Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sisplatiini (

cis

-diamminedichloroplatinum, CDDP) on tunnettu kemoterapeuttista ainetta varten hoitoon useita syöpiä. Kuitenkin tarkkaa mekanismia taustalla apoptoosin syöpäsoluissa aiheuttama CDDP jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa osoitamme mekaanisesti että CDDP indusoi GM3-välitteisen apoptoosin HCT116-solujen estämällä solujen lisääntymistä, ja lisäämällä DNA: n fragmentoituminen ja mitokondrioiden riippuvaisen apoptoosin signaaleja. CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia soluissa kautta reaktiivisten hapen lajien (ROS), säädellään ROS-välitteisen ilmentymisen Bax, Bcl-2 ja p53, ja indusoitiin hajoaminen poly (ADP-ribosyyli) polymeraasi (PARP). Meillä on myös tarkastettava ekspressiotasoja eri gangliosidit HCT116-solujen läsnä tai poissa CDDP. Mielenkiintoista, joukossa gangliosidit, CDDP täydennetty ilmaus vain GM3 aktiiviseen kohtaan ja tuote GM3. Vähentäminen GM3 syntaasin tasolla ektooppinen ilmaus GM3 Sirna (siRNA) pelastettu HCT116 soluja CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia. Tämän osoituksena olivat estämällä apoptoottisia signaaleja vähentämällä ROS tuotantoa säätelyn 12-lipoxigenase aktiivisuutta. Lisäksi apoptoottisten herkkyys CDDP on huomattavasti lisääntynyt GM3-syntaasi-transfektoitujen HCT116-soluja verrattuna kontrolleissa. Lisäksi GM3 syntaasi-transfektoituja soluja käsiteltiin CDDP näytteillä lisääntynyt kertyminen solunsisäisten ROS. Nämä tulokset viittaavat siihen, CDDP: n aiheuttamaa oksidatiivista apoptoosia HCT116-solujen välittämää GM3.

Citation: Chung T-W, Choi H-J, Kim S-J, Kwak C-H, Song K-H, Jin U-H, et al. (2014) gangliosidin GM3 liittyy Cisplatin-indusoitu apoptoosi ihmisen koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 9 (5): e92786. doi: 10,1371 /journal.pone.0092786

Editor: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. heinäkuuta 2013. Hyväksytty: 25 helmikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 14, 2014

Copyright: © 2014 Chung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä Tutkimus on tukenut Basic Science -tutkimusohjelma kautta National Research Foundation of Korea (NRF) se rahoitettiin opetus-, Science and Technology (MEST) Korean (NRF-2013R1A1A2005387) ja Henkilökohtainen kasvain Engineering Research Center apurahan (2008- 0062611). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sisplatiini (

cis

-diamminedichloroplatinum, CDDP) on yleisesti käytetty kemoterapeuttinen aine hoidettaessa useita kiinteitä kasvaimia. CDDP sitoutuu DNA: han tuottamaan DNA addukteja [1]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CDDP säätelee aktiivisuus tiettyjen ionikanavia, kuljetus- proteiinien ja erilaisten solukalvon entsyymit [2], [3], ja indusoi reaktiivisen hapen (ROS) syöpähoidon [4]. Niinpä CDDP säätelee DNA korjaus, transkriptio esto, solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin [5]. On raportoitu, että ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasien (ERK), c-Jun N-terminaalinen kinaasien (JNK: t) /stressi-aktivoidun proteiinikinaasin (SAPK) ja p38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) aktivoituvat CDDP indusoimaan apoptoosin syöpäsoluissa [6], [7]. Lisäksi CDDP indusoi Fas /FasL-välitteistä apoptoosia ihmisen epiteelisoluissa [8] ja mitokondriovaurioita säätelemällä ekspressiotasot Bcl-2-perheen, joilla on joko pro- tai anti-apoptoottisten toimintoja. Vaikuttamalla CDDP sytotoksisuuden syöpäsoluissa, p53-välitteisen transaktivaation pro-apoptoottisen Bax, vähentynyt Bcl-2: n ilmentymisen ja lohkaisu Bid johtaa vähenemiseen mitokondrion potentiaalin ja lisää kaspaasivälitteinen PARP hajoamisen kautta vapauttamaan sytokromi c: mitokondrioista [9] – [12]. Useissa tutkimuksissa on raportoitu, että nämä apoptoottisen ilmiöt johtuvat muuttaminen kalvokoostumusta [13]. Niistä kalvon komponentit, on raportoitu, että ekspressiotasot gangliosidit muuttunut lääkkeellä käsiteltyihin syöpäsoluja [14].

klusterit siaalihappoa sisältävien glykosfingolipidit (GSLs) ovat läsnä kalvon microdomain kaikilla nisäkässolut ja kietoutuvat monenlaisia ​​biologisia toimintoja, kuten solu-solu-vuorovaikutuksia ja signaalitransduktion [15]. Useissa tutkimuksissa on todettu, että erityiset gangliosidit, kuten GM3, GD3 ja GD1b indusoida apoptoosia eri soluihin [16], [17]. GM3 hoito epäkypsiä lisääntyvän glial ja hermosolujen johtaa solujen proliferaatio ja apoptoosin induktion [18], [19]. Lisäksi, GM3 on mukana solukuoleman kautta kertyminen ROS ja solunsisäisen kalsiumionin virtaa suoraan hermosolujen [20], [21]. Hiiren virtsarakon syöpäsoluja, GM3 yliekspressio indusoi apoptoosia ja vähentää pahanlaatuisten mahdollisia [22]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet toiminnallinen merkitys gangliosidin GM3 in CDDP-käsiteltyjen peräsuolen syövän soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

Ihmisen paksusuolen syöpä solulinja HCT116 viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; JBI, Daegu, Korea), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Sisplatiini ostettiin Dong-farmaseuttinen CO., LTD (Seoul, Korea).

N

asetyyli

L-kysteiini (NAC) saatiin Molecular Probes ™ (Invitogen, CA). Baicalein oli Sigma-Aldrich. Vasta-aineet saatiin seuraavasti: Anti-poly (ADP-ribosyyli) polymeraasi (PARP), BCL-2, Bax ja p53 saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-glyseraldehydi-3-phosphode-hydrogenase (GAPDH) hankittiin Chemiconilta (Temecula, LA). Anti-GM3 (M2590) hankittiin Biotest Laboratories (Japani).

Käänteinen transkriptio-polymeraasi ketjureaktio (RT-PCR) B

Kokonais-RNA kustakin solusta eristettiin käyttäen Trizol-reagenssia ( Invitrogen). Yksi mikrogramma RNA: ta suoritettiin käänteistranskriptio oligo-dT-alukkeita käyttäen AccuPower RT-esiseos (Bioneer Co, Daejon, Korea), mukaisesti valmistajan protokollaa. CDNA monistettiin PCR: llä seuraavilla alukkeilla käyttämällä EF-Taq-polymeraasia (SolGent, Seoul, Korea): GM3-syntaasi (413 bp), 5′-CCCTGCCATTCTGGGTACGAC-3 ’(sense) ja 5′-CACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3′ (antisense ); GD3-syntaasi (460 bp), 5’-TGTGGTCCAGAAAGACATTTGTGGA-3 ’(sense) ja 5′-TGGAGTGAGGTATCTTCACATGGGT-3′ (antisense) GalNAc-T (GM2 /GD2-syntaasi) (230 bp), 5’-CCAACTCAACAGGCAACTAC-3 ’( sense) ja 5’-GATCATAACGGAGGAAGGTC-3 ’(antisense); β-aktiinin (247 bp), 5’-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 ’(sense) ja 5′-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3’ (antisense). Käyttö on yhtä suuret määrät mRNA: n RT-PCR-määritys varmistettiin analysoimalla ekspressiotasot β-aktiini. PCR-tuotteet erotettiin geelielektroforeesilla 1,5% agaroosia, joka sisälsi etidiumbromidia 0,5 x Tris-asetaatti-EDTA (TAE) -puskuria.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen proliferaatio tutkittiin käyttäen kaupallisesti saatavilla leviämisen kit II (XTT, Boehringer Mannheim, Mannheim, Saksa). Lyhyesti, soluja osa-viljeltiin 96-kuoppaisilla viljelylevyillä tiheydellä 103 solua /kuoppa 100 ul: aan DMEM /10% FBS: ää. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen elatusaine poistetaan ja korvataan 100 ul: lla tuoretta elatusainetta, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia CDDP. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO 2: ssa 12 h. Lopussa Inkubaation 50 ui XTT koeliuosta valmistettiin sekoittamalla 5 ml XTT-leimausreagenssia ja 100 ui elektroni-kytkentäainetta, joka lisättiin kuhunkin kuoppaan. 4 tunnin kuluttua inkuboinnin 37 ° C: ssa ja 5% CO 2 olosuhteissa, absorbanssi mitattiin käyttämällä ELISA-lukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), jonka testi aallonpituudella 490 nm.

virtaussytometrinen arviointi solunsisäinen redoksitilassa

ROS tuotanto arvioitiin värjäämällä solut dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (H

2DCFDA, Molecular Probes, Carlsbad, CA). Solut pestiin kahdesti DMEM: llä, joka sisälsi 10% FBS: ää, inkuboitiin 10 uM H

2DCFDA laimennettiin DMEM 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa, pestiin PBS: llä, ja trypsiinillä. Dissosioituneet solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, suspendoitiin uudelleen PBS: ään, ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä FACS Calibur (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

Western blot-analyysi

Solut homogenoitiin puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,02% NaN

3, 100 ug /ml fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 1 ug /ml aprotiniinia, ja 1% Triton X- 100. Proteiinikonsentraatiot mitattiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä (Bio-Rad, Richmond, CA). Kolmekymmentä mikrogrammaa kokonais-solu- lysaatti fraktioitiin koon natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille käyttäen Hoefer Sähkösiirtomenetelmiä (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Havaitsemiseksi kohdeproteiinit, me inkuboitiin kalvojen kanssa vastaavia vasta-aineita. Detektio suoritettiin käyttäen johdetun piparjuuriperoksidaasi-kytkettyä anti-hiiri-anti-kani-vasta-aineita (Santa Cruz), ja ECL chemiluminescence (Amersham Biosciences).

yli-ilmentyminen gangliosidin GM3-syntaasin ja sen tuotteen HCT116-soluissa

rakentamiseksi GM3-syntaasi-ekspressioplasmidin, 1,1 kb: n DNA-fragmentti, mukaan lukien ihmisen GM3-syntaasia koodaava alue monistettiin PCR: llä käyttäen aluketta oligonukleotideja 5′-CTAAGCTTATGAGAAGGCCCAGCTTGTTATTAAAAGACATC-3 ’(sense), 5’-ATGAATTCGTTCAAAATTCACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3 ’(antisense) ja ihmisen sikiön aivojen cDNA: ta templaattina. Sense- ja antisense-alukkeet sisältävät

Hind

III ja

Eco

RI restriktiokohdat (alleviivattu), tässä järjestyksessä. Fragmentti puhdistettiin 1% agaroosigeelillä käyttäen Wizard SV Gel ja PCR Clean-Up System (Promega) ja pilkottiin sopivalla restriktioentsyymillä, ja ligoitiin käyttäen T4-ligaasia (Takara Bio Inc., Shiga, Japani) pcDNA3 vektori, tuottaa pcDNA-GM3. Tunnistaa konstrukti GM3 syntaasigeeniä, rajoitus kartoitus ja DNA: n sekvensointi suoritettiin. HCT116-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 10

5 solua /kuoppa ja kasvatettiin yön yli. Solut transfektoitiin 1 ug: pcDNA ja pcDNA-GM3 plasmidiin WelFect-EX ™ PLUS menetelmä (JBI). Inkuboinnin jälkeen transfektoituja soluja viljeltiin kun läsnä oli 500 ug /ml G418: aa (Life Technologies, Inc.). Sen jälkeen, kun 21 päivää selektiivisessä väliaineessa, yksittäiset G418-resistentit pesäkkeet eristettiin. Kolme positiivista kloonia, jotka ilmentävät GM3 syntaasia korkea, määritettynä RT-PCR: llä, käytettiin lisäanalyysiä.

lusiferaasianalyysissä

Reporter plasmidit, pGL3-1600 valmistettiin insertoimalla

Sac

I /

Bgl

II fragmenttien kunkin plasmideista aiemmin luotuja [23] vastaaviin kohtiin promoottorin vähemmän lusiferaasi pGL3-Basic (Promega). Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 10

5 solua /kuoppa ja kasvatettiin yön yli. Solut ko-transfektoitiin 0,5 pmol GM3 nisyntaasipromoottori-lusiferaasireportteri- konstruktioita ja 0,5 ug β-galaktosidaasin plasmidi WelFect-EX ™ PLUS menetelmä (JBI). Soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja inkuboitiin CDDP: ssa 12 h. Lusiferaasiaktiivisuus ja β-galaktosidaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen lusiferaasi ja β-galaktosidaasi-entsyymin määritystä (Promega). Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin β-galaktosidaasin aktiivisuus solulysaatista ja keskiarvo laskettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Immunofluoresenssimikroskopia

HCT116 paksusuolen syövän soluja ympättiin sub-konfluentteja tiheys 12 mm- halkaisijan steriili peitelaseille kuuden kennon kudosviljelylevyille. Solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä /PBS: ään ja pestiin kolme kertaa PBS: llä ja sitten läpäiseviksi 0,5% Tween-20 /PBS: llä 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Ei-spesifiset sivustoja blokattiin sitten PBS: llä, joka sisälsi 1% naudan seerumin albumiinia 30 minuuttia huoneenlämpötilassa kevyellä heilutuksella. Sen jälkeen liuos, joka sisälsi GM3 (M2590), GD3 tai GM2-spesifisten vasta-aineiden tulvi yli soluja 4 ° C: ssa yön yli. PBS-pesun jälkeen, soluja inkuboitiin edelleen FITC-konjugoidulla anti-hiiri-IgM: ssa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jota seurasi pesu PBS: llä, ja lopuksi asennetaan anti-fade-reagenssia (Molecular Probes), joka sisältää 4 ’, 6-iamidino- 2-fenyyli (DAPI). Objektilasit analysoitiin käyttämällä Nikon fluoresenssimikroskopiaa (Nikon, Japani). Esiabsorboidut sekundääristä vasta-ainetta yksin oli myös negatiivisena kontrollina kokeessa.

DNA: n fragmentoituminen määrityksessä

viljellyt solut kerättiin, pestiin PBS: llä, lyysattiin puskurissa (10 mM Tris HCl: lla (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100), ja inkuboitiin jäillä 10 min. Näytteet sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja supernatantit inkuboitiin 200 ug /ml RNaasi A: ta 37 ° C: ssa 1 h. Sen jälkeen näytteitä inkuboitiin 200 ug /ml proteaasi-K 50 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Saostamalla isopropanolilla, DNA suspendoitiin uudelleen Tris-EDTA-liuosta. Näytteet erotettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelissä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä ja UV-läpivalaisulla.

virtaussytometrinen analyysi apoptoottisten solujen

tunnistamiseksi apoptoottisia soluja, pcDNA- tai pcDNA-GM3 -transfectaed HCT116-soluja käsiteltiin CDDP: ssa 24 tuntia. Näytteet pestiin PBS: llä, värjättiin 1 ug /ml FITC-anneksiini V (BD Pharmingen, San Diego, CA) 10 minuutin ajan pimeässä huoneenlämmössä ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä FACS Calibur väline (Becton-Dickinson ).

HPTLC-analyysi gangliosidien

gangliosidit ihmisen paksusuolen syövän soluja käsiteltiin kanssa tai ilman CDDP: n (1,5 x 10

7-solut), uutettiin kloroformi: metanoli: vesi (2: 1:0.4, v /v /v), ja fraktioitiin ja analysoitiin HPTLC käyttäen Silica Gel 60-levyillä (Merck). Levyt kehitettiin kloroformi: metanoli: 0,2% vesipitoinen CaCl

2 (55:45:10, v /v /v). Gangliosidit visualisoitiin suihkuttamalla levy resorsinoli hydrokloridi reagenssin.

valmistus ja transfektion pieniä häiriöitä RNA: iden (siRNA: t) B

siRNA duplex suunniteltu kohdistamaan koodaava sekvenssi ihmisen GM3 syntaasin mRNA: ta ja kasvien klorofylli a /b sitovan proteiinin mRNA: ta negatiivisena kontrollina syntetisoitiin Bioneer Corporation. Kohdesekvenssejä varten GM3-syntaasia siRNA: t ovat 5′-GUAUGUAACGAUGUUGUAU-3 ’, 5′-CAUCAAAGAGACUGCCUUU-3′, ja 5’-CAGGUAUAGCGUGGACUUA-3 ’. HCT116 paksusuolen syövän soluja transfektoitiin GM3-syntaasin siRNA: t ja negatiivinen kontrolli siRNA vastaavasti, käyttämällä WelFect-EX ™ PLUS (JBI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksi päivä transfektion jälkeen transfektion kompleksit poistettiin ja korvattiin elatusaineella. Sen jälkeen inkuboimalla CDDP elatusaineeseen 24 tuntia, transfektoidut solut käytettiin lisäanalyysiä.

Tulokset

CDDP indusoi apoptoosia kertyminen ROS

määrittämiseksi kyky CDDP apoptoosin indusoimiseksi HCT116-soluja, soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla CDDP: ssa 24 tuntia ja DNA eristettiin CDDP-käsiteltyjen HCT116-solut erotettiin elektroforeesilla. Kuten on esitetty kuviossa. 1, CDDP aiheuttama DNA: n fragmentoituminen. Tutkimme myös vaikutus CDDP on mitokondrioiden-riippuvaista apoptoosia signaalit ja p53: n aikana CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia. Hoito HCT116-solujen CDDP kasvattanut p53 ja Bax ilmaisun sekä vähentäminen Bcl-2: n ilmentymisen. Lisäksi CDDP: n hoidon lisännyt pilkkominen PARP, mikä osoittaa, kaspaasin aktivaatio vapauttaa sytokromi c vähentämällä mitokondrion kalvon potentiaali (Fig. 1 B). Koska sukupolven ROS on raportoitu olevan tärkeä rooli CDDP: n aiheuttamaa sytotoksisuutta [24], vaikutus CDDP hoidon solunsisäisen redox tilan HCT116-solujen arvioitiin. Vertasimme tuotanto ROS että CDDP-käsiteltyjen solujen että CDDP-käsittelemättömiä soluja virtaussytometrianalyysillä käyttäen H

2DCFDA. Kuten on esitetty kuviossa. 1C, ROS tuotanto lisääntyi CDDP- käsitellyissä soluissa verrattuna CDDP- käsittelemättömiin soluihin. Kuitenkin samanaikainen hoito NAC, joka on ROS-estäjä yhdessä CDDP vähensi kertyminen solunsisäisten ROS (Fig. 1 C). Korreloi inhiboiva kyky indusoida ROS, NAC pystyi myös merkittävästi inhiboimaan solukuolemaa signaalien läsnä ollessa CDDP, mistä on osoituksena Western-blottauksella. Kuten on esitetty kuviossa. 1D, CDDP indusoi ilmentymisen apoptoottisten proteiinien Bax ja p53 sekä indusoi PARP lohkaisu ja vähentää ilmentymistä anti-apoptoottisten Bcl-2-proteiinia. Nämä vaikutukset CDDP ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa estettiin NAC. Nämä tulokset osoittavat, että ROS: n syntymisen, jonka CDDP vaaditaan apoptoosin HCT116-soluissa.

(A) käsittelyn jälkeen CDDP ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia, genomi-DNA eristettiin ja erotettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelillä. DNA värjättiin etidiumbromidilla ja visualisoitiin UV-valon alla. (B) kokonaismäärä proteiinia HCT116-solut oli eristetty, ja immunoblotting-analyysi suoritettiin mainituilla vasta-aineilla. (C) HCT116-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 30 ug /ml CDDP esikäsittelyn jälkeen 10 nM NAC, jota seuraa korvaaminen kasvualustaan ​​juuri valmistettu, joka sisälsi 10 uM DCFH-DA. 30 min inkubaation 37 ° C: ssa, mitattiin fluoresenssi-intensiteetti virtaussytometrillä. Tulokset edustavat kertainen lisäys niiden vastaavista kontrolleihin (soluja, joita ei käsitelty CDDP), pidetään 1. Data edustaa keskiarvoja ± SD 3 riippumatonta mittausta.

*** P 0,001 vs. CDDP hoidettuun kontrolliryhmään. (D) HCT116-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman CDDP: n (30 ug /ml) esikäsittelyn jälkeen NAC (10 nM). Proteiini eristettiin soluista ja analysoitiin immunoblottauksella käyttäen osoitti vasta-aineita. GAPDH sisällytettiin sisäisenä kontrollina.

CDDP lisää gangliosidin GM3 paksusuolen syöpäsoluissa

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että apoptoosia johtuu muuttamisen kalvokoostumusta [13], [14] meillä tutki CDDP in HCT116-soluissa säätelee ekspressiotasot GM2 ja GD3-syntaasin geenien ja gangliosidit GM2 ja GD3, mutta ei ollut muutoksia sekä parametrien geeniekspression (tuloksia ei ole esitetty) ja gangliosidin tuotannon (kuvio . 2D). CDDP lisääntynyt ilmentyminen GM3 syntaasin vain CDDP: n aiheuttamaa HCT116-solut (Fig. 2A). Tämän lisäksi, myös tutkittu, onko CDDP indusoi GM3-syntaasi käyttää muita paksusuolen syövän soluja, kuten DLD-1, LoVo, ja WiDr. CDDP-hoito johti parannetun ilmentymisen GM3-syntaasin muissa ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa (tietoja ei esitetty). Tutkimme lisäksi, onko ilmentymisen GM3-syntaasin olevassa mallissa ihmisen paksusuolen syövän HCT116-solut indusoidaan käyttämällä muiden kemoterapia-aineiden (5-fluorourasiili ja doksorubisiini), jotka ovat hyvin tiedetään aiheuttavan apoptoosia eri ihmisen syöpäsoluja sekä paksusuolen syöpäsoluja. Ilmaisu GM3 syntaasin ei indusoitunut sekä syöpälääkkeet (tuloksia ei ole esitetty). Kuten on esitetty kuviossa. 2A, mRNA-tasot GM3 syntaasin nostettiin HCT116-soluissa indusoi CDDP, mistä on osoituksena RT-PCR: llä. Lisäksi tutkimme onko promoottorin aktiivisuutta GM3 syntaasigeenin stimuloidaan CDDP: n aiheuttamaa HCT116-soluissa. Viime aikoina olemme raportoineet CREB välittämää transkription säätelyyn ihmisen GM3 syntaasigeeniä [23]. Näin ollen sen määrittämiseksi, GM3-syntaasin geenin promoottorin aktiivisuutta CDDP, GM3-syntaasi-geenin promoottori (pGL3-1600), CREB mutaatio GM3 nisyntaasipromoottori (pGL3-1600 CREB Mu) ja pGL3-basic transfektoitiin HCT116-solujen kanssa, tai ilman CDDP , vastaavasti, minkä jälkeen mittaus lusiferaasiaktiivisuus käyttäen reportterimääritys. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, transkriptionaalista aktiivisuutta pGL3-1600 in HCT116-soluissa käsiteltiin CDDP oli merkittävästi korkeampi kuin käsittelemättömien kontrollisolujen ja pGL3-Basic-transfektoitujen HCT116-solujen kanssa tai ilman CDDP hoitoa. Kuten odotettua, transkription aktiivisuutta CREB mutantti merkittävästi vähentynyt noin kaksinkertaiseksi verrattuna pGL3-1600 promoottori CDDP-käsiteltyjen HCT116-soluissa. Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa. 2C, kasvu gangliosidi GM3 tuotannon havaittiin HCT1116 indusoiman CDDP, mistä on osoituksena immunofluoresenssimäärityksellä. Immunofluoresenssimenetelmällä aktiivisuus GM3 in CDDP-käsitellyissä soluissa tuli erittäin havaittavissa annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas, että käsittelemättömissä soluissa ei havaittu käyttämällä M2590 kuin GM3-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine ja sekundaarinen vasta-aine negatiivisena kontrollina, vastaavasti. Lisäksi olemme tutkineet gangliosidi kuvioita HCT116-soluissa käsitelty ja ilman CDDP käyttäen HPTLC analyysiä. Mielenkiintoista, joukossa gangliosidit, gangliosidi GM3 oli merkittävästi lisääntynyt HCT116-soluissa käsiteltiin CDDP verrattiin ei CDDP ohjaus (Fig. 2D). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että sekä GM3 syntaasia ilmaisun ja gangliosidi GM3 tuotanto lisääntyvät HCT116-soluissa käsitelty CDDP.

(A) kokonais-RNA HCT116 soluista eristettiin käsittelyn jälkeen ilmoitetut pitoisuudet CDDP hoito 12 h ja GM3-syntaasin mRNA: ta havaittiin RT-PCR: llä. (B) HCT116-soluja transfektoitiin ohimenevästi GM3-syntaasin geenin promoottori (pGL3-1600) ja CREB mutaatio GM3 nisyntaasipromoottori (pGL3-1600 CREB Mu), ja sitten viljeltiin kanssa tai ilman CDDP: ssa 12 h. Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin solulysaateista, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta kolminkertaisia ​​mittaus.

*** P 0,001 vs. CDDP hoidettuun kontrolliryhmään. (C) HCT116-soluja viljeltiin ja inkuboitiin sitten ilmoitetun pitoisuuden CDDP hoitoa 12 tuntia. Immunoreaktiivisuus vasten gangliosidi GM3 havaittiin käyttäen fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) -konjugoitu vuohen anti-hiiri IgM: ää tai ilman kanssa M2590-vasta-aineen. (D) gangliosidit eristetään HCT116-solut käsiteltiin CDDP (0, 10, ja 30 ug /ml) analysoitiin HPTLC.

Down-regulation gangliosidin GM3 siRNA kohdentamalla GM3 syntaasi suojaa solujen apoptoosia CDDP

aikaisemmat tiedot osoittivat, että CDDP indusoi apoptoottisen signaalin tapahtumien kautta ROS tuotanto, ja tehostettu ilmentyminen gangliosidin GM3 aktiiviseen kohtaan ja tuote GM3. Näin ollen sen määrittämiseksi, onko kasvatettu gangliosidin GM3 in CDDP-käsiteltyjen HCT116-soluissa liittyy CDDP-välitteisen apoptoosin, olemme suunnitelleet kolme siRNA: t on suunnattu nimenomaan vastaan ​​GM3-syntaasi (siGM3). Nro 2 ja 3, mutta ei nro 1 kolmen siGM3 selvästi alassäädetty ilmentymistä GM3-syntaasin CDDP-käsiteltyjen HCT116-soluja, määritettynä RT-PCR-analyysillä (Fig. 3A). Lisäksi, siGM3 2 ja 3, mutta ei 1 (Fig. 3B) palautettu ekspressiomalleja Bax, Bcl-2 ja p53: n CDDP-käsiteltyjen solujen kuin CDDP-indusoimaton soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että säätely ylöspäin GM3 vaaditaan apoptoosin CDDP: n aiheuttamaa HCT116-soluissa.

HCT116-solut transfektoitiin kolme siRNA kohdistaminen GM3 ja negatiivisen kontrollin siRNA. Soluja viljeltiin sitten 12 (30 ug /ml). Kokonais-RNA ja proteiini lysaatit soluista valmistettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (A) tasot GM3 syntaasin mRNA: kokonais-RNA saadaan kunkin solun havaittiin RT-PCR: llä. (B) kokonaismäärä proteiinia valmistettiin soluista ja analysoitiin western-blottauksella käyttämällä mainituilla vasta-aineilla.

tehostuminen gangliosidin GM3 in CDDP-käsiteltyjen HCT116-solut säätelee 12-lipoxigenase (12-LOX) aktivointi ROS tuotanto

Nerve solukuolema glutamaatin tulokset ROS tuotantoa 12-LOX aktivaation, ja indusoitiin lokalisaatio 12-LOX kalvoon, joka liittyy aktivointi 12-LOX [25]. Kollegamme ovat raportoineet, että 12-LOX rekrytoimista glykosfingolipidikertymäsairauksiin rikastettua mikrodomaineja (GEM) on gangliosidi GM3 riippuvaisella tavalla aikana oksidatiivisen glutamaattitoksisuutta [21]. Tuloksemme osoittavat, että CDDP aiheuttamaa mitokondrioiden riippuvaisen apoptoosin signaaleja gangliosidi GM3 välittämää ROS sukupolvi HCT116-soluissa (Fig. 3 ja Fig. 4A). Siten tutkimme onko tietty estäjä 12-LOX, Baicalein estää 12-LOX toimintaa ROS tuotantoa HCT116 soluissa, jotka ilmentävät gangliosidin GM3 aiheuttama CDDP. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, CDDP aiheuttama GM3 syntaasin ilmentymisen ja ROS tuotanto. Kuitenkin Baicalein tukahdutti CDDP stimuloiman ROS tuotanto, vaikka GM3 syntaasin ilmentymisen indusoima CDDP ei säännelty Baicalein. Lisäksi ROS raadonsyöjä NAC, esti ROS sukupolvi, mutta ei GM3 syntaasin CDDP-käsiteltyjen HCT116-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CDDP: n aiheuttamaa gangliosidi GM3 ilmentyminen voi säädellä 12-LOX aktiivisuuden ROS tuotantoa 12-LOX rekrytointi GEM.

(A) HCT116-solut transfektoitiin siRNA kohdistamista GM3 ja negatiivisen kontrollin siRNA. Soluja viljeltiin sitten 12 h: n läsnä tai poissa ollessa CDDP: n (30 ug /ml). Elatusaine korvattiin juuri valmistettu, joka sisälsi 10 uM DCFH-DA. 30 min inkubaation 37 ° C: ssa, mitattiin fluoresenssi-intensiteetti virtaussytometrillä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD 3 riippumatonta mittausta.

** P 0,01 ja

*** P 0,001 vs. CDDP hoidettuun kontrolliryhmään. ns: ei merkitystä. RT-PCR, kokonais-RNA ja proteiini lysaatit soluista valmistettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tasot GM3 syntaasin mRNA: kokonais-RNA saadaan kunkin solun havaittiin RT-PCR: llä. (B) HCT116-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 30 ug /ml CDDP esikäsittelyn jälkeen 10 nM NAC tai 1 uM Baicalein, ja sitten elatusaine korvattiin juuri valmistettu, joka sisälsi 10 uM DCFH-DA. 30 min inkubaation 37 ° C: ssa, mitattiin fluoresenssi-intensiteetti virtaussytometrillä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD 3 riippumatonta mittausta.

*** P 0,001 vs. CDDP hoidettuun kontrolliryhmään. RT-PCR, kokonais-RNA ja proteiini lysaatit soluista valmistettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tasot GM3 syntaasin mRNA: kokonais-RNA saadaan kunkin solun havaittiin RT-PCR: llä.

CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia on parannettu HCT116-soluja, jotka yli-ilmentävät GM3-syntaasin

tutkia herkkyys CDDP-välitteisen apoptoosin välillä HCT116-solut ja HCT116-solut yli-ilmentävät GM3 syntaasi, me syntyy ekspressoivat stabiilit transfektantit GM3. PcDNA3-GM3 ekspressiovektorin ihmisen GM3-syntaasin cDNA: ta (HCT116 /GM3) ja pcDNA3 tyhjän vektorin (vale), transfektoitiin HCT116-soluissa. Valinnan jälkeen G418-resistenttejä pesäkkeitä, olemme vahvistaneet, että ilmentyminen GM3 syntaasin mRNA: ta ja gangliosidin GM3 olivat erittäin ilmaistaan ​​HCT116 /GM3-soluja verrattuna mock-transfektoituja soluja, mikä näkyy RT-PCR: llä ja immunofluoresenssimäärityksellä (Fig. 5A). Nämä tulokset osoittavat, että entsymaattisesti aktiivista GM3-syntaasi syntetisoi HCT116 /GM3-soluja. Tavanomaisissa viljelyolosuhteissa (10% FBS), kasvu HCT116 /GM3-soluja ei ollut erilainen verrattuna kontrollisoluihin, ja muutokset apoptoottisia signaaleja ei havaittu näissä soluissa, mikä näkyy western blot-analyysi (tietoja ei esitetty). Kuitenkin, kun nämä transfektantit käsiteltiin CDDP annoksesta riippuvalla tavalla, suurempi määrä soluja erottaa levyn HCT116 /GM3 verrattuna vale-soluja käsiteltiin 30 ug /ml CDDP. Todellakin, HCT116 /GM3-soluja osoitettiin olevan herkempi CDDP kuin mock-solujen solukasvun inhibitio osoituksena XTT-määrityksellä (kuvio. 5B). Lisäksi kasvua DNA-vaurioiden jälkeen CDDP altistumisen havaittiin HCT116 /GM3-soluja verrattuna mock-käsitellyistä soluista käyttämällä DNA: n fragmentoituminen määrityksessä (kuvio. 5C). Koska anneksiini V värjää kääntää ulos fosfatidyyliseriinin ulkosivulla solukalvon, käännetään ulos fosfatidyyliseriinin sisäpuolelta sen ulkopinnalle solukalvon tiedetään olevan yksi ominaisuuksista apoptoottisten solujen. Esillä olevassa tutkimuksessa, kuten on esitetty kuviossa. 5D, anneksiini V-positiivisia soluja mitattiin virtaussytometrialla oli myös merkitsevästi lisääntynyt CDDP saaneilla HCT116 /GM3 soluja verrattuna mock soluihin. Tutkia molekyylimekanismi taustalla herkistävää vaikutusta GM3 in CDDP: n aiheuttamaa sytotoksisuutta, kaspaasi-välitteisen PARP hajoamista pelkistämällä mitokondrion potentiaali tutkittiin sen jälkeen, kun CDDP hoidon eri pitoisuuksina (Fig. 5E). Western blot-analyysi osoitti, että HCT116 /GM3 solujen pilkkominen taso PARP nostettiin verrattuna mock soluihin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että GM3 herkistää HCT116-solujen CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia. Tulokset osoittavat, että ROS: lla on keskeinen rooli CDDP: n aiheuttamaa HCT116-soluissa, mikä johtaa solun apoptoosin. Vertasimme tuotanto ROS HCT116 /GM3 solujen että mock soluissa virtaussytometrianalyysillä käyttäen H

2DCFDA. Kuten on esitetty kuviossa. 5F, CDDP-indusoidun ROS tuotanto vahvistunut HCT116 /GM3-soluja verrattuna mock-solut, mutta ei NAC-esikäsitellyt solut, mikä osoittaa, että kasvu GM3 tasoilla tarvitaan ROS tuotannon CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia HCT116-soluja. Nämä tiedot osoittavat, että ROS tuotanto on riippuvainen GM3 tasoilla CDDP: n aiheuttamaa HCT116-soluissa.

(A) RT-PCR: llä ja immunofluoresenssimäärityksellä vahvisti ilmentymisen GM3-syntaasin ja GM3 tuote stabiili transfektantti on pcDNA- GM3 in HCT116-soluissa. Kontrollina, pelkällä vektorilla (pcDNA) -transfected HCT116 ei ilmaista GM3. Mock, vektori (pcDNA3) -transfected solu HCT116 /GM3, pcDNA3-GM3-transfektoiduissa soluissa. (B) Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 24 tunnin kuluttua CDDP hoidon ilmoitettuina pitoisuuksina käyttäen XTT-määritystä HCT116 /GM3-soluja verrattuna mock-käsitellyt solut. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) käsittelyn jälkeen CDDP ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia, genominen DNA analysoitiin 2% agaroosigeelillä. (D) Apoptoottiset solupopulaatioiden mitattiin FACS Calibur-analyysi käyttämällä anneksiini V-värjäyksen, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Nuolet osoittavat apoptoottinen väestön mock ja HCT116 /GM3 soluja, tässä järjestyksessä. (E) HCT116 /GM3 tai mock-soluja käsiteltiin osoitti pitoisuudet CDDP 12 tuntia. Kokosolulysaateista ja supernatantti media valmistettiin ja analysoitiin immunoblottauksella, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät, käyttäen mainituilla vasta-aineilla. (F) vaikutus CDDP hoidon mitattiin fluoresenssi jakelusta DCFH hapettumista HCT116 /GM3 tai mock soluja. Kuten on esitetty kuviossa.