Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

TPR on suuri rulla-kela proteiini sijaitsee ydin- koriin ydin- huokosten monimutkainen jolle useat eri toimintoja ehdotettiin hiivasta ihmisen.

Menetelmät /Principal havainnot

Tässä osoitamme, että ehtyminen TPR RNA interferenssin laukaisee G0-G1 pidätystä ja lopulta indusoi senescent -kuten fenotyyppi riippuvainen läsnäolosta p53. Olemme myös havainneet, että TPR ehtyminen haittaa NES [tumasta järjestyksessä]: sta riippuvainen tumasta proteiinien ja aiheuttaa osittaisen yhteistyön ehtyminen Nup153. Lisäksi TPR ehtymisen vaikutukset tasolla ja toiminta SUMO-proteaasin SENP2 mikä vaikuttaa SUMOylation sääntelyä tumahuokonen ja yleinen SUMOylation solussa.

Johtopäätökset

tiedot ensimmäistä kertaa tarjota näyttöä siitä, että tumahuokonen komponentti on rooli valvoa solujen vanhenemista. Meidän havainnot osoittavat myös uusia rooleja TPR säätelyssä SUMO-1 konjugaatio klo tumahuokonen ja sitä vahvista TPR osallistumista tumasta NES-proteiineja.

Citation: David-Watine B (2011) hiljentäminen tumahuokonen Protein TPR aikaansaa senescent-Like Fenotyyppikuvaus syöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (7): e22423. doi: 10,1371 /journal.pone.0022423

Editor: Michael Polymenis, Texas A M University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 22 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 19 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Brigitte David-Watine. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Institut Pasteur. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijä on ilmoittanut, että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

tumahuokonen komplekseja (NPC) välittävät kaikki valikoiva kaksisuuntaisen liikenteen välillä tumaan ja sytoplasmaan. Todisteet on myös syntymässä osoittaa ylimääräisiä rooleja NPC, niihin kuuluvia proteiineja (nucleoporins) ja liittyvän liikenteen proteiineja, joista jotkut ovat riippumattomia klassisen kuljetuksen [1], [2]. Voidaan siis perustellusti arveltu, että NPC ovat avain patologisia solun olosuhteissa, joissa epänormaali solujen kasvu on keskeinen ominaisuus.

Proteiini TPR (for siirtämisellä promoottorialueen) ja sen homologit ovat konservoituneita komponentti ydinvoima puolella NPC . Nisäkkäillä TPR on 267 kDa rakenteellista proteiinia, jolla on pitkä N-terminaalinen domeeni, joka Associates dimeerin muodostamiseksi rinnakkain, kahden kerrattu kiertynyt kela. C-terminaalinen domeeni on erittäin hapan ja ennustetaan olevan rakenteeton [3]. Nisäkässoluissa TPR on rajoitettu nucleoplasmic fibrillien NPC ja on ehdotettu, että se toimii pääasiassa arkkitehtoninen elementti ydin- kori [4], [5]. Nisäkkäiden TPR on lieassa NPC vuorovaikutusten kautta Nup153 [5], [6], [7], [8]. Monia toimintoja on katsottu johtuvan TPR ja sen homologeja eri lajien lisäksi rooli NPC arkkitehtuuria. Näitä ovat mRNA vientivalvontaa [9], [10], ydinvoima proteiini vienti [4], [11], hiljainen telomeerisesti chromatin järjestämisestä ja telomeeripituuden valvonta [12], [13], [14]. Lisäksi Drosophila ja ihmisen TPR on osoitettu olevan mukana karan tarkistuspisteen kontrolli [15], [16], [17] ja ihmisen TPR valvonnassa Erk2 nucleo-sytoplasman translokaatio [18].

TPR homologit hiivan, Mlp1p-Mlp2p, ovat mukana kiinnittämiseen SUMO-proteaasin Ulp1p NPC [19], [20]. Tämä toiminnallinen vuorovaikutus näyttää olevan konservoitunut Arabidopsis thaliana välillä ESD4 ja NUA, jotka ovat homologeja Ulp1p ja TPR, vastaavasti [21]. SUMOylation vastaa translaation jälkeisen konjugaatio SUMO (pieni ubikitiini liittyvät modifiointiaine proteiinia) tiettyyn lysiinitähteen kohdeproteiiniin. SUMOylation välittyy entsymaattisella Cascade reaktion, jossa peräkkäisesti SUMO aktivoivaan entsyymiin tai E1 ja ainutlaatuinen E2 SUMO-konjugointientsyymiä, Ubc9. SUMO muutos on palautuva, koska SUMO-proteaasien voi dekonjugoimaan SUMO osan muokatusta proteiineista viittaa siihen, että proteiini SUMOylation dynaamisesti säännelty soluissa [22], [23]. Niistä Ulp1p liittyvät SUMO-proteaasien, jotka on tunnettu siitä, nisäkkäillä, SENP1 ja SENP2 osoittavat eniten samankaltainen hiivan Ulp1 ja liittyy myös ydin- kuori. Ulp1p ja SENP2 jakaa omaisuutta on suunnattu NPC niiden ei-katalyyttinen N-pääaluetta [24]. Kuitenkin selkärankaisilla, N-pään NPC-kohdistaminen verkkotunnusta SENP2 vuorovaikutuksessa C-terminaali verkkotunnus Nup153, mutta ei TPR [25], [26].

Cellular vanhenemista oli ensimmäinen kuvattu ” monistus vanhenemista ”, koska rajallinen elinikä ihmisen diploidi fibroblastien in vitro [27]. Tutkimukset syöpäsolut ovat osoittaneet, että huolimatta siitä, että ne pystyvät jakamaan loputtomiin, valtion muistuttavista monistus vanhenemista voidaan akuutisti useiden erilaisten ärsykkeiden indusoimaa kuten kemoterapeuttiset aineet ja säteily. Tämä on sen vuoksi toisen solun ohjelman lisäksi apoptoosin, jotka voivat rajoittaa solujen lisääntymistä [28], [29]. Senescent solut on tunnusomaista laajentunut solukoko, litteä morfologia, kyvyttömyys syntetisoida DNA: ta ja ilmentymistä vanhenemista liittyvää (SA) -β-galaktosidaasi, biomarkkerin vanhenemisen [30].

Me raportoimme tässä, että TPR on kriittinen solujen lisääntymisen ja että TPR ehtyminen johtaa vanhenemista kaltainen fenotyyppi, joka on riippuvainen p53. Myös TPR alassäätöä vaikutukset tumasta proteiinien kanssa Crm1 riippuvan tumasta sekvenssi (NES). Tasot Nup153 ja SENP2 toiminto on tumahuokonen vaikuttaa myös. Tämän seurauksena merkittäviä muutoksia havaittiin rakenteessa SUMO-1 konjugaatio at NPC ja solussa.

Tulokset

TPR Knockdown indusoi G0-G1 pidätetty ja senescent fenotyypin HeLa-soluissa

TPR on hiljattain kuvattu olevan useita eri toimintoja, mutta sen roolia solusyklin, solujen kohtalo ja lisääntymistä ei ole koskaan täysin arvioitu. Meillä on siis tutki vaikutusta TPR heikentymisen solusyklin käyttämällä siRNA kohdistaminen TPR HeLa-soluissa. Olemme havainneet, että taso TPR-proteiinin spesifisesti vähentää, kun 48 tunnin hoidon joko kahden synteettisen siRNA: t käytetään, kuten on esitetty western blot -analyysi yhteensä solu-uutteista käsiteltyjen HeLa-solujen (Fig. 1A ja S1A).

HeLa-soluja ympättiin 24-kuoppalevyille 5 10

-4 solua kuoppaa käsiteltiin TPR tai mock siRNA. 1A. 48 tunnin kuluttua siRNA hoidon kuten päälle luku, solu-uute valmistettiin ja analysoitiin western-blottauksella käyttäen anti-TPR Mab 203-37; tubuliinia käytettiin latauskontrollina. 1B. Kirkaskenttäkuvassa (oikea paneeli) ja konfokaali kuva (vasen paneeli) HeLa-solujen, jotka on leimattu anti-TPR monoklonaalinen vasta kuluttua 2 päivää transfektion TPR tai mock siRNA. Mitta-asteikko: 5 um. 1C. Kasvukäyrä transfektoiduissa HeLa-soluissa TPR, mock siRNA tai transfektoitu: kontrolli (Ctrl). 1D. Edustavia FACS profiilit mock siRNA käsitelty (vasen paneeli), TPR siRNA käsitellyt solut (keskellä) ja ei-transfektoituja soluja tai ohjaus (oikealla). Etanoli-kiinnitettyjä soluja inkuboitiin PI ja analysoitiin FACS: lla ploidia. Solujen määrä on edustettuna pystyakselilla ja DNA-pitoisuus on vaaka-akselilla. G0-G1 ja G2-M-vaiheisiin ovat edustettuina ensimmäisen ja toisen huipun alkaen pystysuoran akselin, vastaavasti. Välissä raidallinen verkkotunnus vastaa S-vaiheeseen. 1E. Induktio vanhenemisen: solut maljattiin alhainen tiheys ja käsitellään TPR tai mock siRNA. 6 päivän jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin SA-β-gal-aktiivisuus pH: ssa 6,0. Mitta-asteikko: 20 um. 1F. Kvantifiointi SA-β-gal-positiivisten solujen viljelmissä köyhdytetty TPR ja värjätä SA-β-gal aktiivisuus pH: ssa 6,0. 1G-1 H. U2OS solut transfektoitiin TPR tai mock siRNA. 1G: Kun 6 päivää solut kiinnitettiin ja värjättiin BrdU ja SA-β-gal-aktiivisuus pH: ssa 6,0. Mitta-asteikko: 15 um. 1H: Kun 6 päivää, solut leimattiin anti-HP1γ ja anti-MacroH2A vasta-aineita ja DAPI. Mitta-asteikko: 5 um. 1I: A375-solut transfektoitiin TPR tai mock siRNA. 6 päivän jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin SA-β-gal-aktiivisuus pH: ssa 6,0. Mitta-asteikko: 15 um.

jälkeen määritetään sijainnin HeLa-soluissa konfokaalimikroskopiaa (Fig. 1 B). Optiset osat keskustan läpi tuman osoitti pistemäinen kuvio ominaisuus nucleoporins klo NE. Altistuminen siRNA kohdistuvista TPR dramaattisesti vähentänyt pistemäinen TPR kuvio klo NE (Fig. 1 B). Koska TPR oli tehokkaasti säädeltiin näissä olosuhteissa kykenimme analysoimaan sen rooli solujen kasvun ja kannattavuuden. Huomasimme, että hoito TPR siRNA heikentynyt solujen lisääntymistä verrattuna mock siRNA-käsitellyt solut (Fig. 1 C). Sen tutkimiseksi, onko tämä johtui pysäyttää solujen lisääntyminen tai solukuolema, soluja käsiteltiin anneksiini-V: n ja propidiumjodidin merkitä tumiin kuolleita soluja ja soluja analysoitiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS). Ei brutto ero TPR siRNA-käsiteltyjä soluja, ja valvonta havaittiin, mikä osoittaa, että kasvu vika ei ollut apoptoosin vuoksi (tietoja ei esitetty).

edelleen karakterisoimiseksi vaikutus TPR pudotus soluproliferaatioon, analysoimme solusyklin jakautumista TPR siRNA käsiteltyjä soluja ja valvonta mittaamalla niiden DNA sisällön FACS. Havaitsimme, että mock siRNA transfektion ei vaikuttanut solusyklin HeLa-solujen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Sitä vastoin solusyklin pidätettiin G0-G1 vaiheeseen TPR Knockdown soluissa kuten kuvassa. 1D. Noin 46%: n kontrollitransfektoidut ja transfektoimattomat solut (2 päivää transfektion) olivat G0-G1 vaiheeseen solusyklin, kun taas 69%: n TPR pudotus solut olivat G0-G1. Samaan aikaan, noin 37-38% kontrollisolujen eteni S-vaiheeseen verrattuna vain 16%: n TPR pudotus solut (Fig. 1 D). Sama osuus solujen nähtiin G2-M-vaiheessa kaikkien kolmen olosuhteissa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kahdessa TPR siRNA-sekvenssejä (Fig. S1B).

Suoritimme sitten pesäkkeitä muodostavien määrityksessä itsenäisenä mittaus leviämisen vika laukaisee TPR ehtyminen. Huomattava vähennys (36%), että pesäkkeiden määrä oli ilmeinen, kun solut transfektoitiin TPR siRNA: t verrattuna mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio. S1C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että transfektoimalla HeLa TPR siRNA dramaattisesti hidastunut kasvainsolujen lisääntymistä.

Tarkempi tutkiminen TPR siRNA-käsitellyissä soluissa osoitti, että murto-osa näistä oli melko ”vakava” fenotyyppi että heillä oli ulkonäkö Vanheneminen kanssa karkeasti laajennettu sytoplasmaan. Tämä sai meidät lisätutkimusten tekeminen keskittyy tässä vastaus. Ohimeneviä RNAi määrityksissä, ajankulun tehokkaan ehtyminen kohdeproteiinin ei ole yli neljä päivää, kun taas TPR Knockdown solut pidätettiin G0-G1. Samaan aikaan ei-transfektoitujen solujen edelleen jakaa ja nopeasti ohittaa ei-jakautuvien solujen. Siksi perustettu ehdot, joiden solut maljattiin alhaisen tiheyden (5,10

4 ja 10

5 kuoppaa kohti 6 hyvin levy) minimoida umpeen ei-transfektoiduissa soluissa.

kokeet näissä olosuhteissa osoitti, että suuri osa väestöstä alkoi muuttua morfologian 3-4 päivää transfektion jälkeen: solut laajennettiin ja litistetty (Fig. 1 E). Merkittävä testi vanhenemista on SA-β-galaktosidaasin aktiivisuus mitattiin happamassa pH [30] ja 6 päivää transfektion jälkeen, useimmat laajentuneen ja litistetty soluja β-gal positiivisia ja väriltään sininen (noin 40%) vuonna TPR knockdown kuoppiin , kun taas senescent kaltaisia ​​sininen solut olivat harvinaisia ​​(noin 10%) että mock käsitelty solu (Fig. 1 F).

TPR siRNA knockdown myös aiheuttamaa vanhenemista kahden muun tuumorisolulinjoja, U2OS, ihmisen osteosarkoomasolu- linja, ja A375 ihmisen melanoomasoluja (Fig. 1G-1I). BrdU-värjäys osoitti, että SA-β-galaktosidaasi-positiiviset solut olivat BrdU negatiivinen (Kuva. 1 G). Lisäksi TPR siRNA-käsiteltyjen U2OS solut ja valvonta leimattiin spesifisten vasta-aineiden histoni variantti makrotason H2A ja HP1γ, kaksi markkereita heterochromatin konstitutiivista että SAHF (Vanheneminen liittyy heterochromatin pesäkkeitä), jotka tunnistettiin senescent ihmisen fibroblasteissa [31] , [32]. Monet makro-H2A ja HP1γ positiivisia ja colocalizing pesäkkeitä havaittiin U2OS senescent soluissa tumat, kun se oli poissa hallinnassa ytimeksi. Kirkkaampi DAPI pisteitä osoittaa heterochromatin colocalized makro-H2A ja HP1γ merkinnät voidaan nähdä kuvassa. 1H.

TPR ehtyminen indusoi tumakertymään p53

Koska p53-reitin usein mukana estämällä kasvainten kehittymiseen käynnistämällä solujen vanhenemista tai apoptoosin vasteena korostaa se oli tärkeää arvioida solun p53 tila kun TPR on tyhjentynyt.

ensin käytettiin immunosytokemian analysoida jakelu p53 ja samalla tutkittiin vaikutusta Nup153 väheneminen, koska tämä on osoitettu delocalize TPR päässä tumahuokonen ydinalan sisätilan. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, p53 signaali esiintyi voimakas pistemäinen merkintöjä ytimet Tpr- ja Nup153- köyhdytettyä soluja. Mitään signaalia ei havaittu kontrolli-soluissa. Vertailun vuoksi, kun sen si- jaan Nup133 tukirakenne nucleoporin, jolla on tärkeä rooli tumahuokonen rakenne ja toiminta, ei aiheuta mitään tumakertymään p53: [33], kuten kertymistä havaittiin TPR-köyhdytettyä U2OS soluissa (tuloksia ei ole esitetty) . Nämä tulokset osoittavat, että TPR ehtyminen tai mislocalization lukemiin tumakertymään p53.

2A. Analyysi p53 jakelun HeLa-soluissa immunofluoresenssilla. Ylempi paneeli: HeLa-solut transfektoitiin TPR, Nup153 ja mock siRNA kuten vasemmalla; alempi paneeli: HeLa-soluja transfektoitiin Nup133 ja mock siRNA. Soluja kiinnitettiin päivänä 2 post -transfection ja leimattiin anti-TPR-aineella (ylhäällä vasemmalla paneelit) tai anti-Nup133 (alhaalla vasemmalla paneeli) ja anti-p53 (oikealla ylhäällä ja alhaalla paneelit). 2B. Hela solujen kokosolu-proteiinin lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin spesifisillä vasta-aineilla TPR, p53, p21, p16 ja tubuliinin, kuten kuviossa on esitetty. 2C. Kokosoluproteiinikuviot lysaattien U2OS käsiteltyjen solujen TPR, TPR + p53 tai ohjaus (mock) siRNA: t erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin spesifisillä vasta-aineilla TPR, p53, p21 ja tubuliinin, kuten kuviossa on esitetty. 2D. Co-ehtyminen p53 ja TPR päinvastaiseksi vanhenemista induktio. Solut transfektoitiin mock, TPR, p53 tai TPR ja p53: n yhdistelmä, kuten on osoitettu. Lopullinen siRNA-pitoisuus oli 100 nM kussakin tapauksessa ja korvausten kanssa tehtiin mock siRNA. Soluja leimattiin SA-β-galaktosidaasi on 6 päivää transfektion jälkeen ja tulos annetaan prosentteina SA-β-galaktosidaasin positiivisten solujen kussakin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Sykliini -riippuvaista estäjä (CDK) p21 on kohonnut monissa stressaavan olosuhteissa ja on transkriptionaalisesti säätelee p53. Siksi tutkittiin seuraukset TPR ehtyminen tasoista p53 ja p21. Tasot p53 ja p21 olivat molemmat säädellään ylöspäin TPR-köyhdytettyä Hela-solut (Fig. 2B) ja U2OS soluja (Fig. 2C). Lisäksi kun arvioidaan soluekstrakteissa jossa sekä TPR ja p53 loppuivat, p21 kertyminen nähtiin olevan alhaisempi kuin TPR siRNA yksinään (Fig. 2C). Tämä havainto osoittaa, että osa p21 kertymistä huomattava johtuu aktivointi p53. Tasoilla CDK-inhibiittorit p16

INKA (Fig. 2B) ja cyclinD1 lisääntyivät myös TPR-köyhdytettyä HeLa-soluja (tuloksia ei esitetä).

Lopuksi sen osoittamiseksi virallisesti roolia p53 välittämisessä induktio vanhenemista in TPR-köyhdytettyä soluja, teemme yhteistyötä köyhdytettyä sekä TPR ja p53. Kaatamalla molemmat TPR ja p53 aiheutti huomattavaa reversiossa Vanheneminen fenotyypin arvioituna prosenttiosuus SA-β-galaktosidaasi-positiivisia soluja (kuvio. 2D).

TPR ehtyminen häiritsee NES-riippuvainen tumasta

on ehdotettu, että alhainen vakaan tason p53 normaaleissa soluissa, eli ilman solustressiä, johtuvat jatkuvasta Crm1 riippuva tumasta [34] ja myöhemmin sytosolin hajoamista p53. Myös TPR hiljattain todettu vuorovaikutuksessa Crm1 käytettäessä Trimeeristä vienti monimutkainen [11]. Voimme siis hypoteesina, että TPR johtaa p53 tumakertymään ja stabilointi estämällä sen tumasta.

Tämän hypoteesin testaamiseksi ensin käytetty konstrukti pSTAT1-NES-GFP, joka koodaa tähteitä 367-427 ihmisen STAT1 että annetaan NES [35], jotta sääntelyyn tapahtumia puuttumatta esto Crm1 riippuvaisten tumasta. Tämä konstrukti kotransfektoitiin TPR, Crm1 ja ohjaus siRNA koetin NES-riippuvainen viennistä. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, jakelun GFP-signaalin elävissä soluissa 48 tuntia transfektion jälkeen osoitti, että Crm1- ja TPR-ehtyminen johti huomattavan ydin- säilyttämistä NES-GFP rakentaa taas GFP pysyi pääosin soluliman in valehoidettujen soluissa. Sitten solut läpäiseviksi ja merkitty Crm1 ja TPR vasta tarkistaa ehtymisen tehokkuus (Fig. 3B).

3A-3B. Jakelu GFP soluissa kotransfektoitiin STAT1-NES-GFP ja TPR, Crm1 tai ohjaus (mock) siRNA: t. 3A: GFP jakelu analysoitiin elävissä soluissa. Tumat leimattiin Hoechst 33342. Mitta-asteikko: 10 um. 3B: Sitten solut läpäiseviksi ja leimattu vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä TPR ja Crm1 ja DAPI varten DNA. Ylälevy: TPR ehtyminen ja valvonta; alempi paneeli: Crm1 ehtyminen ja valvontaa. Mitta-asteikko: 10 um. 3C-3D: TPR ehtyminen viivästyttää tumasta NFKB. HeLa-solut transfektoitiin TPR tai mock siRNA 2 päivää ennen NFKB induktio. Transfektoidut ja ohjaus soluja inkuboitiin sitten TNF 100 IU /ml 40 minuutin ajan. TNF poistettiin sitten keskipitkällä ja solut joko kiinteitä tai pidettiin toiset 1h30 tuoreessa väliaineessa ennen kiinnitystä. 3C: kvantifiointi NFKB signaali: Kaikki kuvat hankittiin samaan suurennus ja altistumisen ja NFKB signaali kvantifioitiin käyttämällä samaa pinta-ala tumissa ja sytoplasmassa soluja eri koeolosuhteissa käyttäen OpenLab3.1.2. Sytosolin signaali piirrettiin ydinaseiden signaali ja keskihajonta laskettiin käyttäen Microsoft Excel. Virhe palkit edustavat keskihajonta. Huomaa, että sytosolin ydinaseiden signaali suhde on hyvin samankaltainen hallinnassa soluissa ennen TNF-hoidon ja 1h30 jälkeen TNF poiston. Tämä oli odotusten ja johtuu NFKB täysin palaamassa sytoplasmaan tällä hetkellä. 1h30 jälkeen TNF poistamisen sytosolin ydinaseiden signaali oli noin 25% pienempi TPR-köyhdytettyä soluja kuin kontrolliryhmässä soluissa. 3D: Immunofluoresoivat merkinnät NFKB ja TPR 1h30 jälkeen TNF poistoa TPR-köyhdytettyä ja ohjaus soluja. Kiinteät solut leimattiin kanin anti-NFKB vasta-aine ja anti-TPR mAb 203-37.

Toimiva Crm1 riippuva NES tarvitaan myös IkappaBepsilon välittämän tumasta, joka ohjaa nucleo-sytoplasmisen jakelu ja induktion ydin- puhdistumaan NFKB /Rel proteiinit [36]. Paremmin vaikutuksen arvioimiseksi TPR ehtymisen NES-tumasta sellaisen endogeenisen proteiinin, HeLa-soluja transfektoitiin ensin TPR tai mock siRNA edeltäneen kahden päivän NFKB induktiota TNF. Kuten on esitetty kuviossa. 3C-3D, TPR ehtyminen viivästynyt puhdistumaan NFKB tumasta verrattuna mock käsiteltyihin soluihin. On syytä huomata, että NFKB kertyminen tumaan seuraavissa TNF-hoidon ei erilainen jäljitellyistä ja TPR-siRNA käsitellyt solut (Fig. 3C).

yrittänyt seuraavaksi määrittää, onko TPR ehtyminen vaikuttaa Crm1 tasoilla ja jakelu , tai päinvastoin. Tämän tekemiseksi transfektoituja HeLa-soluja siRNA: t on suunnattu TPR ja Crm1 tai valetransfektoidut HeLa-soluja, ja 48 tuntia myöhemmin käsittelimme solut Tpr- ja Crm1-spesifisten vasta-aineiden. Immunofluoresenssianalyysi varten Crm1 ilmentymisen hallinnassa ja Crm1 knock-down-solut oli vähentynyt tasoilla nucleoplasm ja ydinvoiman vaipan Crm1 siRNA-transfektoiduissa soluissa. Myös TPR ilmentyminen väheni huomattavasti TPR siRNA-käsitellyt solut. Sen sijaan Crm1 ilmaisu ei näyttänyt vaikuttavan TPR ehtyminen ja TPR ei vaikuta Crm1 knock-down-solut (Fig. S2A-B).

TPR ehtymisen vaikutuksia ilmaisun ja jakelu Nup153 ja SENP2 ydinalan kori

paremmin roolin arvioimiseksi TPR tumahuokonen organisaatio ja toiminta, tutkimme tarkemmin suhdetta TPR ja Nup153 mittaamalla niiden tasot kokonaisuutteissa transfektoitujen solujen TPR tai Nup153 siRNA . Kuten on esitetty western blot-analyysi koko solu-uutteiden (Fig. 4A), solujen käsittely Nup153 siRNA johti lähes täydelliseen häviämiseen Nup153 ja vähentyneen merkittävästi TPR. Tämä lasku TPR tasoilla oli yhdenmukainen aiempien tutkimusten osoittavat, että TPR on mislocalized ydin- sisustus Nup153 pudotus soluissa [8]. Samoin hoito TPR siRNA johti vähentyneen merkittävästi TPR ja vähentää huomattavasti Nup153 signaali (Fig. 4A). Seuraavaksi me vahvisti tämän havainnon immunofluoresenssianalyysin avulla HeLa-soluissa käsitelty TPR siRNA: t ja leimattu vasta-aineiden kanssa eri osien ydinvoiman kirjekuoren. Merkinnät anti-emerin vasta-aineen ja Mab414-vasta-aine, joka tunnistaa kaikki FG-toistuvasti sisältävä nucleoporins lukien Nup153 ei selvästi muutettu (Fig. 4B-4C). Sen sijaan havaitsimme, että merkintöjä tietyn anti-Nup153-vasta-aine vähensi (Fig. 4B-4C). Me Edellä mainittujen seikkojen että TPR ehtyminen kohdistuu nimenomaan tasoon Nup153 proteiinin NE.

4A. HeLa-solut transfektoitiin mock, TPR tai Nup153 siRNA kuten päällä. Kokosolulysaateille analysoitiin 2 päivää transfektion jälkeen immunoblottauksella käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja TPR, anti-FG toista nucleoporin Mab414 merkitä Nup153 ja Nup62 ja anti-tubuliinin kuin lastaus ohjaus. 4B-4C. Nup153 ilme on erityisesti alentaa TPR-köyhdytettyä soluissa. HeLa-soluja käsiteltiin Tpr2 tai mock siRNA 2 päivää. 4C. Solut kiinnitettiin ja leimattiin anti-TPR-vasta-aineen ja anti-emerin, anti-Mab414 tai anti-Nup153 vasta-aineita. Mitta-asteikko: 15 um. 4D. Yksityiskohtia Mab414 ja Nup153 merkintöjä. Mitta-asteikko: 5 um. 4D. Analyysi SENP2 ilmaisun tumauutteita 293 käsiteltyjen solujen TPR, SENP2 ja mock siRNA Western blot -analyysillä. TRFII käytetään latauskontrollina.

Koska TPR ehtyminen muuttunut Nup153 jakauman tumahuokonen ja että Nup153 hihnoja SENP2 NPC, me arveltu, että TPR voivat vaikuttaa SENP2 proteiinipitoisuuden ja toiminta. Tämän hypoteesin testaamiseksi, arvioimme vaikutus TPR heikentymisen SENP2. Ensinnäkin, kun otetaan huomioon, ettei vasta-aine on saatavilla tarkkailla endogeenisen SENP2 kiinteissä soluissa, analysoimme SENP2 tasoilla tumauutteita solujen köyhdytetyn TPR, Nup153 tai SENP2 ja mock köyhdytettyä soluissa. TPR ehtyminen HeLa ja 293 solujen mukana väheneminen SENP2 tasolle hyvin samanlaisia ​​kuin havaittiin SENP2-köyhdytettyä otteita. Sitten vertailla eri proteiinin tasot, me seurataan Nup133 ja TRF2 latauskontrollina ydin- otteita (Fig. 4D ja S3A). Ehtyminen Nup153 samalla aiheuttama väheneminen SENP2 (tuloksia ei ole esitetty).

TPR ehtyminen vaikuttaa SUMOylation

Havainto, että TPR ehtyminen vaikuttaa SENP2 sai meidät kysymystä siitä TPR ehtyminen saattaa häiritä kanssa SUMOylation muiden proteiinien. Sen tutkimiseksi, muutokset yleisessä SUMOylation proteiineja, HeLa-soluja käsiteltiin TPR, SENP2 ja ohjaus siRNA: t ja ydin- ja sytoplasman uutteet analysoitiin ja verrattiin Western-blottauksella käyttäen anti-SUMO-1-vasta-aine. Blots ydin- otteita osoittivat SENP2 tukahduttaminen aiheutti kertyminen suuren molekyylipainon SUMO-1 kuten odotettiin lasku SUMO-proteaasiaktiivisuutta. Mitään tällaista kertymistä havaittiin mock-transfektoiduissa soluissa. Sen sijaan, TPR-köyhdytettyä solut osoittivat kaiken kaikkiaan alhaisempana SUMOylation kuin verrattuna siRNA transfektoiduissa soluissa (Kuva. 5A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin U2OS ja 293-solut (Fig. S3B ja tietoja ei ole esitetty). Näin ollen vapaa SUMO-1 nähtiin kerääntyä TPR-köyhdytettyä soluja (Kuva. S3C).

5A-5B. Analyysi kokonaistaso SUMOylation transfektoiduissa soluissa TPR, Nup153, SENP2 ja mock siRNA. 5A. Tumauutteita siRNA: iden käsiteltyjen solut valmistettiin ja analysoitiin western-blottauksella käyttämällä vasta-aineita, kuten on kuvattu vasemmalla kuvassa. RPB1 käytettiin latauskontrollina. 5B. Analyysi RanGAP1 SUMOylation. Sytoplasminen uutteet TPR, Nup153, SENP2 ja mock siRNA-käsitellyt solut valmistettiin ja analysoitiin western-blottauksella käyttäen anti-RanGAP1 tunnistavaa vasta-ainetta sekä SUMOylated ja ei-SUMOylated muotoja RanGAP1 ja tubuliinin kuin lastaus ohjaus. 5C: SUMO-1 siRNA hoito ohittaa TPR ehtyminen aiheuttamaa vanhenemista HeLa-soluissa. HeLa-solut transfektoitiin TPR, SUMO-1, TPR ja SUMO-1 ja mock siRNA. Sen jälkeen, kun 6 päivää, solut kiinnitettiin ja värjättiin SA-β-gal-aktiivisuus pH: ssa 6,0. Edustavan kuvan jokaisen ehto esitetään. Mitta-asteikko: 15 um.

RanGAP1 (Ran-GTPaasina aktivoiva entsyymi 1) on runsaasti SUMOylated proteiinia ja useimmat anti-RanGAP1 vasta tunnistaa SUMO-1-muutetussa muodossa ja SUMO vapaa RanGAP1, vaeltavat noin 80 kDa ja 70 kDa, vastaavasti. Meillä on siis tutkittiin, mikä vaikutus TPR ehtymisen jakamisesta ja ekspressiotaso ja SUMOylation of RanGAP1. Osa SUMO vapaa RanGAP1 havaita tällä vasta-aineen lisääntynyt soluliman otteita Tpr- ja SENP2-siRNA käsitellyissä verrattuna Mock käsiteltyjen HeLa-soluja (kuvio. 5B) ja U2OS kokosoluekstraktien (Fig. S3B). Ydinvoima uuttojaetta vain SUMO-1-RanGAP1 havaittiin ja todettiin lisääntynyt Tpr- ja SENP2-siRNA käsitellyissä soluissa verrattuna pilkkaavat käsitellyt solut, kun havaitaan anti-SUMO-1 ja anti-RanGAP1 vasta, jossa lisäys on enemmän lausutaan TPR-käsitellyissä soluissa kuin SENP2 käsiteltyjä soluja (Kuva. 5A).

toistaiseksi rooli proteiinin SUMOylation vuonna vanhenemista induktio on tutkittu ainoastaan ​​normaalissa fibroblasteissa. Olemme varmistaneet, että ehtyminen SENP2 voisi aiheuttaa vanhenemista in U2OS solujen meidän kokeellinen asetus (Fig. S3D). Arvioimaan paremmin panos SUMO-1 muutos väylän TPR aiheuttamaa vanhenemista fenotyyppi syöpäsoluissa, me suorittaa rinnakkain RNAi knockdovvn TPR, SUMO-1 ja yhdistetty SUMO-1 ja TPR. 6 päivän jälkeen solut kiinnitettiin ja analysoitiin SA-β-galaktosidaasi-värjäyksellä. Solujen kokonaismäärästä oli dramaattisesti erilainen välillä TPR yksin kunto ja kaksi muuta olosuhteet. Neljäkymmentä tai 50 kenttää laskettiin kunkin kunto: kenttien määrä sisältävien sinisiä soluja ja prosenttiosuus viemän tilan suurennettu sinisiä soluja arvioitiin (taulukko 1). Itse asiassa, SUMO-1 köyhdytettyä soluissa, useimmilla aloilla täynnä soluja kyllästystiheyden siten, että solujen proliferaatiota ole pysähtynyt. Hyvin harvat sinisiä soluja havaittiin: 3 (yhden kentän) noin 20 sinisiä soluja tai niin voitaisiin lueteltu 7 aloilla vain, loput negatiivinen. Lopulta tulokset olivat niin erilaiset, että se oli mahdotonta sisällyttää ne taulukossa 1. Kuten itse asiassa oli vähemmän SA-β-galaktosidaasin positiivisten solujen SUMO-1 köyhdytettyä soluja kuin mock valvontaa. Tulokset on kuvattu taulukossa 1 osoittavat, että koko väestön vaikuttivat TPR ehtyminen taas solut senescent kaltainen fenotyyppi oli paljon dispergoitiin TPR plus SUMO-1 kunnossa. Lisäksi muutamia poikkeuksia lukuun ottamatta useimmat sininen solut eivät osoittaneet täyttä senescent fenotyyppi koska ne eivät litistetty ja SA-β-galaktosidaasi värjäytymistä oli heikko (Kuva. 5C).

Keskustelu

Olemme osoittaneet tässä tutkimuksessa, että heikentävien TPR on riittävä indusoimaan senescent kaltainen fenotyyppi kasvainsolulinjoissa. Vanheneminen fenotyyppi voidaan selittää kertyminen useiden kasvua heikentävän proteiinien toimiva mitogeenisesta signaalin siirtoon ja solukierron säätelyssä. Kaksi keskeistä signalointireittejä, p16INK4a-pRb ja p14ARF-p53, ovat vastuussa suorittamisesta proliferatiivisen pidätys joka luonnehtii senesenssiin [37], [38]. Rb-p16-reitti on puutteellinen sekä HeLa ja U2OS solulinjoissa mutta p53 U2OS ja HeLa-soluissa ja p16 HeLa solut kasvoivat jälkeen TPR knockdown. P53 kerääntyy tumaan ja niin tekee p21 /CIP1, alavirtavaikuttajainhibiittorit joka osallistuu useisiin muotoihin G1 tarkistuspiste valvontaa. Lisäksi osa p21 /Cip1protein ylössäätöä riippuu läsnäolosta p53.

normaalit solut, p53 on tavoite Ubikitiini-proteasomireitillä: alhaisesta tasosta p53 tulos jatkuvasta Mdm2- välittämää tumasta p53 sytosolin hajoamista. HeLa-soluissa, tumasta on tarpeen myös hajoamista p53 välittämän ihmisen papilloomavirus (HPV) 18 E6-proteiinia [39]. Osoitamme tässä, että TPR ehtyminen johtaa ydinaseiden säilyttämisestä GFP reportteri kätkeminen NES sekvenssin STAT1 ja viivästyttää induktion jälkeisen ydin- puhdistumaan NFKB jälkeen TNF poiston HeLa-soluissa [36], kaksi tapahtumaa riippuvainen Crm1 vienti tekijä. Tp hiljattain todettu vuorovaikutuksessa Crm1 in läsnä ollessa NES peptidin tai NES peptidin plus RanGTP kuten trimeerisen vienti monimutkainen [11]. Vaikka molekyyli yksityiskohdat vuorovaikutus ei ole tunnettu lisäksi siitä, puuttuminen TPR on todennäköisesti heikentää toimintaa Crm1 ydin- vientiin. Huomasimme, että TPR knock-down heikosti vaikuttaa Crm1 tasoilla western blot kokeissa, mutta ei ilmeisesti vaikuta Crm1 tasot mitattuna käyttämällä spesifisiä vasta-aineita kiinteän soluissa. Kuitenkin sitä on aiemmin raportoitu, että pienikin downregulation Crm1 johtaa näkyvästi vikoja tumasta [40]. Crm1 inhibitio myös vähentää solujen lisääntymistä ja indusoi syvällinen solujen muutoksia ja apoptoosia (tietoja ei ole esitetty), kuten aikaisemmin on raportoitu [41]. Meillä on siis suosia oletusta, että tärkein seuraus TPR ehtyminen on tumakertymään ja aktivointi p53 estämällä sen tumasta.

Tämän tukemiseksi, leptomycin B (LMB), joka on Crm1 estäjä, on ollut osoitettu vähentävän E6: n kyvyn hajottaa p53: kohdunkaulan karsinooman soluissa [39], [42] ja syy: (i) säilyttäminen STAT1-NES rakentaa tumaan [34], [35], (ii) tumakertymään ja aktivointi