Krooninen sairaus

tiivistelmä

Diffuusi-tyypin kiinteitä tuumoreita koostuvat usein suuri osa harvoin lisääntyvien (eli lepotilassa) syöpäsolut, voimakkaasti osoittaa osallistumista syövän kantasoluja (CSCS) Vaikka diffuusi-tyypin mahasyövän (GC) potilailla on huono ennuste, koska korkea-usein kehittäminen vatsakalvon levitys (PD), on vähän tietoa, että PD-liittyvä CSCS tehoa ja CSC-kohdistaminen terapiassa diffuusi-tyypin GC. Tässä tutkimuksessa perustimme erittäin metastaattinen GC solulinjoissa

in vivo

valinta suunniteltu rikastamista PD liittyvien GC soluihin. Microarray-analyysi, löydettiin CXC-kemokiinireseptori tyypin 4 (CXCR4) voi olla uusi markkeri erittäin metastaattinen CSCS, koska CXCR4-positiivisia soluja voi kasvaa kiinnittämisestä riippumattomasti aloittaa hiirissä, kestettävä sytotoksinen lääke, ja tuottaa eriytetty tytär solut. Kliinisissä näytteissä, nämä CXCR4-positiivisten solujen havaittiin alkaen paitsi myöhään etäpesäkkeiden vaiheessa (kerääntynyt askites), mutta myös aikaisemmin (vatsakalvon pesuja). Lisäksi hoito transformoiva kasvutekijä-β parantaa syövän vastaista vaikutusta dosetakselin indusoimalla solujen erilaistumiseen /epäsymmetrinen solunjakautumisen CXCR4-positiivinen mahalaukun CSCS jopa lepotilassa. Siksi erilaistuminen indusoijia pitää lupauksen saamiseksi mahdollisimman hoitotulokseen päässä olevat syöpälääkkeet kautta kierrätyksen of CSCS.

Citation: Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et ai. (2015) tunnistaminen ja karakterisointi CXCR4-Positive mahasyövän Stem Cells. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10,1371 /journal.pone.0130808

Editor: Masaharu Seno, Okayama University, Japani

vastaanotettu: 18 helmikuu 2015; Hyväksytty: 25 toukokuu 2015; Julkaistu: 25 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja. Kaikki microarray tiedot on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta, GEO; hakunumero GSE53276.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain National Institute of Biomedical Innovation (varten Advanced Research for Medical Products Mining ohjelma ID10-41), terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan (kolmannella Kattava 10-Year strategia syövän ohjaus H22-007), National Cancer Center tutkimus- ja kehitysrahasto (25-A-6, 26-A-3). Drs T Fujita, M Tamaoki ja T Nishimura ovat vastaanottajien Research Resident Fellowship säätiön edistämisen Cancer Research in Japan.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Histopatologisesti GC voidaan jakaa kahteen pääluokkaan: suoliston-tyypin ja hajanainen-tyyppiä. Suoliston-tyyppinen GC vallitseva korkean riskin maantieteellisillä alueilla ja kehittyy läpi vaiheittain kuten

Helicobacter pylori

(

H

.

pylori

) -associated atrofinen gastriitti, suoliston metaplasiaa (IM), ja dysplasia. Sen sijaan hajanainen-tyyppinen GC, jonka osuus on puolet kaikista GC potilaita, on laaja maantieteellinen jakauma ja kehittää jopa

H

.

pylori

vapaa, morfologisesti normaali mahan limakalvon ilman atrofinen gastriitti tai IM, ja diffuusi-tyypin GC saattaa poiketa suolen-tyypin sekä geneettisesti ja fenotyypiltään [1-5]. Toisin kuin yleisyyden suolen-tyyppi, esiintyvyys hajanainen-tyyppinen on tiettävästi kasvaa maailmanlaajuisesti [6]. Ennuste kokeneille hajanainen-tyyppinen GC potilaista pysyi huonona viime vuosikymmenen aikana, koska on korkea vatsakalvon levitys (PD) (78%) verrattuna suoliston-tyyppi (45%) [7]. Erityisesti potilaat, joilla Bormann tyypin IV GC on erittäin huono ennuste, vaikka he saivat monialaista hoitoa [8]. Siksi käsitellään PD on kiireellinen asia parantamisen ennustetta diffuusi-tyyppinen GC potilailla.

Diffuusi-tyyppi GC tyypillisesti ominaista laaja strooman fibroosia huono verisuonitus ja harvinainen proliferatiivinen (

i

.

e

. lepääviä) syöpäsoluja, mikä johtaa huomattavaan terapeuttinen vastus. Näkökulmasta kemoterapiaa, transformoiva kasvutekijä β (TGF-β) on ajateltu edistää aggressiivinen progressiota epiteelin-mesenkymaalitransitioon ja indusoimalla fibroosi [9]. Kuitenkin, TGF-β estää myös soluproliferaatiota, indusoi apoptoosia, ja välittää erilaistumisen epiteelisoluissa, mikä viittaa siihen, että osat TGF-β signalointireittien on kasvain-suppressiivinen aktiivisuus epiteelikasvaimissa [10, 11]. Vaikka saatu todisteita on osoittanut kriittinen rooli TGF-β syövän kantasolujen (CSC) biologia, on vähän tietoa sen roolista diffuusi-tyypin GC.

On raportoitu, että kunkin populaation syöpäsolujen funktionaalisia heterogeenisyys ominaista selvä lisääntyminen ja erilaistuminen kapasiteettia monentyyppisiä kasvaimia [12]. Jotta voidaan ottaa huomioon tällaisten kasvainten heterogeenisyys, kaksi mallia on ehdotettu: klonaalisen evoluutiomalli [13] ja CSC malli [14]. Jälkimmäinen malli on saanut laajaa huomiota, koska se tarjoaa järkevä selitys vastustuskykyä perinteisille kemo- ja sädehoidon, jossa lepotilassa tai hitaasti pyöräily CSCS hengissä, ja tulokset lopulta kasvain uusiutumisen [15-17]. Siksi terapeuttiset strategiat kohdistaa CSCS ovat välttämättömiä hävittää jäljellä taudin ja toistumisen estämiseksi paitsi GC vaan myös muihin syöpiin. Lisäksi nykyisen oivalluksia solun mekanismeja syövän, metastaattisen potentiaalin kasvainsolujen johtuu CSCS, joka voi kloonaamalla aloittaa kasvaimen muodostumisen kaukaisiin kohtiin [18 19]. Vaikka useita solunpintamolekyylien on ehdotettu CSC merkkiaineiden monenlaisia ​​ihmisen maligniteettien, ei ole merkki tunnistamista varten PD-liittyvän CSCS in GC [20-23]. Tunnistamaan tällaiset markkereita, pidimme käsitystä, että toiminnallisesti ja geneettisesti heterogeeninen kasvaimet ovat yhteisiä ja luontainen mekanismien kasvaimen huolto kontekstin mukaan tietyn mikroympäristön. Niinpä me arveltu, että CSCS olisi määriteltävä toiminnallisesti by validoitu hyvin määrityksiä kuten

in vivo

elinsiirrot. Vuonna hajanainen-tyyppinen GC, me aluksi keskittyi vatsakalvon-erityinen asuttaminen solujen ja rikastettu PD-liittyvä CSCS toistuvista

in vivo

valinnat [24, 25]. Tässä olemme huomanneet, CXC-kemokiinireseptori tyypin 4 (CXCR4) voi olla markkeri PD-liittyvän maha- CSCS ja osoittaneet, että TGF-β parantaa tehoa kasvaimen vastaisen lääkkeiden indusoimalla solujen erilaistumiseen /epäsymmetrinen solunjakautumisen CXCR4

+ CSC väestö jopa lepotilassa.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

Kliiniset näytteet saatiin National Cancer Center Hospital (Tokio, Japani) saatuaan kirjallinen suostumus jokaisesta potilaasta ja hyväksyntä National Cancer Center Institutional Review Board (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

Solulinjat ja primaariviljelmiä

ihmisen GC solulinja, HSC-60 perustettiin yhteiskäyttäjä menettelyä käyttäen kuten aiemmin on kuvattu [26]. Erittäin vatsakalvon etäpesäkkeitä solulinja, 60As6 perustettiin peräisin HSC-60 käyttäen potilaalle tehdä kudosta istutettaviksi SCID /SCID-hiirten lyhyesti seuraavat: ksenosiirrettyjä kasvain HSC-60-solujen istutetaan mahalaukun seinämän hiiren. Me toistetaan kuusi jaksoa korjuun vesivatsanesteet kasvainsolujen ja potilaalle tehdä rokotus näiden solujen. Nämä kaksi solulinjoja pidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia. Olemme myös perustaneet kaksi lusiferaasia ilmentämissolulinjat (HSC-60Luc ja 60As6Luc). Kuusi muuta GC solulinjat (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, ja KATO III) myös pidettiin samoissa olosuhteissa. Näiden kuuden, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, ja 58As9 määritettiin edellä esitetyllä menetelmällä [27, 28], ja KATO III saatiin American Type Culture Collection. Primääriviljelystä, solut kerättiin potilaiden vatsakalvon pesut ja askites (NSC-16C, NSC-20C, ja NSC-22C), ja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia.

mikrosiruanalyysi

Yhteensä RNA 60As6, 60As6Luc, HSC-60, ja HSC-60Luc solut eristettiin suspendoimalla solut käytettäessä ISOGEN lyysipuskuria (Nippon Gene, Toyama, Japani) ja sen jälkeen isopropanolisaostuksella. Teimme microarray analyyseja kahdesti käyttämällä Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Menettelyt tehtiin mukaan toimittajien protokollia. Taulukot skannattiin kanssa GeneChip- Scanner 3000 (Affymetrix), ja tiedot analysoitiin Microarray Suite 5.0 kanssa Affymetrix maksuhäiriöanalyysin asetukset ja globaali skaalausta normalisoinnin menetelmää. Leikattu keskiarvo tavoitetehosta kunkin array mielivaltaisesti asetettu 1000. Kaikki microarray tiedot on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta, GEO; hakunumero GSE53276. Jonka 2-kertainen muutos, 684 geenit valittiin erityisiä geenejä 60As6 ja 60As6Luc soluja, ja 1150-geenit valitaan HSC-60 ja HSC-60Luc soluissa.

Eläinkokeet

Kuusi -week-vuotias nainen C.B17 /Icr-SCID (SCID /SCID) hiiriä (CLEA Japani, Japani) oli kasvatettu huoneenlämmössä, jossa on 12 tunnin valo /pimeä päivittäin sykli. Hiiriä pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa ja edellyttäen steriiliä ruokaa, vettä ja häkkejä. 1 x 10

4-1 x 10

6 syövän solut suspendoitiin 1 ml: lla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), ja sitten injektoitiin vatsaonteloon käyttämällä 26 1/2 gaugen neula. Hiiret punnittiin ja mitattiin viikoittain. Humane päätepiste kriteereinä olivat merkittävästi kertyminen vatsan askites, hengenahdistus, piloerektio, anemia, tai laihtuminen yli 10% alkuperäisestä painosta. Kaikki kokeet suoritettiin noudattaen eettisten ohjeiden International Association for Study of Pain ja hyväksyttiin komitean Ethics eläinkokeissa National Cancer Center. Pyrittiin minimoimaan numerot ja kärsimystä käytettyjen eläinten kokeissa.

RT-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin suspendoimalla solut käytettäessä ISOGEN lyysipuskuria seurasi isopropanolisaostus-. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR toteutetaan lineaarisella alueella 25 30 jaksoa varten

MUC5AC

,

CXCR4

,

CXCR7

,

CXCL12

,

LGR5

,

TGFBR1

,

TGFBR2

, ja

ACTB

käyttäen seuraavia alukkeita: 5′-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 ’ja 5’-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 ”varten

MUC5AC

, 5′-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3 ’ja 5′-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3’ varten

CXCR4

, 5′-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3 ’ja 5′-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3’ varten

CXCR7

, 5′-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 ’ja 5′-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3’ varten

CXCL12

, 5′-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 ’ja 5′-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3’ varten

LGR5

, 5′-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 ’ja 5′-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3’ varten

TGFBR1

, 5′-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 ’ja 5′-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3’ varten

TGFBR2

, ja 5′-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 ’ja 5′-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3’ varten

ACTB

.

immunosytokemia

Epäsuora loisteputki immunosytokemiassa suoritettiin CXCR4, MUC5AC, ja Smad2 /3-soluissa kasvatettu 4-kaivokammio dioja. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi huoneenlämmössä 20 minuutin ajan. Kun kolme kertaa pesun PBS (-), niitä inkuboitiin anti-ihmis-CXCR4 monoklonaalinen vasta-aine (R 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) käytettiin kaikkiin tilastollisia analyysejä.

Tulokset

Fenotyyppiset erot vanhempien HSC-60-solujen ja erittäin tuumorigeenisiä alalinja 60As6 solujen

käsiteltävä ilmiö diffuusi-tyyppinen GC-liittyvä PD näkökulmasta molekyyli- ja solubiologian, loimme erittäin vatsakalvon etäpesäkkeitä solulinja, 60As6, mistä diffuusi-tyyppinen GC peräisin oleva solulinja, HSC-60, kautta

in vivo

valikoima koostuu ortotooppisten inokulaation kasvainsolujen ja eristäminen erittäin metastaattinen niistä peräisin askites immunopuutoksesta hiirissä [25]. Vaikka kahdentumisaika näiden kahden solulinjan oli verrattavissa (30 hr HSC-60 ja 31 tuntia ja 60As6)

in vitro

, 60As6 solut muodostivat useita kasvaimen kyhmyjä nopeammin intraperitoneaalisen injektion jälkeen inokulaation hiiriin. Keskimääräinen elinaika oli 167 päivää kiinnittymisen jälkeen 5 x 10

6 HSC-60-solujen, kun taas istuttaminen sama määrä 60As6 solujen johti merkittävä muodostumiseen verinen vatsaonteloon sekä mediaani elinaika oli vain 28 päivää. Anchorage-riippumattomuus voidaan tarvita selviytymisen vapaan syöpäsolujen vatsaonteloon ja Kolonisaatiopotentiaalin. Pesäkkeitä muodostumista määrityksessä, 60As6 solut muodostivat paljon enemmän pesäkkeitä kuin HSC-60-solujen (S1 kuviossa), jotka osoittavat, että 60As6 hallussaan suuri kyky kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Olemme validoitu chemoresistance tunnetaan myös tärkeä ominaisuus CSCS. Soluja viljeltiin, kun läsnä on dosetakselin (Doc), joka on usein käytetty syöpälääke hoitoon GC potilailla. 60As6 oli 6 kertaa suurempi IC

50 arvo Doc verrattuna HSC-60 (52 nM ja 8,4 nM) (S2 Kuva). Nämä tiedot osoittavat, että 60As6 on saavuttanut korkean solunsalpaajaresistentti fenotyypin. Lisäksi morfologia HSC-60-solujen karakterisoitiin tasainen ja suuri, kun taas on 60As6 solut oli puoliksi kelluva ja pieni, joka on samanlainen morfologia usein havaittu CSCS (S3 kuvassa). Olemme ensi tutkinut Lipidilauttojen lokalisoinnin avulla koleratoksiinin B-alayksikkö (cfxB) kuin lipidilautan merkki, koska se on jo raportoitu, että lipidilautan klustereita rikastuneet Veren kantasolut [29]. Kertymistä loisteputki cfxB havaittiin 60As6 soluissa, mutta ei HSC-60, mikä viittaa toinen CSC kaltainen ominaisuus entisen soluja (S3 kuvassa).

arvioimiseksi biologisen eroja HSC-60 ja 60As6 solut, vertasimme geeniekspressioprofiilien mukaan mikrosiruanalyysillä (S1 taulukko). Down-regulation kolmen mahalaukun pit solun erilaistumisen markkereita (

MUC5AC

,

MUC1

, ja

TFF1

) ja jotkut sytokeratiineja löydettiin 60As6. Sen sijaan useat kantasolujen merkkiaineita (

LY75

,

CD44

,

GPNMB

, ja

CXCR4

) on yliaktiivista tässä solulinjassa. Ilmaisu viittaa siihen, että 60As6 on vahva mesenkymaalisten fenotyyppi, joka on ominaista epiteelisoluperäisen CSCS.

lisäksi tutkittiin mRNA: n ilmentymisen sekä tyypillisen differentiaatiomarkkeri

MUC5AC

[3 , 4] ja metastaasin liittyvän kemokiinireseptorin

CXCR4

[30] RT-PCR: llä. Mukaisesti microarray tuloksiin,

MUC5AC

ja

CXCR4

mRNA: t osoittivat toisiaan pois ilmaisun HSC-60 ja 60As6 (kuvio 1A). Kemokiini, SDF-1, jota koodaa

CXCL12

tiedetään sitoutuvan CXCR4 ja sen vastaavan reseptorin CXCR7 [30]; kuitenkin, mRNA: n

CXCL12

ja

CXCR7

ei havaittu kummassakaan solulinjassa. Ilmaisu Sekä MUC5AC ja CXCR4 myös vahvistettiin proteiinin tasolla immunosytokemiallisella värjäytymistä (kuvio 1 B). Täten nämä tulokset viittaavat siihen, että HSC-60-solujen satama enemmän erilaistuneita soluja kuin tehdä 60As6 soluja, jotka ovat enimmäkseen koostuvat eriytymättömiä soluja. Yhdessä kaikki nämä CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia 60As6 osoittavat, että erilaistumattoman alapopulaatio suurella tuumorigeenisyyteen ja lääkeresistenssideterminantit voitaisiin tehokkaasti rikastaa vanhempien soluista aikana

in vivo

valintoja.

(A ) RT-PCR

MUC5AC

,

CXCR4

,

CXCR7

, ja

CXCL12

on GC solulinjassa HSC-60 ja sen alalinjan 60As6. (B) Immunosytokemia varten MUC5AC (vasen ruutu, vihreä) ja CXCR4 (oikea paneeli, vihreä) HSC-60 ja 60As6 soluja, tässä järjestyksessä. Tumat vastavärjättiin DAPI (sininen). Mittaviivat edustaa 100 um. (C) Virtaussytometria-analyysi solun pinnan CXCR4 60As6 soluissa. Sisälasilevyt edustavat CXCR4

+ pieniä soluja (I), CXCR4

– pieniä soluja (II) ja CXCR4

– suuria soluja (III) (Ci). Kukin solupopulaation erotettiin FACS sen vastaavaan puhtaus (Ci-Civ). Immunopositiivista soluja MUC5AC havaittiin vain CXCR4

– suuri solu jae (Civ, alempi paneeli, vihreä). Mittaviivat edustaa 50 um. (D) Kuvat ovat viljelyn jälkeen CXCR4

– pienet ja suuret solut 3 päivää. Mittaviivat edustaa 50 um.

tunnistaminen ja luonnehdinta mahalaukun CSCS vuonna 60As6 ja ensisijainen viljeltyjä soluja

vieressä tutki roolia CXCR4 heikossa-tyyppinen GC solujen PD. Kuten on esitetty kuviossa 1A, reseptorin

CXCR4

oli hyvin ilmaistu 60As6 verrattuna HSC-60, kun taas niiden ligandin

CXCL12 /SDF1

ei ollut molemmissa. On kuitenkin huomattava, että tämä ligandi tiedetään ilmaistaan ​​vatsakalvon mesoteelisolujen [31] ja toimimaan kemokiini aiheuttaa etäpesäkkeiden kautta vuorovaikutusta CXCR4-ilmentävien syöpäsolujen [30]. Siksi me tutki CXCR4 voisi toimia markkerina tunnistamiseksi PD-liittyvä CSCS. Ilmaisu CXCR4 60As6 solut analysoitiin fluoresenssilla aktivoidun solun lajittelua (FACS). Mukaan CXCR4 ilmaisun ja eteenpäin sironnan malli, 60As6 solut osoitti heterogeenisuus koostuu kolmesta eri eläinryhmät: I. CXCR4

+ pieniä soluja (15%), II. CXCR4

– pieniä soluja (65%), ja III. CXCR4

– suuria soluja (20%) (kuvio 1Ci). Sitten solut erotettiin, jolloin kustakin alaryhmästä, jonka puhtaus oli I: 97%, II: 99%, ja III: 54%, vastaavasti (kuvio 1Cii-1Civ). Alhainen lajittelu puhtaus CXCR4

– suuri solu subpopulaatio III johtui saastuminen aggregoidut CXCR4

– pieniä soluja (kuvio 1Civ, musta-boxed paneeli). Näistä kolmesta alapopulaatioiden vain CXCR4

– suuri solu subpopulaatio sisälsi MUC5AC

+ erilaistuneita soluja (kuvio 1Civ, kolme ulkopaneelit). Solujen kasvun seuranta yhdessä solutasolla, todettiin, että CXCR4

– pienet solut lisääntyivät, kun taas CXCR4

– suuria soluja ei tapahtunut solunjakautumisen vielä 3 vuorokauden kuluttua kulttuuri (kuvio 1D ja S4 kuvassa). Nämä havainnot viittaavat siihen, että CXCR4

– pienet solut ovat ohimeneviä vahvistavia soluja, kun taas CXCR4

– suuret solut terminaalisesti erilaistuneita soluja.

Lajittelun jälkeen kahdesta alaryhmästä (I ja II), analysoimme mikä tahansa muutos solupopulaation (kuvio 2A); 7 päivän viljelyn. CXCR4

+ pieniä soluja vastaten alaryhmästä I syntyy itse, CXCR4

– pieniä soluja, ja CXCR4

– suuria soluja (11%, 62%, ja 21%, tässä järjestyksessä), kun taas CXCR4

– pienissä soluissa vastaten alaryhmästä II pystyivät aiheuttaa pääasiassa itse (80%) noin suuria soluja (17%) ja hyvin harvat CXCR4

+ pieniä soluja (2%). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CXCR4

+ pieniä soluja on erilaistumista potentiaalia ja tuottaa CXCR4

– suuria soluja mahdollisesti vaihe CXCR4

– pieniä soluja järjestelmässä solujen erilaistumisen.

(A ) Molemmat CXCR4

+ ja CXCR4

– 60As6 solut lajiteltiin FACS (vasen sarake). Solut Kunkin fraktion viljeltiin 7 päivää, ja sitten analysoitiin ekspressiotasot CXCR4 (oikea palsta). (B) Immunosytokemia varten MUC5AC (vihreä) siirtomaa peräisin yhdestä CXCR4

+ pienisoluinen. Mittaviivat edustaa 50 um. (C) Cell-linjan määrityksessä, jossa on kaksi eri väriä. Lajiteltu yksi CXCR4

+ pieniä soluja värjättiin anti-MUC5AC-vasta (punainen) ja CellTracker Green (Invitrogen, vihreä) ja jäljittämiseksi eläviä soluja 7 päivää. Mittaviivat edustaa 50 um. (D) RT-PCR

LGR5

normaaleissa mahan epiteelisolujen (vasen paneeli), CXCR4

+ pieniä soluja ja CXCR4

– pieniä soluja (oikea paneeli). Laser mikrodissektion erottaa normaali mahan limakalvon kolmeen alueeseen: kuoppaan, niska, ja rauhanen.

Lisäksi CXCR4

+ pieni yksittäinen solu tuotti sisältävän pesäkkeen MUC5AC

+ erilaistuneita soluja jälkeen 7 päivää kulttuuri (kuvio 2B). Tämä havainto tukivat solu-linjaa määrityksessä yhdistettynä elävien solujen värjäytymisen ja immunovärjäyksen MUC5AC (kuvio 2C). Lisäksi, CXCR4

+ pieniä soluja osoitettiin ilmentävän korkean tason

LGR5

, joka tunnetaan merkkinä mahalaukun epiteeli- kantasoluja sijaitsee rauhanen normaalin limakalvon [32] (kuvio 2D ).

Seuraavaksi validoitu ankkurointi itsenäisyyden ja kasvaimen aloittamista kyky kaksi pientä solu alaryhmässä (I ja II). Vuonna pesäkemuodostusta, CXCR4

+ pieniä soluja muodostuu paljon enemmän pesäkkeitä kuin ei CXCR4

– pieniä soluja (kuvio 3A). Sarjalaimennokselle kokeita intraperitoneaalisen inokulaation immuunivajaissa hiirillä että CXCR4

+ pieniä soluja myös hallussaan korkeampi tuumorigeenistä kyky (kasvainten kehittymistä 4/5 ja 1/5 hiiriin inokulointi 10

5 ja 10

4 solut, vastaavasti) verrattuna CXCR4

– pieniä soluja (1/10 ja 0/10 hiiristä 10

5 ja 10

4 solut, vastaavasti) (kuvio 3Bi). Erityisesti kaikki viisi kasvainta kantavien hiirten siirrostuksen jälkeen CXCR4

+ pieniä soluja oli useita kasvain kyhmyt (kuvio 3Bii), ja alkoi kehittää verinen askites 3 viikon kuluessa (kuvio 3Biii).

(A) edustavat kuvat kiinnityspisteiden riippumattoman kasvun CXCR4

+ pieniä soluja ja CXCR4

– pienet solujen pesäkemuodostusta (vasemmalla). Kvantitatiivinen analyysi solujen kasvua käyttämällä CyQuant GR väriainetta (oikealla) (n = 3, keskiarvo + SE; *** p 0,001). Mittaviivat edustaa 200gm. (B) Kasvaimen muodostuminen taajuudella CXCR4

+ pieniä soluja ja CXCR4

– suuria soluja vierassiirrekokeissa hiirillä (Bi). Alempi paneeli osoittaa edustaja makroskooppiset havainnot useita kasvaimen kyhmyjä (bii, nuolenkärki) yhdessä suolistossa ja verinen askites (biii) on SCID /SCID hiiri. (C) RT-PCR (vasen paneeli) ja immunosolukemiallisten värjäyksen (oikea paneeli) CXCR4 (vihreä) ja CXCR7 (vihreä) primaarisissa viljellyissä GC soluja (NSC-20C). Scale palkki edustaa 200gm. (D) virtaussytometrianalyysin primaarisissa viljellyissä GC soluja (NSC-20C) (Di) ja lajitellaan CXCR4

+ solujen jälkeen viljellään 14 päivää (Dii). Pesäkemuodostusta CXCR4

+ ja CXCR4

– pieniä soluja, jotka ovat peräisin NSC-20C soluja (n = 3, keskiarvo + SE; **

p

0,005) (HindIII).

lisäksi hajanainen-tyypin GC solulinjoja, tutkimme myös roolia CXCR4 kliinisessä näytteessä (NSC-20C): ensisijainen kulttuuri muodostaa myös askites on hajanainen-tyyppinen GC potilaan kanssa PD. RT-PCR ja immunovärjäys kokeissa todettiin, että primääriviljelmässä näihin

CXCR4

, mutta ei

CXCR7

(kuvio 3C). Tärkeää on, CXCR4

+ pieniä soluja lajiteltiin NSC-20C hallussaan sekä repopuloiva kyky (kuvio 3Di ja 3Dii) ja korkea pesäkkeenmuodostusta kyky (Kuva 3Diii).

osallistuminen CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 akseli PD

kuudessa muut hajanainen-tyyppinen GC solulinjat (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, ja KATO III), me tutki tarkemmin suhdetta ilmentymistilanne kahden CXCL12 /SDF-1-reseptorit (CXCR4 ja CXCR7) ja kertymistä askitesta hiirissä ympätty syöpäsoluja vatsaonteloon. RT-PCR-kokeet osoittivat, että kaksi GC solulinjat (HSC-39 ja KATO III) ilmentyy voimakkaasti

CXCR4

(kuvio 4A). Lisäksi molemmat ksenosiirrettyjä hiirillä oli useita kasvaimen kyhmyjä ja kertynyt askites (kuvio 4B). Sen sijaan kaksi muuta solulinjat (HSC-44 ja HSC-58) ei osoittanut mitään tai melko alhainen CXCR4 ilmaisu, yhtä tai muutamaa vatsakalvon kasvaimen kyhmy ja ei kertynyt askites (kuvio 4B). Olemme myös vahvistaneet kertyminen askitesta toisessa erittäin vatsakalvon-metastaattinen alalinja 58As9 (peräisin HSC-58), joka ilmaistaan ​​

CXCR7

korkealla tasolla, mutta ei

CXCR4

. Yksi poikkeuksellinen tapaus 44As3 peräisin HSC44 että oli useita kasvain kyhmyjä ja kertynyt askites ilman ilmentymistä sekä

CXCR4

ja

CXCR7

. Kaiken kaikkiaan löysimme suuren korrelaation ekspressiotason

CXCR4

tai

CXCR7

ja aggressiivinen fenotyyppien seitsemässä kahdeksasta solulinjojen paitsi 44As3.

(A) RT-PCR

CXCR4

ja

CXCR7

6 diffuusi-tyyppinen GC solulinjat. (B) makroskooppinen havainnot verinen vatsaonteloon sekä useita kasvaimen kyhmyjä (nuolenkärki tai pisterengasta) SCID /SCID-hiiriin muodostuu 3 viikon kuluttua siirrostuksen kunkin solulinjan.

Kliinisessä käytössä vatsakalvon huuhtelu sytologia (CY) tarjoaa tärkeitä varoituksia syntymässä olevista GC potilaille, koska se voi havaita ”siemen” PD ennen sen makroskooppinen ilmentymä. Jopa tapauksissa, joissa ei ole PD (P0), CY-positiivisten potilaiden huonoon ennusteeseen [33], mikä viittaa siihen, että monet metastaattinen CSCS ovat läsnä vatsakalvon huuhtelu näiden potilaiden. Siksi tutkimme seuraavaksi läsnä CXCR4

+ GC solujen vatsakalvon pesuissa potilailta, eikä kliinisesti havaittavia askitesta.

CXCR4

mRNA havaitaan harvoin pesuvesi 9 10 CY-negatiivisten potilaiden; kuitenkin, mRNA havaittiin pesuvesi 19 34 CY-positiivisilla potilailla (S5a kuvio). Olemme myös vahvisti läsnäolo CXCR4 ja sytokeratiini kaksinkertainen positiivinen pieni GC solujen cobblestone muotoisen mesoteelisolujen kiinnitetty kulttuuriin lautasen pinnan lyhyen aikavälin (7 päivää) kulttuurin potilaan askites (S5B kuvio). Meidän kokeissa vatsakalvon mesoteelisolujen yleensä katosi pitkäaikaiseen viljelyyn jälkeen noin kuukauden. Tällaisissa pitkän aikavälin kulttuuri, löysimme myös läsnä noin CXCR4- tai CXCR7-erittäin positiivisia GC soluja, jotka osoittivat ominaisuudet epiteelin-mesenkymaalitransitioon, vimentiinistä (VIM) -positiivinen (nuoli pään S5c kuvassa), mutta sytokeratiini (PAN ) -negatiivinen. Siksi CXCR4

+ GC solut ovat läsnä pahanlaatuiset vesivatsat paitsi alkuvaiheessa vatsakalvon levittämistä (P0 /CY

+), mutta myös lisää asteittain ominaista avoin askites kertymistä. Kaiken edellä kokeellista ja kliinistä näyttöä siitä, että osa CXCR4

+ tai CXCR7

+ GC soluilla on mahdollisuuksia kehittää vatsakalvon etäpesäkkeitä.

vieressä tutkineet toiminnallista roolia CXCR4 signalointireitin PD. Ilmaisu on

CXCL12 Twitter /

SDF-1

ihmisen ja hiiren vatsakalvon Mesothelium varmistettiin RT-PCR: llä (kuvio 5A). Siksi osallistuminen CXCL12 /SDF-1 solujen invaasiota tutkittiin.