittaneet, että MSC tietyissä olosuhteissa voisi käyttää antiangiogeenisen erittäin vascularized Kaposin sarkooman [33], sekä normaalissa endoteelisolujen viljelmiä

vuonna vitro

[34]. Näin ollen vaikka emme voineet dokumentoida relevanssia

in vitro

tiedot meidän eläinmalleissa, meidän havainnot viittaavat olemassaoloon monimutkainen vuorovaikutus MSC, lymfooma ja endoteelisolujen, tunnettu: i) merkittävä vapautuminen angiogeneesiä /pro-vaeltavien sytokiinien MSC, joka on parannettu läsnäolo lymfoomasolut; ii) voimakas kemotaktinen aktiivisuus MSC endoteelisoluissa, jonka jälkeen sytotoksinen aktiivisuus MSC endoteelisolujen, joissa vaaditaan MSC /endoteelisolujen yhteyttä.

Olemme myös tietoisia siitä, että ekstrapoloinnin tietyn eläinmallin kliinisesti merkittäviä tilanteita tulisi harkita äärimmäisen varovasti. Erityisesti on muistettava, että merkittävä rajoitus Tutkimuksemme edustaa se, että kasvaimia torjuvaa immuunivaste ei ole arvokas meidän SCID mallissa, mutta todennäköisesti se on tärkeää kokonaisvaikutus MSC kasvaimen kasvuun. Itse asiassa, on osoitettu, että immunosuppressiivinen vaikutus MSC voi suosia kasvaimen kasvua allogeeniseen eläimillä [12]. Vaikka joitakin kiistanalaisia ​​tiedot ovat läsnä roolista MSC syövän kehittymisessä ja /tai hoito [35], [36], useita uusia johtopäätöksiä voidaan tiivistää meidän tutkimus: i)

in vitro

vuorovaikutus BM -johdannainen MSC ja lymfoomasoluja huonosti ennustaa

in vivo

vaikutus MSC selviytymisen ksenograftissa omaavilla eläimillä; ii) MSC merkittävästi moduloivat strooman verkosto lymfoomien

in vivo

, lisäämällä määrää α-SMA-positiivisten solujen ja houkutella kasvua kasvaimensisäisellä kuolion; iii) MSC edistää endoteelisolujen migraatiota

in vitro

seurasi endoteelisolujen solukuolema kun MSC /endoteelisolujen suora solu kosketukseen.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

SKW6.4 ja BJAB solulinjat saatiin DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Saksa) tai ostaa American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI-1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön naudan seerumia (FBS, Gibco BRL, Gaithersbrg, MD). Ihmisen BM-johdettu MSC: n ja ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) hankittiin yhtiöltä Lonza (Walkersville, MD). BM-MSC viljeltiin rutiininomaisesti MSC-Growth Medium (MSC-GM, Lonza). HUVEC kasvatettiin 0,2% gelatiinilla päällystetyille kudosviljelylevyille M199 endoteelisolujen kasvua väliaineessa, jota oli täydennetty 20% FBS: ää, 10 mg /ml hepariinia ja 50 mg /ml ECGF (kaikki Lonza), kuten aiemmin on kuvattu [37]. Kaikissa kokeissa MSC ja HUVEC käytettiin välillä 3

rd ja 6

th passage

in vitro.

NHL hiiri ksenograftimalleja

Nainen CB -17 SCID hiiriin (4 viikkoa vanha) saatiin Charles River Laboratories (Hollister, CA) ja ylläpidettiin mukaisesti opas hoito ja käyttö Laboratory Animals. Hiiriä pidettiin mikro-isolaattori häkeissä vapaasti ruokaa ja vettä. Menettelyt, joissa käytetään eläimiä ja niiden hoito tehtiin mukaisesti National Institutes of Health Guide for Care ja koe-eläinten käyttöä ja hyväksyi institutionaalisten Animal Care komitea yliopiston Trieste (hyväksyntänumero Italian terveysministeriön 191 /2008-D). Erityisesti kaikki panostettiin välttämään tarpeetonta kipua eläimistä. SKW6.4 tai BJAB (2 x 10

6) solut otettiin talteen, suspendoitiin PBS: ään, ja i.p. injektoidaan 6 viikon ikäisiä hiiriä. Jälkeen 4 päivää, lymfooma ksenografti hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmiin (vähintään 10 hiirtä kussakin ryhmässä), ja annosteltiin i.p. ajoneuvon (PBS) tai MSC (2 x 10

5 tai 1 x 10

6, vastaa klo lymphoma:MSC suhteessa 10:01 ja 02:01 vastaavasti). Ryhmässä SKW6.4-hiiriä (n = 10), MSC injektoitiin 12 päivää post SKW6.4 injektion.

Eläimiä seurattiin päivittäin painon muutos, sivuvaikutuksia hoidon tai merkkejä sairaus. Kasvaimen kasvu määritettiin calliper mittauksia kahdessa kohtisuorassa suunnassa ja kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: (π /6) x

2 x

b

, jossa

on lyhyempi ja

b

on pidempi akseli; kasvaimen tiheys oletetaan olevan yhtä kuin yksi. Survival laskettiin kesto eläimen elinikää rokottaminen lymfooman solujen kuolemaan asti. Ruumiinavaus suoritettiin sen määrittämiseksi, makroskooppinen laajuus ja histologiset ominaispiirteet vatsakalvon massoja. Lisäksi tärkeiden elinten kuten sydämen, munuaisten, reisiluu (luuytimen), maksa, perna, solmut kerättiin mikroskooppinen tutkimus ja arvioida rakenteessa levittämisen siirteen.

Histopatologisten ja immunophenotypical analyysi

eläinten näytteet kiinnitettiin 10% puskuroidussa-formaliiniliuokseen ja upotettiin parafiiniin. Sillä morfologinen analyysi, 4 um: n paksuisia leikkeitä leikattiin parafiiniblokit ja värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla. Immunohistokemia suoritettiin, jonka avulla streptavidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksi, jossa käytetään seuraavia ensisijainen mAb: iden osalta: CD20, α-SMA ja CD31 (Dako, Glostrup, Tanska). 3-3’diaminobenzidine käytettiin kromogeenina (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Määrittämiseksi kollageenin sisältöä, leikkeet värjättiin Massonin trikromilla. Kun värjäykset, objektilasit tutkittiin Leica DM2000 optisella mikroskoopilla ja mikrovalokuvia otettiin käyttämällä Leica DFC320 digitaalikamera.

Co-kulttuuri kokeita

lymfooma /MSC co-kulttuuri

in vitro

kokeissa MSC ympättiin 6-kuoppaisille-levyille ja seuraavana päivänä, joko BJAB tai SKW6.4 soluja lisättiin MSC viljelmää lymphoma:MSC suhteessa 10:01. Co-viljelmät tehtiin korkeintaan 96 tuntia, lymfooma solumediumia. Joissakin kokeissa, co-viljelmät suoritettiin käyttäen 24-Transwell levyjen (3,0 um, huokoskoko, Corning Costar, Cambridge, MA), jossa MSC kylvetään alemman osaston ja lymfoomasoluja lisätään ylempään osastoon.

endoteelin /MSC co-viljelmiä, HUVEC ympättiin 6-kuoppaisille levyille, ja seuraavana päivänä, MSC lisättiin yhdellä HUVEC:MSC suhteessa 05:01. Co-viljelmät tehtiin korkeintaan 5 päivää HUVEC väliaineessa. Joissakin kokeissa, ennen kuin lisättiin MSC, HUVEC ladattu carbocyanine fluorokromilla Dil (1,1’dioctadecyl-3,3,3 ’, 3’tetramethylindocarbocyanine perkloraatti; Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke, Belgia). Dil on lipofiilinen molekyyli, joka sisältää solukalvon, ja on seuraavat spektritiedot: absorptiomaksimi aallonpituudella 549 nm ja emission maksimi on 565 nm: ssä. Tätä tarkoitusta varten HUVEC inkuboitiin 50 ug /ml Dil 2 tunnin ajan, ennen kuin suoritetaan MSC: endoteelisolujen co-viljelmissä. Morfologia HUVEC viljelmistä ja HUVEC /MSC co-viljelmissä havaittiin säännöllisesti ajan mukana käänteisen faasin kontrastia ja fluoresenssin mikroskoopilla ja koko fluoresenssi kvantifioitiin fluoresenssilevylukijaa.

apoptoosimäärityksessä

analyysiä varten apoptoosin, soluja kahden värjättiin anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (Alexis Biochemicals, Lausen, Sveitsi) ja propidiumjodidilla (PI), mukaan valmistajan ohjeiden ja analysoitiin käyttäen FACScan-virtaussytometrillä (Becton-Dickinson , San Jose, CA), kuten aiemmin on kuvattu [38]. Välttämiseksi epäspesifinen fluoresenssi kuolleita soluja, elävät solut aidatulla tiukasti käyttämällä eteenpäin ja sivusironta. Erityisesti HUVECrlle ja MSC /HUVEC kulttuureissa, analysoimaan aste apoptoosin koko solupopulaation, alustan Sitoutumattomat solut kerättiin trypsiinikäsittelyllä ja yhdistetään kelluvat solujen värjäytymisen.

Proteome profiloija array ja entsyymi-immunologiset määritykset

Viljelmien supernatantit analysoitiin käyttämällä proteomin profiler ihmisen angiogeneesin array (R & D Systems, Minneapolis, MN), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, yhtä suuret määrät supernatantit laimennettiin ja sekoitettiin cocktail biotinyloitua angiogeneesiä tunnistus vasta-aineita ja inkuboitiin (capture) vasta-aine, kalvoja yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen sitoutumaton materiaali, kalvoja inkuboitiin HRP-konjugoitua streptavidiinia. Kemiluminesenssin käytettiin signaalin havaitsemiseen. Värjäys voimakkuus pisteet määritettiin ImageQuant-ohjelmisto (Molecular Dynamics) ja ilmaistuna mielivaltaisissa yksiköissä.

Entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA) ja IL-8: n ja VEGF analyysit tehtiin käyttäen kaupallisesti saatavilla olevia ELISA-kittejä (R & D Systems). Määritykset suoritettiin kahtena ja mukaan valmistajan ohjeiden. Tulokset luettiin optinen tiheys 450 nm käyttäen Anthos 2010 ELISA-lukijaa (Anthos Labtec Instruments, Wals Salzburg, Itävalta).

endoteelisolujen migraatiokokeessa

Solun migraatiokokeessa suoritettiin 24 kuoppaiset Transwell levyt (8,0 um, huokoskoko), kuten aiemmin on kuvattu [39]. MSC ympättiin HUVEC viljelyalustaan ​​alempaan kammioon transwell levyjen ja 72 tunnin jälkeen, 0,25 x 10

5 HUVEC per kuoppa lisättiin alkuun kammioihin 100 ul väliaineessa.