Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syövistä maailmassa. N ”taloudellisesti kehittyneissä maissa” elämäntapa, kuten ruokavalion, muodostaa riskitekijän suosii tämä syöpä. Ruokavalio modulaatio saattaa alentaa ruoansulatuskanavan syövän esiintymisen. Joukossa lupaava elintarvikkeiden ainesosien, meijeri propionibakteerien osoitettiin laukaista apoptoosin ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, vapautumisen kautta lyhytketjuisten rasvahappojen asetaatti ja pro- pionaatti.

Menetelmät /Principal Havainnot

piimä yksinomaan käymisen

P. freudenreichii

, äskettäin suunniteltu. Tässä työssä, pro-apoptoottisen potentiaalia tämän uuden piimä oli osoitettu HGT-1 ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Käynyt maito supernatantti indusoi tyypillisiä apoptoosin kuten kromatiinin tiivistyminen, muodostuminen apoptoottisten elinten, DNA: n pilkkoutuminen, solusyklin pysähtymiseen ja syntyminen subG1 väestöstä, fosfatidyyliseriinin altistumista solukalvon ulompi selosteessa, reaktiivisen hapen kerääntyminen, mitokondrion kalvon läpäisevä mahdollisia häiriöitä, kaspaasi aktivointi ja sytokromi c: vapauttaa. Yllättävää kyllä, tämä uusi fermentoitu maito

P. freudenreichii

tehostettu sytotoksisuus kiinilla huume käytetään mahalaukun syövän kemoterapiassa.

Johtopäätökset /merkitys

Tällaiset uudet probiootti piimä voi siis olla käyttökelpoinen osana ennaltaehkäisevää ruokavalion noudattamista ehkäistä mahasyöpä ja /tai ravintolisänä voimistavan syövän terapeuttisia hoitoja.

Citation: Cousin FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, Jan G (2012) Milk käymisen

Propionibacterium freudenreichii

indusoi apoptoosia HGT-1 ihmisen mahasyöpä syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10,1371 /journal.pone.0031892

Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 marraskuu 2011; Hyväksytty: 19 tammikuu 2012; Julkaistu: 19 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Cousin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin Conseil Regional de Bretagne läpi CBB développement hankepyynnön ja Centre National interprofessionnel de l’Économie laitière (CNIEL) kautta tieteellisen komitean on Syndifrais hankepyynnössä. Tutkimus IRSET ryhmässä tukivat avustusta Ligue Nationale Contre le Cancer (Côte d’Armor, Ille et Vilaine, Morbihan, Vendée ja Sarthe Valiokunnat), INSERM, University of Rennes 1 ja alue Bretagne. FJC apuraha CNIEL (jatko Fellowship). SJL tukivat Association pour la Recherche sur le Cancer (jatko Fellowship). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Diet moduloi riski sairastua mahalaukun syöpään

syöpä on tärkein kuolinsyy taloudellisesti kehittyneissä maissa johtuvat syöpään liittyvän elämäntapavalintoja kuten tupakointi, vähäinen liikunta ja ”länsimainen” ruokavalio [ ,,,0],1]. Itse asiassa roolia ruokavalion syövän kehittymisessä tukevat vahvasti epidemiologisista tutkimuksista, erityisesti syöpien ruoansulatuskanavan. Mahalaukun syöpä (GC) edustaa Kolmas tappavia syöpiä miesten maailmassa. Vuonna 2008, 640,600 tapauksissa GC arvioitiin, mikä aiheuttaa 464,400 kuolemia maailmanlaajuisesti [1]. Tämä tauti on erityisen usein Itä-Aasiassa, ja Keski- ja Itä-Euroopassa. Tärkeimmät etiologisista tekijöitä mahasyövän ovat ruokavalio ja

helikobakteeri

infektio. Merkittäviä todisteita, lähinnä tapausverrokkitutkimukset, viittaa siihen, että riski sairastua GC kasvaa korkea saanti suolattu, säilötty tai savustettu perinteisesti elintarvikkeisiin, sekä kuivattua kalaa ja lihaa. Päinvastoin, kuidut, tuoreita vihanneksia ja hedelmiä, ehkä johtuu niiden C-vitamiinipitoisuus, havaittiin käänteisesti yhteydessä GC riski [2], [3]. Vaikutus luonnon /elintarvikkeiden ainesosien karsinogeenisuutta mahassa on siis tutkittu viime vuosikymmeninä [4] – [6]. Näistä, probioottien ja niiden kyky inhiboida syövän kehittymisen herättänyt tieteellistä mielenkiintoa [7], [8]. Probiootti määritellään yleensä ”live mikro-organismi, joka annettuna riittävä määrä, annetaan terveyden kannalta isäntä” [9]. Vaikka jotkut mikro-organismit, kuten

H. pylori

voivat suosia GC, toiset voivat olla hyödyllinen vaikutus estämällä ruoansulatuskanavan syöpien. Erityisesti valitaan kantoja probioottisten bakteerien voivat rajoittaa syövän kehittymisen eläinmalleissa syövän [10]. Tämä oli erityisen osoituksena paksusuolen syöpä taas vähemmän tiedetään mahdollisista probioottien GC. Eräs mahdollinen mekaaninen selitys tällainen suojaava vaikutus on

in situ

vapautuminen anti-syöpää metaboliitit, kuten lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFAs).

lyhytketjuisia rasvahappoja indusoida syöpäsolujen

SCFA, kuten asetaatti, propionaatti ja butyraatti, ovat tärkeitä anionit suolen sisällön ja niiden pitoisuus voi moduloida ruokavalion. Ne osoitettiin keskeisessä asemassa tärkeitä fysiologisia toimintoja kuten modulaation ruoansulatuskanavan epiteelisolujen proliferaatiota /apoptoosin tasapainossa. Tämä edellyttää SCFA välittämiä solun syklin pidätys, histonideasetylaasi- esto ja apoptoosin stimulaation transformoiduissa soluissa, mutta myös stimulaatiota erilaistumisen terveissä soluissa [11], [12]. On myös raportoitu, että SCFAs butyraatti ja propionaatti sekä indusoida apoptoosia ihmisen mahalaukun sinoomasolulinjoja [13] – [15]. Apoptoosi on luonnollinen fysiologinen prosessi mahdollistaa solujen määrä sääntelyä ja muodostaa tavoite syöpälääkkeiden [16]. Apoptosis mahdollistaa ehtyminen syöpäsolujen ”puhdas” tavalla. Syöpäsolut hajottamatta koordinoidusti ketjureaktion ja jäännökset imeytyvät viereisten kudosten ja immuunijärjestelmä [17], [18]. Kaksi apoptoottisia reittejä on kuvattu: ulkoista reitti, joka välittää aktivoinnin kuoleman reseptorien ja kaspaasin 8, ja sisäisen reaktiotien, jossa mitokondrioita ja kaspaasi 9 osallistuvat [16]. Yleensä syöpäsolujen apoptoottisen funktion puuttuu, mikä voi selittää niiden jatkuvaa lisääntymistä ja näin ollen kasvainten muodostumisen. Kyky indusoida apoptoosia syöpäsoluissa siten tunnustettu sen terapeuttista potentiaalia [16]. Koska maitotuotteiden propionibakteerien pystyvät tuottamaan hyödyllisiä proapoptoottiseen SCFAs, ne voivat osoittautua käyttökelpoisiksi syövän ehkäisyyn tai hoitoon.

Propionibacterium freudenreichii

voi suosia apoptoottisen ehtyminen ruoansulatuskanavan syöpäsolujen

Tämä probiootti dairy Propionibacterium osoitettiin aiheuttavan solukuolemaa ihmisen erilaisten koolonsyöpäsolulinjaa läpi apoptoosin, yhteistyössä kulttuureissa [19]. Aktiivisia yhdisteitä, eritetään elatusaineeseen, laukaista luontainen mitokondrioiden apoptoottisen reitin viljellyissä ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja. Erityisesti SCFAs asetaatiksi ja propionaatti vapautuu

P. freudenreichii

indusoida apoptoosia vaikuttamalla mitokondrioiden adeniini nukleotidin translocator, aiheuttaen mitokondrioita depolarisaation ja permeabilisation, vuoto sytokromi c: n ja kaspaasi-aktivointi [19], [20]. Kuitenkin propionibacterial supernatantit ovat vielä pro-apoptoottisen kuin SCFAs asetaattia ja propionaattia, käytetään pitoisuuksina mitattiin supernatanteista, viittaa siihen, että muut yhdisteet voivat olla mukana tätä vaikutusta. Valitut kannat

P. freudenreichii

pysyvät elää ja metabolisesti aktiivisia suolistossa ihmisten ja ihmisen mikrobiston liittyvien rotilla ne tuottavat SCFAs [21], [22]. Näin ollen ne osoitettiin lisäävän apoptoosia transformoiduissa paksusuolen epiteelisoluissa kuten rottia ruokittiin karsinogeeni 1,2-dimetyylihydratsiinia (DMH), mutta ei kontrolli terveistä [23]. Propionihappobakteereiden voisi olla probioottien suosimalla paksusuolensyöpä ennaltaehkäisyyn, mikäli he saavuttavat tavoitteensa elossa ja metabolisesti aktiivisia. Tässä yhteydessä vektori tai probiootti antovehikkeli, osoitettiin määrittämiseksi propionibakteerien selviytymisen ja toimintaa [21], [24], [25]. Complex maitotuotteita, kuten jogurttia ja juustoa, erityisesti suojella propionibakteerien stressistä, mutta sisältävät monimutkainen seos bakteereja. Näin ollen ei ole mahdollista katsoa edullinen vaikutus tiettyyn rasitusta.

fermentoitu maito arvioitiin propionibakteerien toimitus ajoneuvon tässä yhteydessä

Tässä tutkimuksessa käytimme uuden elintarvikelaatua fermentoitua maitoa, joka sisältää vain

P. freudenreichii

ainoana mikrobikasvuston. Koska tämä tuote sisältää sekä live propionibakteerien ja niiden aktiiviset metaboliitit se pitäisi tuoda ne kosketukseen mahalaukun limakalvon nieltynä. Tämä piimä tutkittiin suhteessa HGT-1 ihmisen mahalaukun syöpäsoluja apoptoosin. Todellakin, propionibakteerien tiedetään tappaa ihmisen paksusuolen syöpäsoluja, mutta niiden vaikutus mahalaukun syöpäsoluja ei tunneta. Fermentoitu maito tappoi HGT-1-soluja on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla. Tyypillisiä piirteitä apoptoosin prosessin havaittiin, kuten kannattavuus pudota, kromatiinin tiivistyminen, apoptoottisten elinten muodostumista, DNA: n pilkkoutuminen, ROS tuotanto, mitokondrion kalvon mahdollisia häiriön, kaspaasin aktivaatio, solusyklin pysähtymiseen ja syntyminen subG1 väestöstä.

tulokset

P. freudenreichii

piimä tappaa ihmisen mahalaukun ja paksusuolen syöpäsoluissa

P. freudenreichii

ITG P9 kasvoivat 72 tuntia 30 ° C: ssa täydennetty maito ja täydennetty maito ultrasuodatusta päästä lopulliseen väestöstä 9,43 log

10 pesäkkeenmuodostusyksiköissä (cfu) /ml ja 9,35 log

10 cfu /ml, vastaavasti. SCFA pitoisuudet olivat 26,21 mM asetaattia ja 54.47 mM propionaatti (2,08 propionaatti /asetaatti suhde) maito käymisteitse supernatantti kun se oli 24,00 mM ja 53,32 mM (2,22 suhde) on fermentoitu maitoon ultrasuodokseksi supernatantti. Nämä suhteet olivat odotettavissa propionibakteerien, jotka yleensä tuottavat kaksi kertaa enemmän propionaattia asetaatti [26]. Kaksitoista muut ruoka-luokan meijeri propionibakteerien kannat testattiin myös (katso taulukko S1 ja kuva S1). Käyttämällä näitä kantoja, kaksitoista piimät saatiin. Propionaatti pitoisuudet vaihtelivat 36-67 mM ja propionibakteerien väestön 9,0-9,7 log

10 pmy /ml, vähemmän ja tehokkaimman rasitusta, vastaavasti.

sytotoksinen potentiaali supernatanttien valmistettu maidosta tai maitoa ultrasuodokseksi, sekä käymisen

P. freudenreichii

ITG P9, tutkittiin. HT-29 ihmisen paksusuolen syövän solujen ja HGT-1 ihmisen mahasyövän soluja käsiteltiin näillä supernatanteista. Eri laimennoksena välillä ½ testattiin. Lisäksi sytotoksisuuden seosta 15 mM asetaattia ja 30 mM propionaatti testattiin pitoisuuksina, lähellä näiden ½ laimennettiin supernatanteista. Positiivisina kontrolleina apoptoosin induktio, kemoterapialääkkeet kamptotekiini (4 uM) ja etoposidi (100 uM) käytettiin HGT-1 ja HT-29-soluja, vastaavasti. Kolme selkeästi erilaista solukuoleman seurannan verrattiin. Kuten kuvassa S2, metyleenisininen, MTT ja trypaanisinieksluusiolla määritykset antoivat samankaltaisia ​​kinetiikka kuoleman. Näin ollen, metyleenisininen määritystä käytettiin tässä tutkimuksessa edelleen arvioida solujen elinkelpoisuus. Ei-käymisteitse maitotuotteet (maito tai maito ultrasuodokseksi) ei ollut vaikutusta, eikä HT-29, eikä myöskään HGT-1 solujen elinkykyä (Fig. 1 A, B). Supernatantti maidon tai maitotuotteiden ultrasuodokseksi käymisen

P. freudenreichii

indusoi samanlaisen sytotoksisuuden on ajasta riippuva tavalla HT-29 ja HGT-1-soluissa, ja lähellä sytotoksisuuteen lääkkeellisesti tai asetaatti /propionaatti seoksen. Puolet maksimaalisesta tappamista HGT-1-soluissa tapahtui kuluttua 24 h ja 26 h hoidon kanssa piimä ja piimä ultrasuodatusta supernatanttien vastaavasti kuluttua 17 h hoidon camptothecin ja 24 tunnin kuluttua hoidon SCFA seoksen (Kuva. S3) . Lisäksi sytotoksisuuden fermentoidun meijerituotteen supernatantteja HGT-1-solujen annoksesta riippuvainen (Fig. 1 C). Kunkin laimennus testataan, lasku HGT-1 solujen elävyyden aiheuttama piimä tai piimä ultrasuodokseksi oli hyvin samankaltainen (Fig. 1 C Fig. S3). Siksi seuraavat vaiheet Tutkimuksen suoritimme vain piimä ultrasuodokseksi supernatantti. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että propionihappobakteerien tehokkaasti tappaa ihmisen paksusuolen ja mahalaukun syövän solut, ainakin osittain kautta tuotannon propionaatti ja asetaatti (Fig. 1). Joitakin muita piimät, käymisen eri meijerituotteiden propionibakteerien kantoja, osoittivat samanlaisia ​​sytotoksisia vaikutuksia syöpäsolujen (taulukko S2).

P. freudenreichii

ITG P9 että tunnetaan sen aineenvaihdunta

in vivo

[22], vastaava piimä tutkittiin edelleen.

(A) vaikutus

P. freudenreichii

piimä HT-29 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja. HT-29-soluja käsiteltiin ½ laimennokseen DMEMc, supernatanttien saatu fermentoitu maito tai piimä ultrasuodatusta (neliöt). Negatiivisina kontrolleina solut käsiteltiin ½ laimennoksilla Käymättömän maitoa tai maitotuotteita ultrasuodatusta (timantit). Positiivisina kontrolleina (kolmiot), soluja käsiteltiin DMEMc sisältää seoksen asetaatin ja propionaatin (C2 /C3, 15/30 mM) tai etoposidi (100 uM). (B) vaikutus

P. freudenreichii

piimä on HGT-1 ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. HGT1 soluja käsiteltiin ½ laimennokseen DMEMc, supernatanttien saatu fermentoitu maito tai piimä ultrasuodatusta (neliöt). Negatiivisina kontrolleina solut käsiteltiin ½ laimennoksilla Käymättömän maitoa tai maitotuotteita ultrasuodatusta (timantit). Positiivisina kontrolleina (kolmiot), soluja käsiteltiin DMEMc sisältää seoksen asetaatin ja propionaatin (C2 /C3, 15/30 mM) tai kamptotesiinin (4 uM). (C) Annos-riippuvuus piimä solumyrkkyvaikutuksessa. HGT-1-soluja käsiteltiin eri supernatantin laimennokset maidosta saatua (tyhjä symbolit) tai maidon ultrasuodosta (plain symbolit) sekä käymisen

P. freudenreichii

. Solujen elinkelpoisuus määritettiin metyleenisinistä määrityksen jälkeen eri aikoina hoidon. Prosenttiosuus elinkelpoisuus laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: 100 x (optisen tiheyden arvot käsiteltyjen solujen /optisen tiheyden arvot ei-käsiteltyjen solujen). Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta kokeesta.

P. freudenreichii

fermentoitua maitoa indusoi tyypillisiä merkkejä apoptoosin ihmisen mahasyövän solujen

Nucleus morfologia HGT-1-soluja inkuboitiin, kun läsnä on

P. freudenreichii

piimä ultrasuodokseksi analysoitiin fluoresenssimikroskopialla jälkeen Hoechst 33342 värjäyksen (kuvio. 2A). Ydin- fluoresenssi käsittelemättömien solujen (verrokki) määrä pysyi ennallaan aikana kokeen sininen normaali ytimet (aika 0 h, Fig. 2 aa). Hoidon aikana, HGT-1-solut näytetään lyhennetyn kromatiinin ja hajanaista ytimet ominaisuudet apoptoottisten tumien (Fig. 2AB, c), jota seurasi ulkonäkö apoptoottisten kappaleiden 72 h (Fig. 2AD). Inter-nukleosomaalisia DNA pirstoutuminen seurauksena DNA: n pilkkoutuminen, tyypillinen merkki apoptoosin [27], myös seurataan piimä ultrasuodokseksi hoitoa. DNA: n fragmentoituminen havaittiin 24 h hoidon fermentoitua maitoa ultrasuodoksen (Fig. 2B), ja vähemmässä määrin kamptotekiinin (Fig. S3). DNA: n määrä kvantitoitiin myös virtaussytometrialla jälkeen propidiumjodidileimauksella tutkia vaikutuksia piimä ultrasuodoksen HGT-1 solukierron jakelu (Fig. 2C). Käsittelemättömän HGT-1-soluissa esitetään solusykliä jakelu (Fig. 2Ca) ilman subG1 vaihe, joka pysyi muuttumattomana aikana kokeen (tietoa ei ole esitetty). Prosenttiosuus solujen subG1 vaiheessa, joka on osoitus apoptoottisen prosessin, huomattavasti ajan myötä fermentoidun maidon ultrasuodos hoitoon (Fig. 2C-B, Cc, Cd): 24 h (39,24 ± 4,87%), 48 h (91,63 ± 0,28 %) ja 72 h (94,79 ± 0,45%). 48 h ja 72 h hoidon jälkeen kaikki solut olivat subG1 solusyklin vaihe, joka osoittaa täydellistä kuoleman HGT-1-soluissa. Kontrollina, kamptotesiini indusoi samanlaiset apoptoottiset tunnusmerkkejä in HGT-1-soluissa (kuvio. S4).

(A) Käynyt maito ultrasuodatusta aiheuttama ydin- tiivistyminen. Soluja viljeltiin (0 h) tai käsitelty 24, 48 tai 72 h ja ½ laimennus

P. freudenreichii

piimä ultrasuodatusta (UF) supernatantti. Sitten solut värjättiin Hoechst 33342 ennen fluoresenssimikroskopialla. Nuolet osoittavat kromatiinin tiivistymistä (b), ydin- pirstoutuminen (c) ja muodostuminen apoptoottisten elinten (d). (B) Maitovalmisteet ultrasuodokseksi aiheuttama DNA pirstoutuminen HGT-1-soluissa. Genominen DNA uutettiin ja analysoitiin 1% agaroosigeelillä. HGT-1-soluja käsiteltiin kuten kohdassa (A). (C) Maitovalmisteet ultrasuodokseksi aiheuttamiin muutoksiin solusyklin vaiheessa jakeluun. DNA-pitoisuus HGT-1-soluissa analysoitiin virtaussytometrialla jälkeen propidiumjodidivärjäys. Edustavia histogrammit vastaavat DNA sisällön analyysiin HGT-1-soluissa esitetään. Prosenttiosuus solupopulaation sub-G1 DNA-pitoisuus, joka osoittaa apoptoosin on osoitettu. Osa kunkin solun osajoukot (sub-G1, G0 /G1, S, G2 /M), sisällä koko solupopulaatio, on esitetty kunkin hoidon aikana. Tulokset ovat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen ± sd. *

P

0,05, **

P

0,01, käsitellyt solut versus kontrolli (0 h). Jakelu solusyklivaiheista käsittelemättömien solujen (verrokki) pysyi muuttumattomana koko kokeen ajan.

Vahvista apoptoosin, phosphatdylserine translokaation sisemmästä ulompaan seloste solukalvon arvioitiin värjäämällä HGT-1-soluissa yhdistelmä anneksiini V-FITC: tä (AV) ja 7-AAD, jota seurasi virtaussytometria fluoresenssin analyysi (Fig. 3). Käsittelemättömät solut (0 h) esitetään osuus on suuri elävien solujen (AV

– /7AAD

-; 92%) ja vain 5% solut värjättiin anneksiini V (Fig. 3B). Nämä prosenttiosuudet määritetään käsittelemättömissä soluissa ei muuttunut sinä aikana kokeen (tietoa ei ole esitetty). Hoidon aikana HGT-1-solujen ½ laimennettu piimä ultrasuodokseksi vuonna DMEMc prosenttiosuus värjättyjen solujen vain 7-AAD (osoittaa kuolio) oli hyvin alhainen (Fig. 3B). Kuitenkin prosenttiosuudet solut värjättiin anneksiini V lisääntynyt merkittävästi aikaa riippuvaisella tavalla ja saavutti 80% 72 h (Fig. 3B). Siten HGT-1-soluissa tehtiin apoptoosia käsittelyn jälkeen

P. freudenreichii

piimä ultrasuodokseksi, tunnettu ensimmäinen AV positiivista värjäytymistä, mikä osoittaa, fosfatidyyliseriini valotus, ja sitten molemmat AV ja 7-AAD positiivista värjäytymistä, mikä osoittaa myöhemmässä menetystä kalvon eheyden. Kontrollina, kamptotesiini indusoi samanlaiset apoptoottiset tunnusmerkkejä (Fig. S5).

Virtaussytometria kineettinen analyysi solukuoleman HGT-1-soluja käsiteltiin

P. freudenreichii

piimä ultrasuodokseksi. (A) Edustava koe anneksiini V /7-AAD värjäys HGT-1-soluja kulloinkin hoidon on esitetty, mittasuhteet anneksiini V-positiivisten solujen (AV +; apoptoottisia soluja). (B) kvantitatiivinen FACS anneksiini V-FITC (AV) sitoutuminen HGT-1-soluissa suoritettiin jälkeen counterstaining 7-aminoactinomycin-D (7AAD). Esitetty arvot vastaavat osuus kunkin solualaryhmiä, sisällä koko solupopulaatio, kunkin hoitoaika. Tulokset ovat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen ± sd. *

P

0,05, **

P

0,01, käsitellyt solut versus kontrolli (0 h).

Kuten SCFA teko suoraan mitokondrioissa kolme tärkeää mitokondrioiden muuttujat määritettiin myös: Tällä ΔΨm sisäkalvon potentiaalia, ja sukupolvi ROS, käyttäen kahta fluoresoivaa antureista, DiOC (6) 3 (joka on ΔΨm-herkkä) ja DHE (joka havaitsee O

2

– taso), ja niiden sijaintia sytokromi c. Käsittelemättömät solut (0 h) osoitti korkeaa fluoresenssi (korkea ΔΨm) ja alhainen DHE fluoresenssi (alhainen tuotanto O

2

-) (Fig. 4A, B). Käsittelyn jälkeen fermentoitu maito ultrasuodatusta, ajasta riippuva väheneminen sisällyttäminen DiOC6 (3) fluoresoivasta koettimesta, joka havaittiin, paljastaen menetys ΔΨm ja siten mitokondrion kalvon depolarisaation (Fig. 4A). Prosenttiosuudet käsiteltiin HGT-1-solujen vähentynyt sisäkalvon potentiaali nousi ajasta riippuvalla tavalla saavuttaa 96% soluista 72 tuntia. FCCP hoito käytettiin positiivisena kontrollina Mitokondrioiden kalvon Depolarisaatio. Tämä menetys ΔΨm vahvistettiin ominaisuus menetys punaisen fluoresenssin seuraavat JC-1-värjäys (Fig. 4B). Mitä ROS tuotanto HGT-1-soluissa, piimä ultrasuodokseksi indusoi kerääntymistä O

2

-, merkittävästi 48 tunnin kuluttua ja 72 tunnin hoidon (Fig. 4C). Tämä ROS kertymistä voidaan osittain estää, jos solut on esikäsitelty, että ROS puhdistusainetta TEMPOL (Fig. S6). Sytokromi c vapautumista mitokondrioita solulimassa on keskeinen solun tapauksessa apoptoottisen ohjelman. Immunoblottauksella tutkiminen sytoplasmassa fraktiolla läsnäolo sytokromi c vahvisti muutoksesta solunosasijaintia (Fig. 4D). Sytokromi c havaittiin sytoplasmassa rikastettu fraktio 24 h hoidon, joka osoittaa siirtäminen tämän proteiinin (Fig. 4D). Tämä relocalization sytokromi c sytoplasmassa vahvistettiin Immuunivärjäystä osoittaa diffuusi immunovärjäykseen koko solun käsittelyn jälkeen, kun taas välimerkein värjäytymistä ennen käsittelyä (kuva. 4E).

kineettinen analyysi mitokondrioiden tapahtumien HGT-1-solujen käsiteltyjen jossa

P. freudenreichii

piimä ultrasuodatusta (A) Virtaussytometria kineettinen analyysi mitokondrion sisäkalvon (ΔΨm) hajoamista kanssa DiOC (6) 3 värjäystä. Päällekkäin otetaan edustava koe esitetään. Irrottaminen FCCP (50 uM, 20 minuuttia) käytettiin positiivisena kontrollina. Määrällinen analyysejä ΔΨm menetys 3 itsenäisestä kokeesta on esitetty. Arvot esitetään suhteessa soluihin, joilla on alhainen ΔΨm, sisällä koko solupopulaatio, kullekin käsittelylle. Tulokset ovat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen ± sd. *

P

0,05, **

P

0,01, käsiteltiin versus kontrolli (0 h). (B) HGT-1 solut värjättiin JC-1. Menetys mitokondrion kalvon potentiaalia on osoitettu asteittain menetys punainen JC-1-aggregaatin fluoresenssi ja sytoplasmista leviämistä vihreän monomeerin fluoresenssin (C) Virtaussytometria kineettinen analyysi anionin superoksidi (O

2

-) kertyminen kanssa DHE värjäys. Overlay on edustava koe ROS havaitseminen kulloinkin hoidon on esitetty. Solut värjättiin dihydroethidium ja analysoitiin virtaussytometrialla. Prooxidant menadioni (Men., 100 uM, 15 minuuttia) käytettiin positiivisena kontrollina. Arvot esitetään suhteessa solujen lisääntynyt ROS (lisäys fluoresenssin intensiteetti), sisällä koko solupopulaatio, kullekin käsittelylle. Tulokset ovat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen ± sd. *

P

0,05, **

P

0,01, käsiteltiin versus kontrolli (0 h). (D) Sytokromi c siirtäminen koko hoitojakson ajan,

P. freudenreichii

piimä ultrasuodokseksi supernatantti ½ arvioitiin western blot-analyysi. Seuraavat solujen käsittely, sytoplasmaan-rikastuttaa fraktiot analysoitiin western-blottauksella ja paljastettiin käyttäen anti-sytokromi c: vasta-aine. Vastaan ​​suunnattuja vasta-HSC-70 käytettiin latauskontrollina. (E) solunosasijaintia sytokromi c. Solut immunovärjättiin anti-sytokromi c-vasta sen jälkeen MitoTracker värjäys ja ennen DNA värjäystä käyttäen TO-PRO 3. Nuoli osoittaa diffuusio sytokromi c sytoplasmassa.

P. freudenreichii

piimä aktivoi caspases

Vahvista apoptoottinen mekanismien aiheuttama piimä ultrasuodokseksi in HGT-1-soluissa, käsittelyä kaspaasien 3, 8 ja 9 analysoitiin western-blottauksella ja vastaavien entsyymiaktiivisuuksien seurannan HGT -1 solu-uutteita (Fig. 5). Ei-piimä ultrasuodatusta ei aiheuttanut kaspaasin aktivaatio in HGT-1 solut: vain proforms kaspaasin 3 ja -9 havaittiin Western blot (kuvio. 5A) eikä kaspaasiaktiivisuus mitattiin (kuvio. 5B). Fermentoitu maito ultrasuodos supernatantti, samoin kuin kamptotesiinin tai seos propionaatti ja asetaatiksi [2: 1] moolisuhteessa, indusoi lohkaisu pro-kaspaasi 3 ja sukupolven aktiivisten muotojen kaspaasi-3-alayksiköt p17 ja p12 (Fig. 5A). Aktivointi kaspaasi-3, joka on efektori kaspaasi, vahvisti apoptoosin. Lisäksi, piimä ultrasuodosta indusoi pilkkominen prokaspaasi-9, joka johtaa 35 ja 37 kDa: n prosessoidut muodot. Kaspaasi 8 ei havaittu kontrolli käsittelemättömän HGT-1-soluja. Kuitenkin hoito propionibacterial supernatanttien tai C2 /C3 seos johti selvään havaitseminen 54 kDa promuotoon, jonka jälkeen sen pilkkominen kuluttua 48 h hoidon.

Jalostus efektori kaspaasi 3 ja initiaattori caspases 8 ja 9 oli seurasi western blottaus ja erityisten entsymaattisten toimintojen seuranta HGT-1-soluissa. (EN) proforms ja katkaistiin alayksiköiden kaspaasi 3, 8, ja 9 havaittiin Western blot lysaateissa HGT-1-soluja käsiteltiin

P. freudenreichii

piimä ultrasuodokseksi supernatantti ½. Ei-fermentoitua maitoa ultrasuodatusta (UF ½, 48 h), seos asetaatin ja propionaatin (C2 /C3, 15/30 mM, 48 h) ja kamptotekiini (4 uM, 48 h), käytettiin kontrolleina. Vastaan ​​suunnattuja vasta-HSC-70 käytettiin latauskontrollina. (B) kaspaasien erityisiä toimia lysaatit soluista, käsiteltiin kuten edellä tutkittiin käyttäen osoitettujen peptidien ja laskettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta kokeesta ± SD. *

P

0,05, **

P

0,01, käsiteltiin versus kontrolli (0 h).

kvantifiointi kaspaasin 3, -8 ja -9 entsyymiaktiivisuuksien vahvistanut kaspaasin aktivaatio sekä propionibacterial aineenvaihduntatuotteiden ja camptothecin. Todellakin, kaspaaseiksi-9 ja -3 aktivoituivat varhaisessa vaiheessa hoidon, kun taas kaspaasin 8 näytti aktivoidaan myöhemmin (kuvio. 5B). Camptothecin ja SCFA seos aktivoituu kaikissa kolmessa tutkittu caspases. Nämä tiedot vahvistivat aktivointi sisäisen reaktiotien apoptoosin fermentoitua maitoa ultrasuodatusta hoitoa, ja varhainen kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 ja -8.

P. freudenreichii

fermentoitua maitoa lisää kamptotesiini sytotoksisuuden

Campthotecin on sytotoksinen kinoliini alkaloidi, joka inhiboi DNA-entsyymin topoisomeraasi I (topo I) ja on laajalti käytetty kemoterapeuttisen hoidon GC. Olemme yllä että propionibacterial aineenvaihduntatuotteiden indusoivat apoptoosin HGT-1-solujen kautta mitokondrioiden kuoleman kautta. Me seuraavaksi tutkitaan apoptoosia indusoitiin molempia kamptotesiinin ja piimä ultrasuodatusta in HGT-1-soluissa. Kohonneet pitoisuudet kamptotesiinin (0, 0,25, 0,5, 1, 2 uM) yhdessä kohonneet pitoisuudet fermentoitua maitoa ultrasuodoksen (0,, ⅛, ¼) testattiin HGT-1 solujen elinkykyä ja molemmat indusoi menetys HGT-1 elinkelpoisuus , annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 6). Lisäksi lisäämällä piimä ultrasuodoksesta parannettu merkittävästi sytotoksisuutta kamptotesiiniä HGT-1-solut (Fig. 6). Esimerkiksi, 0,25 uM kamptotesiini ja piimä ultrasuodatusta laimennettiin pakk johti elinkelpoisuuden menetys 8,6% ja 18,6%, vastaavasti. Näiden kahden yhdisteen johti solujen elinkelpoisuuden menetys 29,8% (Fig. 6), mikä viittaa siihen lisättiin sytotoksisuutta vaikutus, kun kamptotesiinin yhdistettiin piimä ultrasuodatusta in HGT-1-soluissa. Näin ollen, yhdistelmä-indeksi (CI), laskettu aiemmin [28], on arvo 1, mikä osoittaa additiivista vaikutusta kamptotesiinin ja piimä ultrasuodatusta hoitoja.

elinkelpoisuus HGT-1 ihmisen mahasyövän aikana hoidettujen 24 h arvioitiin metyleenisineä määrityksessä. HGT-1-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla kamptotesiinin (0-2 uM) kanssa eri laimennoksilla

P. freudenreichii

piimä ultrasuodatusta (UF) supernatantti. Prosenttiosuus elinkelpoisuus laskettiin seuraavasta kaavasta: 100 x (optisen tiheyden arvot käsiteltyjen solujen /optisen tiheyden arvot ei-käsiteltyjen solujen). Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta kokeesta ± SD. *

P

0,05, **

P

0,01, käsitellyissä soluissa verrattuna kontrolleihin (sama kamptotesiini pitoisuus ilman piimä ultrasuodatusta supernatantti ja sama piimä ultrasuodokseksi supernatantti laimennus ilman kamptotekiini).

keskustelu

uusi piimä, joka sisältää

P. freudenreichii

ainoana bakteeri, kehitettiin jotta edelleen tutkia probioottisten mahdollisuuksia tämän maitotuotteiden valmistuksessa propionibakteerien (tarkistetaan [29]). Tässä tutkimuksessa me raportoimme että vesifaasi tämän piimä tappaa ihmisen paksusuolen ja mahalaukun syövän solujen kautta aineenvaihduntatuotteita, kuten propionaatti ja asetaatti, vapauttaa tämän bakteerin. Tämä käsite perustuu havaittuun sytotoksisia vaikutuksia

P. freudenreichii

piimä supernatantit viljellyillä HT-29 ja HGT-1 syöpäsoluja. Tämä vaikutus saatiin ultrasentrifugoimalla supernatanteilla, eli fermentoitu maito vesifaasi, vailla kaseiinien ja bakteerit, jotka osoittavat, että aktiiviset yhdisteet erittyvät, kuten aikaisemmin on kuvattu propionihappobakteerien [19]. Tästä syystä useimmat kokeet tässä työssä suoritettiin fermentoitua maitoa ultrasuodoksen (Fig. 1). Osoitimme ensimmäistä kertaa, että

P. freudenreichii

piimä supernatantin aiheuttaman apoptoosin HGT-1 solujen ajasta ja annoksesta riippuvaisella tavalla ulkonäkö klassisen morfologiset ja biokemialliset piirteet apoptoosin (tiivistettyä ja hajanainen chromation, DNA-tikapuiden ja kerääntyminen solujen subG1 solusyklin vaihe).

Katsoimme sitten jos solun mekanismeja HGT-1 solukuolemareittiin olivat samanlaisia ​​mitokondrion kuoleman reitin laukaista Caco-2- ja HT-29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa

P. freudenreichii

DMEMc viljelmäsupernatanteista [19], [20]. Sub-solu- ja biokemiallisten tapahtumien havaittiin käsitellyn HGT-1-solujen piimä ultrasuodatusta olivat samankaltaisia ​​ja sisälsivät ainakin mitokondrioiden ΔΨm menetys, ROS (O

2

-) sukupolvi, kaspaaseiksi käsittely ja aktivointi, sytokromi c siirtäminen sytoplasmaan (Fig. 3, 4, 5). Käynyt maito supernatantti aiheuttama käsittely ja kaspaasi-8, lisäksi caspases -3 ja -9.